JP2024515041A - Ｌ－グルホシネートおよびそのホスホエステルを産生するための酵素的方法 - Google Patents

Ｌ－グルホシネートおよびそのホスホエステルを産生するための酵素的方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｌ－グルホシネートまたはそのホスホエステルを産生するための酵素触媒方法に関する。本方法は、活性化Ｌ－ホモセリンＨＡを、メチルホスフィン酸およびメチルホスフィン酸のエステルから選択される基質Ｓと反応させるステップを含む。本発明は、Ｌ－グルホシネートおよびそのホスホエステルの酵素産生における新しい基質を利用可能にする。

Description

本発明は、Ｌ－グルホシネート（「Ｌ－ＧＡ」もしくは「ＬＧＡ」）またはそのホスホエステルを産生するための酵素触媒方法に関する。本方法は、活性化Ｌ－ホモセリンＨＡを、メチルホスフィン酸およびメチルホスフィン酸のエステルから選択される基質Ｓと反応させるステップを含む。本発明は、Ｌ－グルホシネートおよびそのホスホエステルの酵素産生における新しい基質を利用可能にする。
１．発明の背景
有機リン化合物、すなわち炭素－リン結合を含む化学薬剤は、植物保護の分野で除草剤として広く適用されている。除草剤であるグリホサート（Ｒｏｕｎｄｕｐ（登録商標）、Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ（登録商標））およびグルホシネート（Ｂａｓｔａ（登録商標）、Ｌｉｂｅｒｔｙ（登録商標））ならびに生長調整剤であるグリホシン（Ｐｏｌａｒｉｓ（登録商標））などの作用物質がこの目的で使用されている（例えば、G. Hoerlein, Rev. Environ. Contam. Toxicol. 1994, 138, 73-145に記載のとおり）。
Ｐ－メチルホスフィン酸のエステル（例えば、Ｐ－メチルホスフィン酸ブチルエステル；「ＭＰＢＥ」；ＣＡＳ番号：６１７２－８０－１）は、非選択的除草剤であるグルホシネートの合成において、合成構成要素として重要な役割を担っている。これらのエステルは、２つの基本的な合成経路（K. Haackの論文Chem. Unserer Zeit 2003, 37, 128-138の図３ａおよび３ｂ、第１３０頁にまとめられている）：
ａ．ジエチルクロロホスファイト［ＣｌＰ（ＯＣ２Ｈ５）２］をＣＨ３ＭｇＣｌと反応させると、メチルジエトキシホスフィン［Ｈ３ＣＰ（ＯＣ２Ｈ５）２；「ＤＥＭＰ」；ＣＡＳ番号１５７１５－４１－０］が提供され、これを部分的に加水分解すると、対応するメチルホスフィン酸エチルエステル（ＭＰＥＥ；ＣＡＳ番号：１６３９１－０７－４）が得られる。
ｂ．あるいはメタンを三塩化リンと５００℃で反応させて、メチルジクロロホスフィンＨ３ＣＰＣｌ２を得ることもできる。後者をアルコールに加溶媒分解させて、対応するメチルホスフィン酸エステルを得ることができる。
Ｐ－メチルホスフィン酸のエステルは、炭素－炭素二重結合に位置選択的に付加する。この性質は、グルホシネートの合成において、第二のリン－炭素結合の形成に利用される。例えば、Ｈ３ＣＰＨ（Ｏ）ＯＲ（Ｒ＝アルキル）は付加反応で１－シアノ酢酸アリルと反応して中間体を提供する。その後、酢酸置換基をアンモニアと交換し、シアノ基およびホスフィン酸部分のエステル基を加水分解すると、グルホシネートが得られる。
アクリル酸エステルは、より安価な代替出発物質である。それはＰ－メチルホスフィン酸のエステルと反応して３－［アルコキシ（メチル）ホスフィニル］プロピオン酸アルキルエステルになる。このジエステルとシュウ酸ジエチルとのクライゼン反応、加水分解、脱炭酸により、対応するα－ケト酸が提供され、これを還元的アミノ化してグルホシネートを得ることができる。
Ｌ－グルホシネートに向けてのこれらの合成経路および更なる合成経路は、当該技術分野、例えば国際公開第１９９９／００９０３９号、欧州特許出願公開第０５０８２９６号明細書にも記載されている。
国際公開第２０２０／１４５５１３号および国際公開第２０２０／１４５５１４号には、Ｌ－グルホシネートへの化学的経路が記載されている。この経路では、Ｏ－アセチルホモセリンまたはＯ－スクシニルホモセリンなどのホモセリン誘導体が出発物質として使用され、ラクトン化およびハロゲン化を含む一連の反応によってＬ－グルホシネートが得られる。
国際公開第２０２０／１４５６２７号にも同様の経路が記載されており、ハロゲン化の間に臭素誘導体が得られる。
中国特許出願公開第１０６０８３９２２号明細書が開示する経路も同様であるが、Ｌメチオニンから出発する。
欧州特許出願公開第２４０２４５３号明細書には、メチルメルカプタンとジメチルスルフィドとの混合物をＯ－アセチルホモセリンまたはＯ－スクシニルホモセリンと酵素的に反応させてメチオニンを産生する酵素的方法が記載されている。
中国特許出願公開第１０８５１６９９１号明細書には、Ｌ－グルホシネートの別の合成経路が記載されており、Ｌ－ホモセリンの共沸脱水から始めてＬ－３，６－ビス（２－ハロエチル）－２，５－ジケトピペラジンを得て、続いてメチルホスフィン酸ジエステル基を導入し、加水分解する。
グルホシネートのすべての合成経路の一般的な欠点は、得られるグルホシネートがラセミ混合物であることである。しかしながら、Ｄ－エナンチオマーには除草活性がないため、Ｌ－グルホシネートが経済的に注目されるエナンチオマーである。
Ｌ－グルホシネートのエナンチオ選択的合成については、酵素経路が当該技術分野で記載されている。
国際公開第２０１７／１５１５７３号には、Ｄ－グルホシネートからＬ－グルホシネートの２段階酵素合成が開示されている。第１の段階では、Ｄ－グルホシネートを酸化的脱アミノ化して２－オキソ－４－［ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル］酪酸（「ＰＰＯ」）を得て、続いて第２の段階としてＰＰＯをＬ－グルホシネートに特異的アミノ化する。第１の段階は、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの触媒作用によって行われ、第２の段階はトランスアミナーゼによって触媒される。
国際公開第２０２０／０５１１８８号には、ラセミ体グルホシネートをＬ－グルホシネートエナンチオマーに変換する同様の方法が開示されている。さらに、該文献には、ＰＰＯをアミン供与体でアミノ化する間に形成されるα－ケト酸またはケトン副産物をケトグルタル酸デカルボキシラーゼによって変換し、平衡をＬ－グルホシネートにさらにシフトさせる段階が開示されている。
国際公開第２０１９／０１８４０６号には、Ｌ－グルホシネートおよびグルタミン酸を含む混合物からＬ－グルホシネートを精製する方法が開示されている。グルタミン酸は、グルタミニル－ペプチジルシクロトランスフェラーゼによってピログルタミン酸に酵素的に変換され、この場合、Ｌ－グルホシネートは、イオン交換によって得られた混合物から精製される。
本発明の目的は、高エナンチオマー過剰のＬ－グルホシネートを産生するための更なる酵素プロセスを提供することである。特に、このようなプロセスは、これまでＬ－グルホシネートの酵素合成に使用されなかった新しい基質の使用を可能にするはずである。
２．発明の概要
本発明は、上記の課題を、これまでＬ－グルホシネートの酵素産生に使用されなかった基質からＬ－グルホシネートを産生するための方法を提供することによって解決する。特に、本発明は、酵素触媒経路を用いてメチルホスフィン酸およびそのエステルからＬ－グルホシネートまたはＬ－グルホシネートのホスホエステルを産生するための方法を提供する。したがって、これらのリン化合物は、Ｌ－グルホシネートの産生における代替基質として機能し、Ｌ－グルホシネートの産生に現在使用されている既知の基質に依存しない柔軟な産生を可能にする。
特に、この目的は、活性化Ｌ－ホモセリンＨＡを基質Ｓと反応させてこれらの化合物を産生するステップ（ａ）を含む、Ｌ－グルホシネートまたはそのホスホエステルを産生するための酵素触媒方法に関する本発明によって達成される。
ｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＹ－Ｃｇプラスミドマップを示す。 ｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＹ＿Ｐ２Ｔプラスミドマップを示す。 ｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＺ－Ｃｖプラスミドマップを示す。 ｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＺ－Ｈｎプラスミドマップを示す。
４．発明の詳細な説明
驚くべきことに、ある種のリン含有化合物、すなわちメチルホスフィン酸およびメチルホスフィン酸のエステルが、酵素触媒作用下で活性化Ｌ－ホモセリンと反応することができ、そうしてＬ－グルホシネートおよびＬ－グルホシネートホスホエステルへの新しい合成経路が開けることが見出された。これが特に驚くべきことなのは、ＤＥＭＰなどの類似化合物が、活性化Ｌ－ホモセリンとの類似反応で反応しなかったからである。
したがって、本発明は、活性化Ｌ－ホモセリンＨＡを、下記の構造（Ｉ）の基質Ｓと反応させて下記の構造（ＩＩＩ）の化合物を産生するステップ（ａ）を含む、Ｌ－グルホシネートまたはそのホスホエステルを産生するための酵素触媒方法に関し、
Figure 2024515041000001
 式中、Ｒ１は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アリールから選択される。
本発明による「Ｌ－グルホシネートまたはそのホスホエステル」と示される化合物は、構造（ＩＩＩ）で表される。構造（ＩＩＩ）において、Ｒ１＝水素の場合、化合物は、Ｌ－ＧＡである。
構造（ＩＩＩ）において、Ｒ１が、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アリールから選択される場合、化合物は、Ｌ－ＧＡのホスホエステルである。
活性化Ｌ－ホモセリンＨＡは、下記の構造（ＩＩ）を有する：
Figure 2024515041000002
 式中、Ｒ２は、１～１５個の炭素原子を有する炭化水素基であり、該炭化水素基は、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨから選択される少なくとも１個の官能基を任意に含む。
ステップ（ａ）における反応は、スルフヒドリラーゼＥ１、シスタチオニンγ－シンターゼＥ２からなる群より選択される少なくとも１つの酵素によって触媒される。
４．１ 基質Ｓ
本発明による基質Ｓは、メチルホスフィン酸およびメチルホスフィン酸のエステルからなる群より選択される。
基質Ｓは、構造（Ｉ）を有する。構造（Ｉ）において、Ｒ１は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アリールから選択され、
好ましくは、水素、アルキルから選択され、
好ましくは、水素、１～６個、好ましくは１～４個の炭素原子を有するアルキルから選択され、
より好ましくは、水素、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチルから選択され、さらにより好ましくは、水素、メチル、エチル、ｎ－ブチルから選択され、さらにより好ましくは、水素、メチル、ｎ－ブチルから選択され、好ましくは、メチル、ｎ－ブチルから選択される。最も好ましくは、Ｒ１は、ｎ－ブチルである。
構造（Ｉ）において、Ｒ１＝水素の場合、化合物は、メチルホスフィン酸である。
構造（Ｉ）において、Ｒ１が、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アリールから選択される場合、化合物は、メチルホスフィン酸のエステルである。
構造（Ｉ）および構造（ＩＩＩ）におけるＲ１は、同じである。
４．２ 活性化Ｌ－ホモセリンＨ Ａ
本発明による反応における他の反応パートナーは、活性化Ｌ－ホモセリンＨＡである。
当業者であれば、活性化Ｌ－ホモセリンＨＡ（例えば、国際公開第２００８／０１３４３２号では「Ｌメチオニン前駆体」とも表記されることがある）を知っており、これは特にＯ－アシルＬ－ホモセリンを意味する。
４．２．１ 活性化Ｌ－ホモセリンＨＡ
活性化Ｌ－ホモセリンは、化学構造（ＩＩ）を以下のとおり有する：
Figure 2024515041000003
 式中、Ｒ２は、１～１５個の炭素原子を有する炭化水素基であり、該炭化水素基は、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨから選択される少なくとも１個の官能基を任意に含む。
より好ましくは、活性化Ｌ－ホモセリンは、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン［構造（ＩＩ－Ａ）］、Ｏ－スクシニル－Ｌ－ホモセリン［構造（ＩＩ－Ｂ）］、Ｏ－プロピオニルＬ－ホモセリン［構造（ＩＩ－Ｃ）］、Ｏ－アセトアセチル－Ｌ－ホモセリン［構造（ＩＩ－Ｄ）］、Ｏ－クマロイル－Ｌ－ホモセリン［構造（ＩＩ－Ｅ）］、Ｏ－マロニルＬ－ホモセリン［構造（ＩＩ－Ｆ）］、Ｏ－ヒドロキシメチルグルタリル－Ｌ－ホモセリン［構造（ＩＩ－Ｇ）］、およびＯ－ピメリル－Ｌ－ホモセリン［構造（ＩＩ－Ｈ）］からなる群より選択される。
さらにより好ましくは、活性化Ｌ－ホモセリンは、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン［構造（ＩＩ－Ａ）］、Ｏ－スクシニル－Ｌ－ホモセリン［構造（ＩＩ－Ｂ）］からなる群より選択される。
最も好ましくは、活性化Ｌ－ホモセリンは、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン［構造（ＩＩ－Ａ）］である。
Figure 2024515041000004
４．２．２ 活性化Ｌ－ホモセリンＨＡの化学合成
本発明の方法において使用される活性化Ｌ－ホモセリンＨＡは、当業者に公知の有機化学合成経路で得ることができる。例えば、Ｏ－スクシニルホモセリンの合成は、M. Flavin, C. Slaughter, Biochemistry 1965, 4, 1370-1375に記載されている。Ｏ－アセチルホモセリンの合成は、S. Nagai, M. Flavin, Methods in Enzymology, Metabolism of Amino Acids and Amines Part B 1971, 17(Part B), 423-424に記載されている。
潜在的前駆体の化学合成については、例えば、M.D. Armstrong, J. Am. Chem. Soc. 1948, 70, 1756- 1759に記載されている。
４．２．３ 活性化Ｌ－ホモセリンＨＡのバイオテクノロジー合成
代替的に、かつ好ましくは、本発明で使用される活性化Ｌ－ホモセリンＨＡは、バイオテクノロジー手段によって得られる。例えば、これは、国際公開第２００８／０１３４３２号、またはH. Kase, K. Nakayama, Agr. BioI. Chem. 1974, 38, 2021-2030に記載されている。
活性化Ｌ－ホモセリンＨＡを産生する菌株は、好ましくは、大腸菌属の種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、エルウィニア属の種（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）、セラチア属の種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、プロビデンシア属の種（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐ．）、コリネバクテリウム属の種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、シュードモナス属の種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、レプトスピラ属の種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、サルモネラ属の種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、ブレビバクテリウム属の種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ヒフォモナス属の種（Ｈｙｐｏｍｏｎｏｎａｓ ｓｐ．）、クロモバクテリウム属の種（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ノカルジア属の種（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ ｓｐ．）、真菌、特に酵母からなる群より選択される。
Ｌ－ホモセリンを得るためのバイオテクノロジープロセスも、当該技術分野、例えば、米国特許第３，５９８，７０１号明細書、米国特許第６，３０３，３４８号明細書、欧州特許出願公開第０９９４１９０号明細書、欧州特許出願公開第１１４９９１１号明細書、国際公開第２００４／０６７７５７号に記載されている。
４．３ 酵素
本発明による方法は、酵素触媒される。
「酵素」という用語は、１つ以上の化学反応または生化学反応を多少なりとも特異的に触媒または促進する、全体または大部分がタンパク質またはポリペプチドから構成される物質を意味する。
本発明の任意の態様に従って使用される酵素のいずれも、単離された酵素であり得る。特に、本発明の任意の態様に従って使用される酵素は、活性状態で、すべての補因子、基質、補助ポリペプチドおよび／または活性化ポリペプチドまたはその活性に必須な因子の存在下で使用され得る。
特に、このことはまた、「シスタチオニンγ－シンターゼ」および「スルフヒドリラーゼ」、特に「Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ」または「Ｏ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ」という用語が、それぞれの酵素を、それらの機能に必要なすべての補因子と組み合わせて含むことを意味する。特に、この補因子は５’－リン酸ピリドキサール一水和物（「ＰＭＰ」）である。
「ポリペプチド」とは、アミノ酸と呼ばれる化学的構成要素が、ペプチド結合と呼ばれる化学結合で一緒につながった鎖のことである。酵素を含むタンパク質またはポリペプチドは、「ネイティブ型」または「野生型」である場合があり、前者は自然界に存在し、後者はネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有することを意味する。これらの用語は互換的に用いられることもある。ポリペプチドはグリコシル化されていてもいなくてもよい。
本発明の任意の態様に従って使用される酵素は、組換え型であってもよい。本明細書で使用される「組換え型」という用語は、分子もしくはこのような分子によってコードされるもの、特に、それ自体が天然には存在しないが遺伝子工学の結果であるポリペプチドもしくは核酸を指すか、または組換え型分子を含む細胞を指す。例えば、核酸分子が組換え型と言われるは、核酸分子が、触媒的に活性なポリペプチドをコードする配列に機能的に連結されたプロモーターを含んでおり、そのプロモーターが、触媒的に活性なポリペプチドが、改変されていない元の核酸分子を含んでいる対応する野生型細胞におけるポリペプチドのレベルに対して過剰発現されるように操作されている場合である。更なる例として、ポリペプチドが組換え型と言われるのは、自然界に存在するポリペプチド配列と同一であるが、自然界に存在する任意のポリペプチド配列とは異なる１つ以上の点突然変異を含むように操作されている場合である。
本明細書で使用される「過剰発現」という用語は、コードまたは発現されたそれぞれのポリペプチドが、例えば、それぞれの野生型細胞において、発現を増加させるために行われた遺伝子修飾がないときに、同一の条件下で細胞内に通常見出されるよりも高いレベルまたは高い活性で発現されることを意味する。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、目的の酵素が、天然に存在する細胞と比較して濃縮されていることを意味する。酵素は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動および／または活性アッセイによって濃縮され得る。例えば、クマシーブルー色素で染色した後、ポリアクリルアミドゲルを目視して判断すると、目的の酵素は、調製物中に存在する全ポリペプチドの５、１０、２０、５０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％超を構成し得る。
４．３．１ 酵素Ｅ１およびＥ２
本発明による方法のステップ（ａ）は、スルフヒドリラーゼＥ１およびシスタチオニンγ－シンターゼＥ２からなる群より選択される少なくとも１つの酵素によって触媒される。
スルフヒドリラーゼは、下記の反応＜１Ａ＞、＜１Ｂ＞のうちの少なくとも１つを触媒する酵素として当業者に知られている：
＜１Ａ＞：Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン＋メタンチオール→Ｌ－メチオニン＋アセテート。
＜１Ｂ＞：Ｏ－スクシニル－Ｌ－ホモセリン＋メタンチオール→Ｌ－メチオニン＋スクシネート。
反応＜１Ｂ＞よりも反応＜１Ａ＞に対する触媒活性が高いスルフヒドリラーゼを、「Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンスルフヒドリラーゼ」と表記することがある。
反応＜１Ａ＞よりも反応＜１Ｂ＞に対する触媒活性が高いスルフヒドリラーゼを、「Ｏ－スクシニル－Ｌ－ホモセリンスルフヒドリラーゼ」と表記することがある。
シスタチオニンγ－シンターゼは、少なくとも下記の反応＜２＞を触媒する酵素として当業者に知られている：
＜２＞：Ｏ－スクシニル－Ｌ－ホモセリン＋Ｌ－システイン→Ｌ－シスタチオニン＋スクシネート。
好ましい実施形態において、本発明による方法のステップ（ａ）は、スルフヒドリラーゼＥ１によって触媒され、このスルフヒドリラーゼは、さらにより好ましくはＯ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼであり、最も好ましくはＯ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼである。
本発明による方法のステップ（ａ）において使用され得るスルフヒドリラーゼまたはシスタチオニンγ－シンターゼは、バシラス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、特に枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；ブラディリゾビウム属の種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、特にダイズ根粒菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）；ブレビバクテリウム属の種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）；コルウェリア属の種（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｓｐ．）、特に好冷性細菌（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ）；コリネバクテリウム属の種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、特にコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、フミン酸還元菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）；クロモバクテリウム属の種（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、特にクロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）；エルウィニア属の種（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）；大腸菌属の種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）；ヒフォモナス属の種（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、特にヒフォモナス・ネプチュニウム（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｎｅｐｔｕｎｉｕｍ）；クレブシエラ属の種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、特にクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；レプトスピラ属の種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、特に病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）；メチロバシラス属の種（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、特にメチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）；メチロコッカス属の種（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、特にメチロコッカス・カプスラタス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）；ニトロソモナス属の種（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、特にニトロソモナス・ユーロピア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ）；ノカルジア属の種（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．）、特にノカルジア・ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ）；プロビデンシア属の種（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐ．）；シュードモナス属の種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、特に緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；ロドバクター属の種（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、特にロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）；サルモネラ属の種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、特にサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）；セラチア属の種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）；シゲラ属の種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、特に細菌性赤痢（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）；真菌、特に酵母、より好ましくはサッカロミセス属の種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、さらにより好ましくは出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から得ることができる。
本発明による方法において使用され得るスルフヒドリラーゼ酵素は、ＥＣクラスＥＣ２．５．１．４９に分類されるＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリンスルフヒドリラーゼまたはＥＣクラスＥＣ２．５．１．－に分類されるＯ－スクシニル－Ｌ－ホモセリンスルフヒドリラーゼであり得る。
これらの酵素は、メチオニン生合成のための直接スルフリル化経路の一部であり、ＰＭＰ依存性である。これらの酵素は、例えば、M. P. Ferla and W. M. Patrick, Microbiology 2014, 160, 1571-1584に記載されている。
国際公開第０２／１８６１３号、国際公開第２００７／０２４９３３号、欧州特許出願公開第２６５７３４５号明細書、欧州特許出願公開第２６５７２５０号明細書、国際公開第２０１５／１６５７４６号および国際公開第２００８／０１３４３２号には、本発明によるＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリンスルフヒドリラーゼおよびＯ－スクシニル－Ｌ－ホモセリンスルフヒドリラーゼ活性を有する酵素の例が開示されている。
本発明による方法に適したＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリンスルフヒドリラーゼは、コリネバクテリウム属の種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、特にコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）またはフミン酸還元菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）；レプトスピラ属の種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、特に病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）；シュードモナス属の種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、特に緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；酵母、特にサッカロミセス属の種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、好ましくは出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来し得る。本発明による方法に適した好ましいＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリンスルフヒドリラーゼは、コリネバクテリウム属の種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、より好ましくはコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）またはフミン酸還元菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、さらにより好ましくはコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、さらにより好ましくはコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２に由来し得る。
本発明による方法に適したＯ－スクシニル－Ｌ－ホモセリンスルフヒドリラーゼは、ブラディリゾビウム属の種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、特にダイズ根粒菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）；クロモバクテリウム属の種（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、特にクロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）；ヒフォモナス属の種（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、特にヒフォモナス・ネプチュニウム（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｎｅｐｔｕｎｉｕｍ）；メチロバシラス属の種（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、特にメチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）；メチロコッカス属の種（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、特にメチロコッカス・カプスラタス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）；ニトロソモナス属の種（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、特にニトロソモナス・ユーロピア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ）；ノカルジア属の種（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．）、特にノカルジア・ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ）；シュードモナス属の種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、特に緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）；ロドバクター属の種（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、特にロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）に由来し得る。
本発明による方法に適した好ましいＯ－スクシニル－Ｌ－ホモセリンスルフヒドリラーゼは、クロモバクテリウム属の種（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、特にクロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）；ヒフォモナス属の種（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、特にヒフォモナス・ネプチュニウム（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｎｅｐｔｕｎｉｕｍ）に由来し得る。さらにより好ましくは、それはクロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）ＡＴＣＣ１２４７２、ヒフォモナス・ネプチュニウム（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｎｅｐｔｕｎｉｕｍ）ＡＴＣＣ１５４４４に由来し得る。
本発明による方法において使用され得るシスタチオニンγ－シンターゼは、ＥＣクラスＥＣ２．５．１．４８に分類されるシスタチオニンγ－シンターゼであり得る。
これらの酵素は、ＰＭＰ依存性であり、例えば、T. Clausen, R. Huber, L. Prade, M.C.Wahl and A. Messerschmidt, The EMBO Journal 1998, 17, 6827-6838に記載されている。
本発明による方法に適したシスタチオニンγ－シンターゼは、大腸菌属の種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）；コリネバクテリウム属の種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、特にコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）；クレブシエラ属の種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、特にクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；バシラス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、特に枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；シゲラ属の種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、特に細菌性赤痢（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）；コルウェリア属の種（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｓｐ．）、特に好冷性細菌（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ）；サルモネラ属の種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、特にサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）に由来し得る。
それぞれの配列は、ブラウンシュヴァイク酵素データベース（Braunschweig Enzyme Database）（ＢＲＥＮＤＡ、ドイツ、www.brenda-enzymes.org/index.phpから入手可能）、アメリカ国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnological Information）（ＮＣＢＩ、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/から入手可能）または京都遺伝子ゲノム百科事典（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）（ＫＥＧＧ、日本、www.https://www.genome.jp/kegg/から入手可能）などのデータベースから得ることができる。
下記の表１は、本発明による方法のステップ（ａ）において使用され得るスルフヒドリラーゼおよびシスタチオニンγ－シンターゼの好ましい例を示す。スルフヒドリラーゼをコードする遺伝子は、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンスルフヒドリラーゼ（「ＡＨＳ」）については「ｍｅｔＹ」、「ｍｅｔ１７」、および「Ｍｅｔ１７」と表示され、Ｏ－スクシニル－Ｌ－ホモセリンスルフヒドリラーゼ（「ＳＨＳ」）については「ｍｅｔＺ」と表示される。シスタチオニンγ－シンターゼ（「ＣＧＳ」）をコードする遺伝子は、「ｍｅｔＢ」および「ｍｅｔＩ」と表示される。
Figure 2024515041000005
本発明の方法の好ましい実施形態において、ステップ（ａ）の反応は、スルフヒドリラーゼＥ１、シスタチオニンγ－シンターゼＥ２からなる群より選択される少なくとも１つの酵素によって触媒され、スルフヒドリラーゼ酵素Ｅ１のポリペプチド配列は、
－ 配列番号２および配列番号２のバリアント、配列番号６および配列番号６のバリアント、配列番号１９および配列番号１９のバリアント、配列番号２２および配列番号２２のバリアント、配列番号２３および配列番号２３のバリアントからなる群より選択されるＯ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ならびに
－ 配列番号１０および配列番号１０のバリアント、配列番号１４および配列番号１４のバリアント、配列番号１８および配列番号１８のバリアント、配列番号２０および配列番号２０のバリアント、配列番号２４および配列番号２４のバリアント、配列番号２５および配列番号２５のバリアント、配列番号２６および配列番号２６のバリアント、配列番号２７および配列番号２７のバリアント、配列番号２８および配列番号２８のバリアント、配列番号３４および配列番号３４のバリアントからなる群より選択されるＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ
からなる群より選択され、
－ シスタチオニンγ－シンターゼＥ２のポリペプチド配列は、配列番号１７およびそのバリアント、配列番号２１およびそのバリアント、配列番号２９およびそのバリアント、配列番号３０およびそのバリアント、配列番号３１およびそのバリアント、配列番号３２およびそのバリアント、配列番号３３およびそのバリアントからなる群より選択される。
本発明の方法のより好ましい実施形態において、ステップ（ａ）の反応は、以下からなる群より選択されるスルフヒドリラーゼＥ１によって触媒される：
配列番号２および配列番号２のバリアント、配列番号６および配列番号６のバリアント、配列番号１９および配列番号１９のバリアント、配列番号２２および配列番号２２のバリアント、配列番号２３および配列番号２３のバリアントからなる群より選択されるＯ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ならびに
配列番号１０および配列番号１０のバリアント、配列番号１４および配列番号１４のバリアント、配列番号１８および配列番号１８のバリアント、配列番号２０および配列番号２０のバリアント、配列番号２４および配列番号２４のバリアント、配列番号２５および配列番号２５のバリアント、配列番号２６および配列番号２６のバリアント、配列番号２７および配列番号２７のバリアント、配列番号２８および配列番号２８のバリアント、配列番号３４および配列番号３４のバリアントからなる群より選択されるＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ。
本発明の方法のさらにより好ましい実施態様において、ステップ（ａ）の反応は、配列番号２および配列番号２のバリアント、配列番号６および配列番号６のバリアントからなる群より選択されるＯ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ならびに配列番号１０および配列番号１０のバリアント、配列番号１４および配列番号１４のバリアントからなる群より選択されるＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼからなる群より選択されるスルフヒドリラーゼＥ１によって触媒される。
本発明の方法のさらにより好ましい実施形態において、ステップ（ａ）の反応は、配列番号２、配列番号６からなる群より選択されるＯ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、および配列番号１０、配列番号１４からなる群より選択されるＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼからなる群より選択されるスルフヒドリラーゼＥ１によって触媒される。
「バリアント」という用語は、下記でさらに説明される（項目４．３．３．１）。本出願の文脈において、「バリアント」は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を意味すると理解される。
４．３．２ 酵素を得るための方法
本発明による方法において使用され得る酵素は、当業者に公知の方法で合成することができる。
一手法は、大腸菌（＝「Ｅ．ｃｏｌｉ」）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの微生物で酵素を発現させ、全細胞を全細胞生体触媒として反応に加えることである。別の手法は、酵素を発現させ、微生物を溶解し、細胞溶解液を加えることである。さらに別の手法は、酵素を溶解液から精製、または部分的に精製し、純粋な酵素もしくは部分的に純粋な酵素を反応に加えることである。反応に複数の酵素が必要な場合、単一の微生物内ですべての酵素を発現させることを含め、酵素を１つまたは複数の微生物で発現させることができる。
例えば、当業者であれば、本発明による酵素を、例えば、独国特許出願公開第１００３１９９９号明細書に記載されているように、細胞におけるこれらの酵素の発現、特に過剰発現（これ以降、「発現、特に過剰発現」を「（過剰）発現」と略記し、「発現、特に過剰発現する」を「（過剰）発現する」と略記する）およびその後の単離によって得ることができる。エピソームプラスミドが、例えば、それぞれの遺伝子の発現を増加させるために使用される。このようなプラスミドにおいて、（過剰）発現される核酸分子、または（過剰）発現されるポリペプチドもしくは酵素をコードする核酸分子は、遺伝子の上流に位置するｌａｃプロモーターなどの強力な誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の結合部位および転写開始点を構成する約４０～５０塩基対からなるＤＮＡ配列であり（M. Patek, J. Holatko, T. Busche, J. Kalinowski, J. Nesvera, Microbial Biotechnology 2013, 6, 103-117）、それによって、制御されるポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現の強さに影響を与えることができる。「機能的連結」は、プロモーターと遺伝子の連続的な配置によって得られ、遺伝子の転写が引き起こされる。
発現を増加させるための適切な強力なプロモーターまたはこのようなプロモーターを作製する方法は、文献から公知である（例えば、S. Lisser & H. Margalit, Nucleic Acid Research 1993, 21, 1507-1516; M. Patek and J. Nesvera in H. Yukawa and M Inui (eds.), Corynebacterium glutamicum, Microbiology Monographs 23, Springer Verlag Berlin Heidelberg 2013, 51-88; B. J. Eikmanns, E. Kleinertz, W. Liebl, H. Sahm, Gene 1991, 102, 93-98）。例えば、ネイティブプロモーターは、これらのプロモーターに機能的に連結された遺伝子の発現を増加させることに関して、既知のコンセンサス配列の方向にプロモーター配列を変更することによって最適化され得る（M. Patek, B. J. Eikmanns, J. Patek, H. Sahm, Microbiology 1996, 142, 1297-1309; M. Patek, J. Holatko, T. Busche, J. Kalinowski, J. Nesvera, Microbial Biotechnology 2013, 6, 103-117）。
酵素活性をコードする遺伝子が、例えばグルコース依存性ｄｅｏプロモーターなどのプロモーターの制御下で連続的に発現される（過剰）発現には、構成的プロモーターも適している。ｔａｃ、ｌａｃ、またはｔｒｐなどの化学的に誘導されたプロモーターも適している。プロモーターを誘導するためのシステムとして最も普及しているのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンである。この場合、ラクトースまたはイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）がインデューサーとして使用される。また、アラビノース（例えば、ｐＢＡＤシステム）またはラムノース（例えば、大腸菌ＫＲＸ）をインデューサーとして用いる系も一般的である。物理的誘導のシステムとしては、例えば、タカラバイオ社製の大腸菌ｃｓｐＡプロモーターもしくはＬａｍｂｄａ ＰＬに基づく温度誘導性コールドショックプロモーターシステム、また浸透圧誘導性プロモーター、例えば、ｏｓｍＢ（例えば国際公開第９５／２５７８５号）である。
適切なプラスミドまたはベクターは、原則として、当業者がこの目的に利用可能なすべての実施形態である。先行技術には、この目的に使用され得る標準プラスミド、例えば、ｐＥＴ－３ａまたはｐＥＴ－２６ｂ（＋）（Novagen社から市販されている）に例示されるベクターのｐＥＴシステムが記載されている。更なるプラスミドおよびベクターは、例えば、Novagen社、Promega社、New England Biolabs社、Clontech社またはGibco BRL社のパンフレットから入手することができる。更なる好ましいプラスミドおよびベクターは、以下に見出すことができる：Glover, D.M. (1985) DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. and Denhardt, D. T (eds) (1988) Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990) Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York。
次いで、増幅される遺伝子を含むプラスミドベクターを、例えば、コンジュゲーションまたは形質転換によって、所望の菌株に変換する。コンジュゲーションの方法は、例えば、A. Schaefer, J. Kalinowski, A. Puehler, Applied and Environmental Microbiology 1994, 60, 756-759に記載されている。形質転換の方法は、例えば、G. Thierbach, A. Schwarzer, A. Puehler, Applied Microbiology and Biotechnology 1988, 29, 356-362, L. K. Dunican & E. Shivnan, Bio/Technology 1989, 7, 1067-1070およびA. Tauch, O. Kirchner, L. Wehmeier, J. Kalinowski, A. Puehler, FEMS Microbiology Letters 1994, 123, 343-347に記載されている。「クロスオーバー」イベントによる相同組換え後、得られた菌株は、当該遺伝子のコピーを少なくとも２つ含んでいる。
所望の酵素は、当業者に公知の方法で、例えば、ボールミル、フレンチプレスまたは超音波破砕機を用いて、所望の活性を含む細胞を破砕し、その後、細胞、細胞破片、および例えばガラスビーズなどの破砕助剤を１３０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離することにより分離することによって単離することができる。得られた無細胞粗抽出物を使用して、酵素アッセイとＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによる産物のその後の検出を行うことができる。代替的に、酵素は、クロマトグラフィー法（例えばニッケル－ニトリロ三酢酸アフィニティークロマトグラフィー、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー）により、当業者に公知の方法で濃縮するか、あるいは均質になるまで精製することができる。
核酸またはポリペプチドが（過剰）発現しているかどうかは、核酸分子の場合には定量的ＰＣＲ反応によって決定し、ポリペプチドの場合にはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動、ウェスタンブロッティングまたは比較活性アッセイによって決定することができる。遺伝子修飾は、選択および／または同定された培養条件下での酵素活性および／または選択性の変化をもたらす転写的、翻訳的および／または翻訳後修飾を対象とすることができる。
４．３．３ 定義
４．３．３．１ 「バリアント」
本発明の文脈において、ポリペプチド配列に関する「バリアント」という用語は、参照配列に対する同一性の程度が少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％のポリペプチドのポリペプチド配列を指す。さらに特定の実施形態において、同一性の程度は、少なくとも９８．０％、より好ましくは少なくとも９８．２％、より好ましくは少なくとも９８．４％、より好ましくは少なくとも９８．６％、より好ましくは少なくとも９８．８％、より好ましくは少なくとも９９．０％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、または少なくともより好ましくは少なくとも９９．９％である。ある種のポリペプチド配列の「バリアント」が、そのポリペプチド配列と同一ではないことは言うまでもない。
このようなバリアントは、特にアミノ酸配列において、欠失、挿入、置換、またはそれらの組み合わせ、ならびにこのような高分子またはそのバリアントを含む融合体を導入することによって調製することができる。
所与のポリペプチドの特性および機能の有意な修飾をもたらさない所与のポリペプチド配列のアミノ酸残基の修飾が当業者に知られている。したがって、例えば、多くのアミノ酸は、多くの場合、問題なく相互に交換できる。このような適切なアミノ酸置換の例は、以下のとおりである：ＡｌａはＳｅｒによって；ＡｒｇはＬｙｓによって；ＡｓｎはＧｌｎまたはＨｉｓによって；ＡｓｐはＧｌｕによって；ＣｙｓはＳｅｒによって；ＧｌｎはＡｓｎによって；ＧｌｕはＡｓｐによって；ＧｌｙはＰｒｏによって；ＨｉｓはＡｓｎまたはＧｌｎによって；ＩｌｅはＬｅｕまたはＶａｌによって；ＬｅｕはＭｅｔまたはＶａｌによって；ＬｙｓはＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕによって；ＭｅｔはＬｅｕまたはＩｌｅによって；ＰｈｅはＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒによって；ＳｅｒはＴｈｒによって；ＴｈｒはＳｅｒによって；ＴｒｐはＴｙｒによって；ＴｙｒはＴｒｐまたはＰｈｅによって；ＶａｌはＩｌｅまたはＬｅｕによって。また、特にポリペプチドのＮ末端またはＣ末端における、例えばアミノ酸の挿入または欠失の形での修飾は、多くの場合、ポリペプチドの機能に重大な影響を及ぼさないことも知られている。
これと一致して、配列番号２、配列番号６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３のうちのいずれかの本発明による好ましいバリアントは、それぞれ、タンパク質の機能、例えば触媒活性、またはタンパク質の折り畳みもしくは構造に必須であるそれぞれの配列のアミノ酸を含むポリペプチド配列を有する。酵素、特にスルフヒドリラーゼまたはシスタチオニンγ－シンターゼの活性が維持されるように、他のアミノ酸が、欠失、置換もしくは挿入によって置き換えられてもよく、または必須アミノ酸が保存的な方法で置き換えられてもよい。
４．３．３．２ 「配列同一性」
当業者は、２つのヌクレオチド間またはアミノ酸配列間の類似性または同一性を計算するために、様々なコンピュータプログラムが利用可能であることを認識している。
同一性を決定するための好ましい方法は、最初に、比較される配列間の最大のアラインメントを生成する。同一性を決定するためのコンピュータプログラムには、以下を含むＧＣＧプログラムパッケージが含まれるが、これらに限定されない：
－ ＧＡＰ［J. Deveroy et al., Nucleic Acid Research 1984, 12, page 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (WI)］、ならびに
－ ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（S. Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990, 215, 403-410）。ＢＬＡＳＴプログラムは、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の情報源から取得することができる（BLAST Handbook, S. Altschul et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; S. Altschul et al., 上記）。
例えば、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、S. B. Needleman and C. D. Wunschにより開発されたアルゴリズム（J. Mol. Biol. 1970, 48, 443-453）（これはＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに統合されている）によって、ＢＬＯＳＵＭ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重み（gap weight）、および１、２、３、４、５もしくは６の長さ重み（length weight）を用いて決定することができる。当業者であれば、異なるパラメータを使用することでわずかに異なる結果がもたらされるが、全体として２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージが大きく異なることはないことを認識するであろう。ＢＬＯＳＵＭ６２行列は、通常、デフォルト設定（ギャップ重み：１２、長さ重み：１）を適用して使用される。
本発明の文脈において、上記のアルゴリズムに従って８０％の配列同一性は８０％の相同性を意味する。同じことが、より高い同一性についても当てはまる。
最も好ましくは、配列間の同一性の程度は、本発明の文脈において、プログラム「Ｎｅｅｄｌｅ」で、置換行列ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ開始ペナルティ１０、およびギャップ伸長ペナルティ０．５を使用して決定される。Ｎｅｅｄｌｅプログラムは、S. B. Needleman and C. D. Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48, 443-453に記載されているグローバルアラインメントアルゴリズムを実装している。本発明に従って使用される置換行列は、ＢＬＯＳＵＭ６２であり、ギャップ開始ペナルティは１０であり、ギャップ伸長ペナルティは０．５である。本発明の文脈において使用される好ましいバージョンは、F. Madeira, Y.M. Park, J. Lee, N. Buso, T. Gur, N. Madhusoodanan, P. Basutkar, A.R.N. Tivey, S.C. Potter, R.D. Finn, Nucleic Acids Research 2019, 47, W636-W641, Web Server issue(２０２１年３月３１日にhttps://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/からオンライン経由でアクセス可能な推奨バージョン)。
特定の実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列と参照ポリペプチド配列とのまたは参照ポリペプチド配列に対する同一性パーセンテージは、ｉ）Ｎｅｅｄｌｅプログラムを使用して、ＢＬＯＳＵＭ６２置換行列、ギャップ開始ペナルティ１０、およびギャップ伸長ペナルティ０．５により、２つアミノ酸配列をアライメントし、ｉｉ）アラインメント内の完全一致の数を数え、ｉｉｉ）完全一致の数を２つのアミノ酸配列のうち最長のものの長さで除算し、ｉｖ）ｉｉｉ）の除算した結果をパーセンテージに変換することによって決定することができる。
４．３．３．３ 「特に活性の高いバリアントを同定するための好ましいアッセイ」
４．３．３．３．１ アッセイＡ
配列番号２、配列番号６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３のうちのいずれかの特に好ましいポリペプチドバリアントは、それぞれ、本発明の文脈において、下記のアッセイ（「アッセイＡ」）において活性を示すものとして当業者に同定され得る。
アッセイＡは、下記のステップにより行われる：
Ａ１）まず、試験されるバリアントの活性を、下記のステップＡ１．１）、Ａ１．２）、Ａ１．３）によって以下のとおり測定する：
Ａ１．１）リン酸緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）、３ｍＭ Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン－ＨＣｌ、１０μＭの５’－リン酸ピリドキサール一水和物、および試験されるポリペプチド１．０ｎｍｏｌを含む反応液９９０μｌを調製し、５０℃に加熱する。
Ａ１．２）Ｐ－メチルホスフィン酸ブチル（ＭＰＢＥ、ＣＡＳ＃６１７２－８０－１）の２００ｍＭ溶液１０μｌを加えて反応を開始する。反応液中のＭＰＢＥの濃度は２ｍＭである。
Ａ１．３）ＭＰＢＥの添加後、５０℃で１２０分間反応させる。次いで、１％ギ酸水溶液１０μｌを加え、氷上で冷却することによって、反応を停止させる。
Ａ２）次いで、下記のステップＡ２．１）、Ａ２．２）、およびＡ２．３）によって以下のとおりブランクテストを行う：
Ａ２．１）リン酸緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）、３ｍＭ Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン－ＨＣｌ、１０μＭの５’－リン酸ピリドキサール一水和物を含む反応液９９０μｌを調製し、５０℃に加熱する。
Ａ２．２）Ｐ－メチルホスフィン酸ブチル（ＭＰＢＥ、ＣＡＳ＃６１７２－８０－１）の２００ｍＭ溶液１０μｌを加えて反応を開始する。
Ａ２．３）ＭＰＢＥの添加後、５０℃で１２０分間反応させる。次いで、１０μｌの１％ギ酸溶液を加え、氷上で冷却することによって、反応を停止させる。
Ａ３）最後に、Ａ１．３）およびＡ２．３）の反応液中で得られたＬ－ＧＡのブチル－ホスホエステル（すなわち、Ｒ１＝ｎ－ブチルの式（ＩＩＩ）による化合物）の量（モル）を、それぞれ、好ましくは項目５．７に記載されるＬＣ－ＭＳ分析によって決定し、比較する。
Ａ４）Ａ１．３）について決定されたＬ－ＧＡのブチル－ホスホエステルの量がＡ２．３）について決定された量より多い場合、試験されるバリアントは、アッセイＡにおいて活性を示す。
Ａ１．３）について決定されたＬ－ＧＡのブチル－ホスホエステルの量が、Ａ２．３）について決定された量と同じかそれより少ない場合、試験されるバリアントは、アッセイＡにおいて活性を示さない。
ステップＡ１．３）およびＡ２．３）における好ましいギ酸溶液は、ギ酸アンモニウムまたはギ酸ナトリウム溶液である。代替的に、ステップＡ１．３）およびＡ２．３）における反応は、メタノール、好ましくはメタノール１ｍｌを加えることによって停止させることもできる。
４．３．３．３．２ アッセイＢ
更なるアッセイ（「アッセイＢ」）において、配列番号２、配列番号６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３のうちのいずれかのポリペプチドバリアントの活性が、それぞれ、ポリペプチドに関して決定され得る。
アッセイＢは、下記のステップにより行われる：
Ｂ１）まず、「標準」ポリペプチド標準の活性（すなわち、配列番号２、配列番号６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３から選択される１つのポリペプチド配列）を、下記のステップＢ１．１）、Ｂ１．２）、およびＢ１．３）によって以下のとおり決定する：
Ｂ１．１）リン酸緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）、３ｍＭ Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン－ＨＣｌ、１０μＭの５’－リン酸ピリドキサール一水和物、および「標準」ポリペプチド１．０ｎｍｏｌを含む反応液９９０μｌを調製し、５０℃に加熱する。
Ｂ１．２）Ｐ－メチルホスフィン酸ブチル（ＭＰＢＥ、ＣＡＳ＃６１７２－８０－１）の２００ｍＭ溶液１０μｌを加えて反応を開始する。反応液中のＭＰＢＥの濃度は２ｍＭである。
Ｂ１．３）ＭＰＢＥ添加後、５０℃で１２０分間反応させる。次いで、１％ギ酸水溶液１０μｌを加え、氷上で冷却することによって、反応を停止させる。
Ｂ２）次いで、下記のステップＢ１．１）、Ｂ１．２）、およびＢ１．３）を、バリアントを用いて繰り返す：
Ｂ２．１）リン酸緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）、３ｍＭ Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン－ＨＣｌ、１０μＭの５’－リン酸ピリドキサール一水和物、試験される「バリアント」ポリペプチド１．０ｎｍｏｌを含む反応液９９０μｌを調製し、５０℃に加熱する。
Ｂ２．２）Ｐ－メチルホスフィン酸ブチル（ＭＰＢＥ、ＣＡＳ＃６１７２－８０－１）の２００ｍＭ溶液１０μｌを加えて反応を開始する。反応液中のＭＰＢＥの濃度は２ｍＭである。
Ｂ２．３）ＭＰＢＥの添加後、５０℃で１２０分間反応させる。次いで、１０μｌの１％ギ酸水溶液を加え、氷上で冷却することによって、反応を停止させる。
Ｂ３）最後に、Ｂ１．３）およびＢ２．３）の反応液中で得られたＬ－ＧＡのブチル－ホスホエステル（すなわち、Ｒ１＝ｎ－ブチルの式（ＩＩＩ）による化合物）の量を、好ましくは項目５．７に記載されるＬＣ－ＭＳ分析によって決定し、比較する。
Ｂ４）次いで、Ｂ２．３）で得られたＬ－ＧＡのブチル－ホスホエステルの量（モル）の比を、Ｂ１．３）で得られたＬ－ＧＡのブチル－ホスホエステルの量（モル）で除算する。次いで、この比に１００を乗じて、「標準」ポリペプチドに対するバリアントポリペプチドの相対活性をパーセントで示す。
ステップＢ１．３）およびＢ２．３）における好ましいギ酸溶液は、ギ酸アンモニウムまたはギ酸ナトリウム溶液である。代替的に、ステップＢ１．３）およびＢ２．３）における反応は、メタノール、好ましくはメタノール１ｍｌを加えることによって停止させることもできる。
４．３．３．４ 「好ましいバリアント」
４．３．３．４．１ 「配列番号２のバリアント」
特に、配列番号２のバリアントは、ポリペプチド配列の配列番号２に対して、≧８０％、より好ましくは≧８５％、より好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９１％、より好ましくは≧９２％、より好ましくは≧９３％、より好ましくは≧９４％、より好ましくは≧９５％、より好ましくは≧９６％、より好ましくは≧９７％、より好ましくは≧９８％、より好ましくは≧９９％、より好ましくは≧９９．９％の配列同一性を有するポリペプチドである。
配列番号２の好ましいバリアントは、項目４．３．３．３．１のアッセイＡにおいて活性を示す。
さらにより好ましくは、配列番号２のそれぞれのバリアントの活性は、項目４．３．３．３．２のアッセイＢにおいて決定される配列番号２の活性に対して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９９％である。
さらにより好ましくは、配列番号２のそれぞれのバリアントの活性は、項目４．３．３．３．２のアッセイＢにおいて決定される配列番号２の活性に対して、１～１０００％の範囲、好ましくは５～５００％の範囲、より好ましくは１０～４００％の範囲、より好ましくは４０～２００％の範囲、より好ましくは５０～１５０％の範囲、より好ましくは６０～１４０％の範囲、より好ましくは７０～１３０％の範囲、より好ましくは８０～１２０％の範囲、より好ましくは９０～１１０％の範囲、より好ましくは１００％の範囲である。
４．３．３．４．２ 「配列番号６のバリアント」
特に、配列番号６のバリアントは、ポリペプチド配列の配列番号６に対して、≧８０％、より好ましくは≧８５％、より好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９１％、より好ましくは≧９２％、より好ましくは≧９３％、より好ましくは≧９４％、より好ましくは≧９５％、より好ましくは≧９６％、より好ましくは≧９７％、より好ましくは≧９８％、より好ましくは≧９９％、より好ましくは≧９９．９％の配列同一性を有するポリペプチドである。
配列番号６の好ましいバリアントは、項目４．３．３．３．１のアッセイＡにおいて活性を示す。
さらにより好ましくは、配列番号６のそれぞれのバリアントの活性は、項目４．３．３．３．２のアッセイＢにおいて決定される配列番号６の活性に対して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９９％である。
さらにより好ましくは、配列番号６の活性は、項目４．３．３．３．２のアッセイＢにおいて決定される配列番号６の活性に対して、１～１０００％の範囲、好ましくは５～５００％の範囲、より好ましくは１０～４００％の範囲、より好ましくは４０～２００％の範囲、より好ましくは５０～１５０％の範囲、より好ましくは６０～１４０％の範囲、より好ましくは７０～１３０％の範囲、より好ましくは８０～１２０％の範囲、より好ましくは９０～１１０％の範囲、より好ましくは１００％の範囲である。
４．３．３．４．３ 「配列番号１０のバリアント」
特に、配列番号１０のバリアントは、ポリペプチド配列の配列番号１０に対して、≧８０％、より好ましくは≧８５％、より好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９１％、より好ましくは≧９２％、より好ましくは≧９３％、より好ましくは≧９４％、より好ましくは≧９５％、より好ましくは≧９６％、より好ましくは≧９７％、より好ましくは≧９８％、より好ましくは≧９９％、より好ましくは≧９９．９％の配列同一性を有するポリペプチドである。
配列番号１０の好ましいバリアントは、項目４．３．３．３．１のアッセイＡにおいて活性を示す。
さらにより好ましくは、配列番号１０のそれぞれのバリアントの活性は、項目４．３．３．３．２のアッセイＢにおいて決定される配列番号１０の活性に対して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９９％である。
さらにより好ましくは、配列番号１０のそれぞれのバリアントの活性は、項目４．３．３．３．２のアッセイＢにおいて決定される配列番号１０の活性に対して、１～１０００％の範囲、好ましくは５～５００％の範囲、より好ましくは１０～４００％の範囲、より好ましくは４０～２００％の範囲、より好ましくは５０～１５０％の範囲、より好ましくは６０～１４０％の範囲、より好ましくは７０～１３０％の範囲、より好ましくは８０～１２０％の範囲、より好ましくは９０～１１０％の範囲、より好ましくは１００％の範囲である。
４．３．３．４．４ 「配列番号１４のバリアント」
特に、配列番号１４のバリアントは、ポリペプチド配列の配列番号１４に対して、≧８０％、より好ましくは≧８５％、より好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９１％、より好ましくは≧９２％、より好ましくは≧９３％、より好ましくは≧９４％、より好ましくは≧９５％、より好ましくは≧９６％、より好ましくは≧９７％、より好ましくは≧９８％、より好ましくは≧９９％、より好ましくは≧９９．９％の配列同一性を有するポリペプチドである。
配列番号１４の好ましいバリアントは、項目４．３．３．３．１のアッセイＡにおいて活性を示す。
さらにより好ましくは、配列番号１４のそれぞれのバリアントの活性は、項目４．３．３．３．２のアッセイＢにおいて決定される配列番号１４の活性に対して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９９％である。
さらにより好ましくは、配列番号１４のそれぞれのバリアントの活性は、項目４．３．３．３．２のアッセイＢにおいて決定される配列番号１４の活性に対して、１～１０００％の範囲、好ましくは５～５００％の範囲、より好ましくは１０～４００％の範囲、より好ましくは４０～２００％の範囲、より好ましくは５０～１５０％の範囲、より好ましくは６０～１４０％の範囲、より好ましくは７０～１３０％の範囲、より好ましくは８０～１２０％の範囲、より好ましくは９０～１１０％の範囲、より好ましくは１００％の範囲である。
４．３．３．４．５ 更なるバリアント
配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３のうちのいずれかの好ましいバリアントは、それぞれ、項目４．３．３．４．１に記載される配列番号２について記載されるように、準用して決定され得る。
配列番号１９の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号１９」という語に置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号２２の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号２２」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号２３の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号２３」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号１８の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号１８」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号２０の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号２０」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号２４の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号２４」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号２５の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号２５」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号２６の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号２６」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号２７の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号２７」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号２８の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号２８」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号３４の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号３４」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号１７の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号１７」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号２１の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号２１」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号２９の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号２９」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号３０の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号３０」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号３１の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号３１」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号３２の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号３２」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
配列番号３３の好ましいバリアントは、項目４．３．３．４．１の記載において、「配列番号２」という語を「配列番号３３」という語で置き換えた場合に生じる手順によって決定され得る。
４．４ 方法条件
本発明による方法のステップａ）における反応は、当業者に公知の条件下で行うことができる。
活性化Ｌ－ホモセリンＨＡを基質Ｓと反応させる反応媒体は、好ましくは水性であり、より好ましくは水性緩衝剤である。
バイオトランスフォーメーションにおいて一般的に使用され、本明細書において有利に使用される例示的な緩衝剤としては、トリス、リン酸塩、またはグッド緩衝剤のいずれか、例えば２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（「ＡＤＡ」）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（「ＰＩＰＥＳ」）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（「ＡＣＥＳ」）、Ｐ－ヒドロキシ－４－モルホリンプロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳＯ」）、塩化クロラミン、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（「ＢＥＳ」）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（「ＴＥＳ」）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）、３－（ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ）－２－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸（「ＤＩＰＳＯ」）、アセトアミドグリシン、３－（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ（２－ヒドロキシプロパン）スルホン酸（「ＴＡＰＳＯ」）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（「ＰＯＰＳＯ」）、４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（「ＨＥＰＰＳＯ」）、３－［４－（２－ヒドロキシエチル）１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸（「ＨＥＰＰＳ」）、トリシン、グリシンアミド、ビシン、または３－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］プロパン－１－スルホン酸（「ＴＡＰＳ」）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、アンモニウムは、緩衝剤として作用し得る。１つ以上の有機溶媒も反応に加えてよい。
好ましくは、本発明による方法のステップａ）は、リン酸緩衝剤中で行われる。
方法のステップａ）における反応媒体のｐＨは、好ましくは２～１０の範囲、より好ましくは５～８の範囲、最も好ましくは７．５である。
本発明による方法は、好ましくは２０℃～７０℃の範囲、より好ましくは３０℃～５５℃の範囲、最も好ましくは５０℃の範囲の温度で行われる。
４．５ Ｌ－グルホシネートホスホエステル
本発明による方法の産生物は、下記の構造（ＩＩＩ）の化合物である：
Figure 2024515041000006
構造（ＩＩＩ）による化合物は、Ｌ－グルホシネート（Ｒ１＝Ｈの場合）またはＬ－グルホシネートホスホエステル（Ｒ１＝アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキルまたはアリールの場合）である。
Ｒ１＝ｎ－ブチルの構造（ＩＩＩ）による化合物は、「Ｌ－ＧＡ－Ｂｕ」または「ＬＧＡ－Ｂｕ」と略記される。
当業者であれば、構造（ＩＩＩ）による化合物中の残基Ｒ１の同一性は、基質構造（Ｉ）中の残基Ｒ１の同一性に依存することを理解する。
Ｒ１が水素である場合、Ｌ－グルホシネートは、本発明による方法において直接的に得られる。
Ｒ１がアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アリール、好ましくはアルキル、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－ブチルから選択される好ましい実施形態において、化合物（ＩＩＩ）は、Ｌ－グルホシネートホスホエステルである。
それらの実施形態において、本発明による方法は、ステップ（ａ）において得られ、Ｒ１がアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アリール、好ましくはアルキル、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－ブチルから選択される構造（ＩＩＩ）の化合物を鹸化してＬ－グルホシネートを得る更なるステップｂ）を含むことがさらに好ましい。
これは当業者に公知の方法で行うことができる。
好ましくは、このような鹸化は、酸性条件下で、より好ましくは、ステップ（ａ）で得られる構造（ＩＩＩ）の化合物を含む反応媒体１容量と６Ｎ ＨＣｌ４容量とを２時間混合し、得られた混合物を５０℃～１５０℃、好ましくは１００℃でインキュベートすることによって行われる。
代替的に、酵素鹸化を行うこともできる。
５．実施例
スルフヒドリラーゼ（ＥＣ２．５．１．－およびＥＣ２．５．１．４９）をコードする異なる起源の遺伝子について、活性化ホモセリン誘導体および構造（Ｉ）に従った異なる基質と反応してグルホシネート誘導体を形成する能力を試験した。
５．１ 例１ 適切な酵素の同定およびプラスミドの構築
５．１．１ 考察したスルフヒドリラーゼ
この例で使用したＯ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼおよびＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼの遺伝子の文献詳細を表２にまとめた。
Figure 2024515041000007
５．１．２ 遺伝子発現プラスミドの調製
５．１．２．１ コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＯ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼｍｅｔＹ
コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２由来のｍｅｔＹ遺伝子は、Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードし、ＮＣＢＩのＮＣ＿００３４５０でアクセス可能なゲノム配列の遺伝子座タグＮＣｇｌ０６２５に記載されている。
酵素の発現を実現するために、発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）（Novagen EMD Millipore社）を使用した。したがって、配列番号３によるｍｅｔＹ＿ＣｇポリヌクレオチドをＧｅｎｅＡｒｔ（ThermoFisher Scientific社（米国ウォルサム在））により合成した。
発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＹ－Ｃｇをアセンブルするために、ベクターｐＥＴ－２６（＋）およびｍｅｔＹ＿Ｃｇポリヌクレオチドを共にＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで処理し、ライゲーションし、ライゲーション混合物を使用して大腸菌を形質転換した。得られたベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＹ－Ｃｇを図１に概略的に示す。
発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＹ－ＣｇのＤＮＡを、形質転換体から単離した。
５．１．２．２ コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＯ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼｍｅｔＹ＿Ｐ２Ｔ
Ｏ－アセチルホモセリンスルフリラーゼバリアントｍｅｔＹ＿Ｐ２Ｔは、配列番号５によるポリヌクレオチドによってコードされ、このポリヌクレオチドは、４位～６位までのヌクレオ塩基がａｃａであることを除いて、配列番号１のポリヌクレオチドと同一である。
配列番号５のポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、２位のアミノ酸プロリンがスレオニンで置換されていることを除いて、配列番号１のポリヌクレオチドと同一である。
酵素バリアントｍｅｔＹ＿Ｐ２Ｔの発現を実現するために、発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）（Novagen EMD Millipore社）を使用した。したがって、配列番号７によるｍｅｔＹ＿Ｐ２ＴポリヌクレオチドをＧｅｎｅＡｒｔ（ThermoFisher Scientific社（米国ウォルサム在））により合成した。
発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＹ＿Ｐ２Ｔをアセンブルするために、ベクターｐＥＴ－２６（＋）およびｍｅｔＹ＿Ｐ２Ｔポリヌクレオチドを共にＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで処理し、ライゲーションし、ライゲーション混合物を使用して大腸菌を形質転換した。得られたベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＹ＿Ｐ２Ｔを図２に概略的に示す。
発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＹ＿Ｐ２ＴのＤＮＡを、形質転換体から単離した。
５．１．２．３ クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）由来のＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼｍｅｔＺ
クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）ＡＴＣＣ１２４７２由来のｍｅｔＺ遺伝子は、Ｏ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードし、ＮＣＢＩのＡＥ０１６８２５でアクセス可能なゲノム配列の遺伝子座タグＣＶ＿２７２５に記載されている。
酵素の発現を実現するために、発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）（Novagen EMD Millipore社）を使用した。したがって、配列番号１１によるｍｅｔＺ＿ＣｖポリヌクレオチドをＧｅｎｅＡｒｔ（ThermoFisher Scientific社（米国ウォルサム在））により合成した。
発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＺ－Ｃｖをアセンブルするために、ベクターｐＥＴ－２６（＋）およびｍｅｔＺ＿Ｃｖポリヌクレオチドを共にＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで処理し、ライゲーションし、ライゲーション混合物を使用して大腸菌を形質転換した。得られたベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＺ－Ｃｖを図３に概略的に示す。
発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＺ－ＣｖのＤＮＡを、形質転換体から単離した。
５．１．２．４ ヒフォモナス・ネプチュニウム（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｎｅｐｔｕｎｉｕｍ）由来のＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼｍｅｔＺ
ヒフォモナス・ネプチュニウム（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｎｅｐｔｕｎｉｕｍ）ＡＴＣＣ１５４４４由来のｍｅｔＺ遺伝子は、Ｏ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードし、ＮＣＢＩのＣＰ０００１５８でアクセス可能なゲノム配列の遺伝子座タグＨＮＥ＿２６７２に見出すことができる。
酵素の発現を実現するために、発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）（Novagen EMD Millipore社）を使用した。したがって、配列番号１５によるｍｅｔＺ＿ＨｎポリヌクレオチドをＧｅｎｅＡｒｔ（ThermoFisher Scientific社（米国ウォルサム在））により合成した。
発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＺ－Ｈｎをアセンブルするために、ベクターｐＥＴ－２６（＋）およびｍｅｔＺ＿Ｈｎポリヌクレオチドを共にＸｂａＩおよびＸｈｏＩで処理し、ライゲーションし、ライゲーション混合物を使用して大腸菌を形質転換した。得られたベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＺ－Ｈｎを図４に概略的に示す。
発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＺ－ＨｎのＤＮＡを、形質転換体から単離した。
５．２ 形質転換およびスフヒドリラーゼの発現
スルフヒドリラーゼ遺伝子を持つこれらのベクターを、各々大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（New England Biolabs社）に形質転換し、その後、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地寒天プレート上で３７℃にて１６時間培養した。ネガティブコントロールとして、ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）を挿入していないＢＬ２１菌株を使用した。
得られた菌株を、それぞれＥｃ ＢＬ２１ ｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＹ－Ｃｇ、Ｅｃ ＢＬ２１ ｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＹ－Ｃｇ＿Ｐ２Ｔ、Ｅｃ ＢＬ２１ ｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＺ－Ｃｖ、Ｅｃ ＢＬ２１ ｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＺ－Ｈｎ、Ｅｃ ＢＬ２１ ｐＥＴ－２６ｂ（＋）と名付けた。
各ケースにおいて、コロニーを選択し、これを５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地１０ｍｌに接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで６時間培養した。その後、ＬＢ培地５０μｌを５０ｍｇ／ｌカナマイシンで処理し、増殖細胞培養物５０μｌを接種し、２８℃、２５０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。この細胞培養物を、５０μｇ／ｌのカナマイシンを含有する新鮮なＬＢ培地２００ｍｌでＯＤが０．１５になるまで２ｌフラスコ中で希釈し、ＯＤが０．５に達するまで同一条件下でさらに培養した（約４時間）。次いで、３００ｍＭ ＩＰＴＧストック溶液（最終濃度３００μＭのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、Sigma-Aldrich社、ドイツ）２００μｌを加えることによって、遺伝子発現誘導の開始点に影響を与えた。誘導は２８℃、２５０ｒｐｍで４時間行った。次いで、培養物を採取し（８ｍｌ、ＯＤ＝１に標準化）、遠心分離（２０分、４０００ｒｐｍ、４℃）で上清を除去し、ペレット化した細胞を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７．５）８００μｌで２回洗浄し、緩衝剤１ｍｌに取り込んだ。機械的細胞消化をＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０機器（QBiogene社，ハイデルベルク在）で行って、ガラスビーズ（直径０．２～０．３ｍｍ）３００ｍｇを入れた消化容器中で細胞を６．５ｍ／ｓで３０秒間４回振盪した。次いで、未消化の細胞および細胞破片を除去するため、粗抽出物を１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を酵素アッセイに使用した。上清中のポリペプチドの濃度は、ＳＤＳページおよびソフトウェアＧｅｌＱｕａｎｔ（登録商標）（BiochemLabSolutions社）を介した各バンドの分析によって決定した。
５．３ 本発明による例Ｉ１～Ｉ４
それぞれのポリペプチドが、それぞれのリン含有基質と活性化Ｌ－ホモセリンとの反応を触媒するかどうかを決定するために、下記のアッセイを行った。活性化Ｌ－ホモセリン基質としてＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリンを使用した。
８８０μｌのリン酸緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）に、Ｏ－アセチルホモセリン－ＨＣｌの３０ｍＭ水溶液１００μｌ、５’－リン酸ピリドキサール一水和物（１ｍＭ）の１ｍＭ水溶液１０μｌ、Ｐ－メチルホスフィン酸ブチル（ＣＡＳ番号６１７２－８０－１；「ＭＰＢＥ」）の２００ｍＭ水溶液１０μｌを加えた。反応は５０℃で１２０分間行った。次いで、１００μｌのバッチ溶液を１００μｌのメタノールで希釈し、ＬＣ－ＭＳ ＱＱＱ（項目５．７）に適用してＬＧＡ－Ｂｕを分析した。
５．４ 本発明による例Ｉ５
ｐＥＴ－２６ｂ（＋）＿ｍｅｔＹ－Ｃｇ＿Ｐ２Ｔから単離したポリペプチドの触媒作用を、Ｐ－メチルホスフィン酸メチル（「ＭＰＭＥ」；ＣＡＳ番号１６３９１－０６－３）との反応でさらに試験した。
１ｎｍｏｌのこのポリペプチドを含有する８８０μｌのリン酸緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）に、Ｏ－アセチルホモセリン－ＨＣｌの３０ｍＭ水溶液１００μｌ、５’－リン酸ピリドキサール一水和物（１ｍＭ）の１ｍＭ水溶液１０μｌ、ＭＰＭＥの２００ｍＭ水溶液１０μｌを加えた。反応は５０℃で１２０分間行った。次いで、１００μｌのバッチ溶液を１００μｌのメタノールで希釈し、ＬＣ－ＭＳ ＱＱＱ（項目５．７）に適用してＬＧＡ－Ｂｕを分析した。
５．４ 比較例Ｃ１～Ｃ４
他のリン化合物が上記反応の基質として機能するかどうかをさらに調査した。ジエチルメチルホスホナイト（「ＤＥＭＰ」；ＣＡＳ番号１５７１５－４１－０）をこの目的で試験した。
試験されるポリペプチド１ｎｍｏｌを含有するリン酸緩衝剤８８０μｌ（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）に、Ｏ－アセチルホモセリン－ＨＣｌの３０ｍＭ水溶液１００μｌ、５’－リン酸ピリドキサール一水和物（１ｍＭ）の１ｍＭ水溶液１０μｌ、ＤＥＭＰの２００ｍＭ水溶液１０μｌを加えた。反応は５０℃で１２０分間行った。次いで、バッチ溶液１００μｌを１００μｌのメタノールで希釈し、ＬＣ－ＭＳ ＱＱＱ（項目５．７）に適用してＬＧＡ－Ｂｕを分析した。
５．５ 比較例Ｃ５～Ｃ８
さらに、上記反応＜１Ａ＞に従って、それぞれのポリペプチドがＯ－アセチルホモセリンとメチルメルカプタン（「ＭＭ」；ＣＡＳ番号７４－９３－１）との野生型反応を触媒するかどうかを調べた。
試験されるポリペプチド１ｎｍｏｌを含有するリン酸緩衝剤８８０μｌ（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）に、Ｏ－アセチルホモセリン－ＨＣｌの３０ｍＭ水溶液１００μｌ、５’－リン酸ピリドキサール一水和物（１ｍＭ）の１ｍＭ水溶液１０μｌ、ＭＭの２００ｍＭ水溶液１０μｌを加えた。反応は５０℃で１２０分間行った。その後、バッチ溶液１００μｌを１００μｌのメタノールで希釈し、ＬＣ－ＭＳ ＱＱＱ（項目５．７）に適用してそれぞれの産生物を分析した。
本発明による例Ｉ１～Ｉ４の場合、産生物は、構造（ＩＩＩ）による化合物であり、Ｒ１＝ｎ－ブチル（「ＬＧＡ－Ｂｕ」）である。
本発明による例Ｉ５の場合、産生物は、構造（ＩＩＩ）による化合物であり、Ｒ１＝メチルである。
比較例Ｃ１～Ｃ４の場合、産生物は、構造（ＩＩＩ）による化合物であり、Ｒ１＝エチル（「ＬＧＡ－Ｅｔ」）である。
比較例Ｃ５～Ｃ６の場合、産生物はメチオニンである。
結果を下記の表３にまとめる。使用した略号は、以下のとおりである：
「ＤＥＭＰ」＝メチルジエトキシホスフィン（ＣＡＳ番号１５７１５－４１－０）；
「ＭＰＢＥ」＝Ｐ－メチルホスフィン酸ブチル（ＣＡＳ番号６１７２－８０－１）；
「ＭＰＭＥ」＝Ｐ－メチルホスフィン酸メチル（ＣＡＳ番号１６３９１－０６－３）；
「ＭＭ」＝メチルメルカプタン（ＣＡＳ－Ｎｏ：７４－９３－１）。
Figure 2024515041000008
５．６ 結果
表３にまとめた結果は、驚くべきことに、試験したポリペプチドが、ＭＰＢＥおよびＭＰＭＥなどの他の基質であるメチルホスフィン酸化合物を受け入れ、活性化Ｌ－ホモセリンとの反応を触媒して、ＬＧＡのそれぞれのｎ－ブチルまたはメチルリン酸エステルを産生することを示している。
この知見がさらに驚くべきものだったのは、ＤＥＭＰなどの他のリン酸化合物は基質として機能しないため、当業者はこれらの酵素がこれらの反応を触媒するとは予想しなかったからである。
この知見は、ＬＧＡおよびその誘導体に対する新しい酵素経路を開くものである。
５．７ 分析方法
実験の分析測定はすべて、ＬＣ－ＭＳ ＱＱＱシステムでスキャンして行った。サンプルはメタノールで希釈した（ｖ：ｖ＝１：２）。
適用したＨＰＬＣは、Agilent社の１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙシリーズで、エレクトロスプレーイオン化質量分析計６４２０トリプル四重極に接続されている。ピークの同定は、ポジティブ検出モードで保持時間および分子量によって行った。
データの評価は、ピーク面積およびゼロを含まない二次キャリブレーションによって行った。
取得方法の詳細
イオン源 ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）
時間パラメータ
質量範囲 ｍ／ｚ＝５０～３００
スキャン／秒 ４００
フラグメンテーション ４０Ｖ
極性 ポジティブ（スキャンモード）
ソースパラメータ
ガス温度 ３５０℃
ガス流量 １２ｌ／分
ネブライザー ５０ｐｓｉ
キャピラリー ４０００Ｖ
バイナリポンプ
注入量 ２．００μＬ
流量 ０．６０ ｍＬ／分
溶媒組成
溶媒Ａ １００ｍＭの酢酸アンモニウム＋Ｈ２Ｏ中０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸
溶媒Ｂ アセトニトリル中０．１％ギ酸
グラジエントは表４を参照
Figure 2024515041000009
カラム
タイプ Ｌｕｎａ ＨＩＬＩＣ；１００ｘ２ｍｍ；３μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ００Ｄ－４４４９－ＢＯ
温度 ３０．０℃
６．配列の概要
下記の表は、本出願の文脈で言及されたＤＮＡおよびタンパク質配列の概要を提供する：
使用した略号は、以下のとおりである：「ＡＨＳ」＝Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ；「ＳＨＳ」＝Ｏ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ；「ＣＧＳ」＝シスタチオニンγ－シンターゼ。
Figure 2024515041000010
Figure 2024515041000011
Figure 2024515041000012

Claims (11)

  1. Ｌ－グルホシネートまたはそのホスホエステルを産生するための酵素触媒方法であって、
    活性化Ｌ－ホモセリンＨＡを下記構造（Ｉ）の基質Ｓと反応させて下記構造（ＩＩＩ）の化合物を産生するステップ（ａ）を含み、
    Figure 2024515041000013
     式中、Ｒ１は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アリールから選択され、
    前記活性化Ｌ－ホモセリンＨＡは、下記の構造（ＩＩ）を有し、
    Figure 2024515041000014
     式中、Ｒ２は、１～１５個の炭素原子を有する炭化水素基であり、前記炭化水素基は、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨから選択される少なくとも１つの官能基を任意に含み、
    ステップ（ａ）における前記反応が、スルフヒドリラーゼＥ１、シスタチオニンγ－シンターゼＥ２からなる群より選択される少なくとも１つの酵素によって触媒される、
    酵素触媒方法。
  2. 前記活性化Ｌ－ホモセリンＨＡが、Ｏ－スクシニル－Ｌ－ホモセリン、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンから選択される、請求項１記載の方法。
  3. 前記活性化Ｌ－ホモセリンＨＡが、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンである、請求項２記載の方法。
  4. Ｒ１が、水素、アルキルから選択される、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
  5. アルキル基が、メチル、エチル、ｎ－ブチルから選択される、請求項４記載の方法。
  6. Ｒ１が、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アリールから選択され、ステップ（ａ）において得られる前記構造（ＩＩＩ）の前記化合物を鹸化してＬ－グルホシネートを得るステップ（ｂ）をさらに含む、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
  7. ステップ（ａ）における前記反応が、スルフヒドリラーゼＥ１によって触媒される、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
  8. 前記スルフヒドリラーゼＥ１が、Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼである、請求項７記載の方法。
  9. 前記スルフヒドリラーゼ酵素Ｅ１のポリペプチド配列が、
    配列番号２および配列番号２のバリアント、配列番号６および配列番号６のバリアント、配列番号１９および配列番号１９のバリアント、配列番号２２および配列番号２２のバリアント、配列番号２３および配列番号２３のバリアント、
    配列番号１０および配列番号１０のバリアント、配列番号１４および配列番号１４のバリアント、配列番号１８および配列番号１８のバリアント、配列番号２０および配列番号２０のバリアント、配列番号２４および配列番号２４のバリアント、配列番号２５および配列番号２５のバリアント、配列番号２６および配列番号２６のバリアント、配列番号２７および配列番号２７のバリアント、配列番号２８および配列番号２８のバリアント、配列番号３４および配列番号３４のバリアント
    からなる群より選択され、
    前記シスタチオニンγ－シンターゼＥ２のポリペプチド配列が、配列番号１７および配列番号１７のバリアント、配列番号２１および配列番号２１のバリアント、配列番号２９および配列番号２９のバリアント、配列番号３０および配列番号３０のバリアント、配列番号３１および配列番号３１のバリアント、配列番号３２および配列番号３２のバリアント、配列番号３３および配列番号３３のバリアントからなる群より選択され、バリアントは、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
  10. 前記活性化Ｌ－ホモセリンＨＡが、活性化Ｌ－ホモセリンＨＡを産生する菌株の発酵によって調製される、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
  11. 前記活性化Ｌ－ホモセリンＨＡを産生する菌株が、大腸菌属の種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、エルウィニア属の種（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）、セラチア属の種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、プロビデンシア属の種（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐ．）、コリネバクテリウム属の種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、シュードモナス属の種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、レプトスピラ属の種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、サルモネラ属の種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、ブレビバクテリウム属の種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ヒフォモナス属の種（Ｈｙｐｏｍｏｎｏｎａｓ ｓｐ．）、クロモバクテリウム属の種（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ノカルジア属の種（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ ｓｐ．）、真菌からなる群より選択される、請求項１０記載の方法。
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