CN117119892A - 用于生产l-草铵膦及其磷酸酯的酶方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶催化生产L‑草铵膦或其磷酸酯的方法。该方法包括其中活化的L‑高丝氨酸HA与选自甲基次膦酸和甲基次膦酸酯的底物S反应的步骤。本发明使得在L‑草铵膦及其磷酸酯的酶催化方法制备中可获得新的底物。
Description
本发明涉及一种用于生产L-草铵膦(“L-GA”或“LGA”)或其磷酸酯的酶催化方法。该方法包括其中活化的L-高丝氨酸HA与选自甲基次膦酸和甲基次膦酸酯的底物S反应的步骤。本发明使得在L-草铵膦及其磷酸酯的酶促生产中可获得新的底物。
1.背景技术
有机磷化合物，即包含碳-磷键的化学试剂，广泛用作植物保护领域的除草剂。除草剂草甘膦和草铵膦/>以及生长调节剂草甘膦用于此目的(如G./>Rev.Environ.Contam.Toxicol.1994,138,73-145中所描述的)。
对甲基次膦酸酯(例如，对甲基次膦酸丁酯；“MPBE”；CAS号:6172-80-1)在非选择性除草剂草铵膦的合成中作为合成砌块具有关键作用。这些酯可通过两种基本合成途径获得(总结于K.Haack,Chem.Unserer Zeit 2003,37,128-138的文章第130页的图3a和3b)：
a.二乙基亚磷酰氯[ClP(OC2H5)2]与CH3MgCl反应得到甲基二乙氧基膦[H3CP(OC2H5)2；“DEMP”；CAS号.15715-41-0]，其被部分水解得到相应的甲基膦酸乙酯(MPEE；CAS号:16391-07-4)。
b.或者，甲烷可以在500℃与三氯化磷反应生成甲基二氯膦H3CPCl2。后者可以在醇中溶剂化，得到相应的甲基膦酸酯。
对甲基次膦酸酯选择性地加成碳-碳双键。该性质用于草铵膦的合成，以形成第二磷碳键。例如，H3CPH(O)OR(R＝烷基)在加成反应中与1-氰基烯丙基乙酸酯反应以提供中间体。随后乙酸亚组分与氨的交换以及亚膦酸部分的氰基和酯基的水解得到草铵膦。
丙烯酸酯是一种更便宜的替代原料。它能与对甲基膦酸酯反应生成3-[烷氧基(甲基)膦基]丙酸烷基酯。该二酯与草酸二乙酯的Claisen反应、水解和脱羧产生相应的α-酮酸，该α-酮酸可被还原胺化生成草铵膦。
在本领域中，例如在WO 1999/009039 A1，EP 0 508 296 A1中也描述了这些和其他合成L-草铵膦的路线。
WO 2020/145513 A1和WO 2020/145514 A1描述了生成L-草铵膦的化学路线。在该路线中，高丝氨酸衍生物如O-乙酰基高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸被用作起始原料，并且通过包括内酯化和卤化在内的一系列反应获得L-草铵膦。
WO 2020/145627 A1描述了类似的路线，其中，在卤化过程中获得了溴衍生物。
CN 106083922 A公开的路线是相似的，但是从L-蛋氨酸开始。
EP 2402453 A2描述了一种通过将甲硫醇和二甲基硫醚的混合物与O-乙酰基高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸酶促反应来生产甲硫氨酸的酶促方法。
CN 108516991 A描述了另一种合成L-草铵膦的途径，从L-高丝氨酸的共沸脱水得到L-3,6-双(2-卤乙基)-2,5-二酮哌嗪开始，随后引入甲基亚膦酸二酯基团并水解。
草铵膦的所有合成路线的一般缺点是获得的草铵膦是外消旋混合物。然而，由于D-对映体没有除草活性，L-草铵膦是具有经济价值的对映体。
对于L-草铵膦的对映选择性合成，本领域描述了酶促途径。
WO 2017/151573 A1公开了由D-草铵膦两步酶促合成L-草铵膦的方法。在第一步中，D-草铵膦被氧化脱氨基以得到2-氧代-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(“PPO”)，随后PPO被特异性胺化为L-草铵膦作为第二步。第一步由D-氨基酸氧化酶催化，第二步由转氨酶催化。
WO 2020/051188 A1公开了将外消旋草铵膦转化为L-草铵膦对映异构体的类似方法。此外，其还公开了其中在PPO与胺供体胺化过程中形成的α-酮酸或酮副产物被酮戊二酸脱羧酶转化，以进一步将平衡转移到L-草铵膦的步骤。
WO 2019/018406 A1公开了从包含L-草铵膦和谷氨酸盐的混合物中纯化L-草铵膦的方法。谷氨酸盐通过谷氨酰肽基环转移酶酶促转化为焦谷氨酸盐，然后通过离子交换从所得混合物中纯化L-草铵膦。
本发明的目的是提供另一种用于以高对映体过量生产L-草铵膦的酶促过程。特别是，这种方法应该允许使用迄今为止未用于L-草铵膦酶促合成的新底物。
2.发明简述
本发明通过提供一种从先前未用于酶促生产L-草铵膦的底物生产L-草铵膦的方法来解决上述问题。特别地，本发明提供了一种使用酶催化途径从甲基膦酸及其酯生产L-草铵膦或L-草铵膦的磷酸酯的方法。因此，这些磷化合物在L-草铵膦的生产中用作替代底物，其允许生产的灵活性，所述生产不依赖于目前用于L-草铵膦生产的已知底物。
特别地，该目的通过本发明实现，本发明涉及一种用于生产L-草铵膦或其磷酸酯的酶催化方法，包括步骤(a)，其中活化的L-高丝氨酸HA与底物S反应以生产这些化合物。
3.附图说明
图1示出了pET-26b(+)_metY-Cg质粒图谱。
图2示出了pET-26b(+)_metY_P2T质粒图谱。
图3示出了pET-26b(+)_metZ-Cv质粒图谱。
图4示出了pET-26b(+)_metZ-Hn质粒图谱。
4.发明详述
令人惊讶地发现，某些含磷化合物，即甲基膦酸和甲基膦酸酯，可以在酶催化下与活化的L-高丝氨酸反应，从而开辟了合成L-草铵膦和L-草铵膦磷酯的新途径。这尤其令人惊讶，因为类似的化合物如DEMP没有与活化的L-高丝氨酸发生类似的反应。
因此，本发明涉及一种用于生产L-草铵膦或其磷酸酯的酶催化方法，包括步骤(a)，其中活化的L-高丝氨酸HA与以下结构(I)的底物S反应以产生以下结构(III)的化合物，
其中R1选自氢、烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基。
根据本发明表示为“L-草铵膦或其磷酸酯”的化合物由结构(III)表示。当结构(III)中的R1＝氢时，该化合物为L-GA。
当结构(III)中的R1选自烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基时，该化合物是L-GA的磷酸酯。
活化的L-高丝氨酸HA具有以下结构(II)：
其中R2是具有1至15个碳原子的烃基基团，其任选地包括选自OH、COOH、NH的至少一个官能基团。
步骤(a)中的反应由选自硫化氢解酶E1、胱硫醚γ-合酶E2的至少一种酶催化。
4.1底物S
根据本发明的底物S选自甲基次膦酸和甲基次膦酸酯。
底物S具有结构(I)。在结构(I)中，R1选自氢、烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基，
优选选自氢、烷基，
优选选自氢、具有1至6个、优选1至4个碳原子的烷基，
更优选选自氢、甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基，甚至更优选选自氢、甲基、乙基、正丁基，甚至更优选选自氢、甲基、正丁基，优选选自甲基、正丁基。最优选地，R1是正丁基。
当结构(I)中的R1＝氢时，该化合物是甲基次膦酸。
当结构(I)中的R1选自烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基时，该化合物是甲基膦酸的酯。
结构(I)和结构(III)中的R1是相同的。
4.2活化的L-高丝氨酸HA
根据本发明的反应中的另一反应物(reaction partner)是活化的L-高丝氨酸HA。
本技术人员知道活化的L-高丝氨酸HA(有时也表示为“L-蛋氨酸前体”，例如在WO2008/013432A1中)，其特别指O-酰基L-高丝氨酸。
4.2.1活化的L-高丝氨酸HA
活化的L-高丝氨酸具有如下化学结构(II)：
其中R2是具有1至15个碳原子的烃基基团，其任选地包括选自OH、COOH、NH的至少一个官能基团。
更优选地，活化的L-高丝氨酸选自O-乙酰基-L-高丝氨酸[结构(II-A)]、O-琥珀酰-L-高丝氨酸[结构(II-B)]、O-丙酰-L-高丝氨酸[结构(II-C)]、O-乙酰乙酰基-L-高丝氨酸[结构(II-D)]、O-香豆酰-L-高丝氨酸[结构(II-E)]、O-丙二酰-L-高丝氨酸[结构(II-F)]、O-羟甲基戊二酰-L-高丝氨酸[结构(II-G)]和O-戊二酰-L-高丝氨酸[结构(II-H)]。
甚至更优选地，活化的L-高丝氨酸选自O-乙酰基-L-高丝氨酸[结构(II-A)]、O-琥珀酰-L-高丝氨酸[结构(II-B)]。
最优选地，活化的L-高丝氨酸是O-乙酰基-L-高丝氨酸[结构(II-A)]。
4.2.2活化的L-高丝氨酸HA的化学合成
本发明方法中使用的活化的L-高丝氨酸HA可以通过技术人员已知的有机化学合成路线获得。例如，M.Flavin,C.Slaughter,Biochemistry 1965,4,1370-1375中描述了O-琥珀酰高丝氨酸的合成。S.Nagai,M.Flavin,Methods in Enzymology,Metabolism ofAmino Acids and Amines Part B 1971,17(Part B),423-424中描述了O-乙酰基-高丝氨酸的合成。
潜在前体的化学合成例如描述于M.D.Armstrong,J.Am.Chem.Soc.1948,70,1756-1759。
4.2.3活化的L-高丝氨酸HA的生物技术合成
可选地，优选地，本发明中使用的活化的L-高丝氨酸HA通过生物技术手段获得。例如，在WO 2008/013432 A1中或由H.Kase,K.Nakayama,Agr.BioI.Chem.1974,38,2021-2030中所描述的。
产生活化的L-高丝氨酸HA的菌株优选选自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、钩端螺旋体属(Leptospira sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、Hypomononas sp.、色杆菌属(Chromobacterium sp.)、诺卡氏菌属(Norcardia sp.)、真菌，特别是酵母。
获得L-高丝氨酸的生物技术方法也在本领域，例如在US 3,598,701、US 6,303,348B1、EP 0 994 190 A2、EP 1 149 911 A2、WO 2004/067757 A1中所描述。
4.3酶
根据本发明的方法是酶催化的。
术语“酶”是指全部或大部分由蛋白质或多肽组成的任何物质，它们或多或少地催化或促进一种或多种化学或生物化学反应。
根据本发明任何方面使用的任何酶都可以是分离的酶。特别地，根据本发明任何方面使用的酶可以在活性状态下使用，并且存在所有辅酶因子、底物、辅助和/或活化多肽或其活性所必需的因子。
特别地，这也意味着术语“胱硫醚γ-合酶”和“硫化氢解酶”，特别是“O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶”或“O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶”包含各自的酶及其功能所需的所有辅酶因子。特别地，该辅酶因子是5’-磷酸吡哆醛一水合物(“PMP”)。
“多肽”是一系列被称为氨基酸的化学构件，它们通过被称为肽键的化学键连接在一起。蛋白质或多肽，包括酶，可以是“天然的”或“野生型的”，这意味着它分别存在于自然界或具有天然蛋白质的氨基酸序列。这些术语有时可以互换使用。多肽可以糖基化，也可以不糖基化。
根据本发明任何方面使用的酶可以是重组的。本文使用的术语“重组的”是指分子或由这种分子编码的分子，特别是多肽或核酸，其本身不是天然存在的，而是基因工程的结果，或指包含重组分子的细胞。例如，如果核酸分子包含与编码催化活性多肽的序列功能连接的启动子，并且该启动子已经被工程化，使得催化活性多肽相对于包含原始未改变核酸分子的相应野生型细胞中的多肽水平过表达，则该核酸分子是重组的。作为另一个实例，如果多肽与自然界中出现的多肽序列相同，但已经被改造成包含一个或多个点突变，以区别于自然界中出现的任何多肽序列，则多肽是重组的。
本文使用的术语“过表达”是指编码或表达的相应多肽的表达水平或活性高于在相同条件下，在没有进行遗传修饰以增加表达的情况下，例如在相应野生型细胞中通常在细胞中发现的水平或活性。
本文所用术语“分离的”是指感兴趣的酶与它天然存在的细胞相比是富集的。可以通过SDS聚丙烯酰胺电泳和/或活性测定来富集该酶。例如，通过在用考马斯蓝染料染色后目视检查聚丙烯酰胺凝胶来判断，感兴趣的酶可以构成制剂中存在的所有多肽的5、10、20、50、75、80、85、90、95或99％以上。
4.3.1酶E1和E2
根据本发明的方法的步骤(a)由选自硫化氢解酶E1和胱硫醚γ-合酶E2的至少一种酶催化。
本技术人员已知硫化氢解酶是催化以下反应<1A>、<1B>中的至少一种的酶：
<1A>：O-乙酰基-L-高丝氨酸+甲硫醇→L-甲硫氨酸+乙酸。
<1B>：O-琥珀酰-L-高丝氨酸+甲硫醇→L-甲硫氨酸+琥珀酸。
对于反应<1A>比反应<1B>具有更高催化活性的硫化氢解酶可以被称为“O-乙酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶”。
对反应<1B>具有比反应<1A>更高催化活性的硫化氢解酶可以称为“O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶”。
本技术人员已知胱硫醚γ-合酶是催化至少以下反应<2>的酶：
<2>：O-琥珀酰-L-高丝氨酸+L-半胱氨酸→L-胱硫醚+琥珀酸
在优选的实施方案中，根据本发明的方法的步骤(a)由硫化氢解酶E1催化，该硫化氢解酶甚至更优选为O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，最优选为O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
可用于本发明方法的步骤(a)中的硫化氢解酶或胱硫醚γ-合酶可源自芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)，特别是慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)；短杆菌属；科尔韦氏菌属(Colwellia sp.)，特别是冷红科尔韦尔氏菌(Colwellia psychrerythraea)；棒状杆菌属，特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、萜拟棒状杆菌(Corynebacteriumhumireducens)；色杆菌属，特别是紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)；欧文氏菌属；埃希氏菌属，特别是大肠杆菌；生丝单胞菌属(Hyphomonas sp.)，特别是裙带菌丝单胞菌(Hyphomonas neptunium)；克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)，特别是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)；钩端螺旋体属(Leptospira sp.)，特别是问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)；甲基菌属(Methylobacillus sp.)，特别是Methylobacillusflagellates；甲基球菌属(Methylococcus sp.)，特别是荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)；亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas sp.)，特别是欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)；诺卡氏菌属(Nocardia sp.)，特别是鼻疽诺卡菌(Nocardiafarcinica)；普罗维登斯菌属；假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，特别是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；红细菌属(Rhodobacter sp.)，特别是类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)；沙门氏菌属(Salmonellasp.)，特别是肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)；沙雷氏菌属(Serratia sp.)；志贺氏菌属(Shigella sp.)，特别是福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)；真菌，优选酵母，更优选酵母属(Saccharomycessp.)，甚至更优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
可用于根据本发明的方法中的硫化氢解酶可以是分类在EC类EC 2.5.1.49中的O-乙酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶或分类在EC类EC 2.5.1-中的O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶。
这些酶是甲硫氨酸生物合成的直接硫酰化途径的一部分，并且是PMP依赖性的。它们例如由M.P.Ferla and W.M.Patrick,Microbiology 2014,160,1571-1584中所描述的。
WO 02/18613A1、WO 2007/024933 A2、EP 2 657 345 A1、EP 2 657 250 A2、WO2015/165746A1和WO 2008/013432 A1公开了根据本发明具有O-乙酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶和O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶的实例。
适用于根据本发明的方法的O-乙酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶可以源自棒状杆菌，特别是谷氨酸棒状杆菌或萜拟棒状杆菌；钩端螺旋体属，特别是问号钩端螺旋体；假单胞菌属，特别是铜绿假单胞菌；酵母，特别是酵母属，优选酿酒酵母。适用于根据本发明的方法的优选的O-乙酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶可以源自棒状杆菌属。更优选谷氨酸棒状杆菌或萜拟棒状杆菌，甚至更优选谷氨酸棒状杆菌，甚至更优选谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。
适用于根据本发明的方法的O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶可以源自慢生根瘤菌属，特别是慢生型大豆根瘤菌；色杆菌属，特别是紫色色杆菌；生丝单胞菌属，特别是裙带菌丝单胞菌；甲基菌属，特别是Methylobacillus flagellates；甲基球菌属，特别是荚膜甲基球菌；亚硝化单胞菌属，特别是欧洲亚硝化单胞菌；诺卡氏菌属，鼻疽诺卡菌；假单胞菌属，特别是铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；红细菌属，特别是类球红细菌。
适用于根据本发明的方法的优选的O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶可以源自色杆菌属，特别是紫色色杆菌；生丝单胞菌属，特别是裙带菌丝单胞菌。甚至更优选地，它可以源自紫色色杆菌ATCC 12472、裙带菌丝单胞菌ATCC 15444。
可用于根据本发明的方法中的胱硫醚γ-合酶可以是分类在EC类EC 2.5.1.48中的胱硫醚γ-合酶。
这些酶是PMP依赖性的，例如由T.Clausen,R.Huber,L.Prade，M.C.Wahl andA.Messerschmidt,The EMBO Journal 1998,17,6827-6838中所描述的。
适用于根据本发明的方法的胱硫醚γ-合酶可以源自埃希氏杆菌属，特别是大肠杆菌；棒状杆菌属，特别是谷氨酸棒状杆菌；克雷伯氏菌属，特别是肺炎克雷伯氏菌；芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌；志贺氏菌属，特别是福氏志贺氏菌；科尔韦氏菌属，特别是冷红科尔韦尔氏菌；沙门氏菌属，特别是肠道沙门氏菌。
各个序列可从诸如Braunschweig Enzyme Database(BRENDA,Germany,可以在www.brenda-enzymes.org/index.php下载)、National Center for BiotechnologicalInformation(NCBI,可以在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/下载)或者KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes(KEGG,Japan,可以在www.https://www.genome.jp/kegg/下载)等数据库中获得。
下表1给出了可以在根据本发明的方法的步骤(a)中使用的硫化氢解酶和胱硫醚γ-合酶的优选实例。编码硫化氢解酶的基因对于O-乙酰基-L-高丝氨酸硫化氢解酶(“AHS”)表示为“metY”、“met17”和“Met17，对于O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶(“SHS”)表示为“metZ”。编码胱硫醚γ-合酶(“CGS”)的基因被标记为“metB”和“metI”。
表1
在本发明方法的优选实施方案中，步骤(a)中的反应由选自硫化氢解酶E1、胱硫醚γ-合酶E2的至少一种酶催化，其中硫化氢解酶E1的多肽序列选自：
-选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：2的变体、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：6的变体、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：19的变体、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：22的变体、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：23的变体的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，和
-选自SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：10的变体、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：14的变体、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：18的变体、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：20的变体、SEQ IDNO：24和SEQ ID NO：24的变体、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：25的变体、SEQ ID NO：26和SEQID NO：26的变体、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：27的变体、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：28的变体、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：34的变体的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，
-并且其中胱硫醚γ-合酶E2的多肽序列选自SEQ ID NO：17及其变体、SEQ ID NO：21及其变体、SEQ ID NO：29及其变体、SEQ ID NO：30及其变体、SEQ ID NO：31及其变体、SEQID NO：32及其变体、SEQ ID NO：33及其变体。
在本发明方法的更优选的实施方案中，步骤(a)中的反应选自以下的硫化氢解酶E1催化：
选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：2的变体、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：6的变体、SEQID NO：19和SEQ ID NO：19的变体、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：22的变体、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：23的变体的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，和
选自SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：10的变体、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：14的变体、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：18的变体、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：20的变体、SEQ IDNO：24和SEQ ID NO：24的变体、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：25的变体、SEQ ID NO：26和SEQID NO：26的变体、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：27的变体、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：28的变体、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：34的变体的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶。
在本发明方法的更优选的实施方案中，步骤(a)中的反应由选自O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶E1催化，O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：2的变体、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：6的变体，以及O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶选自SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：10的变体、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：14的变体。
在本发明方法的更优选的实施方案中，步骤(a)中的反应选自SEQ ID NO：2、SEQID NO：6的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶和选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的硫化氢解酶E1催化。
术语“变体”在下文进一步解释(第4.3.3.1项)。在本申请的上下文中，应当理解为指与相应多肽序列具有至少80％序列相同性的多肽序列。
4.3.2获得酶的方法
可用于本发明方法的酶可通过本领域技术人员已知的方法合成。
一种方法是在微生物如大肠杆菌(＝“E.coli”)、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等中表达酶，并将全细胞作为全细胞生物催化剂加入反应中。另一种方法是表达酶，裂解微生物，并加入细胞裂解物。另一种方法是从裂解物中纯化或部分纯化酶，并向反应中加入纯的或部分纯的酶。如果一个反应需要多种酶，这些酶可以在一种或几种微生物中表达，包括在一种微生物中表达所有酶。
例如，技术人员可以通过在细胞中表达，特别是过表达(下文中，“表达，特别是过表达”缩写为(过)表达，“表达，特别是过表达”缩写为“(过)表达”)和随后的分离获得根据本发明的酶，例如如DE 100 31 999A1中所描述的。例如，游离质粒用于增加各自基因的表达。在这种质粒中，待(过)表达或编码待(过)表达的多肽或酶的核酸分子可以置于位于基因上游的强诱导型启动子如lac启动子的控制之下。启动子是由约40至50个碱基对组成的DNA序列，其构成RNA聚合酶全酶的结合位点和转录起点(M.Pátek,J.Holátko,T.Busche,J.Kalinowski,J.Microbial Biotechnology 2013,6,103-117)，由此可影响受控多核苷酸或基因的表达强度。“功能连接”是通过启动子与基因的顺序排列获得的，这导致基因的转录。
从文献(例如S.Lisser&H.Margalit,Nucleic Acid Research 1993,21,1507-1516；M.Patèk and J.Nesvera in H.Yukawa and M Inui(eds.),Corynebacteriumglutamicum,Microbiology Monographs 23,Springer Verlag Berlin Heidelberg 2013,51-88；B.J.Eikmanns,E.Kleinertz,W.Liebl,H.Sahm,Gene 1991,102,93-98)中已知用于增加表达的合适的强启动子或产生这种启动子的方法。例如，可以通过在已知共有序列的方向上改变启动子序列以增加与这些启动子功能性连接的基因的表达来优化天然启动子(M.Pátek,B.J.Eikmanns,J.Pátek,H.Sahm,Microbiology 1996,142,1297-1309；M.Pátek,J.Holátko,T.Busche,J.Kalinowski,J.Microbial Biotechnology 2013,6,103-117)。
组成型启动子也适用于(过)表达，其中编码酶活性的基因在启动子如葡萄糖依赖性deo启动子的控制下连续表达。化学诱导的启动子也是合适的，例如tac、lac或trp。用于诱导启动子的最广泛的系统是E.coli的lac操纵子。在这种情况下，使用乳糖或异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)作为诱导剂。此外，使用阿拉伯糖(例如pBAD系统)或鼠李糖(例如E.coli KRX)的系统作为诱导剂是常见的。用于物理诱导的系统例如是基于来自Takara或Lambda PL的E.coli cspA启动子以及渗透诱导型启动子例如osmB(例如WO 95/25785A1)的温度诱导冷休克启动子系统。
合适的质粒或载体原则上是本领域技术人员为此目的可获得的所有实施方案。现有技术描述了可用于此目的的标准质粒，例如由pET-3a或pET-26b(+)举例说明的pET系统载体(可从Novagen商购)。其它质粒和载体可以从例如Novagen、Promega、New EnglandBiolabs、Clontech或Gibco BRL公司的小册子中获得。进一步优选的质粒和载体可以在以下文献中找到：Glover,D.M.(1985)DNA cloning:a practical approach,Vol.I-III,IRLPress Ltd.,Oxford；Rodriguez,R.L.and Denhardt,D.T(eds)(1988)Vectors:a surveyof molecular cloning vectors and their uses,179-204,Butterworth,Stoneham；Goeddel,D.V.(1990)Systems for heterologous gene expression,MethodsEnzymol.185,3-7；Sambrook,J.；Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecularcloning:a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork。
然后将含有待扩增基因的质粒载体转化至所需菌株，例如通过接合或转化。接合的方法例如由A.J.Kalinowski,A.Pühler,Applied and EnvironmentalMicrobiology1994,60,756-759中所描述的。例如在G.Thierbach,A.Schwarzer,A.Pühler,Applied Microbiology and Biotechnology 1988,29,356-362,L.K.Dunican&E.Shivnan,Bio/Technology 1989,7,1067-1070and A.Tauch,O.Kirchner,L.Wehmeier,J.Kalinowski,A.Pühler,FEMS Microbiology Letters 1994,123,343-347中描述了转化方法。在通过“交叉”事件进行同源重组后，产生的菌株包含至少两个相关基因的拷贝。
所需的酶可以通过以本领域技术人员已知的方式破碎含有所需活性的细胞来分离，例如借助于球磨机、弗氏压碎器或超声波粉碎机，随后通过在13000rpm和4℃离心10分钟来分离细胞、细胞碎片和破碎助剂，例如玻璃珠。使用所得的无细胞粗提取物，然后可以进行酶分析以及随后对产物的LC-ESI-MS检测。或者，可以通过色谱方法(例如镍-腈基三乙酸亲和层析、链霉亲和素亲和层析、凝胶过滤层析或离子交换层析)以本领域技术人员已知的方式富集酶，或者纯化至均匀。
核酸或多肽是否(过)表达，可以通过定量PCR反应(对于核酸分子)、SDS聚丙烯酰胺电泳、蛋白质印迹或比较活性测定(对于多肽)来确定。遗传修饰可以针对转录、翻译和/或翻译后修饰，其导致在选择和/或鉴定的培养条件下酶活性和/或选择性的变化。
4.3.3定义
4.3.3.1“变体”
在本发明的上下文中，关于多肽序列的术语“变体”是指与参考序列具有至少80％、更优选至少81％、更优选至少82％、更优选至少83％、更优选至少84％、更优选至少85％、更优选至少86％、更优选至少87％、更优选至少88％、更优选至少89％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％的相同性的多肽序列。在进一步的具体实施方案中，相同性程度为至少98.0％、更优选至少98.2％、更优选至少98.4％、更优选至少98.6％、更优选至少98.8％、更优选至少99.0％、更优选至少99.1％、更优选至少99.2％、更优选至少99.3％、更优选至少99.4％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％或至少更优选至少99.9％。不言而喻，某一多肽序列的“变体”与该多肽序列并不相同。
这种变体可以通过引入缺失、插入、取代或其组合，特别是在氨基酸序列中，以及包含这种大分子或其变体的融合来制备。
本领域技术人员已知给定多肽序列的氨基酸残基的修饰不会导致给定多肽的性质和功能的显著修饰。因此，例如，许多氨基酸经常可以毫无问题地彼此交换；这种合适的氨基酸取代的实例是：Ala由Ser取代；Arg由Lys取代；Asn由Gln或His取代；Asp由Glu取代；Cys由Ser取代；Gln由Asn取代；Glu由Asp取代；Gly由Pro取代；His由Asn或Gln取代；Ile由Leu或Val取代；Leu由Met或Val取代；Lys由Arg或Gln或Glu取代；Met由Leu或Ile取代；Phe由Met或Leu或Tyr取代；Ser由Thr取代；Thr由Ser取代；Trp由Tyr取代；Tyr由Trp或Phe取代；Val由Ile或Leu取代。还已知修饰，特别是在多肽的N-或C-末端，以例如氨基酸插入或缺失的形式，通常对多肽的功能没有显著影响。
根据这一点，根据SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:17、SEQID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33中任一个的本发明的优选变体具有包含对于所述序列必需的功能，例如蛋白质的催化活性，或蛋白质的折叠或结构的多肽序列。其他氨基酸可以被删除、取代或被插入取代，或者必需氨基酸以保守的方式被取代，以保持酶的活性，特别是硫化氢解酶或胱硫醚γ-合酶的活性。
4.3.3.2“序列相同性”
本领域技术人员知道，各种计算机程序可用于计算两个核苷酸或氨基酸序列之间的相似性或相同性。
用于确定相同性的优选方法最初在要比较的序列之间产生最大的比对。用于确定相同性的计算机程序包括但不限于GCG程序包，该程序包包括：
-GAP[J.Deveroy et al.,Nucleic Acid Research 1984,12,page 387,GeneticsComputer Group University of Wisconsin,Medicine(WI)]，和
-BLASTP,BLASTN and FASTA(S.Altschul et al.,Journal of MolecularBiology 1990,215,403-410)。该BLAST程序可以从国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源获得(BLAST Handbook,S.Altschul et al.,NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894；S.Altschul etal.，见上文)。
例如，两个氨基酸序列之间的百分比相同性可以通过已经集成到GCG软件包中的GAP程序中的S.B.Needleman and C.D.Wunsch,J.Mol.Biol.1970,48,443-453，使用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵，间隙权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6来确定。本领域技术人员将认识到，使用不同的参数将导致稍微不同的结果，但是两个氨基酸序列之间的百分比相同性总体上不会有显著差异。BLOSUM62矩阵通常应用默认设置(间隙权重：12，长度权重：1)。
在本发明的上下文中，根据上述算法80％的序列相同性意味着80％的同源性。这同样适用于更高的相同性。
最优选地，在本发明的上下文中，通过程序“Needle”使用替换矩阵BLOSUM62、空位开放罚分10和空位拓展罚分0.5来确定序列之间的相同性程度。Needle程序实施S.B.Needleman and C.D.Wunsch,J.Mol.Biol.1970,48,443-453中所描述的全局比对。根据本发明使用的替换矩阵是BLOSUM62，空位开放罚分是10，空位拓展罚分是0.5。在本发明的上下文中使用的优选版本是由F.Madeira,Y.M.Park,J.Lee,N.Buso,T.Gur,N.Madhusoodanan,P.Basutkar,A.R.N.Tivey,S.C.Potter,R.D.Finn,Nucleic AcidsResearch2019,47,W636–W641,Web Server issue(经由https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/在2021年3月31在线可访问的优选版本)提出的版本。
在一个具体的实施方案中，多肽的氨基酸序列与参考多肽序列的相同性百分比通过以下方式确定：i)使用Needle程序用BLOSUM62取代矩阵比对两个氨基酸序列，空位开放罚分为10，空位拓展罚分为0.5；ii)计算比对中精确匹配的数量；iii)将精确匹配的数量除以两个氨基酸序列中最长的长度，以及iv)将iii)的除法结果转换成百分比。
4.3.3.3“鉴定特别有活性的变体的优选测定方法”
4.3.3.3.1测定A
在本发明的上下文中，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQID NO:33中的任一种的特别优选的多肽变体可以由技术人员分别鉴定为在以下分析中显示活性的多肽变体(“测定A”)。
测定A通过以下步骤进行：
A1)首先，通过如下步骤A1.1)、A1.2)和A1.3)确定待测试变体的活性：
A1.1)制备990μl的反应溶液，该溶液含有磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)、3mM的O-乙酰基L-高丝氨酸-HCl、10μM吡哆醛5’磷酸一水合物和1.0nmol待测多肽，并加热至50℃。
A1.2)通过加入10μl的200mM的正甲基膦酸丁酯溶液(MPBE,CAS#6172-80-1)开始反应。反应溶液中MPBE的浓度为2mM。
A1.3)加入MPBE后，在50℃进行反应120分钟。然后，通过加入10μl的1％甲酸盐溶液并在冰上冷却来停止反应。
A2)然后，通过如下步骤A2.1)、A2.2)和A2.3)进行空白测试：
A2.1)制备990μl的反应溶液，该溶液含有磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)、3mM的O-乙酰基L-高丝氨酸-HCl、10μM吡哆醛5’磷酸一水合物，并加热至50℃。
A2.2)通过加入10μl的200mM的正甲基膦酸丁酯溶液(MPBE,CAS#6172-80-1)开始反应。
A2.3)加入MPBE后，在50℃进行反应120分钟。然后，通过加入10μl的1％甲酸盐溶液并在冰上冷却来停止反应。
A3)最后，优选通过第5.7项下描述的LC-MS分析，测定和比较分别在A1.3)和A2.3)的反应溶液中获得的L-GA的丁基磷酸酯(即根据式(III)的化合物，其中R1＝正丁基)的量(以摩尔计)。
A4)如果A1.3)测定的L-GA的丁基磷酸酯的量大于A2.3)测定的量，则待测试的变体在测定A中显示活性。
如果A1.3)测定的L-GA的丁基磷酸酯的量等于或小于为A2.3)测定的量，则待测试的变体在测定A中不显示活性。
步骤A1.3)和A2.3)中优选的甲酸盐溶液是甲酸铵或甲酸钠溶液。或者，步骤A1.3)和A2.3)中的反应也可以通过加入甲醇，优选1ml甲醇来停止。
4.3.3.3.2测定B
在进一步的测定(“测定B”)中，可以测定关于多肽的分别SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33中任一种的多肽变体的活性。
测定B通过以下步骤进行：
B1)首先，通过以下步骤B1.1、B1.2)和B1.3)测定“标准”多肽标准品(即选自SEQID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:10、SEQID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的一个多肽序列)的活性：
B1.1)制备990μl的反应溶液，该溶液含有磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)、3mM的O-乙酰基L-高丝氨酸-HCl、10μM吡哆醛5’磷酸一水合物和1.0nmol待测“标准”多肽，并加热至50℃。
B1.2)通过加入10μl的200mM的正甲基膦酸丁酯溶液(MPBE,CAS#6172-80-1)开始反应。反应溶液中MPBE的浓度为2mM。
B1.3)加入MPBE后，在50℃进行反应120分钟。然后，通过加入10μl的1％甲酸盐溶液并在冰上冷却来停止反应。
B2)然后，使用变体重复步骤B1.1)、B1.2)和B1.3)：
B2.1)制备990L的反应溶液，该溶液含有磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)、3mM的O-乙酰基L-高丝氨酸-HCl、10μM吡哆醛5’磷酸一水合物和1.0nmol待测“变体”多肽的反应溶液，并加热至50℃。
B2.2)通过加入10μl的200mM的正甲基膦酸丁酯溶液(MPBE,CAS#6172-80-1)开始反应。反应溶液中MPBE的浓度为2mM。
B2.3)加入MPBE后，在50℃进行反应120分钟。然后，通过加入10μl的1％甲酸盐溶液并在冰上冷却来停止反应。
B3)最后，优选通过5.7项下描述的LC-MS分析，测定和比较在B1.3)和B2.3)的反应溶液中获得的L-GA的丁基磷酸酯(即式(III)化合物，其中R1＝正丁基)的量。
B4)然后，将在B2.3)中获得的L-GA的丁基磷酸酯的量(以摩尔计)除以在B1.3)中获得的L-GA的丁基磷酸酯的量(以摩尔计)。然后将该比率乘以因子100，给出变体多肽相对于“标准”多肽的相对活性百分比。
步骤B1.3)和B2.3)中优选的甲酸盐溶液是甲酸铵或甲酸钠溶液。或者，步骤B1.3)和B2.3)中的反应也可以通过加入甲醇，优选1ml甲醇来停止。
4.3.3.4“优选变体”
4.3.3.4.1“SEQ ID NO:2的变体”
特别地，SEQ ID NO：2的变体是与多肽序列SEQ ID NO：2具有≥80％、更优选≥85％、更优选≥90％、更优选≥91％、更优选≥92％、更优选≥93％、更优选≥94％、更优选≥95％、更优选≥96％、更优选≥97％、更优选≥98％、更优选≥99％、更优选≥99.9％序列相同性的多肽。
SEQ ID NO：2的优选变体在第4.3.3.3.1项下的测定A中显示活性。
甚至更优选地，相对于在4.3.3.3.2项下的测定B中测定的SEQ ID NO：2的活性，SEQ ID NO：2的相应变体的活性为至少1％，优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少99％。
甚至更优选地，相对于在4.3.3.3.2项下的测定B中测定的SEQ ID NO：2的活性，SEQ ID NO：2的相应变体的活性在1至1000％的范围内，优选在5至500％的范围内，更优选在10至400％的范围内，更优选在40至200％的范围内，更优选在50至150％的范围内，更优选在60至140％的范围内，更优选在70至130％的范围内，更优选在80至120％的范围内，更优选在90至110％的范围内，更优选100％。
4.3.3.4.2“SEQ ID NO:6的变体”
特别地，SEQ ID NO：6的变体是与多肽序列SEQ ID NO：6具有≥80％、更优选≥85％、更优选≥90％、更优选≥91％、更优选≥92％、更优选≥93％、更优选≥94％、更优选≥95％、更优选≥96％、更优选≥97％、更优选≥98％、更优选≥99％、更优选≥99.9％序列相同性的多肽。
SEQ ID NO：6的优选变体在4.3.3.3.1项下的测定A中显示活性。
甚至更优选地，相对于在4.3.3.3.2项下的测定B中测定的SEQ ID NO：6的活性，SEQ ID NO：6的相应变体的活性为至少1％，优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少99％。
甚至更优选地，相对于在4.3.3.3.2项下的测定B中测定的SEQ ID NO：6的活性，SEQ ID NO：6的相应变体的活性在1至1000％的范围内，优选在5至500％的范围内，更优选在10至400％的范围内，更优选在40至200％的范围内，更优选在50至150％的范围内，更优选在60至140％的范围内，更优选在70至130％的范围内，更优选在80至120％的范围内，更优选在90至110％的范围内，更优选100％。
4.3.3.4.3“SEQ ID NO:10的变体”
特别地，SEQ ID NO：10的变体是与多肽序列SEQ ID NO：10具有≥80％、更优选≥85％、更优选≥90％、更优选≥91％、更优选≥92％、更优选≥93％、更优选≥94％、更优选≥95％、更优选≥96％、更优选≥97％、更优选≥98％、更优选≥99％、更优选≥99.9％序列相同性的多肽。
SEQ ID NO：10的优选变体在4.3.3.3.1项下的测定A中显示活性。
甚至更优选地，相对于在4.3.3.3.2项下的测定B中测定的SEQ ID NO：10的活性，SEQ ID NO：10的相应变体的活性为至少1％，优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少99％。
甚至更优选地，相对于在4.3.3.3.2项下的测定B中测定的SEQ ID NO：10的活性，SEQ ID NO：10的相应变体的活性在1至1000％的范围内，优选在5至500％的范围内，更优选在10至400％的范围内，更优选在40至200％的范围内，更优选在50至150％的范围内，更优选在60至140％的范围内，更优选在70至130％的范围内，更优选在80至120％的范围内，更优选在90至110％的范围内，更优选100％。
4.3.3.4.4“SEQ ID NO:14的变体”
特别地，SEQ ID NO：14的变体是与多肽序列SEQ ID NO：14具有≥80％、更优选≥85％、更优选≥90％、更优选≥91％、更优选≥92％、更优选≥93％、更优选≥94％、更优选≥95％、更优选≥96％、更优选≥97％、更优选≥98％、更优选≥99％、更优选≥99.9％序列相同性的多肽。
SEQ ID NO：14的优选变体在4.3.3.3.1项下的测定A中显示活性。
甚至更优选地，SEQ ID NO：14的相应变体的活性相对于在4.3.3.3.2项下的测定B中测定的SEQ ID NO：14的活性为至少1％，优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少99％。
甚至更优选地，相对于在4.3.3.3.2项下的测定B中测定的SEQ ID NO：14的活性，SEQ ID NO：14的相应变体的活性在1至1000％的范围内，优选在5至500％的范围内，更优选在10至400％的范围内，更优选在40至200％的范围内，更优选在50至150％的范围内，更优选在60至140％的范围内，更优选在70至130％的范围内，更优选在80至120％的范围内，更优选在90至110％的范围内，更优选在100％。
4.3.3.4.5其他变体
SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQID NO:33中的任何一个的优选变体可以分别如在4.3.3.4.1项中描述的对SEQ ID NO:2所述进行相应的调整来确定。
SEQ ID NO:19的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:19”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:22的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:22”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:23的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:23”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:18的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:18”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:20的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:20”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:24的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:24”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:25的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:25”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:26的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:26”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:27的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:27”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:28的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:28”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:34的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:34”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:17的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:17”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:21的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:21”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:29的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:29”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:30的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:30”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:31的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:31”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:32的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:32”代替时产生的程序来确定。
SEQ ID NO:33的优选变体可以通过当在4.3.3.4.1项的描述中，单词“SEQ ID NO:2”被单词“SEQ ID NO:33”代替时产生的程序来确定。
4.4方法条件
根据本发明的方法的步骤a)中的反应可以在技术人员已知的条件下进行。
活化的L-高丝氨酸HA与底物S反应的反应介质优选为水性，更优选为水性缓冲剂。
通常用于生物转化反应并有利地用于本文的示例性缓冲剂包括Tris、磷酸盐或任何Good’s缓冲液，例如2-(N-吗啉代)乙磺酸(“MES”)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(“ADA”)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(“PIPES”)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基磺酸(“ACES”)、对羟基-4-吗啉代丙磺酸(“MOPSO”)、氯胆胺(cholamine chloride)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(“MOPS”)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(“BES”)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(“TES”)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(“HEPES”)、3-(双(2-羟乙基)氨基)-2-羟基丙烷-1-磺酸(“DIPSO”)、乙酰胺甘氨酸、3-(N-三(羟甲基)甲氨基(-2-羟基丙烷)磺酸(“TAPSO”)、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(“POPSO”)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)(“HEPPSO”)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(“HEPPS”)、三甲基甘氨酸、甘氨酰胺、二羟乙甘胺酸或3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]丙-1-磺酸(“TAPS”)。
在一些实施方案中，铵可以作为缓冲剂。一种或多种有机溶剂也可以加入到反应中。
优选地，根据本发明的方法的步骤a)在磷酸盐缓冲液中进行。
本方法步骤a)中的反应介质的pH优选在2至10的范围内，更优选在5至8的范围内，最优选7.5。
根据本发明的方法优选在20℃至70℃范围内，更优选在30℃至55℃范围内，最优选在50℃范围内进行。
4.5L-草铵膦磷酸酯
根据本发明的方法的产物是具有以下结构(III)的化合物：
根据结构(III)的化合物是L-草铵膦(对于R1＝H)或L-草铵膦磷酸酯(对于R1＝烷基、烯基、炔基、羟烷基或芳基)。
根据结构(III)的化合物，其中R1＝正丁基，缩写为“L-GA-Bu”或“LGA-Bu”。
本技术人员理解，根据结构(III)的化合物中残基R1的特性取决于底物结构(I)中残基R1的特性。
如果R1是氢，则在根据本发明的方法中直接获得L-草铵膦。
在优选的实施方案中，其中R1选自烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基，优选烷基，更优选甲基、乙基、正丁基，化合物(III)是L-草铵膦磷酸酯。
在这些实施方案中，进一步优选根据本发明的方法包含进一步的步骤b)，其中将在步骤(a)中获得的结构(III)的化合物皂化，其中R1选自烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基，优选烷基，更优选甲基、乙基、正丁基，得到L-草铵膦。
这可以通过技术人员已知的方法进行。
优选地，这种皂化在酸性条件下进行，更优选通过将1体积含有在步骤(a)中获得的结构(III)化合物的反应介质和4体积6N HCl混合2h，并在50℃至150℃的温度，优选在100℃孵育所得混合物。
或者，可以进行酶促皂化。
5.实施例
测试编码硫化氢解酶的不同来源的基因(EC 2.5.1.-和EC 2.5.1.49)与活性高丝氨酸衍生物和根据结构(I)的不同底物反应形成草铵膦衍生物的能力。
5.1实施例1合适酶的鉴定和质粒的构建
5.1.1检测到的硫化氢解酶
表2总结了实施例中使用的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶和O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶基因的参考文献详细信息。
表2
5.1.2基因表达质粒的制备
5.1.2.1源自谷氨酸棒状杆菌的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶metY
源自谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的metY基因编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，并且可以在NCBI的NC_003450下可访问的基因组序列的locus_tag NCgl0625下找到。
为了实现该酶的表达，使用了表达载体pET-26b(+)(Novagen EMD Millipore)。因此，SEQ ID NO：3的metY_Cg多核苷酸由GeneArt(ThermoFisher Scientific(Waltham,USA))合成。
为了组装表达载体pET-26b(+)_metY-Cg，将载体pET-26(+)和metY_Cg多核苷酸均用NdeI和NotI处理，连接，并将连接混合物用于转化E.coli。得到的载体pET-26b(+)_metY-Cg如图1所示。
从转化子中分离出表达载体pET-26b(+)_metY-Cg的DNA。
5.1.2.2源自谷氨酸棒状杆菌的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶metY_P2T
O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶变体metY_P2T由SEQ ID NO：5的多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO：1的多核苷酸相同，除了从位置4到6的核酸碱基是aca。
SEQ ID NO：5的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽，其与SEQ IDNO：1的多核苷酸相同，除了位置2的氨基酸脯氨酸被苏氨酸取代。
为了实现酶变体metY_P2T的表达，使用了表达载体pET-26b(+)(Novagen EMDMillipore)。因此，SEQ ID NO：7的metY_P2T多核苷酸由GeneArt(ThermoFisherScientific(Waltham,USA))合成。
为了组装表达载体pET-26b(+)_metY_P2T，将载体pET-26(+)和metY_P2T多核苷酸均用NdeI和NotI处理，连接，并将连接混合物用于转化E.coli。得到的载体pET-26b(+)_metY_P2T如图2所示。
从转化子中分离出表达载体pET-26b(+)_metY_P2T的DNA。
5.1.2.3源自紫色色杆菌的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶metZ
源自紫色色杆菌ATCC 12472的metZ基因编码O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，并且可以在NCBI的AE016825下可访问的基因组序列的locus_tag CV_2725下找到。
为了实现该酶的表达，使用了表达载体pET-26b(+)(Novagen EMD Millipore)。因此，SEQ ID NO：11的metZ_Cv多核苷酸由GeneArt(ThermoFisher Scientific(Waltham,USA))合成。
为了组装表达载体pET-26b(+)_metZ-Cv，将载体pET-26(+)和metZ-Cv多核苷酸均用NdeI和XhoI处理，连接，并使用连接混合物转化E.coli。得到的载体pET-26b(+)_metZ-Cv如图3所示。
从转化子中分离出表达载体pET-26b(+)_metZ-Cv的DNA。
5.1.2.4源自裙带菌丝单胞菌的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶metZ
源自裙带菌丝单胞菌ATCC 15444的metZ基因编码O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，并且可以在NCBI的CP000158下的可访问的基因组序列的locus_tag HNE_2672下找到。
为了实现该酶的表达，使用了表达载体pET-26b(+)(Novagen EMD Millipore)。因此，SEQ ID NO：15的metZ_Hn多核苷酸由GeneArt(ThermoFisher Scientific(Waltham,USA))合成。
为了组装表达载体pET-26b(+)_metZ-Hn，将载体pET-26(+)和metZ_Hn多核苷酸均用XbaI和XhoI处理，连接，并使用连接混合物转化E.coli。得到的载体pET-26b(+)_metZ-Hn如图4所示。
从转化子中分离出表达载体pET-26b(+)_metZ-Hn的DNA。
5.2硫化氢解酶的转化和表达
将这些携带硫化氢解酶基因的载体分别转化为大肠杆菌BL21(DE3)(New EnglandBiolabs)，其随后在含有50mg/l卡那霉素的LB培养基琼脂平板上于37℃培养16h。携带无任何插入片段的载体pET26b(+)的菌株BL21用作阴性对照。
菌株分别命名为Ec BL21 pET-26b(+)_metY-Cg、Ec BL21 pET-26b(+)_metY-Cg_P2T、Ec BL21 pET-26b(+)_metZ-Cv、Ec BL21 pET-26b(+)_metZ-Hn和Ec BL21 pET-26b(+)。
在每种情况下，选择一个菌落，将其接种到含有50mg/l卡那霉素的10ml LB培养基中，并在37℃、250rpm下培养6小时。随后用50mg/l卡那霉素处理50μl LB培养基，接种50μl生长细胞培养物，并在28℃、250rpm下孵育16h。将该细胞培养物在2l烧瓶中用200ml含50μg/l卡那霉素的新鲜LB培养基稀释至OD为0.15，并在相同条件下进一步培养，直至OD为0.5(约4h)。然后通过加入200μl的300mM IPTG储备溶液(最终浓度300μM异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)，Sigma-Aldrich，Germany)来影响基因表达诱导的起点。诱导在28℃、250rpm下进行4h然后收获培养物(8ml标准化为OD＝1)，通过离心(20min，4000rpm，4℃)除去上清液，用800μl的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.5)洗涤沉淀细胞两次，并维持在1ml缓冲液中。机械细胞消化在FastPrep FP120仪器(QBiogene,Heidelberg)中进行，其中细胞在含有300mg玻璃珠(0.2-0.3mm)的消化容器中以6.5m/s的速度摇动四次，每次30s。然后将粗提取物在12000rpm、4℃、20min离心，以除去未消化的细胞和细胞碎片。上清液用于酶分析。通过SDS page测定上清液中多肽的浓度，并通过软件(BiochemLabSolutions)分析相应的条带。
5.3本发明实施例I1至I4
进行以下测定以确定相应的多肽是否催化相应的含磷底物和活化的L-高丝氨酸的反应。O-乙酰基L-高丝氨酸用作活化的L-高丝氨酸底物。
向含有1nmol待测polpypetide的880μl磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)中加入100μl的30mM O-乙酰基高丝氨酸-HCl水溶液、10μl的1mM 5’-磷酸吡哆醛一水合物水溶液(1mM)和10μl的200mM对甲基膦酸丁酯水溶液(CAS号6172-80-1；“MPBE”)。反应在50℃进行120min，然后，将100min分批溶液稀释在100min甲醇中，应用于LC-MS QQQ(第5.7项)以分析LGA-Bu。
5.4本发明实施例I5
在与对甲基膦酸甲酯(“MPME”；CAS号16391-06-3)的反应中进一步测试从pET-26b(+)_metY-Cg_P2T分离的多肽的催化作用。
向含有1nmol这种多肽的880μl磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)中加入100μl的30mMO-乙酰基高丝氨酸-HCl水溶液、10μl的1mM 5’-磷酸吡哆醛一水合物水溶液(1mM)和10μl的200mM MPME水溶液。反应在50℃进行120min。然后，将100μl分批溶液稀释在100μl甲醇中，应用于LC-MS QQQ(第5.7项)以分析LGA-Bu。
5.4比较例C1至C4
进一步研究了其他磷化合物是否可以作为上述反应的底物。为此，测试了甲基亚磷酸钠二乙酯(，，DEMP“；CAS号15715-41-0)。
向含有1nmol待测多肽的880μl磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)中加入100μl的30mMO-乙酰基高丝氨酸-HCl水溶液、10μl的1mM 5’-磷酸吡哆醛一水合物水溶液(1mM)和10μl的200mM DEMP水溶液。反应在50℃进行120min。然后，将100μl分批溶液稀释在100μl甲醇中，应用于LC-MS QQQ(第5.7项)以分析LGA-Bu。
5.5比较例C5至C8
进一步研究了根据上述反应<1A>相应的多肽是否会催化O-乙酰基高丝氨酸与甲硫醇(“MM”；CAS号74-93-1)。
向含有1nmol待测多肽的880μl磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)中加入100μl的30mMO-乙酰基高丝氨酸-HCl水溶液、10μl是1mM 5’-磷酸吡哆醛一水合物水溶液(1mM)和10μl的200mM水溶液。反应在50℃进行120min。然后，将100μl分批溶液稀释在100μl甲醇中，并应用于LC-MS QQQ(第5.7项)，以分析相应的产物。
在本发明实施例I1至I4的情况下，产物是根据结构(III)的化合物，其中R1＝正丁基(“LGA-Bu”)。
在本发明实施例I5的情况下，产物是根据结构(III)的化合物，其中R1＝甲基。
在比较实施例C1至C4的情况下，产物是根据结构(III)的化合物，其中R1＝乙基(“LGA-Et”)。
在比较例C5至C6的情况下，产物是蛋氨酸。
下表3总结了这些结果。使用的缩写是
“DEMP”＝甲基二乙氧基膦(CAS号15715-41-0)；
“MPBE”＝对甲基膦酸丁酯(CAS号6172-80-1)；
“MPME”＝对甲基膦酸甲酯(CAS号16391-06-3)；
“MM”＝甲硫醇(CAS号74-93-1)。
表3
| 实施例 | 酶 | 多肽 | 底物 | 产物 |
| I1 | Cg_MetY | SEQ ID NO:2 | MPBE | 是 |
| I2 | Cg_MetY_P2T | SEQ ID NO:6 | MPBE | 是 |
| I3 | Cv_MetZ | SEQ ID NO:10 | MPBE | 是 |
| I4 | Hn_MetZ | SEQ ID NO:14 | MPBE | 是 |
| I5 | Cg_MetY_P2T | SEQ ID NO:6 | MPME | 是 |
| C1 | Cg_MetY | SEQ ID NO:2 | DEMP | 否 |
| C2 | Cg_MetY_P2T | SEQ ID NO:6 | DEMP | 否 |
| C3 | Cv_MetZ | SEQ ID NO:10 | DEMP | 否 |
| C4 | Hn_MetZ | SEQ ID NO:14 | DEMP | 否 |
| C5 | Cg_MetY | SEQ ID NO:2 | MM | 是 |
| C6 | Cg_MetY_P2T | SEQ ID NO:6 | MM | 是 |
| C7 | Cv_MetZ | SEQ ID NO:10 | MM | 是 |
| C8 | Hn_MetZ | SEQ ID NO:14 | MM | 是 |
5.6结果
表3中总结的结果令人惊讶地显示，测试的多肽接受其它底物甲基次膦酸化合物，如MPBE和MPME，并催化它们与活化的L-高丝氨酸反应成相应的LGA磷酸正丁基或甲基酯。
这一发现甚至更令人惊讶，因为技术人员不会预料到这些酶会催化这些反应，因为其他磷酸盐化合物如DEMP不作为底物起作用。
这一发现为LGA及其衍生物开辟了新的酶促途径。
5.7分析方法
实验的所有分析测量都是通过LC-MS QQQ系统上的扫描进行的。将样品稀释在甲醇中(v：v＝1：2)。
所应用的HPLC属于Agilent的1260Infinity系列，连接到具有电喷雾电离的质谱仪6420三重四极杆。以阳性检测模式通过保留时间和分子量进行峰鉴定。
通过峰面积和无零二次校准进行数据评估。
采集方法详细信息
离子源 ESI(电喷雾电离)
时间参数
质量范围 m/z＝50-300
每秒扫描数 400
解离 40V
极性 正离子(扫描模式)
源参数
气体温度 350℃
气流 12l/min
喷雾器 50psi
毛细管 4000V
二元泵
注入体积 2.00μL
流速 0.60mL/min
溶剂组分
溶剂A 100mM醋酸铵加0.1％(v/v)甲酸在H2O中
溶剂B 0.1％甲酸的乙腈
梯度见表4。
表4
| 时间(min) | 溶剂A(％) | 溶剂B(％) |
| 0.5 | 5 | 95 |
| 1.2 | 45 | 55 |
| 4.0 | 45 | 55 |
| 4.1 | 95 | 5 |
| 7.0 | 95 | 5 |
| 7.1 | 5 | 95 |
| 10.0 | 5 | 95 |
柱
类型Luna HILIC；100x 2mm；3μm；Phenomenex 00D-4449-BO
温度30.0℃
6.序列概述
下表提供了在本申请中提及的DNA和蛋白质序列的概述：
使用的缩写有：“AHS”＝O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶；“SHS”＝O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶；“CGS”＝胱硫醚γ-合酶。
/>
/>
/>
Claims (11)
1.一种用于生产L-草铵膦或其磷酸酯的酶催化方法，包括步骤(a)，其中活化的L-高丝氨酸HA与以下结构(I)的底物S反应以产生以下结构(III)的化合物，
其中R1选自氢、烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基，
并且其中所述活化的L-高丝氨酸HA具有以下结构(II)：
其中R2是具有1至15个碳原子的烃基基团，其任选地包含选自OH、COOH、NH的至少一个官能基团，
并且其中步骤(a)中的反应由选自硫化氢解酶E1、胱硫醚γ-合酶E2的至少一种酶催化。
2.根据权利要求1的方法，其中所述活化的L-高丝氨酸HA选自O-琥珀酰-L-高丝氨酸、O-乙酰基-L-高丝氨酸。
3.根据权利要求2的方法，其中所述活化的L-高丝氨酸HA是O-乙酰基-L-高丝氨酸。
4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中R1选自氢、烷基。
5.根据权利要求4的方法，其中烷基基团选自甲基、乙基、正丁基。
6.根据权利要求1至3任一项的方法，其中R1选自烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基，进一步包括步骤(b)，其中将步骤(a)中获得的结构(III)的化合物皂化以得到L-草铵膦。
7.根据权利要求1至6任一项的方法，其中步骤(a)中的反应由硫化氢解酶E1催化。
8.根据权利要求7的方法，其中所述硫化氢解酶E1是O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶。
9.根据权利要求1至8任一项的方法，其中所述硫化氢解酶E1的多肽序列选自：
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：2的变体、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：6的变体、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：19的变体、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：22的变体、SEQ ID NO：23和SEQ IDNO：23的变体，
SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：10的变体、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：14的变体、SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：18的变体、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：20的变体、SEQ ID NO：24和SEQID NO：24的变体、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：25的变体、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：26的变体、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：27的变体、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：28的变体、SEQ IDNO：34和SEQ ID NO：34的变体，
并且其中所述胱硫醚γ-合酶E2的多肽序列选自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：17的变体、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：21的变体、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：29的变体、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：30的变体、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：31的变体、SEQ ID NO：32和SEQ IDNO：32的变体、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：33的变体，其中变体定义为与相应多肽序列具有至少80％序列相同性的多肽序列。
10.根据权利要求1至9任一项的方法，其中所述活化的L-高丝氨酸HA通过产生活化的L-高丝氨酸HA的菌株的发酵制备。
11.根据权利要求10的方法，其中生产活化的L-高丝氨酸HA的菌株选自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、普罗维登斯菌属(Providencia sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、钩端螺旋体属(Leptospira sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、Hypomononas sp.、色杆菌属(Chromobacterium sp.)和诺卡氏菌属(Norcardia sp.)、真菌。
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