ES2650451T3 - Variante de polipéptido que tiene actividad homoserina acetiltransferasa y microorganismo que expresa el mismo - Google Patents

Variante de polipéptido que tiene actividad homoserina acetiltransferasa y microorganismo que expresa el mismo Download PDF

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Abstract

Un polipéptido modificado que tiene actividad homoserina O-acetiltransferasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o al menos el 95 % de homología con la misma, en la que el aminoácido en la posición 111 a partir del aminoácido inicial metionina, de la secuencia se sustituye con ácido glutámico y el aminoácido en la posición 112 de la secuencia se sustituye con treonina o histidina.

Description

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En la presente invención, el microorganismo anterior puede ser un microorganismo, en el que el número de copias de uno o más genes seleccionados a partir del grupo que consiste en el gen que codifica la fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), el gen que codifica la aspartato aminotransferasa (aspC) y el gen que codifica la aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd) es elevado, o el promotor del gen se sustituye por un promotor de mejora de actividad o se muta para tener una actividad mejorada.
En la presente invención, la serie de enzimas tiene las actividades de síntesis de O-acetil homoserina a partir de fosfoenolpiruvato, tal como se muestra en los siguientes Esquemas de reacción. Por lo tanto, la acumulación de Oacetil homoserina en las células se puede inducir potenciando la expresión de los genes que tienen estas actividades.
Fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc)
Fosfoenolpiruvato + H2O + CO2 <-> Oxaloacetato + Fosfato
Aspartato aminotransferasa (aspC)
Oxaloacetato + Glutamato <-> Aspartato + a-cetoglutarato
Aspartato cinasa (thrA)
Aspartato + ATP <-> Aspartil-4-fosfato + ADP
Aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd)
Aspartil-4-fosfato + NADPH <-> Aspartato-semialdehído + Fosfato + NADP+
Homoserina deshidrogenasa (thrA)
Aspartato-semialdehído + NADPH <-> Homoserina
En los esquemas de reacción, el gen thrA que codifica la enzima bifuncional, aspartato cinasa/homoserina deshidrogenasa se mejora previamente mediante la ayuda de la inhibición de la retroalimentación en la cepa CJM2 en el Ejemplo experimental 2, y las tres enzimas restantes se pueden mejorar mediante un aumento en el número de copias del gen, la sustitución del promotor del gen anterior por el promotor de mejora de actividad, o la inducción de una mutación del promotor para la mejora de la actividad.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "aumento en el número de copias" se refiere a una introducción adicional de un gen deseado en el cromosoma o mediante la introducción de un plásmido que tiene el gen que codifica la enzima correspondiente.
En los Ejemplos de la presente invención, una cepa CJM2-AP se preparó mediante la deleción del promotor de acs de una cepa CJM2 con metA y metB delecionados y la sustitución del promotor pro de la misma, y después se transformó para tener coaA resistente a la retroalimentación para preparar una cepa CJM2-AP/CO que tiene un elevado grupo de acetil-coA, seguido por la preparación de una cepa CJM3 que tiene dos copias de tres genes ppc, aspC y asd. A continuación, las cepas CJM3 con pCL_Pcj1_metA#11(EL), pCL_Pcj1_metA#11(EH) y pCL_Pcj1_metA#11(ET) introducidos se denominaron como CA05-0578, CA05-0579 y CA05-0580, respectivamente, y se depositaron en el Korean Culture Center of Microorganism el 12 de diciembre de 2011, y se les asignó los números de acceso, KCCM11229P y KCCM11230P, respectivamente (Ejemplo experimental 2).
Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para producir O-acetil homoserina, que comprende las etapas de cultivar el microorganismo que comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido modificado o el microorganismo que se transforma con el vector recombinante enlazado de manera operativa al polinucleótido que codifica el polipéptido modificado, y obtener la O-acetil homoserina que se produce durante el cultivo anterior del microorganismo.
En la presente invención, la producción de O-acetil homoserina usando el microorganismo que expresa el polipéptido modificado se puede realizar con un medio y condiciones apropiadas conocidas en la materia. Es bien entendido por los expertos en la materia que el procedimiento de cultivo se puede ajustar fácilmente de acuerdo con la cepa seleccionada.
Los ejemplos del procedimiento de cultivo incluyen, pero sin limitación, cultivos por lotes, continuo y por lotes alimentado. El medio usado en el cultivo tiene que estar en las condiciones de cultivo para una cepa específica.
El medio usado en la presente invención puede incluir cualquier fuente de carbono de sacarosa, glucosa, glicerol y ácido acético o combinaciones de los mismos, y la fuente de nitrógeno a usar se ejemplifica mediante las fuentes de nitrógeno orgánico tales como peptona, extracto de levadura, extracto de carne de vaca, extracto de malta, licor de maceración de maíz y harina de frijol y fuentes de nitrógeno inorgánico como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio o combinaciones de los mismos.
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El medio puede incluir dihidrogeno fosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio y las correspondientes sales que contienen sodio como una fuente de fosfato. El medio también puede incluir una sal de metal tal como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. Además, los aminoácidos, las vitaminas y los precursores apropiados también se pueden agregar. El medio o los precursores se pueden añadir al cultivo por tipo de lotes o por tipo continuo. El pH del cultivo se puede ajustar durante el cultivo mediante la adición de manera apropiada de un compuesto tal como hidróxido de amonio, hidróxido potásico, amoniaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico, y la generación de espumas se puede inhibir durante el cultivo usando un antiespumante tal como éster de poliglicol de ácidos grasos.
Con el fin de mantener las condiciones aeróbicas del cultivo, el oxígeno o el gas que contiene oxígeno se debe de inyectar en el cultivo. Con el fin de mantener las condiciones anaeróbicas y microaeróbicas, no se puede inyectar gas o se puede inyectar nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono. La temperatura del cultivo puede ser de 27 °C a 37 °C, y preferentemente 30 °C a 35 °C. El período de cultivo puede continuarse siempre que se produzca el material deseado, y preferentemente durante 10 a 100 horas.
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en más detalle con referencia a los Ejemplos y Ejemplos experimentales. Sin embargo, estos Ejemplos son solo con fines ilustrativos, y la invención no pretende estar limitada por estos Ejemplos.
Ejemplo 1: Construcción de plásmido que incluye homoserina O-succiniltransferasa y homoserina Oacetiltransferasa
Se realizó una PCR usando el cromosoma de la cepa W3110 de E.coli (N.º de acceso ATCC9637) adquirida de American Type Culture Collection como un molde y cebadores de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 para amplificar el gen metA que codifica la homoserina O-succiniltransferasa.
Los cebadores usados en la PCR se prepararon basándose en la secuencia del cromosoma de E.coli de NC_000913 registrado en NIH Gene Bank, y los cebadores de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 tienen los sitios de restricción EcoRV y HindIII, respectivamente.
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La PCR se realizó usando el cromosoma de Deinococcus radiodurans como un molde y los cebadores de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4 para amplificar el gen metX que codifica la homoserina O-acetiltransferasa (SEQ ID NO: 44). Los cebadores de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4 tienen los sitios de restricción EcoRV y HindIII, respectivamente.
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La PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 3 minutos, 25 ciclos que consisten en la desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 56 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 5 minutos, y polimerización a 72 °C durante 7 minutos.
Los productos de PCR obtenidos se clonaron en el plásmido pCL1920 que contiene el promotor cj1 (KR 20060068505) tras el tratamiento con enzimas de restricción, EcoRV y HindIII, respectivamente. E.coli DH5α se transformó con los plásmidos clonados, y la E.coli DH5α transformada se seleccionó en placas LB que contienen 50 µg/ml de espectinomicina para obtener plásmidos. Los plásmidos obtenidos se denominaron como pCL_Pcj1_metA y pCL_Pcj1_metXdr, respectivamente.
Ejemplo 2: Construcción de polipéptido modificado que tiene actividad homoserina O-acetiltransferasa
El aminoácido glicina (Gly) en la posición 111 de la O-succiniltransferasa se sustituyó por ácido glutámico (Glu) usando el plásmido pCL_Pcj1_metA preparado en el Ejemplo 1 como un molde y un kit de mutagénesis de sitio dirigido (Stratagene, Estados Unidos) (G111E). Las secuencias de los cebadores usados son como sigue:
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<210> 11 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia artificial
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<220> <223> cebador directo
<400> 11 ttgtaactgg tgcgccgctg gaactggtgg ggtttaatga tgtc
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<210> 12 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia artificial
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<220> <223> cebador directo
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<223> Variante del polipéptido que tiene actividad homoserina O-succinil transferasa, metA EL
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