CN101157955B

CN101157955B - 猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3γ作为猪生产性状的遗传标记及应用

Info

Publication number: CN101157955B
Application number: CN2007101756393A
Authority: CN
Inventors: 熊远著; 任竹青; 雷明刚; 左波
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2007-10-09
Filing date: 2007-10-09
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2027-10-09
Also published as: CN101157955A

Abstract

本发明属于猪的标记辅助选择技术领域，克隆得到一个适合检测猪生产性状的遗传标记。该遗传标记是猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3γ，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述。序列长度为1346bp，包含1179bp的开发阅读框，36bp 5’非翻译区和131bp的3’非翻译区。所述的IDH3γ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所述，包含IDH3γ第2内含子序列，为猪的标记辅助选择提供了新的遗传标记。本发明还公开了猪IDH3γ基因的cDNA序列和第2内含子的DNA序列作为猪微卫星分型检测的应用。

Description

猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3γ作为猪生产性状的遗传标记及应用

技术领域

本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3γ基因的克隆及其作为遗传标记在猪生产性状标记辅助选择上的应用。

背景技术

通过生产性状的表型值估算出的育种值进行动物选择性育种，已大大促进了家畜生产性状的遗传改良。九十年代以来，随着分子生物学技术的进步以及在猪领域中的应用，逐步出现了以分子标记为核心的分子标记辅助选择和渗入等分子育种技术，这些技术与常规育种相结合，大大加速了猪育种进程。能够应用于分子标记辅助选择的基因或标记必须对目标性状具有较大的遗传贡献率，即主效基因或标记，因此寻找这些主效基因和与之紧密连锁的分子标记成为分子标记辅助选择的前提和基础，也是当前和今后一段时间猪分子生物学领域的研究重点和急需解决的问题。

目前已有多个位于功能基因内部的与生产性状紧密连锁的分子标记被发现并申请专利。例如，在传统的猪育种计划中，由于消费者对瘦肉的兴趣，因此选择主要强调降低脂肪。脂肪降低主要以背膘厚降低来衡量。然而，背膘厚下降同样导致了肌内脂肪的下降，脂肪最后的沉积部位是肌肉，因此肌内脂肪与味道以及肌肉的接受程度呈正相关。为防止肌内脂肪进一步的下降，必须找到影响此性状的分子标记，因为肌内脂肪是很难在活体中度量的。Gerbens等证实了位于猪6号染色体上肌肉组织特异候选基因心脏脂肪酸结合蛋白与猪中肌内脂肪含量和其它生产性状的关系，该基因已被申请专利，其专利号为WO97/35878；另外，Rothschild等发现了leptin受体基因内与瘦肉率有关的分子标记，其专利号为U.S.Pat.Nos.5972621。

异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate Dehydrogenase，IDH)是生物体三羧酸循环(Tricarboxylic Acid Cycle)中的重要的限速酶，负责催化异柠檬酸氧化脱羧成α-酮戊二酸，并将氧化型NAD或NADP还原成NADH或NADPH(Chen，Redox electrode for monitoring dehydrogenase-catalyzed reactions.Clin Chim Acta，1990，190(3)：129-37：)。IDH在生物体内有两种存在形式，即以NAD为电子受体的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)和以NADP为电子受体的异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)。NADP-IDH广泛存在于真核生物的各种细胞器(如叶绿体、线粒体等)、胞质和原核细胞中(Camacho等，Isocitrate dehydrogenases fromHaloferax volcanii and Sulfolobus solfataricus：enzyme purification，characterisation and N-terminal sequence.FEMS Microbiol Lett，1995，134：85-90：)。NAD-IDH则普遍被认为仅存在于真核生物线粒体中，但有研究者在嗜酸硫细菌中也发现了NAD-IDH，因此它的分布也似乎变得广泛起来(Inoue等，Biochemical andmolecular characterization of the NAD(+)-dependent isocitrate dehydrogenase from the chemolithotrophAcidithiobacillus thiooxidans.FEMS Microbiol Lett，2002，214：127-132：)。在哺乳动物中，主要有三种形式的IDH，即胞液型NADP-IDH(IDH1)、线粒体型NADP-IDH(IDH2)和线粒体型NAD-IDH(IDH3)。猪IDH2是一个单聚体，分子量为43.6kDa，编码413个氨基酸(Haselbeck等，Isolation and sequence of a cDNAencoding porcine mitochondrial NADP-specific isocitrate dehydrogenase.Biochemistry，1992，31：6219-6223：)。该酶需要1mol的NAPDH或NADP⁺和一种二价金属离子来产生酶活(Benderdour等，Cardiac mitochondrialNADP⁺-isocitrate dehydrogenase is inactivated through 4-hydroxynonenal adduct formation：an event thatprecedes hypertrophy development.J Biol Chem，2003，278：45154-45159)，研究表明，在第311位苏氨酸上结合Mn²⁺将产生最高的酶活性(Bailey等，2-[(4-Bromo-2，3-dioxobutyl)thio]and 2-[(3-bromo-2-oxopropyl)thio]adenosine 2′5′-bisphosphate：new nucleotide analogues that act as affinity labels of nicotinamide adeninedinucleotide phosphate specific isocitrate dehydrogenase.Biochemistry，1987，26：6858-6869：)。IDH1和IDH2不仅在三羧酸循环中发挥作用，而且在线粒体中通过NADPH的再生参与阻止氧化损伤(Ceccarelli等，Crystal structure of porcine mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase complexed with Mn²⁺andisocitrate.Insights into the enzyme mechanism.J Biol Chem，2002，277：43454-43462：)。像IDH2一样，IDH1也是一个单聚体，它可以作为三羧酸循环的一部分参与合成脂肪酸(Koh等，Cytosolic NADp⁺-dependentisocitrate dehydrogenase plays a key role in lipid metabolism.J Biol Chem，2004，279：39968-39974：)。

IDH3是由α、β、γ三个亚基以2∶1∶1的比例组成的异源四聚体，每个四聚体各有两个ADP、异柠檬酸、NAD、NADH以及Mn²⁺结合位点，但未发现其他金属离子结合位点。其中α亚基为催化亚基，并有一部分的异柠檬酸结合位点，而β、γ亚基可能与调节有关，上面有ADP结合位点(Kim等，Identification and functionalcharacterization of a novel，tissue-specific NAD(+)-dependent isocitrate dehydrogenase beta subunit isoform.JBiol Chem，1999，274：36866-36875：)。

目前已有人、小鼠、大鼠、牛、狗和斑马鱼的IDH3γ基因组结构、表达和功能研究报道，人IDH3γ基因定位于Xq28(Sandoval等，The genomic organization of a human creatine transporter(CRTR)gene locatedin Xq28.Genomics.1996，35(2)：383-5：)，包括两个不同的转录本，cDNA序列全长分别为1723bp(GeneBank登录号：NM_174869)和1500bp(GeneBank登录号：NM_004135)，有13个外显子。

但目前国内外对猪IDH3γ基因的cDNA全长克隆、基因组结构分析以及多态性研究还是空白。

发明内容

本发明的目的在于克隆猪异柠檬酸脱氢酶IDH3γ基因，寻找该基因的遗传变异与猪生长、胴体和肉质生产性状间的关系，为猪的标记辅助育种提供遗传标记。

本发明提供了猪异柠檬酸脱氢酶IDH3γ基因的cDNA序列，该序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

所获得的IDH3γ基因cDNA序列长度为1346bp，序列中包含1179bp的开发阅读框，36bp 5’非翻译区和131bp的3’非翻译区。

在序列表SEQ ID NO：3第133-172bp处，SEQ ID NO：4第133-172bp处，SEQ ID NO：5第133-164bp处，SEQ ID NO：6第133-164bp处存在以二核苷酸“GT”为重复单位的微卫星多态。

一种筛选猪生产性状遗传标记的方法，按照以下步骤：

根据人、鼠IDH3γ基因cDNA同源序列设计引物在猪cDNA中扩增，获得猪IDH3γ基因的cDNA序列；再从猪血液中提取基因组DNA，根据该基因cDNA序列设计引物，PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO：3-6所示的序列；用该DNA序列设计引物在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染检测。

申请人已将本发明制备的遗传标记成功地应用在猪标记辅助选择的关联分析中。

更详细的技术方案参见实施例。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1：是本发明克隆的猪异柠檬酸脱氢酶IDH3γ基因的cDNA序列；

序列表SEQ ID NO：2：是本发明克隆的猪异柠檬酸脱氢酶IDH3γ基因推导的氨基酸序列

序列表SEQ ID NO：3：是本发明克隆的第一头大白猪IDH3γ基因包括第二内含子核苷酸序列；

序列表SEQ ID NO：4：是本发明克隆的第二头大白猪IDH3γ基因包括第二内含子核苷酸序列；

序列表SEQ ID NO：5：是本发明克隆的第一头梅山猪IDH3γ基因包括第二内含子核苷酸序列；

序列表SEQ ID NO：6：是本发明克隆的第二头梅山猪IDH3γ基因包括第二内含子核苷酸序列；

图1：是本发明的2个猪种猪异柠檬酸脱氢酶IDH3γ基因序列比对结果和突变位点显示。

图2：是本发明克隆的猪异柠檬酸脱氢酶IDH3γ基因第二内含子微卫星多态的聚丙烯凝胶电泳图谱和分型结果。

图中：泳道1-4代表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为455bp；泳道1为AB基因型，泳道2、4以及5为AA基因型，泳道3和6为BB基因型。

具体实施方式

实施例1：异柠檬酸脱氢酶IDH3γ基因cDNA序列的制备

猪异柠檬酸脱氢酶IDH3γ基因cDNA全长序列的制备需要首先合成正向cDNA双链(应用美国Clontech公司的试剂盒，按照试剂盒的操作说明书操作)，该cDNA双链的合成是在反转录过程中，该反转录酶具有在cDNA单链5’末端连接上3个以上的碱基G，同时将接头引物接上cDNA序列的两端，再用接头引物进行LD-PCR(Long Distance PCR)，获得双链全长cDNA。制备正向cDNA双链时所用的三个引物为：正向TII寡聚核苷酸引物：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’(12μM)，CDS引物：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)VN-3’(12μM)，PCR引物：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(12μM)。利用成年梅山猪的脂肪组织总RNA合成正向双链cDNA的简要步骤如下：取1μg的总RNA样品与CDS引物和正向II寡聚核苷酸引物各1μL混合，加RNase-free H20至总体积为5μL，离心至管底，然后在72℃温育2min，迅速置于冰上冷却1-2min，轻微离心将内容物收集管底，加入2μL 5×第一链反应缓冲液(试剂盒自带)，375mM KCl，30mM MgCl2)，1μLdNTP(10mM)，1μL DTT(20mM)BD PowerScript反转录酶，离心后在72℃温育1h，合成第一链cDNA。以2μL的第一链cDNA为模板，加入2μL dNTP，4μL PCR引物，2μL 50×BD Advantage 2 Polymerase Mix，10μL 10×BD Advantage 2PCR缓冲液(试剂盒自带)和80μL水至总体积100μL，进行PCR：95℃ 1min变性，13个循环95℃ 15s，65℃ 30s，68℃ 6min，合成全长cDNA双链。

以人IDH3γ基因的cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80％以上的表达序列标签(EST)，拼接猪EST-重叠群，以EST-重叠群为模板设计引物，引物序列如下：

5’RACE正向引物：5’-AACGCAGAGTACGCGGG-3’；

5’RACE反向引物：5’-TCCTCCGTCGGCCAAGTA-3’；

3’RACE正向引物：5’-CAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTT-3’；

3’RACE反向引物：5-’CGGCAGGTTGTGGTTTGTT-3’。

用5’RACE正向引物和5’RACE基因特异引物扩增猪IDH3γ基因的5’末端，用3’RACE正向引物和3’RACE基因特异引物扩增猪IDH3γ基因的3’末端。PCR反应体系为25μl，其中模板双链cDNA为100ng，dNTPs浓度为200μmol/L，每条引物浓度为0.4μmol/L，2U的Taq DNA聚合酶(Biostar International，Canada)，加去离子水至总体积25μl；PCR反应程序：94℃预变性2min；然后94℃变性50s、57℃退火50s、72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物经纯化(应用武汉生工公司UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，按该试剂盒的说明书操作)、克隆后，进行序列测定，序列测定由上北京奥科生物技术公司完成，将测序所得到的序列与EST-重叠群进行序列拼接获得猪IDH3γ基因的全长cDNA序列。

实施例2：基因片段的获得及多态性检测方法的建立

选2头大白猪(国外血统)和2头梅山猪(中国地方猪血统)根据人IDH3γ基因的基因组结构和通过实施例1获得的猪IDH3γ基因的cDNA序列为试验材料，设计以下引物，其引物如下：

正向引物F1：5’-GTTCTAGGTGCCCACGAG-3’；

反向引物R1：5’-TTGACATGCAGCATGAGC-3’。

用此引物在2头大白猪和2头梅山猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系为25μl，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为200μmol/L，每条引物浓度为0.3μmol/L，1U的Taq DNA聚合酶(BiostarInternational，Canada)，加去离子水至总体积25μl；PCR反应程序：94℃预变性4min；然后94℃变性50s、58℃退火50s、72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min。

不同猪种的PCR产物经纯化(应用武汉生工公司UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，按试剂盒的说明书操作)、克隆后，进行序列测定，序列测定由上海生工生物技术公司完成。不同猪种的PCR产物序列经ClusterW软件进行序列比对，序列间比对结果见图1。上述扩增片段共存在2处突变，其中位于该片段存在重复单位为“GT”的微卫星多态性。据此，设计以下引物，引物序列如下：

正向引物F₂：5’-TGAGTACTTGCCCAAGCG-3’，

反向引物R₂：5’-AGGCCCCAAACCTAACAG-3’。

PCR反应体系为20μl，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为200μmol/L，每条引物浓度为0.5μmol/L，1U的Taq DNA聚合酶(Biostar International，Canada)，加去离子水至总体积25μl；PCR反应程序为：94℃预变性4min；然后94℃变性50s、57℃退火50s、72℃延伸20sec，共35个循环；最后72℃延伸7min。

取5μl PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染后观察并记录分型结果。结果如图2所示，发现只有两个等位基因，片段长度为283bp(“GT”重复数为20)是A等位基因，片段长度为275bp(“GT”重复数为16)是B等位基因，从而形成3种不同的基因型AA、BB和AB。

实施例3：本发明的遗传标记在不同猪群中的多态性分布的检测

在2个商品猪群(大白和长白)和6个中国地方猪种(梅山、淮南、八眉、通城、合作和二花脸)中检测猪IDH3γ基因第二内含子微卫星多态性，检测结果如表1所示。在所检测的几个猪群中A等位基因占绝对优势，其中在长白、梅山、合作以及二花脸猪中没有发现B等位基因。

表1本发明制备的猪IDH3γ基因微卫星多态在不同猪群中基因型与基因型频率

Figure DEST_PATH_G200710175639320071225D000051

实施例4：本发明的遗传标记在猪主要生产性状关联分析中的应用

为了确定猪IDH3γ基因多态性与猪表型差异是否相关，选择华中农业大学农业部猪遗传育种重点实验室组建的259头大白×梅山F2代资源群体为试验材料，采用实施例2所建立的微卫星分型方法进行多态性检测，并分析猪IDH3γ基因微卫星不同基因型与猪生产性状的相关关系。采用SAS统计软件(SASInstitute Inc，Version 8.0)GLM程序进行单标记方差分析，同时采用REG程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为：

Y_ijkl＝μ+G_i+F_j+S_k+Y_l+b_ijklX_ijkl+e_ijkl

Y_ij为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用-1，0和1分别代表AA、AB和BB基因型，显性效应用1，-1和1分别代表AA、AB和BB基因型)；S_k、Y_l、F_j为固定效应，分别为性别、年度、家系效应，b_ijkl为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰体重为协变量，肉质性状以屠宰日龄为协变量，生长不考虑协变量；e_ijkl为残差效应。

在所检测的259头大×梅F2代个体中，AA基因型144个，AB基因型有72个，BB基因型有43个。不同基因型与生产性状间的统计分析结果总结于表2和3。

从表2发现，猪IDH3γ基因微卫星的不同基因型在屠宰率、肋骨数以及平均皮厚性状存在显著差异(P＜0.05)，该位点在肋骨数主要以加性效应为主，在平均皮厚以显性效应为主。

从表3可以得出，猪IDH3γ基因微卫星所形成的不同基因型在肌内水分性状存在极显著差异(P＜0.01)，其他性状不存在显著性的相关关系。

表2本发明制备的猪IDH3γ基因微卫星多态与胴体性状的关联分析

Figure DEST_PATH_G200710175639320071225D000052

Figure DEST_PATH_G200710175639320071225D000061

注：以上数值为最小二乘均值±标准误；含有相同字母表示差异不显著，小写字母表示差异显著，大写字母表示差异极显著；加性效应负值表示B等位基因降低性状表型值；^*表示p＜0.05，^**表示p＜0.01(表3同)。

表3本发明制备的猪IDH3γ基因微卫星多态与肉质性状的关联分析

Figure DEST_PATH_G200710175639320071225D000062

<110>华中农业大学

<120>猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3 γ作为猪生产性状的遗传标记及应用

<130>

<141>2007-09-28

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1346

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>CDS

<222>(37)..(1215)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(1216)..(1346)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(36)

<223>

<400>1

gagggtcgag acctgctgcg gttctcactt tctgtc atg gcg ctg aag gtg gcg 54

Met Ala Leu Lys Val Ala

1 5

acg gct gca ggc ggc gcg gcg aag gca gtg ctc agg cca gcc ctc ctc 102

Thr Ala Ala Gly Gly Ala Ala Lys Ala Val Leu Arg Pro Ala Leu Leu

10 15 20

tgc cgt ccc tgg gag gtt cta ggt gcc cac gag gcc ccc cgg agg agc 150

Cys Arg Pro Trp Glu Val Leu Gly Ala His Glu Ala Pro Arg Arg Ser

25 30 35

ttc tct caa cag aca att cct ccg tcg gcc aag tat ggg ggg cgg cac 198

Phe Ser Gln Gln Thr Ile Pro Pro Ser Ala Lys Tyr Gly Gly Arg His

40 45 50

acg gtg acc atg arc ccg ggg gat ggc atc ggg ccg gag ctc atg ctg 246

Thr Val Thr Met Ile Pro Gly Asp Gly Ile Gly Pro Glu Leu Met Leu

55 60 65 70

cat gtc aag tct gtg ttc agg cat gcg tgt gtg cct gtg gac ttc gaa 294

His Val Lys Ser Val Phe Arg His Ala Cys Val Pro Val Asp Phe Glu

75 80 85

gag gtg cat gtg agc tcc aac gcc gac gag gag gac atc cgg aat gcc 342

Glu Val His Val Ser Ser Asn Ala Asp Glu Glu Asp Ile Arg Asn Ala

90 95 100

atc atg gcc atc cgt cgg aac cgt gtg gct cta aag ggc aat att gaa 390

Ile Met Ala Ile Arg Arg Asn Arg Val Ala Leu Lys Gly Asn Ile Glu

105 110 115

aca aac cac aac ctg ccg ccg tcg cac aag tcc cgg aac aac atc ctc 438

Thr Asn His Asn Leu Pro Pro Ser His Lys Ser Arg Asn Asn Ile Leu

120 125 130

cgc acc agc ctg gac ctc tat gcc aac gtc atc cac tgc aag agc ctg 486

Arg Thr Ser Leu Asp Leu Tyr Ala Asn Val Ile His Cys Lys Ser Leu

135 140 145 150

ccc ggc gtc gtc acg cgg cac agg gac gtc gac atc ctc atc gtc cgg 534

Pro Gly Val Val Thr Arg His Arg Asp Val Asp Ile Leu Ile Val Arg

155 160 165

gag aac acg gag ggc gag tac agc agc ctg gag cac gag agc gtg gca 582

Glu Asn Thr Glu Glv Glu Tyr Ser Ser Leu Glu His Glu Ser Val Ala

170 175 180

gga gtg gtg gag agc ctc aag atc atc acc aag gcc aag tcc ctg cgc 630

Gly Val Val Glu Ser Leu Lys Ile Ile Thr Lys Ala Lys Ser Leu Arg

185 190 195

atc gcc gag tac gcc ttc aaa ctg gcc cag gag acg ggg cgc aag aaa 678

Ile Ala Glu Tyr Ala Phe Lys Leu Ala Gln Glu Thr Gly Arg Lys Lys

200 205 210

gtg acg gct gtg cac aag gcc aac atc atg aag ctg ggc gat ggg ctc 726

Val Thr Ala Val His Lys Ala Asn Ile Met Lys Leu Gly Asp Gly Leu

215 220 225 230

ttc ctc cag tgc tgc aag gag gtg gcg gcc ggt tac ccc cac atc acc 774

Phe Leu Gln Cys Cys Lys Glu Val Ala Ala Gly Tyr Pro His Ile Thr

235 240 245

ttc gag aac atg atc gta gac aac acc acc atg cag ctg gtg tcc cgg 822

Phe Glu Asn Met Ile Val Asp Asn Thr Thr Met Gln Leu Val Ser Arg

250 255 260

ccg cag cag ttc gac gtc atg gtg atg ccc aac ctc tac ggc aac atc 870

Pro Gln Gln Phe Asp Val Met Val Met Pro Asn Leu Tyr Gly Asn Ile

265 270 275

gtc aac aac gtc tgc gcg ggc ctg gtg ggc ggc ccc ggg ctc gtg gcg 918

Val Asn Asn Val Cys Ala Gly Leu Val Gly Gly Pro Gly Leu Val Ala

280 285 290

ggg gcc aac tac ggg cac gtg tac gcc gtc ttc gag acc gct acg agg 966

Gly Ala Asn Tyr Gly His Val Tyr Ala Val Phe Glu Thr Ala Thr Arg

295 300 305 310

aac aca ggc aag agc atc gcc aac aag aac att gcc aac ccc aca gcg 1014

Asn Thr Gly Lys Ser Ile Ala Asn Lys Asn Ile Ala Asn Pro Thr Ala

315 320 325

acg ctg ctc gca agc tgc atg atg ctc gac cac ctc aag ctc cac tcc 1062

Thr Leu Leu Ala Ser Cys Met Met Leu Asp His Leu Lys Leu His Ser

330 335 340

tac gcc acg tcc atc cgc aag gcc gtc ttg gcg tcc atg gac aac gaa 1110

Tyr Ala Thr Ser Ile Arg Lys Ala Val Leu Ala Ser Met Asp Asn Glu

345 350 355

aac atg cac acg cca gac atc ggg ggc cag ggc acg acg tcg gaa gcc 1158

Asn Met His Thr Pro Asp Ile Gly Gly Gln Gly Thr Thr Ser Glu Ala

360 365 370

atc cag gac atc att cgc cac atc cgc atc atc aac ggg cgg gcg gtg 1206

Ile Gln Asp Ile Ile Arg His Ile Arg Ile Ile Asn Gly Arg Ala Val

375 380 385 390

gag gcc tag gccaccctgg ggactgtgcc ggccactctg tagatgccct 1255

Glu Ala

ttgcaccccc agctccctag ccagcccggg gggtggaccc agaataaacc cgcttctgct 1315

caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1346

<210>2

<211>392

<212>PRT

<213>猪(Sus scrofa)

<400>2

Met Ala Leu Lys Val Ala Thr Ala Ala Gly Gly Ala Ala Lys Ala Val

1 5 10 15

Leu Arg Pro Ala Leu Leu Cys Arg Pro Trp Glu Val Leu Gly Ala His

20 25 30

Glu Ala Pro Arg Arg Ser Phe Ser Gln Gln Thr Ile Pro Pro Ser Ala

35 40 45

Lys Tyr Gly Gly Arg His Thr Val Thr Met Ile Pro Gly Asp Gly Ile

50 55 60

Gly Pro Glu Leu Met Leu His Val Lys Ser Val Phe Arg His Ala Cys

65 70 75 80

Val Pro Val Asp Phe Glu Glu Val His Val Ser Ser Asn Ala Asp Glu

85 90 95

Glu Asp Ile Arg Asn Ala Ile Met Ala Ile Arg Arg Asn Arg Val Ala

100 105 110

Leu Lys Gly Asn Ile Glu Thr Asn His Asn Leu Pro Pro Ser His Lys

115 120 125

Ser Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Ser Leu Asp Leu Tyr Ala Asn Val

130 135 140

Ile His Cys Lys Ser Leu Pro Gly Val Val Thr Arg His Arg Asp Val

145 150 155 160

Asp Ile Leu Ile Val Arg Glu Asn Thr Glu Gly Glu Tyr Ser Ser Leu

165 170 175

Glu His Glu Ser Val Ala Gly Val Val Glu Ser Leu Lys Ile Ile Thr

180 185 190

Lys Ala Lys Ser Leu Arg Ile Ala Glu Tyr Ala Phe Lys Leu Ala Gln

195 200 205

Glu Thr Gly Arg Lys Lys Val Thr Ala Val His Lys Ala Asn Ile Met

210 215 220

Lys Leu Gly Asp Gly Leu Phe Leu Gln Cys Cys Lys Glu Val Ala Ala

225 230 235 240

Gly Tyr Pro His Ile Thr Phe Glu Asn Met Ile Val Asp Asn Thr Thr

245 250 255

Met Gln Leu Val Ser Arg Pro Gln Gln Phe Asp Val Met Val Met Pro

260 265 270

Asn Leu Tyr Gly Asn Ile Val Asn Asn Val Cys Ala Gly Leu Val Gly

275 280 285

Gly Pro Gly Leu Val Ala Gly Ala Asn Tyr Gly His Val Tyr Ala Val

290 295 300

Phe Glu Thr Ala Thr Arg Asn Thr Gly Lys Ser Ile Ala Asn Lys Asn

305 310 315 320

Ile Ala Asn Pro Thr Ala Thr Leu Leu Ala Ser Cys Met Met Leu Asp

325 330 335

His Leu Lys Leu His Ser Tyr Ala Thr Ser Ile Arg Lys Ala Val Leu

340 345 350

Ala Ser Met Asp Asn Glu Asn Met His Thr Pro Asp Ile Gly Gly Gln

355 360 365

Gly Thr Thr Ser Glu Ala Ile Gln Asp Ile Ile Arg His Ile Arg Ile

370 375 380

Ile Asn Gly Arg Ala Val Glu Ala

385 390

<210>3

<211>581

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(581)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(133)..(172)

<223>

<400>3

gttctaggtg cccacgaggc cccccggagg agcttctctg tgagtacttg cccaagcgtg 60

cgtgtgcacg tgtgcatgtg tacatccatg tgcaccatct gtgtgcggag gcgcgtgtgt 120

acagctggat gcgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtctttccct 180

ctggggcgcc cccccccctc cccgagcggg cacagccttg tccctccatc cttggctgac 240

ctgtgtcttc ttccctcctg ccccctctag caacagacaa ttgtgagtat tcctctgtgt 300

tctgcctgtt aggtttgggg cctttcgttg cttcggggtt gagcccagtc cagcgggggg 360

cggggactgc tccgctgctt gcctcctgac ccgggggcgc cctgcgtgtc cctgtctggg 420

gggcgggggg cgggcgcgcc cgctcagtgc tgctgggagg aagggacccg aaggccgctc 480

tcccccgcct tctagcctcc gtcggccaag tatggggggc ggcacacggt gaccatgatc 540

ccgggggatg gcattgggcc ggagctcatg ctgcatgtca a 581

<210>4

<211>581

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(581)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(133)..(172)

<223>

<400>4

gttctaggtg cccacgaggc cccccggagg agcttctctg tgagtacttg cccaagcgtg 60

cgtgtgcacg tgtgcatgtg tacatccatg tgcaccatct gtgtgcggag gcgcgtgtgt 120

acagctggat gcgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtctttccct 180

ctggggcgcc cccccccctc cccgagcggg cacagccttg tccctccatc cttggctgac 240

ctgtgtcttc ttccctcctg ccccctctag caacagacaa ttgtgagtat tcctctgtgt 300

tctgcctgtt aggtttgggg cctttcgttg cttcggggtt gagcccagtc cagcgggggg 360

cggggactgc tccgctgctt gcctcctgac ccgggggcgc cctgcgtgtc cctgtctggg 420

gggcgggggg cgggcgcgcc cgctcagtgc tgctgggagg aagggacccg aaggccgctc 480

tcccccgcct tctagcctcc gtcggccaag tatggggggc ggcacacggt gaccatgatc 540

ccgggggatg gcattgggcc ggagctcatg ctgcatgtca a 581

<210>5

<211>573

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(573)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(133)..(164)

<223>

<400>5

gttctaggtg cccacgaggc cccccggagg agcttctctg tgagtacttg cccaagcgtg 60

cgtgtgcacg tgtgcatgtg tacatccatg tgcaccatct gtgtgcggag gcgcgtgtgt 120

acagctggat gcgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtctttcc ctctggggcg 180

cccccccccc tccccgagcg ggcacagcct tgtccctcca tccttggctg acctgtgtct 240

tcttccctcc tgccccctct agcaacagac aattgtgagt attcctctgt gttctgcctg 300

ttaggtttgg ggcctttcgt tgcttcgggg ttgagcccag tccagcgggg ggcggggact 360

gctccgctgc ttgcctcctg acccgggggc gccctgcgtg tccctgtctg gggggcgggg 420

ggcgggcgcg cccgctcagt gctgctggga ggaagggacc cgaaggccgc tctcccccgc 480

cttctagcct ccgtcggcca agtatggggg gcggcacgcg gtgaccatga tcccggggga 540

tggcattggg ccggagctca tgctgcatgt caa 573

<210>6

<211>573

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(573)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(133)..(164)

<223>

<400>6

gttctaggtg cccacgaggc cccccggagg agcttctctg tgagtacttg cccaagcgtg 60

cgtgtgcacg tgtgcatgtg tacatccatg tgcaccatct gtgtgcggag gcgcgtgtgt 120

acagctggat gcgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtctttcc ctctggggcg 180

cccccccccc tccccgagcg ggcacagcct tgtccctcca tccttggctg acctgtgtct 240

tcttccctcc tgccccctct agcaacagac aattgtgagt attcctctgt gttctgcctg 300

ttaggtttgg ggcctttcgt tgcttcgggg ttgagcccag tccagcgggg ggcggggact 360

gctccgctgc ttgcctcctg acccgggggc gccctgcgtg tccctgtctg gggggcgggg 420

ggcgggcgcg cccgctcagt gctgctggga ggaagggacc cgaaggccgc tctcccccgc 480

cttctagcct ccgtcggcca agtatggggg gcggcacgcg gtgaccatga tcccggggga 540

tggcattggg ccggagc tca tgctgcatgt caa 573

Claims

1.一种猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3γ，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述，序列长度为1346bp，包含1179bp的开发阅读框，36bp 5’非翻译区和131bp的3’非翻译区。

2.一种猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3γ，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所述，其中包含IDH3γ第2内含子序列。

3.根据权利要求1所述的基因IDH3γ，扩增该基因的cDNA序列的引物如下所示：

5’RACE正向引物：5’-AACGCAGAGTACGCGGG-3’；

5’RACE反向引物：5’-TCCTCCGTCGGCCAAGTA-3’；

3’RACE正向引物：5’-CAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTT-3’；

3’RACE反向引物：5-’CGGCAGGTTGTGGTTTGTT-3’。

4.根据权利要求2所述的基因IDH3γ的部分DNA序列，其特征在于，序列表SEQ ID NO：3第133-172bp处，SEQ ID NO：4第133-172bp处，SEQ ID NO：5第133-164bp处，SEQ IDNO：6第133-164bp处存在以二核苷酸“GT”为重复单位的微卫星多态。

5.一种筛选猪生产性状遗传标记的方法，按照以下步骤：

根据人、鼠IDH3γ基因cDNA同源序列设计引物在猪cDNA中扩增，获得猪IDH3γ基因的cDNA序列；再从猪血液中提取基因组DNA，根据该基因cDNA序列设计引物，PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO：3-6所示的DNA序列；用该DNA序列设计引物在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染检测。

6.权利要求1或2所述的猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3γ在猪标记辅助选择中的应用。