JPS62282586A - 組換え遺伝子産物の製法及び培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は組換え遺伝子産物の製法及びその製造の際に使
用する新規培地に関する。

〔従来技術〕

組換えＤＮＡ産物の生産性を向上させるには、主として
目的遺伝子を組み込んだベクターの改良か、あるいは、
培地、培養法の改良による。

前者の例として強力なプロモーターの構築と利用（ｄｅ
　Ｂｏｅｒ、　Ｈ−ｅｔａｌ−Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ−
Ａｃａｄ−５ｃｉ−８０，２１（１９８３）、ＳＤ配列
−開始コトン周辺領域の改変（Ｎ−Ｗａｒｂｓｒｔｏｎ
　ｅｔａｌ・、　Ｎａｃｌ、　Ａｃ１ｄ、Ｒｅ５−１１
　、５８３７（１９８３））、ベクターコピー数の増大
（Ｂｒ１ｇ１ｔｔｅＥ、５ｃｈｏｎｅｒ　ｅｔａｌ、Ｐ
ｒｏｃ−Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ−５ｃｉ−８１，５４０３
（１９８４））などが挙げられる。

一方、後者の培地、培養法の改良に関する報告は少なく
、わずかに菌の高濃度培養を主眼におき、デービス培地
を改変させた培地を用いて、ｐＨコントロールしながら
グルコースを分割して添加する培養法が報告されている
。（ＨｌＭｅｒｉｅｔａｌ・＋　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　
Ｊａｐａｎ　１２　。

３１３−３１９　（１９７９）、　Ｔ−Ｋｏｂａｙａｓ
ｈｉ　ｅｔａｌ−Ｐｒｏｃ−−Ｐａｃ−Ｃｈｅｍ−Ｅｎ
ｇ−Ｃｏｎｇｒ−ｒ　３ｒ（７４，１４７５０（１９８
３））ｔ、かじ、これらでは、菌の高濃度培養は達成さ
れているが、大腸菌全菌体蛋白に対する目的産物の割合
が明記されていない。

〔発明が解決すべき問題点〕

目的遺伝子産物の生産性を向上させるに際し発現ベクタ
ーを改良する事は時間と技術を要する。又、ベクターの
改良は目的遺伝子産物が異なるつどに行なわれる性質の
ものであり、あまり汎用的でない。又、前記培養法では
本発明者らの実験によると確かに菌濃度は上昇するが、
全大腸菌蛋白当りの目的産物の量は通常の培養法に比し
逆に著しく低下し、その生産性は何ら改善されないこと
が判明した。

〔問題点を解決するための手段〕 そこで本発明者らは組換え遺伝子産物の生産性を向上さ
せる方法につき種々検討した結果、カゼイン加水分解物
酵母エキス、無機塩及び大腸菌資化性炭素源を必須成分
とする培地中で組換え遺伝子をもつ大腸菌を培養すると
遺伝子産物の生産性が大巾に向上することを見い出した
。

本発明は上記知見に基づいて完成されたものである。

即ち本発明は、カゼイン加水分解物、酵母エキス、無機
塩及び大腸菌資化性炭素源を必須成分とする培地中で組
換え遺伝子を持つ大腸菌を培養し、その培養物より組換
え遺伝子産物を採取する事を特徴とする組換え遺伝子産
物の製法及びこの製法に使用する上記培地に関する。

本発明で使用するカゼイン加水分解物はカゼインを加水
分解したものなら特に制限ないが、カゼインをトリプシ
ン、ペプシン、パパイン等のプロテアーゼで加水分解し
たものが好ましく例えばバクトートリプトン（ディフコ
社製）やペプトンなどが好ましい。この使用量は培地１
２当り１〜１００ｇ好ましくは５〜５０ｇ、さらに好ま
しくは１０〜３０ｇ程度である。

酵母エキスの使用量は培地１１当り１〜１００ｇ、好ま
しくは２〜３０ｇ、さらに好ましくは５〜１’　５　ｇ
程度である。

無機塩としては例えばＮａＣ１、ＫＣＩ、　Ｎａ２ＳＯ
４，ＣａＣｌ２．　Ｃａ　ＣＯ３＋　ＭｇＳＯ４，ＣＩ
）８０４　、　Ｆｅ　８０４　、　Ｚｎ　８０４　、　
Ｍｎ　Ｃ＋２゜リン酸塩などが好ましくはＮａＣ１があ
げられ、それらの使用量は培地１２当り０．１〜５０ｇ
、好ましくは１〜３０ｇ、さらに好ましくは２〜１０ｇ
程度である。

又、大腸菌資化性の炭素源としては例えば、グリセロー
ル、グルコース、アラビノース、マンニトール、マルト
ース、トレハロース、ソルビトールなどがあげられ、グ
リセロール、ソルビトール、トレハロースが好ましい。

その使用量は培地１−ｅ当り５％以下、好ましくは０．
００１〜３％、さらに好ましくは０６０１〜２．５％程
度である。

本発明で使用する培地には他の成分も添加することがで
きる。他の成分としては例えば炭酸カルシウムなどのｐ
Ｈ調節剤や産生される遺伝子産物に取り込まれる微量元
素の供給源例えば遺伝子産物がＣａ−Ｚｎ−スーパーオ
キシドディスムターゼ（ＳＯＤ）の場合における硫酸銅
や硫酸亜鉛などがあげられる。

本発明で使用する培地は固体培地でもよいが上記培地成
分を蒸留水に溶解した液体培地の方が実用的で好ましい
。

本発明の製法を実施するには、上記培地中で組換え遺伝
子を持つ大腸菌を培養し、その培養物より組換え遺伝子
産物を採取すればよい。

組換え遺伝子としては大腸菌にその遺伝子産物を産生さ
せるものであれば特に制限なく、例えばＳＯＤ、ＴＰＡ
、ＴＮＦインターフェロン、成長ホルモン、インターロ
イキン２、インシュリン、ソマトスタチン、エンドルフ
ィン、カルシトニンなどをコードする遺伝子やトリプト
ファン、フェニルアラニンなどのアミノ酸合成酵素など
乞コードする遺伝子などがあげられる。

培養は常法によりおこなうことができ、例えば空気を吹
き込みながら２０〜５０℃好ましくは２５〜４０°Ｃで
３〜１２０時間好ましくはｌＯ〜３６時間程度振盪培養
などの方法でおこなえばよい。

の 培養物よりの組換え遺伝子産物ｋｇ取は常法によりおこ
なうことができ、例えば培養物馨遠心処理して集菌し、
遺伝子産物がそのＰ液中に存在する場合は、そのＰＫを
クロマトグラフィー処理などの処理によりおこなうこと
ができろ。

又、遺伝子産物が国体中に存在する場合は、集菌した菌
体を緩衝液に懸濁した後例えば超音波処理などで黴菌し
、次いで遠心処理して得られる上清をクロマトグラフィ
ーなとで処理することによりその遺伝子産物？得ろこと
ができる。

〔効　果〕

次に本発明の効果を実験例により説明する。

実験例１゜ （１）実験方法 下記表１の大腸菌資化性炭素源の１つを５ｇ／２含む他
は実施例１又は２の培地と同じ組成の培地を用い、実施
例１又は２と同様に培養して培養物を得、集菌、破囚し
た後遠心分離し、上清を得た。この上清につきＳＯＤの
産生量をＦｒ１ｄｏｖｉｃｌｒ法で測定し、又総蛋白量
をＬｏｗｒｙ　−１：’ｏｌｉｎｅ法（０・Ｈ−Ｌｏｗ
ｒｙ、　ｅｔａＩ・Ｊ−Ｂｉｏｌ・Ｃｈｅｍ・１９３＋
２６５（１９５１））で測定し、全菌体蛋白に対するＳ
ＯＤ蛋白の比を算出した。

（２）結果 結果を表１に示す。

ａ）；炭素源無添茄を１としたときの相対的ＳＯＤ産生
量 ｂ）；全菌体蛋白あたりのＳＯＤ蛋白の割合（％）この
表から明らかなように炭素源を添加するとＳＯＤの産生
量は増大し、又、全菌体蛋白あたりのＳＯＤ蛋白の割合
も増大する。

実験例２゜ （１）　　実験方法 実施例１で使用した培地からグリセロール及び酵母エキ
ス及びバクトドリプトンを除いた敵に表１で示す量のグ
リセロール及び酵母エキス及びバクトドリプトンあるい
はペプトンを加えた培地を用いた。組換遺伝子としてｐ
ＲＴＡｃ８＊有する菌を用いたときは３０石ジャーファ
ーメンタ−に１９００ｍ１宛仕込み１２０℃　１０分殺
菌した。これに０Ｄ＝１に達した種培養液２００ｍ１を
接種し、３０°Ｃで通気攪拌培養を開始した。０Ｄ＝０
．１５になったところで培養温度を３７℃に上昇し、更
に２４時間培養を続けた１４４１ｉ　ｉｉ＋　　１　　
＋−Ｖ　　　　ｎＴＡｒ　只か右′ナム　ｆＭｔｙ　田
Ｌ１ナー　ｋきは実施例３の方法より培養した。一方、
グルコースの流加培養は、既報告（Ｈ３Ｍｏｒｉ　ｅｔ
ａｌ、　Ｊ。

Ｃｈｅｍ、Ｅｎｇ−Ｊａｐａｎｌ　２．３１３　（１９
７９））に従い、下記培地を用い終濃度が０５％となる
様に温度上昇後、４時間おきに５回、グルコースを添加
した（添茄量総計３％）、又ｐＨは自動制御操作により
ｐＨ＝　６．０以下とならぬ様にアンモニア水で調節し
た。

得られた培養物を実験例１と同様に処理、測定をおこな
った。

流加培養培地の組成：　ＫＨ２ＰＯ４４ｇ　、　Ｋ２　
ＨＰＯ４４ｇ、　Ｎａ２ＨＰＣ４Ｈ１２Ｏ２０７ｇ、（
ＮＨ４）２　ＳＯ４１，２ｇ、　ＮＨ４Ｃｌ　０．２　
ｇ、酵母エキス９　ｇ　、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，２
，４ｇ。

ＦｅＳ’Ｏ４Ｈ７Ｏ２０４０＋１１ｇ、　ＣａＣ１ｚ　
Ｈ２Ｈ２０４０”ｇ、　ＭｎＳＯ４・１０■、　ＡｌＣ
ｌ３・６８２０１０■、　ＣＯＣｌ２・６８２０４■。

Ｚｎ　ＳＯ４・７　Ｈ２０３０ｍｇ、　Ｎａ２ＭｏＯ４
・２　Ｏ２０２［［１ｇ、　ＣｕＳＯ４’５８２０２５
　Ｉｌｏｇ−Ｈ３Ｂｏ３０．５　’ｎｇ、　　グｋ　：
７−ス５　ｇ（２）　　　結　　果 結果を表２に示す。

この表から明らかなようにグリセロール添加量を増加さ
せると又酵母エキス、ペプトンの添加量を増加させると
ＳＯＤの生産性は増大する。

又、公知のグルコース流下培養法に比し約２〜４倍もの
生産性の向上がみられる。従って、本発明は組換え遺伝
子産物の生産性のよい製造性としてすぐれたものである
。

次に実施例により本発明°を具体的に説明する。

実施例１゜ 後記参考例の７）で得られたｐＲＴａｃ　ＳＯＤ　８〜
１３をＨａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎｇｈａｒ
ｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　２５４−２５５　（１
９８２）　）で形質転換した大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴ
ＣＣ２７３２５）を２０μｇ／ｍ１のアンピシリンとＯ
ｌｌ　ｍＭｃｕｓｏ４及び０．１ｍＭ　Ｚｎ　８０４５
　ｇ　／−１３のグリセロールを含むＬ培地（他に培地
１２中バクトドリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、食塩
５ｇ含有）に接種し、３０°Ｃで振盪培養し、５５０　
ｎｍにおける吸光度が０．２となったところで、培養温
度乞３７℃に上昇した。更に振盪培養を約２４時間続け
た。

３）培養液１９Ａを６０００ｒｐｍｌＯ分間の遠・〔沈
降にかけ集菌した。夏は培養液の１／１０容Ｃ５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（７，５）　　１　ｍＭｃｕｓＯ４
−１ｍＭ　Ｚｎ　Ｓ　０４緩衝液に懸濁した。これを水
冷下で超音波処理し、菌を破砕した。処理液の５５０ｎ
ｍにおける吸光度が、処理前の１／１０にまで減４した
ところで処理を終了した。

最後に、この処理液を３０００　Ｏｒｐｍ　　３０力間
超遠心沈降し、上清を得た。この上清には、ＳＯＤが抽
出されている。

４）得られた溶菌上清液７１５ｍ１（総活性：３０７７
　Ｋｕ　、比活性９９．６　ｕ／ｍｇ−ｐ　）を用いズ
ＳＯＤの精製を行った。

■　ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー予め５０　ｍ
Ｍの食塩水で平衡化したダイアイオフＨＰ−２０を５．
８０Ｘ３９ｃｍＨＯカラムに充填し、光分平衡化する。

溶菌上清ｉ７１５ｍｌに５０　ｍＭの食塩水５６０　ｍ
ｌを加えこの混４液をカラムに吸着後、直ちに５０ｍＭ
酢酸ソーダ淫篠Ｍ０月弓で六うム突番のぬｑ嬉件Ｘ名司
る。ついで０，１Ｍグリシン−苛性ソーダ緩衝液の６０
％メタノール溶液、ｐＨ１０，０で溶出しＳＯＤ活性を
示す両分を集めた。（画分Ａ、３８２ｍ１） この画分を約０．５Ｎの塩酸でｐＨ７，０に調節後４０
℃の水浴上でエバポレートにより濃縮乾個する。乾個物
をｔ　ｏ　ｏ　ｍｉの水に溶解後、４０　ｍＭ食塩を含
む５ｍＭ’Ｊン酸緩衝液、ｐＨ７，５に対し透析チュー
ブを用いて透析を行う。

■　ＤＥＡＥ−１ヨバール力ラムクロマトグラフイ　　
− 透析されたＳＯＤを含む溶液を予め４０ｍＭ食塩を含む
５　ｍＭ　ＩＪ　／酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化された
ＤＥＡＥ−トヨパールの充填され゛たカラム（３’　ｘ
　２８　ａｍＨ）　Ｋ通導する。ついで同じ緩衝液で溶
出させてＳＯＤを吸着させずに通過液として得る。（画
分Ｂ、１７６ｍ１）■　セファデックスＧ−１００ゲル
クロマトグラフ　　ィ　　− 画分Ｂ１７６ｍ１を限外濾過膜（ＹＭ−５）を用いて８
　ｍｌにａ縮した液を予め１％食塩を含んだ５　ｍＭ　
ＩＪン酸緩衝ｉ、ｐＨ７，０で平衡化したセファデック
スＧ−１００（２’Ｘ１５９ｃｍＨ）カラムに吸着させ
、平衡化緩衝液で溶出しＳＯＤ活性を示す画分を得た（
画分Ｃ，８０ｍｌ　）溶菌上清液　３０７７　　１００
　　　　　９９．６画分Ａ　　２５５８　８３．１　１
４１８画分Ｂ画分２５０３　８１．３　３６１４画分Ｃ
２１９６７１，４３８１１ これを、ミリフォアフィルターでろ過した後限外濾過で
ａｍし、次いで凍結乾燥した。この結果、比活性３８１
０　Ｕｎｉｔ／ｍｇ−ｒ）のＳＯＤ粉末０．５７ｇ力価
を得た。

実施例２゜ 実施例１で使用した培地に炭酸カルシウム３％を添加し
た培地を用い、他は同様にして培養した。

培養終了後６Ｎ塩酸乞炭酸カルシウムの沈澱がなくなる
まで、加えた後、実施例１と同様に抽出精製した。この
結果、１９２の培養液より比活性３　ｓ　ＯＯＵ／ｍｇ
−ｐのＳＯＤ粉末を０．５０　ｇ力価得た。

実施例３゜ （１）培地調製 大腸菌の培養に通常、用いられる下記組成の培地を基本
培地とした。

バクトドリブトン　　　（Ｂａｃｔｏ　　ｔｒｙｐｔｏ
ｎｅ　）　　　　　　　　１０　ｇ酵母エキス　（Ｙｅ
ａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　）　　　　　１０　ｇグリセ
ロール　　　　　　　　　　　　　　２０ｇ食　　　　
塩　　（ＮａＣ１）　　　　　　　　　　　　５ｇ上記
の成分を蒸留水で１２とした後、２ＮＮａＯＨでｐ）］
を７．０に調整する。Ｌ培地は、調製後、ｓ　ｏ　ｏ　
ｍｉ容三角コルベンに２００　ｍ１分注後１２０℃で１
０分間亦圧殺菌した。冷却後、これは殺菌したＣｕＳＯ
４及びＺｎＳＯ４溶液を、終濃度０、１　ｍＭとなる様
に加えた。

（２）　　使用菌株 ＳＯＤ遺伝子発現プラスミドｐＴＡｃ８ｅ保有した大腸
菌に１２株の変異株を用いた。

（３）培養 （１）で調製した培地に終濃度が２０μｇ／ｍｌとなん る様、アンピシリンを加蛛た後、ＳＯＤ生産大腸菌を接
種した。３７°Ｃで振盪培養し、６００　ｎｍにおける
吸光度が０．１〜０．３となったところでインプロビル
−β−チオガラクトピラノシド（シグマ社製）を終濃度
１　ｍＭとなる様に茄え、更に５時間培養した。

（４）　　　抽　　出 培養液１９ノを６００　Ｏｒｐｍ、１０分間の遠心沈降
にかけ、集菌した。菌は培養液の１７１０容の５０　ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（７−５）　−１ｍＭｃｕｓ０４
−１ｍＭＺｎ　３０４−１　ｍＭ　ＰＭＳ　Ｆ　Ｃフェ
ニルメタンスルフォニルフルオライド）緩衝液に懸濁し
た。

これを水冷下で超音波処理し、菌を破砕する。

超音波処理中適宜処理液の吸光度乞測定し、その吸光度
が、処理前の１／１０にまで減少したところで超音波処
理を終了した。

最後に、この処理液乞３００００　ｒｐｍ、３０分間超
遠心沈降し上清を得た。

矢いで実施例１と同様にして比活性３７５０Ｕｎｉｔ／
ｍｇｐのＳＯＤ粉末７０．１ｇ得た。

参考例 （１）ヒト胎盤からのｍＲＮ　Ａの分離とＳＯＤｍＲＮ
Ａの同定： 新生児誕生より１時間以内の新鮮な胎盤約３００ｇをリ
ン酸生理食塩水（ＰＢＳ溶液）で洗い、グアニジン・チ
オシアネート法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　１８．５２９４−５２９９　（１９７９）］によっ
て細胞質の全ＲＮＡを抽出した。この抽出した全ＲＮＡ
を高塩濃度の緩衝液（Ｔｒｉｓ、　０．５Ｍ　ＮａＣ１
を含む、ｐＨ７，４）に溶かし、これ乞オリゴ（ｄＴ　
）セの緩衝Ｋ　（Ｔｒｉｓ、　Ｎａ　Ｃ１を含まず、ｐ
Ｈ７，４）で溶出してエタノール沈澱させた。全ＲＮＡ
　１５０　ｍｇより１．７１１１ｇのｍＲＮＡ　’ｅ得
た。沈澱を２００　μｌの滅菌水に溶かし、８０°Ｃ２
分間加温後急冷して、５〜２０％シヨ糖密度勾配遠心法
により分子量の大きさの順に分離した。

実際には日立ＲＰＳ　４０　Ｔローターを用い、３５Ｋ
　ｒｐｍ、１７時間０℃で遠心した。

次いで分離した各画分（０，５ｍ１）の一部を、ウサギ
網状赤血球ライセード（アマジャム社製）の系で翻訳さ
せ、合成された蛋白質？免疫学的方法（エンザイム・イ
ムノアッセイ法）（Ｊ。

Ｐｈａｒｍ、Ｄｙｎ−，５３９４−４０２（１９８２）
　）で調べ（２）　　ｍＲＮＡのアニーリングとｃＤＮ
Ａの合成：（１）で得られた分画を用い、岡山−Ｂｅｒ
ｇの方法ＣＭｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌｏ、　２．１６
１−１７０（１９８２）　］に従って以下のように合成
した。

あらかじめ５０　ｍＭＴｒｉｓ　（ｐＨ８，３）　、　
３０ｍＭＫＣ。

０．３ｍＭジチオスレイト−＃（ＤＴＴ）、８　ｍＭ　
Ｍｇ　ＣＩ２．４０μｇ／　ｍｌアクチノマイシンＤ、
各２　ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、
３０μＣＩ　（α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ　（６００Ｃｉ　
／ｍｍｏｌ）　（ＮＥＮ社製）、２８０単位のりボヌク
レアーゼインヒビター（和光紬薬社製）、および２．８
μｇのプラスミドプライマー〔大腸菌プラスミドｐＳＶ
　７１８６　（ファルマシア社製）を用い、岡山−Ｂｅ
ｒｇ法に順じて合成したＴ−テーリング約６０塩基のプ
ライマー〕を含む溶液１０μｌを調製し、３７℃に保つ
。次に１０　ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）、ｌ　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡと３　ｐｇのｍＲＮＡを含む溶液１０μｌを調製し
、６５℃で５分間加温後直ちに３７℃に移した後、上記
溶液１０μｌと混合して、さらに５分間加温した。つづ
いて５単位の逆転写酵素（ライフサイエンス社製）を加
え、３７℃で２０分間加温した。２μｌの２５０　ｍＭ
　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）と１μｍの１０％ＳＤＳ溶液
を加えて反応を停止させた後、フェノール・クロロホル
ム抽出、エタノール沈澱をそれぞれ２回経て次の段階へ
進んだ。

（３）式（１）の塩基配列を含有するプラスミドの合成
：（２）で得られた沈澱物を１４０　ｍＭカコジル酸ナ
ト　リ　ウ　Ａ　　−３０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　　（ｐＨ
６，８）　、　１　　ｍＭ　Ｃｏ　Ｃ＋２．０、１　ｍ
Ｍ　ＤＴＴ、１　ｍＭ　ｄＣＴＰおよび５０　μｃｉ　
［：α−３２Ｐ　）　ｄｃＴＰを含む溶液に溶かし、３
７℃で２〜３分間加温後、Ｉ８単位のターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ファルマシア社
製）を加え、全体を１５μ■とした。３７℃で３分間加
温した後、逆転写反応と同様な後処理を行ってエタノー
ル沈澱物を得た。

次に該沈澱物を５０　ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ（ｐＨ８，０）、１０　ｍＭ　Ｍｇ　ＣＩ２．１ｏ
ｏμｇウシ血清アルブミ７　（ＢＳＡ）、およびＩ２単
位のＢｉｎｄ　ｍにツポンジーン社製）を含む溶液に俗
かして３７℃、２〜４時間加温した。フェノール・クロ
ロホルム抽出、エタノール沈澱後、こし３１０μｍのｌ
　ＯｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７，３）、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ
を含む溶液に溶かし、さらに３μｍのエタノールを加え
て全体を１３μｍとした。この溶′Ｍ、１μｍに０、０
４　ｐｍｏｌのオリゴ（ｄＧ）リンカ−〔大腸菌プラス
ミドｐｓｖｌ’９３２（ファルマシア社製）を用い、岡
山−Ｂｅｒｇ法に順じて合成したｄＧ−テーリング約１
２塩基のリンカ−〕、Ｉ１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７
，５）、０．１　ＭＮａＣＩ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡの１
０倍！Ｉ縮液１μｍと蒸留水８μｍを加えて全体を１０
μｍとし、該溶版乞６５°０５分間、４２°Ｇ３０分間
と経時加温後０℃に保った。これに２０　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｇ　（ｐＨ７、５）　、　４　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０
　ｍＭ硫酸アンモニウム、０、１　ＭＫ　ＣＩ、５０　
μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、０．１　ｍＭβ−ニコチンアミド
アデノシンジヌクレオチド（ＮＡＤ）おヨヒ０．６μｇ
の大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ファルマシア社）を含む濃縮
ｇ７加えて最終的に該濃度溶液１００μｍとし、１２℃
で一夜茄温した。次いで、各２０　ｍＭを含んだｄＡＴ
Ｐ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧ’ｒＰおよびＴＴＰを０．４　
Ａ１．１．５　ｍＭβ−ＮＡＤを１μｍ、大腸菌ＤＮＡ
リガーゼを０４μｇ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１を０
．３μｇ、そして大腸菌リボヌクレアーゼＨを１単位そ
れぞれ添加して（全体として１０４μ■）、さらに１２
℃で１時間、２５℃で１時間加温した。

（４）大腸菌への形質転換。

大腸菌としてχ１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４）を使用
した。コンピテントセルはＭａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌ
ｅｃｕｊａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　ｃｏｌｄ　ｓｐｒ
ｉｎｇ　ｈａｒｂｏｒ　ｈａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　。

２５４−２５５（１９８２）］と全く同様の方法で調製
し、０．２　ｍｌづつ分注した。該ＤＮＡ溶液を２０μ
ｌづつ５本形質転換し、バクトドリプトン１゜ｇ／ｌ、
イーストエクストラクト５ｇ／ｌ、ジアミノピメリン酸
０．０１％、チミジン０．００４％およびアンピシリン
（Ａｐ）ｓｏμｇ／ｍｌを含む１．５％寒天培地上にコ
ロニー約３万個を得た。

（５）　　コロニーハイブリダイゼーシジン：得られた
コロニーのうち約１万個を同組成の寒天培地上に移し換
え（５１２個／　１４　Ｘ　１０　ｃｍプレート；２枚
１組とし、１枚をマスタープレートとして保存した。）
、直径約３ｍｍに成長するまで培養した。これにワット
マン５４１０紙をゆっくりとのせ、コロニーを完全に口
紙に移行させてから、クロラムフェニコール２５０μｇ
／ｍｌを含む同組成寒天培地上に該口紙を密着させ一昼
夜培養した。口紙へのＤＮＡ固定は次のように行った。

培養後の口紙を０．５　Ｍ　Ｎａ　ＯＨで５分間、２回
処理し、０．５ＭＴｒｉｓ　（ｐＨ７，４）で中性にも
どし、２Ｘ　ＳＳＣ（ｐＨ７）　（１ｘｓｓｃ　：　０
．１５ＭＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム）
処理χ経、９５％エタノール水溶液で軽く洗浄した後風
乾した。プローブとして（Ａ）１７ヌクレオチド：ＡＡ
（ＴｏｒＣ）　ＴＴ　（ＴｏｒＣ）ＧＡ（ＡｏｒＧ）　
ＣＡ（ＡｏｒＧ）ＡＡ（ＡｏｒＧ）ＧＡの３２種類（Ｂ
　１４　ヌクレオチド：ＧＡ（ＴｏｒＣ）ＣＡ（Ｔｏｒ
Ｃ）ＴＧ（ＴｏｒＣ）ＡＴ　（Ｔ、　ＣｏｒＡ）ＡＴの
２４種種類上れぞれトリエステル法で化学合成し、以下
に述べるハイブリダイゼーションに使用した。

（イ）　プレハイブリダイゼーション 口紙を６　ｘ　ＳＥＴ　（１ｘＳＥＴ　：　０．１５Ｍ
ＮａＣ１，０，０１５ＭＴｒｉｓ　（ｐＨ７，５）、１
　ｍＭ　ＥＤＴＡ）、０．５％ソニデットＰ４０（半井
化学社裂〕および１００μｇ　／　ｍｌの変性大腸菌Ｄ
ＮＡ（ファルマシア社製の大腸囚ＤＮＡχ５分間煮沸後
急冷したもの）を含む溶液で５５℃、２時間茄温した。

（ロ）ハイブリダイゼーション 次に変性大腸菌ＤＮＡの代りに１００μｇ／ｍｌの酵母
ｔＲＮＡ　（ＢＲＬ社裂）ト、（ｒ−３２ＰＩＡＴＰ（
５０００Ｃｉ　／ｍｍｏｌ　ＮＥＮ社！りとポリヌクレ
オチドキナーゼ（ＮＥＢ社製）を用いて５′位を［：”
Ｐ］標識したプローブ０．２μｇ／ｍｌと２用いて２９
℃、２時間ハイブリダイゼーションを行った。

（ハ）式（１）の塩基配列を含むプラスミドの単離洗浄
は各々（Ａ）３９℃で５分間（Ｂ）２９℃で２０分間、
続いて室温で１０分間の処理？６ｘ　ｓｓｃ溶液を用い
て各段階３回づつ繰返した。

０ｉ＝ａ＝に乾後、Ｘ線フィルム（コダソクＸＡＲｓ）
を用いてオートラジオグラフィーを行ない、ＦＡ）ｉＢ
）両方にポジティブなコロニー？１個選別し、その菌体
よりプラスミド音数り出し、そのプラスミドをｐＨ８３
２３７と命名した。

（６）発現ベクターの構築 大腸菌プラスミドＩ）ＵＣｌ３（ファルマシア社裂）上
のラクトース・プロモーターに最近接したＨａｅ　ｎ　
部位暑切断後、エキソヌクレアーゼＢａｔ３１　（ＮＥ
Ｂ社製）で両ｉ’に約１００　ｂｐ削除り。

Ｔ４　ＤＮＡ　リガーゼ（宝酒造社裂）で再閉環させた
プラスミドｐΔＵＣｔａを調製した（このプラスミドは
ラクトース・プロモーターとしての機能２失っている）
。次いでこのプラスミドのＨｉｎｃ　Ｕ切断部位にＴｒ
ｐＡターミネータ−（ファルマシア社製）を挿入し、プ
ラスミドｐΔＵＣＴ１３を得た。

（Ａ）　　ＳＯＤ？コードするＤＮＡの調製前記（５）
の（ハ）で得られたｐＨ３３２３７をＰｖｕ　ＩＩで消
化し、Ｘｂａ　Ｉ　リンカ−（ＮＥＢ社製）をＴ４ＤＮ
ＡＩノーガーゼで連結してＸｂａ　１部位を設けこのプ
ラスミドをｐＨ３Ｘ３２３７と命名した。

ｐＨ３Ｘ３２３７をＰｓｔ　Ｊで消化し、エキソヌクレ
アーゼＢａ１３１で遂次消化した。さらにＴ４ＤＮＡ　
、ｔ’　ＩＪメラーゼで末端を平滑にそろえ、ＢａｍＨ
Ｉ　ＩＪンカー（宝酒造社製）を連結してＢａｍＨＩと
Ｘｂａｌ（いずれもニラポン・ジーン社製）で消化後約
６３０〜７００　ｂｐのＤＮＡを２−１６％グラジェン
トポリアクリルアミドゲルで回収した。

（Ｂ）　　ＴａｃプロモーターおよびＳＯＤ　ＤＮＡを
挿入したプラスミドの調製 プラスミドＩ）ＤＲ５４０（ファルマシア社裂）ンＥｃ
ｏＲＩ　（二ｙボン・ジーン社製）とＢａｍＨＩで消化
しＴａｃプロモーター？含む１２１ｂｐ馨ボリアクリル
アミドゲルで回収し、ｐｊＵｃＴ＋３のＥｃｏＲＩ　−
ＢａｍＨＩ間に挿入して得られた約３Ｋｂのプラスミド
をｐＴａｃ　Ｉと命名した（第３図）。

ｐＴａｃ　ＴのＢａｍＨＩ　−Ｘｂａ　１間に（７）（
Ａ）で得られた約６３０−７００ｂｐのＤＮＡ　ｙａ−
挿入して得られたプラスミドを大腸菌ＤＨＩ　（ＡＴＣ
Ｃ３３８４９）に形質転換した。得られた種々のプラス
ミドの塩基配列を決定し、ＳＤ配列（ＡＧＧＡ）から開
始コドンＡＴＧまでの距離が８〜１３ヌクレオチド長の
プラスミドをｐＴａｃ　ＳＯＤ　８〜１３と命名した。

（７）　　ランナウェイ型ＳＯＤ発現ベクターの構築Ａ
ＴＣＣより購入したランナウェイプラスミドｐＭＯＢ　
４５　（ＡＴＣＣ３７１０６）　（Ｍ−Ｂｉｔｔｅｒ　
ａｎｄＤ、Ｖａｐｎｅｋ、Ｇｅｎｅ　１５．３１９−３
２９．　（１９８１））をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ　ｍ　
（宝酒造、以下すべて同社製品）で切断し、ランナウェ
イ複製起点を含む６．７ＫｂのＤＮＡ断片を切り出した
。このＤＮＡを精製し、Ｂａ１３１酵素で処理し、両端
径々０．３　Ｋｂぐらい消化後、ＤＮＡポリメラーゼで
処理してＤＮＡ’末端を平滑にした。一方、ＡＴＣＣよ
り購入したｐＢＲ３２２をＴｔｈ　１１１　ＩＩで切断
しアンピシリン耐性遺伝子を含む１．３　ＫｂのＤＮＡ
を切り出した。このＤＮＡも精製後、上記方法と同様に
Ｂａｌ　３１酵素、ＤＮＡポリメラーゼでｌｌ１Ｒ処理
した。こうして得られた２本のＤＮＡ断片を等モルで混
合し、更にＢｉｎｄ［Ｉリンカ−及びＥｃｏＲＩリンカ
−（宝酒造）を１０倍モル量加えてから、Ｔ　４　ＤＮ
Ａリガーゼで処理し、ＤＮＡを連結した。

次に、このＤＮＡ試料を大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２
７３２５）株へＭＬｎｉａｔｉｓらの方法で（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎ
ｇ　ｈａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　２５４−２
５５（１９８２）、形質転換し、アンピシリン耐性株を
選別した。任意に選んだ１２株について、その保有する
プラスミドの制限酵素解析を行った。

この結果、上記２本のＤＮＡ断片が連結し、かつひとつ
の連結部にのみ２種のリンカ−（ＨｉｎｄｌＩＩとＥｃ
ｏＲＩ　）が挿入されたプラスミドｐＲ４が得られた。

次にｐＲ４をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断して開
裂し、この部位間にｐΔＵＣＴ、、　　　（前記（６）
（３）参照）に由来し、マルチクローニング部位と転写
終結因子を含む０．４　ＫｂのＥｃｏ　ＲＩ　−Ｈｌｎ
ｄ　ｍ断片を挿入してｐＲ３を構築した。更に、このｐ
Ｒ３をＥｃｏＲＩとＸｂａ　Ｔで切断開裂し、この部位
間にｐＴａｃｓＯＤ８〜１３（前記（６）　（Ｂ）参照
）に由来しｔａｃプロモーターとヒトＳＯＤ遺伝子乞含
む約０．７　ＫｂのＥｃ。

ＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉ　ＤＮＡ断片？挿入し、ｐＲＴａｃ
　Ｓ０４　８〜１３を構築した。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）カゼイン加水分解物、酵母エキス、無機塩及び大
   腸菌資化性炭素源を必須成分とする培地中で組換え遺伝
   子を持つ大腸菌を培養し、その培養物より、組換え遺伝
   子産物を採取する事を特徴とする組換え遺伝子産物の製
   法
2. （２）カゼイン加水分解物、酵母エキス、無機塩及び大
   腸菌資化性炭素源を必須成分とする組換え遺伝子をもつ
   大腸菌用の新規改良培地