JP2890168B2 - 新規アミノペプチダーゼ - Google Patents
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- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はストレプトマイセス・サ
ーモニトリフィカンス (Streptomyces thermonitrifica
ns)の培養液から分離した新規アミノペプチダーゼ（ami
nopeptidase);前記微生物を培養することによって前記
アミノペプチダーゼを製造する方法；および前記アミノ
ペプチダーゼを用いた天然形組換え蛋白の製造方法に関
する。アミノペプチダーゼは蛋白の１次構造決定、薬剤
開発等において産業的用途を有し、特に、組換えＤＮＡ
技術を使用して微生物によって産生された、N-末端にメ
チオニンを有したN-メチオニル組換え蛋白からN-末端メ
チオニンを除去させることによって天然蛋白のようなア
ミノ酸配列を有する組換え蛋白を製造することに有用で
ある。
ーモニトリフィカンス (Streptomyces thermonitrifica
ns)の培養液から分離した新規アミノペプチダーゼ（ami
nopeptidase);前記微生物を培養することによって前記
アミノペプチダーゼを製造する方法；および前記アミノ
ペプチダーゼを用いた天然形組換え蛋白の製造方法に関
する。アミノペプチダーゼは蛋白の１次構造決定、薬剤
開発等において産業的用途を有し、特に、組換えＤＮＡ
技術を使用して微生物によって産生された、N-末端にメ
チオニンを有したN-メチオニル組換え蛋白からN-末端メ
チオニンを除去させることによって天然蛋白のようなア
ミノ酸配列を有する組換え蛋白を製造することに有用で
ある。
【０００２】
【従来の技術】アミノペプチダーゼは多種類の微生物、
動物細胞等から見出され概ね活性維持のためにカルシウ
ムまたは亜鉛等を求める金属プロテアーゼ（metallo-pr
otease)である。これら酵素等は一般的に５０〜７０℃
の温度においても活性を保有する共通点がある反面、種
によっていろいろな他の特性を有するものとしられてい
る。 組換えヒト蛋白にN-末端メチオニンが存在すると
ヒトに投与される際望まない免疫反応を起こすことがあ
るので、N-末端メチオニンを除去し、１次アミノ酸配列
がヒトから由来したものと同一な成熟した真核蛋白を製
造することが好ましい。 ロンカリおよびジュバー（G.
Roncari and H.Zuber, Methodin Enzymology,19, 544
(1970)）はバシラス・ステアロサーモフィルロス（Baci
llus stearothermophilus)から特性が少しづつ異なる３
つのアミノペプチダーゼを発見して報告し、ウワジマ等
(TakayuriUwajima, etal., Agr.Biol.Chem., 37 (12),2
727(1973)）はストレプトマイセス・ペプチドファシエ
ンス（Streptomyces peptidofaciens)ＫＹ２３８９から
由来した、カルシウムを求めるアミノペプチダーゼの物
理化学的性質を報告した。
動物細胞等から見出され概ね活性維持のためにカルシウ
ムまたは亜鉛等を求める金属プロテアーゼ（metallo-pr
otease)である。これら酵素等は一般的に５０〜７０℃
の温度においても活性を保有する共通点がある反面、種
によっていろいろな他の特性を有するものとしられてい
る。 組換えヒト蛋白にN-末端メチオニンが存在すると
ヒトに投与される際望まない免疫反応を起こすことがあ
るので、N-末端メチオニンを除去し、１次アミノ酸配列
がヒトから由来したものと同一な成熟した真核蛋白を製
造することが好ましい。 ロンカリおよびジュバー（G.
Roncari and H.Zuber, Methodin Enzymology,19, 544
(1970)）はバシラス・ステアロサーモフィルロス（Baci
llus stearothermophilus)から特性が少しづつ異なる３
つのアミノペプチダーゼを発見して報告し、ウワジマ等
(TakayuriUwajima, etal., Agr.Biol.Chem., 37 (12),2
727(1973)）はストレプトマイセス・ペプチドファシエ
ンス（Streptomyces peptidofaciens)ＫＹ２３８９から
由来した、カルシウムを求めるアミノペプチダーゼの物
理化学的性質を報告した。
【０００３】またバシラス・サブチリス (Bacillus sub
tilis) (Fred W.Wagner et al., Arch. Biochem. Bioph
ys., 197 (1), 63-72 (1979)）,ストレプトマイセス・
リモスス（Streptomyces rimosus) (Lj. Vitale et a
l., Appl.Microbiol. Biotechnol.,23,449-455(198
6)）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces
griseus)(K.D.Vosbecket al., J. Biol. Chem.,238, 6
029-6034 (1973))等からアミノペプチダーゼが分泌され
ることが報告された。
tilis) (Fred W.Wagner et al., Arch. Biochem. Bioph
ys., 197 (1), 63-72 (1979)）,ストレプトマイセス・
リモスス（Streptomyces rimosus) (Lj. Vitale et a
l., Appl.Microbiol. Biotechnol.,23,449-455(198
6)）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces
griseus)(K.D.Vosbecket al., J. Biol. Chem.,238, 6
029-6034 (1973))等からアミノペプチダーゼが分泌され
ることが報告された。
【０００４】スパンジンとブルラムバーグは土壌から分
離したストレプトマイセス・グリセウスの培養液を熱処
理、バイオゲルＰ−４ゲル濾過(Bio-Gel P-4 gel filtr
ation).ＤＥＡＥ−セファロースイオン交換クロマトグ
ラフィの過程でN-末端配列がＡｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−
Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕで始めてＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る分子量は約３３ＫＤであるアミノペプチダーゼを分離
した (Anya Spungin and Shmaryahu Blumberg, Eur.J.
Biochem.,183, 471-477 (1989))。
離したストレプトマイセス・グリセウスの培養液を熱処
理、バイオゲルＰ−４ゲル濾過(Bio-Gel P-4 gel filtr
ation).ＤＥＡＥ−セファロースイオン交換クロマトグ
ラフィの過程でN-末端配列がＡｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−
Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕで始めてＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る分子量は約３３ＫＤであるアミノペプチダーゼを分離
した (Anya Spungin and Shmaryahu Blumberg, Eur.J.
Biochem.,183, 471-477 (1989))。
【０００５】最近、主に商業的に供給されるプロナーゼ
(pronase)という酵素はストレプトマイセス・グリセウ
スＫ−１菌株（K-1 strain)から分離されたもので、こ
れにはいろいろな蛋白分解酵素が混合されているので、
組換え蛋白のN-末端に存在するメチオニンのみを除去す
るには効果的でない。
(pronase)という酵素はストレプトマイセス・グリセウ
スＫ−１菌株（K-1 strain)から分離されたもので、こ
れにはいろいろな蛋白分解酵素が混合されているので、
組換え蛋白のN-末端に存在するメチオニンのみを除去す
るには効果的でない。
【０００６】一方、微生物を用いた組換えヒト由来蛋白
の製造時N-末端にメチオニンが付加され、産生された蛋
白からN-末端メチオニンを除去して天然形蛋白を製造し
ようとする試図が多くあった。例えば、ヒト成長ホルモ
ンのN-末端と異なる蛋白質のＣ−末端を融合、発現させ
た後、特殊なプロテアーゼ (protease)を用いて切断す
る方法 (PCT国際公開第ＷＯ８９／１２６７８号、ＥＰ
公告第２０２９０号および第３２１９４０号)および蛋
白を細胞内で発現させ宿主細胞外へ分泌される時メチオ
ニンが切断、除去されるようになすことによって培地か
ら天然形蛋白質を収得する方法等がある。（ＥＰ公開第
００８８６３２ Ａ２号；米国特許第４７５５４６５
号；日本特許公開第０１２７３５９１号；ＥＰ公告第３
０６６７３号；大韓民国特許公開第９４−５７９号）。
前記の方法等は収率が低く、天然形組換え蛋白と融合蛋
白が類似する物理的特性を有する場合目的とする天然形
組換え蛋白を分離するに難しく、新しくベクターを作っ
て宿主細胞を形質転換させる等の煩わしい操作と発現条
件を最適化させる努力が付加的に必要とする欠点があ
る。
の製造時N-末端にメチオニンが付加され、産生された蛋
白からN-末端メチオニンを除去して天然形蛋白を製造し
ようとする試図が多くあった。例えば、ヒト成長ホルモ
ンのN-末端と異なる蛋白質のＣ−末端を融合、発現させ
た後、特殊なプロテアーゼ (protease)を用いて切断す
る方法 (PCT国際公開第ＷＯ８９／１２６７８号、ＥＰ
公告第２０２９０号および第３２１９４０号)および蛋
白を細胞内で発現させ宿主細胞外へ分泌される時メチオ
ニンが切断、除去されるようになすことによって培地か
ら天然形蛋白質を収得する方法等がある。（ＥＰ公開第
００８８６３２ Ａ２号；米国特許第４７５５４６５
号；日本特許公開第０１２７３５９１号；ＥＰ公告第３
０６６７３号；大韓民国特許公開第９４−５７９号）。
前記の方法等は収率が低く、天然形組換え蛋白と融合蛋
白が類似する物理的特性を有する場合目的とする天然形
組換え蛋白を分離するに難しく、新しくベクターを作っ
て宿主細胞を形質転換させる等の煩わしい操作と発現条
件を最適化させる努力が付加的に必要とする欠点があ
る。
【０００７】しかしながら、N-メチオニル組換え蛋白の
N-末端に存在するメチオニンのみを選択的に除去できる
特殊なアミノペプチダーゼを用いれば、前記の欠点なく
して天然形蛋白を製造することができる (PCT国際公開
第ＷＯ８６／０４６０９およびＷＯ８６／２０４５２７
Ａ１号)。例えば、N-末端アミノ酸配列がMet-Phe-Pro-T
hr-Ileであるメチオニルヒト成長ホルモンの場合には、
N-末端のX-Pro（Ｘは任意のアミノ酸残基）部位を認知
して切断反応がＸ残基前で停止される特性を有している
アミノペプチダーゼを用いてN-末端メチオニンのみを選
択的に除去することができるし、その間でも酵素活性度
が高いものほど産業的に用いることが有利である。
N-末端に存在するメチオニンのみを選択的に除去できる
特殊なアミノペプチダーゼを用いれば、前記の欠点なく
して天然形蛋白を製造することができる (PCT国際公開
第ＷＯ８６／０４６０９およびＷＯ８６／２０４５２７
Ａ１号)。例えば、N-末端アミノ酸配列がMet-Phe-Pro-T
hr-Ileであるメチオニルヒト成長ホルモンの場合には、
N-末端のX-Pro（Ｘは任意のアミノ酸残基）部位を認知
して切断反応がＸ残基前で停止される特性を有している
アミノペプチダーゼを用いてN-末端メチオニンのみを選
択的に除去することができるし、その間でも酵素活性度
が高いものほど産業的に用いることが有利である。
【０００８】現在まで知られているN-末端メチオニン残
基除去による天然形組換え蛋白の製造に用いられるアミ
ノペプチダーゼではビブリオ・プロテオリチクス (Vibr
io proteolyticus)から抽出、精製したアミノペプチダ
ーゼ (WO86/01229, Bio-Technology General Corp.),
豚腎臓から抽出、精製したアミノペプチダーゼ (WO86/2
04527A1,武田（Takeda))等が報告されているが多様な基
質特異性および活性度を有するいろいろなアミノペプチ
ダーゼの開発が必要である。
基除去による天然形組換え蛋白の製造に用いられるアミ
ノペプチダーゼではビブリオ・プロテオリチクス (Vibr
io proteolyticus)から抽出、精製したアミノペプチダ
ーゼ (WO86/01229, Bio-Technology General Corp.),
豚腎臓から抽出、精製したアミノペプチダーゼ (WO86/2
04527A1,武田（Takeda))等が報告されているが多様な基
質特異性および活性度を有するいろいろなアミノペプチ
ダーゼの開発が必要である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】このような事実等に根
拠して本発明者等は新しいアミノペプチダーゼを開発す
るための研究を継続した末にストレプトマイセス・サー
モニトリフィカンスがガラクトースを炭素源として培養
される時該培養液内にアミノペプチダーゼ活性が増加す
ることを見出して、それから従来に知られたアミノペプ
チダーゼと著しく異なる特性を示す新しいアミノペプチ
ダーゼを分離し、その作用のための最適反応条件を確立
して本発明を完成した。
拠して本発明者等は新しいアミノペプチダーゼを開発す
るための研究を継続した末にストレプトマイセス・サー
モニトリフィカンスがガラクトースを炭素源として培養
される時該培養液内にアミノペプチダーゼ活性が増加す
ることを見出して、それから従来に知られたアミノペプ
チダーゼと著しく異なる特性を示す新しいアミノペプチ
ダーゼを分離し、その作用のための最適反応条件を確立
して本発明を完成した。
【００１０】本発明の目的はストレプトマイセス・サー
モニトリフィカンス培養液から分離された新規アミノペ
プチダーゼを提供するものである。
モニトリフィカンス培養液から分離された新規アミノペ
プチダーゼを提供するものである。
【００１１】本発明の他の目的はストレプトマイセスサ
ーモニトリフィカンスを培養することを含む、前記アミ
ノペプチダーゼの製造方法を提供するものである。
ーモニトリフィカンスを培養することを含む、前記アミ
ノペプチダーゼの製造方法を提供するものである。
【００１２】本発明のまた他の目的は前記アミノペプチ
ダーゼを用いて、N-メチオニル組換え蛋白のN-末端メチ
オニンを除去することによって、天然形組換え蛋白を製
造する方法を提供するものである。
ダーゼを用いて、N-メチオニル組換え蛋白のN-末端メチ
オニンを除去することによって、天然形組換え蛋白を製
造する方法を提供するものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】以下本発明を詳細に説明
すれば次のようである。
すれば次のようである。
【００１４】本発明のアミノペプチダーゼはＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上での分子量（即ち、還元状態の分子量）は約４
１〜４５ＫＤであり、ゲル濾過クロマトグラフィーで測
定した分子量（即ち、天然状態の分子量）は約３６〜４
０ＫＤである新規アミノペプチダーゼである。
ＡＧＥ上での分子量（即ち、還元状態の分子量）は約４
１〜４５ＫＤであり、ゲル濾過クロマトグラフィーで測
定した分子量（即ち、天然状態の分子量）は約３６〜４
０ＫＤである新規アミノペプチダーゼである。
【００１５】本発明のアミノペプチダーゼはN-末端のア
ミノ酸配列がＬｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｕであり、内部にＧｌｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ
−ＰｒｏおよびＡｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒのアミノ酸配列を含む。
ミノ酸配列がＬｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｕであり、内部にＧｌｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ
−ＰｒｏおよびＡｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒのアミノ酸配列を含む。
【００１６】なお、合成基質を用いた試験でロイシンに
対しては特異的に作用するが、リシン等と共に陽電荷を
ともなったアミノ酸に対しては反応が制限的に進行され
るので、通常的にロイシンアミノペプチダーゼに分類す
ることができる。
対しては特異的に作用するが、リシン等と共に陽電荷を
ともなったアミノ酸に対しては反応が制限的に進行され
るので、通常的にロイシンアミノペプチダーゼに分類す
ることができる。
【００１７】本発明のアミノペプチダーゼはｐＨ７．５
〜９．０，もっと好ましくはｐＨ８．０〜８．５にても
っとも高い活性を示し、２０〜７０℃，さらに好ましく
は３０〜５０℃の温度にてもっとも高い活性を示し、５
０℃の温度にても数時間安定した活性を保有する特性が
ある。また亜鉛やマグネシウム等二価金属イオンの存在
時活性が増加し、これら金属イオンがオルトフェナント
ロリン(orthophenanthroline)等と同じ物質と錯化合物
を形成するようになると活性を失う金属プロテア−ゼで
ある。
〜９．０，もっと好ましくはｐＨ８．０〜８．５にても
っとも高い活性を示し、２０〜７０℃，さらに好ましく
は３０〜５０℃の温度にてもっとも高い活性を示し、５
０℃の温度にても数時間安定した活性を保有する特性が
ある。また亜鉛やマグネシウム等二価金属イオンの存在
時活性が増加し、これら金属イオンがオルトフェナント
ロリン(orthophenanthroline)等と同じ物質と錯化合物
を形成するようになると活性を失う金属プロテア−ゼで
ある。
【００１８】本発明のアミノペプチダーゼはストレプト
マイセス・サーモニトリフィカンスを培養することによ
って得ることができる。産生されたアミノペプチダーゼ
の量は培地中の炭素源の種類によって異なるし、炭素源
としてはガラクトースがもっとも好ましいし、その濃度
は１〜５％、望ましくは２〜３％の濃度が好ましい。炭
素源としてガラクトースを使用することを除いた培地組
成は通常の培地組成、例えばエドワードおよびボールの
文献 (C. Edwards and A.S.Ball,FEMS Microbiol.Let
t., 40, 61-66 (1987))に記載された組成を使用するこ
とができる。培養が完了した後、培養液を遠心分離して
上澄液を得て；上澄液に２０〜６０％（重量／容量）、
好ましくは３０〜５０％（重量／容量）の硫酸アンモニ
ウムを加え；適切な濃度の硫酸アンモニウムを含む前記
上澄液に第三級ブタノールを加えることによって上澄液
を三相分割（R. Lovrien et al., Protein Purificatio
n Micro to Macro, Alan R. Liss, Inc., New York, pp
131-148 (1987))させ下層の清い溶液を得て（１次三相
分割）；前記清い溶液に硫酸アンモニウムを７０〜１０
０％（重量／容量）、好ましくは８０〜９０％（重量／
容量）の濃度で加え、産生された溶液をさらに三相分割
の手続きを経るようにして第三級ブタノール層（上層）
および水性層（下層）の間に凝結物 (aggregates)の形
態で存在する、目的蛋白を含む中間層を得て；前記中間
層を緩衝液に溶解させた後、例えば、Ｓ−セファロース
カラムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー、例え
ばＦＰＬＣモノーＳカラムを用いたＦＰＬＣ(FastPerfo
rmanceLiquid Chromatography:Sweden Pharmacia社)過
程を経ることによって高純度で精製されたアミノペプチ
ダーゼを得ることができる。
マイセス・サーモニトリフィカンスを培養することによ
って得ることができる。産生されたアミノペプチダーゼ
の量は培地中の炭素源の種類によって異なるし、炭素源
としてはガラクトースがもっとも好ましいし、その濃度
は１〜５％、望ましくは２〜３％の濃度が好ましい。炭
素源としてガラクトースを使用することを除いた培地組
成は通常の培地組成、例えばエドワードおよびボールの
文献 (C. Edwards and A.S.Ball,FEMS Microbiol.Let
t., 40, 61-66 (1987))に記載された組成を使用するこ
とができる。培養が完了した後、培養液を遠心分離して
上澄液を得て；上澄液に２０〜６０％（重量／容量）、
好ましくは３０〜５０％（重量／容量）の硫酸アンモニ
ウムを加え；適切な濃度の硫酸アンモニウムを含む前記
上澄液に第三級ブタノールを加えることによって上澄液
を三相分割（R. Lovrien et al., Protein Purificatio
n Micro to Macro, Alan R. Liss, Inc., New York, pp
131-148 (1987))させ下層の清い溶液を得て（１次三相
分割）；前記清い溶液に硫酸アンモニウムを７０〜１０
０％（重量／容量）、好ましくは８０〜９０％（重量／
容量）の濃度で加え、産生された溶液をさらに三相分割
の手続きを経るようにして第三級ブタノール層（上層）
および水性層（下層）の間に凝結物 (aggregates)の形
態で存在する、目的蛋白を含む中間層を得て；前記中間
層を緩衝液に溶解させた後、例えば、Ｓ−セファロース
カラムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー、例え
ばＦＰＬＣモノーＳカラムを用いたＦＰＬＣ(FastPerfo
rmanceLiquid Chromatography:Sweden Pharmacia社)過
程を経ることによって高純度で精製されたアミノペプチ
ダーゼを得ることができる。
【００１９】本発明によって、N-末端にメチオニン残基
を有する蛋白質、例えばN-メチオニルヒト成長ホルモン
を反応緩衝液中に最適反応条件下でストレプトマイセス
・サーモニトリフィカンスから分離されたアミノペプチ
ダーゼで処理して天然形組換え蛋白質を製造する方法が
提供される。
を有する蛋白質、例えばN-メチオニルヒト成長ホルモン
を反応緩衝液中に最適反応条件下でストレプトマイセス
・サーモニトリフィカンスから分離されたアミノペプチ
ダーゼで処理して天然形組換え蛋白質を製造する方法が
提供される。
【００２０】前記メチオニル蛋白としては通常の精製方
法によって大腸菌、酵母等の宿主細胞から得られた全て
のメチオニル蛋白を使用することができ、使用する蛋白
の分子量によってアミノペプチダーゼの量が異なるがメ
チオニルヒト成長ホルモンの場合１mg当り０．２〜２０
ユニットのアミノペプチダーゼを使用して処理すること
が好ましい。
法によって大腸菌、酵母等の宿主細胞から得られた全て
のメチオニル蛋白を使用することができ、使用する蛋白
の分子量によってアミノペプチダーゼの量が異なるがメ
チオニルヒト成長ホルモンの場合１mg当り０．２〜２０
ユニットのアミノペプチダーゼを使用して処理すること
が好ましい。
【００２１】N-末端メチオニンの製造に使用された反応
緩衝液、例えば、トリス−ＨＣｌは７．５〜９．５，好
ましくは８．０〜８．５のｐＨ範囲および０〜３００ｍ
Ｍ，好ましくは０〜１００ｍＭのＮａＣｌ濃度を有する
ことができる。
緩衝液、例えば、トリス−ＨＣｌは７．５〜９．５，好
ましくは８．０〜８．５のｐＨ範囲および０〜３００ｍ
Ｍ，好ましくは０〜１００ｍＭのＮａＣｌ濃度を有する
ことができる。
【００２２】反応は２０〜５０℃、好ましくは３０〜４
０℃範囲の温度で１０〜２０時間行うことができる。
０℃範囲の温度で１０〜２０時間行うことができる。
【００２３】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
いが実施例で使用された試験方法は別に言及しない限り
下記の参照例によって行うことができる。
明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
いが実施例で使用された試験方法は別に言及しない限り
下記の参照例によって行うことができる。
【００２４】本明細書で使用される％は別途の言及がな
い場合固体／固体は重量／重量、固体／液体は重量／容
量、液体／液体は容量／容量％をそれぞれ示す。
い場合固体／固体は重量／重量、固体／液体は重量／容
量、液体／液体は容量／容量％をそれぞれ示す。
【００２５】参照例：酵素活性の測定 酵素活性はプレイダラー(Pfleiderer, Meth. Enzymol.,
19,514-521(1970))の方法によって測定された。５０％
DMSO(dimethylsulfoxide;米国シグマ (sigma)社から購
入)に溶解された２５mg／mlのロイシン−パラニトロア
ニリド (Leucine-paranitroanilide;米国シグマ社から
購入)２０マイクロリットルを基質として含む緩衝液 (1
00mMトリス、pH8.0)１mlにアミノペプチダーゼを加えて
３７℃で１分間反応させ、４０５ｎｍで光学密度 (OD
405nm)を測定した。酵素活性度１単位はＯＤ405nmを１
だけ増加させる酵素の量で定義された。
19,514-521(1970))の方法によって測定された。５０％
DMSO(dimethylsulfoxide;米国シグマ (sigma)社から購
入)に溶解された２５mg／mlのロイシン−パラニトロア
ニリド (Leucine-paranitroanilide;米国シグマ社から
購入)２０マイクロリットルを基質として含む緩衝液 (1
00mMトリス、pH8.0)１mlにアミノペプチダーゼを加えて
３７℃で１分間反応させ、４０５ｎｍで光学密度 (OD
405nm)を測定した。酵素活性度１単位はＯＤ405nmを１
だけ増加させる酵素の量で定義された。
【００２６】実施例１：培養時の炭素源によるアミノペ
プチダーゼ産生量の変化 ２５％（容量／容量）グリセロール、１．０％ペプト
ン、０．５％カザミノ酸、０．５５％リン酸カリウム二
塩基酸、０．０５％リン酸カリウム一塩基酸および３．
０％Ｄ−ガラクトースを濡れた細胞重量を基準として１
０〜３０％の濃度で含む種保存培地に懸濁されたストレ
プトマイセス・サーモニトリフィカンス (ATCC 23385)
菌糸体１mlを１．０％ペプトン、０．５％酵母エキスお
よび、グルコース、ガラクトース、マンノース、ラクト
ースおよびスクロースでなるグループから選択された
２．０％の炭素源を含む培地に接種して、５０℃で培養
した。１９、２４、３９時間ごとに各培養液１mlを取っ
た後、遠心分離器 (Millipore,U.S.A.)で遠心分離 (13,
000×g, 5分)して得た上澄液に存在するアミノペプチダ
ーゼの活性度を測定した。測定されたそれぞれの活性度
はガラクトースを炭素源として３９時間培養した時の活
性度 (unit/ml)を１００(%)として比較し該結果を次の
表１に示した。
プチダーゼ産生量の変化 ２５％（容量／容量）グリセロール、１．０％ペプト
ン、０．５％カザミノ酸、０．５５％リン酸カリウム二
塩基酸、０．０５％リン酸カリウム一塩基酸および３．
０％Ｄ−ガラクトースを濡れた細胞重量を基準として１
０〜３０％の濃度で含む種保存培地に懸濁されたストレ
プトマイセス・サーモニトリフィカンス (ATCC 23385)
菌糸体１mlを１．０％ペプトン、０．５％酵母エキスお
よび、グルコース、ガラクトース、マンノース、ラクト
ースおよびスクロースでなるグループから選択された
２．０％の炭素源を含む培地に接種して、５０℃で培養
した。１９、２４、３９時間ごとに各培養液１mlを取っ
た後、遠心分離器 (Millipore,U.S.A.)で遠心分離 (13,
000×g, 5分)して得た上澄液に存在するアミノペプチダ
ーゼの活性度を測定した。測定されたそれぞれの活性度
はガラクトースを炭素源として３９時間培養した時の活
性度 (unit/ml)を１００(%)として比較し該結果を次の
表１に示した。
【００２７】
【表１】 炭素源による培養液１ml当りアミノペプチダーゼの活性度(%) 炭素源 培養時間 グルコース ガラクトース マンノース ラクトース スクロース 19 4.7 48.4 26.4 14.7 12.8 24 48.4 58.9 37.6 35.3 25.2 39 15.5 100.0 45.0 22.1 22.1 実施例２：ストレプトマイセスサーモニトリフィカンス
の培養 先ず種培養のために２％ガラクトース、１．０％トリプ
トン、０．５％カザミノ酸、０．６％リン酸塩、０．０
１％ＭｇＳＯ4,０．０１％ＦｅＣｌ2、０．０１％Ｍｎ
Ｃｌ2および０．０１％ＺｎＣｌ2の組成の滅菌種培養培
地（最終ｐＨ７．４〜７．６）３００mlを１リットル容
量のフラスコに入れた。２５％（容量／容量）グリセロ
ール、１．０％ペプトン、０．５％カザミノ酸、０．５
５％リン酸カリウム二塩基酸、０．０５％リン酸カリウ
ム一塩基酸および３．０％Ｄ−ガラクトースを濡れた細
胞重量を基準として１０〜３０％の濃度で含む種保存培
地に懸濁されたストレプトマイセス・サーモニトリフィ
カンス (ATCC 23385)菌糸体１mlを前記滅菌培地に接種
しこれを５０℃で２０時間種培養した。
の培養 先ず種培養のために２％ガラクトース、１．０％トリプ
トン、０．５％カザミノ酸、０．６％リン酸塩、０．０
１％ＭｇＳＯ4,０．０１％ＦｅＣｌ2、０．０１％Ｍｎ
Ｃｌ2および０．０１％ＺｎＣｌ2の組成の滅菌種培養培
地（最終ｐＨ７．４〜７．６）３００mlを１リットル容
量のフラスコに入れた。２５％（容量／容量）グリセロ
ール、１．０％ペプトン、０．５％カザミノ酸、０．５
５％リン酸カリウム二塩基酸、０．０５％リン酸カリウ
ム一塩基酸および３．０％Ｄ−ガラクトースを濡れた細
胞重量を基準として１０〜３０％の濃度で含む種保存培
地に懸濁されたストレプトマイセス・サーモニトリフィ
カンス (ATCC 23385)菌糸体１mlを前記滅菌培地に接種
しこれを５０℃で２０時間種培養した。
【００２８】５リットル容量の発酵機４台を用いて本培
養を行って、各発酵機ごと３％ガラクトース、０．３％
トリプトン、０．３％カザミノ酸、１．４％スキムミル
ク、０．６％リン酸塩、０．０１％ＭｇＳ０4、０．０
１％ＦｅＣｌ2、０．０１％ＭｎＣｌ2および０．０１％
ＺｎＣｌ2の組成を有する滅菌培地（最終ｐＨ７．４〜
７．６）３リットルをそれぞれ入れて、前記で収得した
フラスコ培養液７０mlを接種した後、５００ｒｐｍ，５
０℃、１ｖｖｍの条件で１８時間〜２２時間培養した。
養を行って、各発酵機ごと３％ガラクトース、０．３％
トリプトン、０．３％カザミノ酸、１．４％スキムミル
ク、０．６％リン酸塩、０．０１％ＭｇＳ０4、０．０
１％ＦｅＣｌ2、０．０１％ＭｎＣｌ2および０．０１％
ＺｎＣｌ2の組成を有する滅菌培地（最終ｐＨ７．４〜
７．６）３リットルをそれぞれ入れて、前記で収得した
フラスコ培養液７０mlを接種した後、５００ｒｐｍ，５
０℃、１ｖｖｍの条件で１８時間〜２２時間培養した。
【００２９】実施例３：アミノペプチダーゼの精製 実施例２で収得した培養液 (約１０リットル）を１０、
０００×ｇで３０分間遠心機 (JA10 rotor,米国 Beckma
n社)で遠心分離して上澄液を取ってアミコン濃縮器 (Am
icon Spiral Cartridge, MWCO 10KD)を使用して約２リ
ットルのかさに濃縮した。
０００×ｇで３０分間遠心機 (JA10 rotor,米国 Beckma
n社)で遠心分離して上澄液を取ってアミコン濃縮器 (Am
icon Spiral Cartridge, MWCO 10KD)を使用して約２リ
ットルのかさに濃縮した。
【００３０】濃縮液に１００％硫酸アンモニウム溶液を
適切に加えて最終硫酸アンモニウム濃度が３３％にいた
るようにした後、この混合液に同一容量の第三級ブタノ
ール(t-butanol)を加え１時間撹拌した。生成された溶
液を１０、０００×ｇで１０分間遠心分離して下層の清
い溶液を回収した（１次三相分割）。
適切に加えて最終硫酸アンモニウム濃度が３３％にいた
るようにした後、この混合液に同一容量の第三級ブタノ
ール(t-butanol)を加え１時間撹拌した。生成された溶
液を１０、０００×ｇで１０分間遠心分離して下層の清
い溶液を回収した（１次三相分割）。
【００３１】この溶液にさらに硫酸アンモニウム粉末を
添加して最終濃度が９０％にいたるようにし、この混合
液に同一かさの第三級ブタノールを加え１時間の間撹拌
した後、１０、０００×ｇで１０分間遠心分離して中間
の蛋白凝結層を回収した（２次三相分割）。
添加して最終濃度が９０％にいたるようにし、この混合
液に同一かさの第三級ブタノールを加え１時間の間撹拌
した後、１０、０００×ｇで１０分間遠心分離して中間
の蛋白凝結層を回収した（２次三相分割）。
【００３２】凝結された蛋白を２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液(pH6.8)に溶かして、同一溶液に充分に透析さ
せた後、同一緩衝液で平衡されたＳ−セファロース ( 5
cm×10cm， Sweden Pharmacia 社)へ吸着させた後、０
〜１．０Ｍ ＮａＣｌ線形勾配を用いてアミノペプチダ
ーゼを溶出させた。
ム緩衝液(pH6.8)に溶かして、同一溶液に充分に透析さ
せた後、同一緩衝液で平衡されたＳ−セファロース ( 5
cm×10cm， Sweden Pharmacia 社)へ吸着させた後、０
〜１．０Ｍ ＮａＣｌ線形勾配を用いてアミノペプチダ
ーゼを溶出させた。
【００３３】溶出された活性分画をさらに２０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)に充分に透析させ同一緩衝
液で平衡されたＦＰＬＣモノ−Ｓカラム (0.5cm×5cm，
Sweden Pharmacia社)に吸着させて、０．３Ｍ ＮａＣ
ｌを含む前記緩衝液で一度洗った後、０．３〜０．８Ｍ
ＮａＣｌ線形勾配を用いてアミノペプチダーゼを溶出
させた。
酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)に充分に透析させ同一緩衝
液で平衡されたＦＰＬＣモノ−Ｓカラム (0.5cm×5cm，
Sweden Pharmacia社)に吸着させて、０．３Ｍ ＮａＣ
ｌを含む前記緩衝液で一度洗った後、０．３〜０．８Ｍ
ＮａＣｌ線形勾配を用いてアミノペプチダーゼを溶出
させた。
【００３４】実施例４：新規アミノペプチダーゼの特性
測定 （１）分子量測定 製造されたアミノペプチダーゼの分子量を確認するため
にこれをＳＤＳ−ＰＡＧＥし該結果を図１に示した。図
１で第１ラインは標準分子量標識蛋白、即ち、ゲル上段
から９７、６７、４２、３１、２２および１４ＫＤを示
し，第２ラインはＳ−セファロースカラムから溶出され
たアミノペプチダーゼの分画を、第３ラインは最終精製
されたアミノペプチダーゼを示したものである。第３ラ
インのアミノペプチダーゼと標準蛋白とを比較した結果
分子量が約４１〜４５ＫＤであることを確認した。
測定 （１）分子量測定 製造されたアミノペプチダーゼの分子量を確認するため
にこれをＳＤＳ−ＰＡＧＥし該結果を図１に示した。図
１で第１ラインは標準分子量標識蛋白、即ち、ゲル上段
から９７、６７、４２、３１、２２および１４ＫＤを示
し，第２ラインはＳ−セファロースカラムから溶出され
たアミノペプチダーゼの分画を、第３ラインは最終精製
されたアミノペプチダーゼを示したものである。第３ラ
インのアミノペプチダーゼと標準蛋白とを比較した結果
分子量が約４１〜４５ＫＤであることを確認した。
【００３５】なお、アミノペプチダーゼの天然状態の分
子量を測定するためにＦＰＬＣスーパーローズ１２カラ
ム(FPLC superose 12 column) (1cm×30cm、 Sweden Ph
armacia社)を利用してゲル濾過クロマトグラフィーを実
施した。分子量決定のための標準蛋白として組換えヒト
成長ホルモン、オボアルブミン (ovoalbumin),牛血清蛋
白（BSA)を使用して次の式によって分配係数を求めた
後、分配係数 (partitioncoefficient)と分子量間の標
準曲線を求めた。
子量を測定するためにＦＰＬＣスーパーローズ１２カラ
ム(FPLC superose 12 column) (1cm×30cm、 Sweden Ph
armacia社)を利用してゲル濾過クロマトグラフィーを実
施した。分子量決定のための標準蛋白として組換えヒト
成長ホルモン、オボアルブミン (ovoalbumin),牛血清蛋
白（BSA)を使用して次の式によって分配係数を求めた
後、分配係数 (partitioncoefficient)と分子量間の標
準曲線を求めた。
【００３６】分配係数＝（溶出容量−空隙容量）／（全
体容量−空隙容量） 同一条件でアミノペプチダーゼの分配係数を測定しこれ
からアミノペプチダーゼの分子量が３６〜４０ＫＤであ
ることを確認し該結果を図２に示した。
体容量−空隙容量） 同一条件でアミノペプチダーゼの分配係数を測定しこれ
からアミノペプチダーゼの分子量が３６〜４０ＫＤであ
ることを確認し該結果を図２に示した。
【００３７】（２）アミノ酸配列分析 アミノペプチダーゼのN-末端アミノ酸配列分析はアミノ
酸配列分析器（モデル471A, 米国 Applied Biosystems
社）内で自動化されたエドマン分解反応によって行われ
た (Geoffrey Zubay,Biochemistry,第２版、47-48, (19
88))。該反応結果生じるフェニルチオヒダントイン (ph
enylthiohydantoin)が付いたアミノ酸は逆相HPLCカラム
(220mm× 2.1mmモデルPTH-222,米国 Applied Biosyste
ms社)を利用して分離し、その保持時間と標準アミノ酸
の前記カラムでの保持時間とを比較した結果、本発明の
アミノペプチダーゼのN-末端アミノ酸配列はＬｙｓ−Ｐ
ｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｕであることを確認した。
酸配列分析器（モデル471A, 米国 Applied Biosystems
社）内で自動化されたエドマン分解反応によって行われ
た (Geoffrey Zubay,Biochemistry,第２版、47-48, (19
88))。該反応結果生じるフェニルチオヒダントイン (ph
enylthiohydantoin)が付いたアミノ酸は逆相HPLCカラム
(220mm× 2.1mmモデルPTH-222,米国 Applied Biosyste
ms社)を利用して分離し、その保持時間と標準アミノ酸
の前記カラムでの保持時間とを比較した結果、本発明の
アミノペプチダーゼのN-末端アミノ酸配列はＬｙｓ−Ｐ
ｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｕであることを確認した。
【００３８】アミノペプチダーゼの内部アミノ酸配列を
確認するために次のような一連の実験を行った。まず、
精製されたアミノペプチダーゼ２mgを５００マイクロリ
ットルの超純粋蒸留水に溶かした後、アミノペプチダー
ゼの活性をなくすために３０分間沸かして凍結乾燥し１
ｍＭ水酸化ナトリウム８００マイクロリットルに溶かし
た。この溶液に１０倍濃度のトリプシン分解緩衝液 (tr
ypsin digestin buffer:1M Tris-Cl,10mM CaCl2, pH8.
3)１００マイクロリットルと０．１mg／mlトリプシン
(ドイツ BoehringerMannheim社)１００マイクロリット
ルを加えて２５℃で２４時間の間反応させアミノペプチ
ダーゼが完全に切断されるようにした。反応結果生じる
アミノペプチダーゼのペプチド等は逆相高速液体クロマ
トグラフィーカラム (3.9mm×３００mm、μBondapak C
18,米国ミリポア社)を利用して分離して、ペプチドが溶
出されるクロマトグラムを図３に示した。図３で＊で示
されたピークを収集して前記で記述したＮ末端アミノ酸
配列分析方法と同一な方法でペプチドのアミノ酸配列を
確認した結果、保持時間が約１７．５分であるペプチド
のアミノ酸配列はＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏであったし、保
持時間が約１９分であるペプチドのアミノ酸配列はＡｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒであっ
た。
確認するために次のような一連の実験を行った。まず、
精製されたアミノペプチダーゼ２mgを５００マイクロリ
ットルの超純粋蒸留水に溶かした後、アミノペプチダー
ゼの活性をなくすために３０分間沸かして凍結乾燥し１
ｍＭ水酸化ナトリウム８００マイクロリットルに溶かし
た。この溶液に１０倍濃度のトリプシン分解緩衝液 (tr
ypsin digestin buffer:1M Tris-Cl,10mM CaCl2, pH8.
3)１００マイクロリットルと０．１mg／mlトリプシン
(ドイツ BoehringerMannheim社)１００マイクロリット
ルを加えて２５℃で２４時間の間反応させアミノペプチ
ダーゼが完全に切断されるようにした。反応結果生じる
アミノペプチダーゼのペプチド等は逆相高速液体クロマ
トグラフィーカラム (3.9mm×３００mm、μBondapak C
18,米国ミリポア社)を利用して分離して、ペプチドが溶
出されるクロマトグラムを図３に示した。図３で＊で示
されたピークを収集して前記で記述したＮ末端アミノ酸
配列分析方法と同一な方法でペプチドのアミノ酸配列を
確認した結果、保持時間が約１７．５分であるペプチド
のアミノ酸配列はＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏであったし、保
持時間が約１９分であるペプチドのアミノ酸配列はＡｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒであっ
た。
【００３９】（３）至適ｐＨ測定 アミノペプチダーゼの最適ｐＨを測定するために、５０
％ＤＭＳＯに溶解された２５mg／mlのロイシン−パラア
ニリド２０マイクロリットルを含む、ｐＨ３．０〜９．
５の汎用緩衝液（１００ｍＭクエン酸、１００ｍＭリン
酸ナトリウム、１００ｍＭ硼酸および１００ｍＭリン
酸）中でその活性を調査した。緩衝液のｐＨは５Ｎ水酸
化ナトリウムで調節した。その結果、本発明によるアミ
ノペプチダーゼの酵素活性の至適ｐＨは７．５〜９．０
でありｐＨ８．０〜８．５で酵素活性が最も活発に起こ
るのを確認し、これを図４に示した。
％ＤＭＳＯに溶解された２５mg／mlのロイシン−パラア
ニリド２０マイクロリットルを含む、ｐＨ３．０〜９．
５の汎用緩衝液（１００ｍＭクエン酸、１００ｍＭリン
酸ナトリウム、１００ｍＭ硼酸および１００ｍＭリン
酸）中でその活性を調査した。緩衝液のｐＨは５Ｎ水酸
化ナトリウムで調節した。その結果、本発明によるアミ
ノペプチダーゼの酵素活性の至適ｐＨは７．５〜９．０
でありｐＨ８．０〜８．５で酵素活性が最も活発に起こ
るのを確認し、これを図４に示した。
【００４０】（４）熱安定性 熱に対する安定性をさぐるために、実施例３で製造され
たアミノペプチダーゼの分取量を含む１８個のチューブ
を３０℃、５０℃、７０℃でそれぞれ３０分、１時間、
２時間、３時間、５時間、７時間放置した後、酵素活性
度を測定して該結果を図５に示した。これによりアミノ
ペプチダーゼが５０℃および３０℃で安定することが分
かった。
たアミノペプチダーゼの分取量を含む１８個のチューブ
を３０℃、５０℃、７０℃でそれぞれ３０分、１時間、
２時間、３時間、５時間、７時間放置した後、酵素活性
度を測定して該結果を図５に示した。これによりアミノ
ペプチダーゼが５０℃および３０℃で安定することが分
かった。
【００４１】（５）酵素活性に対するオルトペナントロ
リンの影響 実施例３で製造されたアミノペプチダーゼの分画にオル
トフェナントロリン (orthophenanthroline: OP)を最終
濃度０ｍＭ，１ｍＭおよび５ｍＭでそれぞれ添加した。
生成された溶液を３７℃で１分間反応させた後、アミノ
ペプチダーゼの活性を測定し該結果を次の表２に示し
た。この結果から本発明のアミノペプチダーゼが金属プ
ロテアーゼであることを確認した。
リンの影響 実施例３で製造されたアミノペプチダーゼの分画にオル
トフェナントロリン (orthophenanthroline: OP)を最終
濃度０ｍＭ，１ｍＭおよび５ｍＭでそれぞれ添加した。
生成された溶液を３７℃で１分間反応させた後、アミノ
ペプチダーゼの活性を測定し該結果を次の表２に示し
た。この結果から本発明のアミノペプチダーゼが金属プ
ロテアーゼであることを確認した。
【００４２】
【表２】 （６）基質特異性 アミノペプチダーゼの基質特異性は次のように調査され
た。各１単位のアミノペプチダーゼをロイシン、メチオ
ニン、グリシン−プロリン、アラニン、リシン、グリシ
ンおよびグリシン−フェニルアラニンのパラニトロアニ
リド１０ｍＭをそれぞれ含む１００ｍＭトリス緩衝液
(pH8.0)に添加し、生成された混合物を３７℃で反応さ
せた。反応時間は各基質によってパラニトロアニリドが
一定した速度で精製される範囲内で決定した。基質によ
るアミノペプチダーゼの活性は参照例によって測定しロ
イシンーパラニトロアニリドに対する活性を１００％と
して比較して該結果を次の表３に示した。
た。各１単位のアミノペプチダーゼをロイシン、メチオ
ニン、グリシン−プロリン、アラニン、リシン、グリシ
ンおよびグリシン−フェニルアラニンのパラニトロアニ
リド１０ｍＭをそれぞれ含む１００ｍＭトリス緩衝液
(pH8.0)に添加し、生成された混合物を３７℃で反応さ
せた。反応時間は各基質によってパラニトロアニリドが
一定した速度で精製される範囲内で決定した。基質によ
るアミノペプチダーゼの活性は参照例によって測定しロ
イシンーパラニトロアニリドに対する活性を１００％と
して比較して該結果を次の表３に示した。
【００４３】
【表３】 基質特異性 基質 (10mM) 活性度（％） ロイシン−パラニトロアニリド １００ メチオニン−パラニトロアニリド ３．６０ グリシン−プロリン−パラニトロアニリド ０．８０ アラニン−パラニトロアニリド ０．６０ リシン−パラニトロアニリド ０．０３ グリシン−パラニトロアニリド ０．０４ グリシン−フェニルアラニン−パラニトロアニリド ０．１１ 実施例５：最適反応条件の決定 基質としてメチオニルペプチド (Met-Phe-Pro-Thr-Glu-
Pro-Ser)２００マイクログラムを含む０．１Ｍトリス緩
衝液をそれぞれｐＨ７，ｐＨ７．５，ｐＨ８，ｐＨ８．
５およびｐＨ９のｐＨ別に製造し、前記基質を含む０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液をｐＨ６からｐＨ７．５ま
でｐＨ０．５間隔で製造し、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム
緩衝液をｐＨ８．５〜ｐＨ１０まで０．５のｐＨ間隔で
ｐＨ別で製造した後各緩衝液１mlに０．４単位のアミノ
ペプチダーゼを添加した。混合物を３７℃で１０分間反
応させた後各反応混合物中のアミノペプチダーゼ活性を
測定し該結果を図６に示した。これから、ｐＨ７．５〜
９．５の緩衝液での処理が他の緩衝液でより相対的に優
れた酵素活性を示すことが分った。
Pro-Ser)２００マイクログラムを含む０．１Ｍトリス緩
衝液をそれぞれｐＨ７，ｐＨ７．５，ｐＨ８，ｐＨ８．
５およびｐＨ９のｐＨ別に製造し、前記基質を含む０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液をｐＨ６からｐＨ７．５ま
でｐＨ０．５間隔で製造し、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム
緩衝液をｐＨ８．５〜ｐＨ１０まで０．５のｐＨ間隔で
ｐＨ別で製造した後各緩衝液１mlに０．４単位のアミノ
ペプチダーゼを添加した。混合物を３７℃で１０分間反
応させた後各反応混合物中のアミノペプチダーゼ活性を
測定し該結果を図６に示した。これから、ｐＨ７．５〜
９．５の緩衝液での処理が他の緩衝液でより相対的に優
れた酵素活性を示すことが分った。
【００４４】また、アミノペプチダーゼの活性を維持す
るための適切なイオン強度を確認するために、塩化ナト
リウムをそれぞれ０、１００、２００、３００、４００
および５００ｍＭの最終濃度で添加した１００ｍＭトリ
ス緩衝液 (pH8.0)中で前記基質をアミノペプチダーゼで
処理し該結果を図７に示した。図面から分るように、塩
化ナトリウムの濃度が増加するによって酵素活性度が相
対的に減少した。しかしながら、酵素の安定性を長い間
維持するためにはイオン強度が必要であるので、反応緩
衝液にＮａＣｌを０〜１００ｍＭになるように加えるこ
とが好ましい。
るための適切なイオン強度を確認するために、塩化ナト
リウムをそれぞれ０、１００、２００、３００、４００
および５００ｍＭの最終濃度で添加した１００ｍＭトリ
ス緩衝液 (pH8.0)中で前記基質をアミノペプチダーゼで
処理し該結果を図７に示した。図面から分るように、塩
化ナトリウムの濃度が増加するによって酵素活性度が相
対的に減少した。しかしながら、酵素の安定性を長い間
維持するためにはイオン強度が必要であるので、反応緩
衝液にＮａＣｌを０〜１００ｍＭになるように加えるこ
とが好ましい。
【００４５】実施例６：天然形組換えヒト成長ホルモン
の製造 大韓民国特許公告第９２−９９号の方法によって製造さ
れたメチオニルヒト成長ホルモン約６００マイクログラ
ムにアミノペプチダーゼ８単位を添加し混合物を反応緩
衝液 (50mMトリス(pH8.0),100mM NaClおよび1mM PMSF)
で充分に透析させた後、２ml容量のセントリコン (cent
ricon,アミコン(Amicon)社) を用いて容量を０．６mlま
で濃縮した後、３７℃の水浴に２４時間漬けた。２４時
間が経過した後、反応混合物を２０ｍＭトリス緩衝液
(pH8.0)で充分に透析させた後、同一緩衝液であらかじ
め平衡させたＤＥＡＥ−セファロースカラムに適用し
た。カラムを同一緩衝液で洗浄した後、２０ｍＭトリス
および１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液をカラムに加
えてヒト成長ホルモンを溶出した。
の製造 大韓民国特許公告第９２−９９号の方法によって製造さ
れたメチオニルヒト成長ホルモン約６００マイクログラ
ムにアミノペプチダーゼ８単位を添加し混合物を反応緩
衝液 (50mMトリス(pH8.0),100mM NaClおよび1mM PMSF)
で充分に透析させた後、２ml容量のセントリコン (cent
ricon,アミコン(Amicon)社) を用いて容量を０．６mlま
で濃縮した後、３７℃の水浴に２４時間漬けた。２４時
間が経過した後、反応混合物を２０ｍＭトリス緩衝液
(pH8.0)で充分に透析させた後、同一緩衝液であらかじ
め平衡させたＤＥＡＥ−セファロースカラムに適用し
た。カラムを同一緩衝液で洗浄した後、２０ｍＭトリス
および１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液をカラムに加
えてヒト成長ホルモンを溶出した。
【００４６】実施例７：天然形組換えヒト成長ホルモン
の特性 実施例６で得られた天然形組換えヒト成長ホルモンをN-
末端配列分析器 (アプライドバイオシステムス、モデル
471A蛋白配列分析器(Applied Biosystems, model 471A
Protein Sequencer))を使用してメチオニル基が除去さ
れた程度を確認し該結果を図８Ａと図８Ｂに示した。図
８Ａおよび図８Ｂはそれぞれアミノペプチダーゼの処理
前後のN-末端配列分析結果を示す。図８Ｂでみればヒト
成長ホルモンのはじめてのアミノ酸はフェニルアラニン
で示されメチオニン位置においてはほとんどピークがみ
られなかった。したがって、本発明による前記処理によ
ってN-末端のメチオニン残基がほとんど完全に除去さ
れ、またN-末端のメチオニンのみが選択的に切断されも
っと以上のアミノ酸は切断されないのが確認された。N-
末端のメチオニンが除去された天然形組換えヒト成長ホ
ルモンの純度測定はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行い、結
果は図９のレーン２に示している。
の特性 実施例６で得られた天然形組換えヒト成長ホルモンをN-
末端配列分析器 (アプライドバイオシステムス、モデル
471A蛋白配列分析器(Applied Biosystems, model 471A
Protein Sequencer))を使用してメチオニル基が除去さ
れた程度を確認し該結果を図８Ａと図８Ｂに示した。図
８Ａおよび図８Ｂはそれぞれアミノペプチダーゼの処理
前後のN-末端配列分析結果を示す。図８Ｂでみればヒト
成長ホルモンのはじめてのアミノ酸はフェニルアラニン
で示されメチオニン位置においてはほとんどピークがみ
られなかった。したがって、本発明による前記処理によ
ってN-末端のメチオニン残基がほとんど完全に除去さ
れ、またN-末端のメチオニンのみが選択的に切断されも
っと以上のアミノ酸は切断されないのが確認された。N-
末端のメチオニンが除去された天然形組換えヒト成長ホ
ルモンの純度測定はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行い、結
果は図９のレーン２に示している。
【００４７】最終的に精製された天然形組換えヒト成長
ホルモンの力価を放射受容体分析法(radio receptorass
ay)で測定した結果、世界保健機構 (WHO)で供給する脳
下垂体由来のヒト成長ホルモンの力価である２．５ＩＵ
／mgに準する２．７ＩＵ／mgで表れた（大韓内分泌学会
誌、５卷第３号、１９９０）。
ホルモンの力価を放射受容体分析法(radio receptorass
ay)で測定した結果、世界保健機構 (WHO)で供給する脳
下垂体由来のヒト成長ホルモンの力価である２．５ＩＵ
／mgに準する２．７ＩＵ／mgで表れた（大韓内分泌学会
誌、５卷第３号、１９９０）。
【００４８】以上の説明で分るように、本発明人等によ
り考案されたメチオニルヒト成長ホルモンとアミノペプ
チダーゼの反応条件は天然形組換えヒト成長ホルモンの
物理化学的性質をそのまま維持させながらN-末端のメチ
オニンのみを選択的に除去する最適な反応条件であるこ
とが立証された。
り考案されたメチオニルヒト成長ホルモンとアミノペプ
チダーゼの反応条件は天然形組換えヒト成長ホルモンの
物理化学的性質をそのまま維持させながらN-末端のメチ
オニンのみを選択的に除去する最適な反応条件であるこ
とが立証された。
【００４９】
【発明の効果】本発明のアミノペプチダーゼは新規なも
ので、これを用いると微生物を用いて産生された組換え
蛋白からN-末端メチオニンのみを選択的に除去して天然
形組換え蛋白を製造することができる。
ので、これを用いると微生物を用いて産生された組換え
蛋白からN-末端メチオニンのみを選択的に除去して天然
形組換え蛋白を製造することができる。
【図１】ストレプトマイセスサーモニトリフィカンス培
養液から分離したアミノペプチダーゼの分子量を測定す
るためのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）の結果を示したものである。
養液から分離したアミノペプチダーゼの分子量を測定す
るためのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）の結果を示したものである。
【図２】天然形（還元形）アミノペプチダーゼの分子量
を決定するためのゼル濾過クロマトグラフィーの結果を
示したものである。
を決定するためのゼル濾過クロマトグラフィーの結果を
示したものである。
【図３】アミノペプチダーゼの内部アミノ酸配列を確認
するためアミノペプチダーゼをトリプシンで切断した
後、逆相高速液体クロマトグラフィ−を用いて分離した
結果を示したものである。
するためアミノペプチダーゼをトリプシンで切断した
後、逆相高速液体クロマトグラフィ−を用いて分離した
結果を示したものである。
【図４】ｐＨ変化によるアミノペプチダーゼの活性変化
を示したものである。
を示したものである。
【図５】温度および時間の経果によるアミノペプチダー
ゼの活性変化を示したものである。
ゼの活性変化を示したものである。
【図６】アミノペプチダーゼの各ｐＨ区間での活性度の
変化を示したものである。
変化を示したものである。
【図７】１００ｍＭトリス緩衝液 (pH8.0)中での塩化ナ
トリウム濃度変化によるアミノペプチダーゼの相対活性
度の変化を示したものである。
トリウム濃度変化によるアミノペプチダーゼの相対活性
度の変化を示したものである。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれアミノペプチ
ダーゼとの反応によってN-末端のメチオニンが除去され
る前と後に行われた、ヒト成長ホルモンのN-末端配列分
析結果を示したものである。
ダーゼとの反応によってN-末端のメチオニンが除去され
る前と後に行われた、ヒト成長ホルモンのN-末端配列分
析結果を示したものである。
【図９】本発明の方法により製造された天然形組換えヒ
ト成長ホルモンの純度を示すSDS-PAGEの結果を示したも
のである。
ト成長ホルモンの純度を示すSDS-PAGEの結果を示したも
のである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 權 純 昌 大韓民国大田直轄市西区内洞28−４新星 ＡＰＴ．３棟107号 (72)発明者 李 承 柱 大韓民国大田直轄市儒城区道龍洞386− ４ラッキーＡＰＴ．Ｂ棟107号 (72)発明者 金 政 鎬 大韓民国大田直轄市儒城区道龍洞386− １ラッキー寄宿舎511号 (72)発明者 金 範 俊 大韓民国大田直轄市儒城区道龍洞386− １ラッキー寄宿舎502号 (56)参考文献 米国特許5143839（ＵＳ，Ａ) Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌ．23 ｐ．449−455 （1986) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/48 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】ストレプトマイセス・サーモニトリフィカ
ンス（Streptomyces thermonitrificans）の培養液から
単離され、以下の性質を有するアミノペプチダーゼ： （ａ）作用 Ｎ末端にメチオニン残基を有するペプチド又は蛋白質に
作用し、Ｎ−末端メチオニンを選択的に除去する （ｂ）基質特異性 ３７℃及びｐＨ８（１００ｍＭトリス緩衝液）の条件で
測定される各種基質に対するアミノペプチダーゼ活性： (i) メチオニン−パラニトロアニリドに対する活性は、
ロイシン−パラニトロアニリドに対する活性に比べて低
い (ii)グリシン−プロリン−パラニトロアニリド、アラニ
ン−パラニトロアニリド、リシン−パラニトロアニリ
ド、グリシン−パラニトロアニリド及びグリシン−フェ
ニルアラニン−パラニトロアニリドに対する活性は、非
常に低い （ｃ）至適ｐＨ ７．５〜９ （ｄ）至適温度 ３０〜５０℃ （ｅ）分子量（還元状態） 約４１〜４５ｋＤ （ｆ）分子量（天然状態） 約３６〜４０ｋＤ - 【請求項２】 N-末端にLys-Phe-Ser-Lys-Lys-Phe-Asn-
Gluのアミノ酸配列を含み,Glu-Pro-Gly-Thr-Gly-Ala-Le
u-Glu-ProまたはAsn-Pro-Asp-Ile-Val-Tyrのアミノ酸配
列を含む請求項１記載のアミノペプチダーゼ。 - 【請求項３】 ストレプトマイセス・サーモニトリフィ
カンスを、ガラクト−スを炭素源として含む培地で培養
して培養液からアミノペプチダーゼを分離することを含
む請求項１又は請求項２に記載のアミノペプチダーゼの
製造方法。 - 【請求項４】 前記ガラクトース濃度は１〜４％である
請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 （イ）ストレプトマイセス・サーモニト
リフィカンスの培養液を遠心分離してそれから上澄液を
分離し、 （ロ）上澄液に硫酸アンモニウムを加え、（ハ）第三級
ブタノールを上澄液に加えて三相分割を行い下層の清い
溶液を分離し、（ニ）清い溶液に硫酸アンモニウムを加
え段階（ハ）を反復して前記第三級ブタノール層および
前記水性層との間の中間層を分離し、（ホ）前記段階
（ニ）で得た中間層を用いた陽イオン交換クロマトグラ
フィーによってアミノペプチダーゼを含有した分画を得
て、（ヘ）前記分画を用いてＦＰＬＣを行うことによっ
て高純度のアミノペプチダーゼを得る段階をさらに含
む、請求項３または請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 前記段階（ロ）および（ニ）で前記硫酸
アンモニウムをそれぞれ３５〜５０％（重量／容量）お
よび８０〜９０％（重量／容量）の濃度で添加する請求
項５記載の方法。 - 【請求項７】 前記陽イオン交換クロマトグラフィーが
S-セファロースカラムを使用して行われる請求項５記載
の方法。 - 【請求項８】 前記FPLCをFPLCモノ−Sカラムを使用し
て行う請求項５記載の方法。 - 【請求項９】 N-メチオニル組換え蛋白を反応緩衝液中
で請求項１記載のアミノペプチターゼと反応させること
によって、微生物により産生されたN-メチオニル組換え
蛋白からメチオニンを除去することにより天然形組換え
蛋白を製造する方法。 - 【請求項１０】 前記組換え蛋白が組換え人間成長ホル
モンである請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】前記反応緩衝液が０〜１００ｍＭの範囲
の濃度で塩化ナトリウムを含み、そのpHが７．５〜９．
５の範囲である請求項９または請求項１０記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019930011107A KR970010135B1 (ko) | 1993-06-17 | 1993-06-17 | 신규 아미노펩티다제 |
| KR93-11107 | 1993-06-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07147979A JPH07147979A (ja) | 1995-06-13 |
| JP2890168B2 true JP2890168B2 (ja) | 1999-05-10 |
Family
ID=19357590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6135268A Expired - Fee Related JP2890168B2 (ja) | 1993-06-17 | 1994-06-17 | 新規アミノペプチダーゼ |
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| Country | Link |
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| EP (1) | EP0629695B1 (ja) |
| JP (1) | JP2890168B2 (ja) |
| KR (1) | KR970010135B1 (ja) |
| CN (1) | CN1098742A (ja) |
| AT (1) | ATE206159T1 (ja) |
| BR (1) | BR9402461A (ja) |
| CO (1) | CO4230106A1 (ja) |
| DE (1) | DE69428395T2 (ja) |
| EG (1) | EG21684A (ja) |
| ES (1) | ES2160605T3 (ja) |
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| KR100365838B1 (ko) * | 2000-03-24 | 2002-12-26 | 한국생명공학연구원 | 브레비바실러스 보스테렌시스 ｂｃｓ-1 에서 유래한 신규내열성 ｄ-입체특이적 디펩티다아제 및 이를 이용한ｄ-아미노산 함유 펩타이드의 합성 방법 |
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| MX2009005764A (es) * | 2006-11-30 | 2009-08-24 | Biocon Ltd | Metodo para producir polipeptidos libres de metionina n-terminal en celulas huesped microbianas. |
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