CN1098742A - 氨基肽酶及该酶和其蛋白的制备方法 - Google Patents

氨基肽酶及该酶和其蛋白的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1098742A
CN1098742A CN94107221A CN94107221A CN1098742A CN 1098742 A CN1098742 A CN 1098742A CN 94107221 A CN94107221 A CN 94107221A CN 94107221 A CN94107221 A CN 94107221A CN 1098742 A CN1098742 A CN 1098742A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aminopeptidase
substratum
recombinant protein
streptomycete
nitro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN94107221A
Other languages
English (en)
Inventor
朴淳宰
李荣美
元特渊
权纯昌
李承柱
金政镐
金范俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LG Corp
Original Assignee
Lucky Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lucky Ltd filed Critical Lucky Ltd
Publication of CN1098742A publication Critical patent/CN1098742A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/11—Aminopeptidases (3.4.11)
    • C12Y304/11002—Membrane alanyl aminopeptidase (3.4.11.2), i.e. aminopeptidase N

Abstract

一种由嗜热硝基链霉菌(Streptomyces thcrmonitrificans)的培养物中分离得到的新型氨基 肽酶，及用所述的氨基肽酶得到的野生型重组蛋白 质。

Description

本发明涉及一种新型的氨基肽酶及其制备方法。更具体地说，本发明涉及一种由嗜热硝基链霉菌（Streptomyces thermonitrificans）中分离出来的新型的氨基肽酶;及用培养所述的微生物来制备本发明所述的氨基肽酶的方法;和用所述的氨基肽酶来制备野生型重组蛋白的方法。
氨基肽酶存在于各种微和物体和动物细胞及需要金属离子，如钙，锌等，作为其活性剂的一般金属蛋白酶中。据知，所述的酶由于衍生源不同，它们甚至可以在50-70℃的温度范围内保持其不同本性的活性。
氨基肽酶在决定蛋白质的一级结构和制造药品等方面有其工业用途。尤其是被用来在微生物体内，用重组DNA技术，消去N端带有蛋氨酸重组蛋白质的N端蛋氨酸（N-蛋氨酰基重组蛋白），以制备具有一个与野生型蛋白相同氨基酸序列的重组蛋白。
因为重组人蛋白若有N端蛋氨酸的存在可能引起服用时的意想不到的免疫反应，所以人们希望通过消去N端蛋氨酸来生产与人源一级蛋白氨基酸序列一致的成熟的真核蛋白质。
G.Roncari和H.Zuber在Method in Enzymology，19，544（1970）中披露了得自于嗜热脂肪芽胞杆菌（Bacillus stearothermophilus）而其性质相互间略有差异的三种氨基肽酶;Takayuri Uwajima et al.在Aqr.Biol.Chem.37（12），2727（1973）中报道了一种源自于Streptomyces peptidofaciens KY 2389链霉菌并需要钙离子来维持其活性的氨基肽酶的一些生理化学性质。
而且，在诸如以下的菌种中也得到了不同的氨基肽酶，如枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）（Fred W.Wagner et al.，Arch.Biochem.Biophys.，197（1），63-72（1979）），龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）（Lj.Vitale et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，23，449-455（1986）），灰色链霉菌（Streptomyces griseus）（K.D.Vosbeck et al.，J.Biol.Chem.，238，6029-6034（1973））等。
A.Spungin和S.Blumberg在Eur.J.Biochem.，183，471-477（1989）中披露了一种氨基肽酶，其分子量用SDS-PAGE法测得约为33kd，其N端氨基酸序列为Ala-Pro-Asp-Ile-Pro-Leu，其分离提纯的方法包括，热处理由土壤中分离到的灰色链霉菌（Streptomyces griseus）培养物，然后将此热处理过的培养物用Bio-Gel P-4凝胶过滤色谱及DEAE琼脂糖离子交换色谱提纯。
近来，一种从灰色链霉菌K-1株（Streptomyces griseus K-1 Strain）中分离到的、称作链霉蛋白酶的酶已可从市场上得到。然而，由于这种酶含有不同蛋白酶的混合物，所以它还不能有效地消去N端蛋氨酸残基。
另一方面，人们也在不断地努力，设法通过消去产生于微生物体内的重组蛋白质的N端蛋氨酸残基来制备一种野生型蛋白质。其典型的制备野生型人体生长激素的方法包括表达一个人体生长激素的N端与另一个蛋白质的C端融合在一起的融合蛋白，然后用一个特定的蛋白酶剪切这个融合蛋白（PCT公开号WO89/12678;EP专利公开号20290和321940）;及另一制备野生型重组蛋白质的方法，它经过在一个微生物细胞内表达一个含有分泌信号肽的重组蛋白质，使得当蛋白质被分泌到细胞外时，含有N端蛋氨酸残基的分泌信号肽也被除去，然后从培养基中重新回收野生型重组蛋白（EP公开号0088632 A2;U.S.4，755，465;JP公开号01273591;EP公开号306673;和韩国公开号94-579的专利）。但是以上方法的产量较低，而且如果两个蛋白质的物理性质相似，那么分离所需要的野生型蛋白质就会产生困难，并且有可能需要复杂和艰苦的过程来用新制备的表达载体转化宿主细胞，及确定合适的发酵条件。
人们曾设想过不一定非要通过能特别地消去存在于N-蛋氨酰重组蛋白质中的蛋氨酸残基的特定氨基肽酶来制备野生型重组蛋白质（PCT公开号WO86/04609和WO86/204527 Al）。例如，一个N端氨基酸序列为Met-Phe-Pro-Thr-Ile的蛋氨酰人类生长激素，可以通过使用一个可识别N端的X-Pro位点（X代表任意一个氨基酸残基）的氨基肽酶选择性地消除其N端蛋氨酸。这样即可在X残基前终止剪切反应。
这里，如由蛋白水解弧菌（Vibrio proteolyticus）（Bio-Technology General Corp.，WO86/01229）中分离提纯得到的及由猪肾（Takeda，WO86/204527 Al）中抽取纯化得到一些氨基肽酶被用以通过消去N端蛋氨酸残基来制备野生型重组蛋白质。然而仍存在继续发展氨基肽酶的需要，以适应各种底物特异性及高度的酶活性的需求。
本发明的一个目的在于提供一个源自于嗜热硝基链霉菌（Streptomyces themonitrificans）的新型氨基肽酶。
本发明的另一个目的在于提供一个通过培养嗜热硝基链霉菌来制备所说的氨基肽酶的方法。
本发明的再一个目的在于提供一个用所述的氨基肽酶来消除N-蛋氨酰重组蛋白上的N端蛋氨酸残基来制备野生型重组蛋白质的方法。
本发明的以上目的及其他目的和特征将通过以下对本发明及其附图的描述来阐明，其中：
图1所示用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定的由嗜热硝基链霉菌培养物中分离得到的氨基肽酶的分子量结果;
图2描述了用凝胶过滤色谱测得的天然（未还原的）形式氨基肽酶的分子量结果;
图3表示用胰蛋白酶消化过的氨基肽酶来确定其内部氨基酸序列的反相高压液相色谱（HPLC）的结果;和
图4所示为氨基肽酶随pH值的变化而产生的活性变化;
图5表示氨基肽酶的活性随温度及时间的变化而产生的变化;
图6表明氨基肽酶的活性变化水平与pH值的函数关系。
图7试图解释氨基肽酶的相对活性对于100mM Tris缓冲液（pH8.0）中氯化钠浓度的变化。
图8A和8B表明了用氨基肽酶消去N端蛋氨酸前后的一个重组人类生长激素N端氨基酸分析结果。
图9表示为用SDS-PAGE证实以本发明的方法制备的野生型重组的人类生长激素的纯度的结果。
文中引用的文献都并入本文作为参考。
本发明的新型氨基肽酶在SDS-聚丙烯酰胺凝胶（即在还原态）上测得的分子量约为41-45kd，在凝胶过滤色谱（即处于自然状态）测得的分子量约为36-40kd。
该氨基肽酶包含N端为Lys-Phe-Ser-Lys-Lys-Phe-Asn-Glu的氨基酸序列及其他区域为Glu-Pro-Gly-Thr-Gly-Ala-Leu-Glu-Pro和Asn-Pro-Asp-Ile-Val-Tyr的氨基酸序列;而且它可归入亮氨酸氨基肽酶类，这是因为它只是特异地与亮氨酸反应而绝不会与如赖氨酸这样的带正电荷的氨基酸反应。
本发明的氨基肽酶在7.5-9.0的pH值范围内表现出高活性，更优选的是从8.0-8.5，温度范围是20-70℃，更优选的是30-50℃，在50℃时可保存其活性达数小时。
而且，该氨基肽酶是一个金属蛋白酶，因为其活性可由于二价金属离子，如锌、镁等，的存在而增加;当金属离子与如邻菲咯啉（orthophenanthroline）这样的螯合剂形成铬合物时，其活性降低。
本发明的氨基肽酶是通过培养嗜热硝基链霉菌（Streptomyces thermonitrificans）来制备的。可得到的氨基肽酶的量随着培养基中的碳源种类及浓度的不同而变化。优选采用半乳糖为碳源，其浓度范围按培养基总重量计为1-5%，优选2-3%。
除了采用半乳糖为碳源培养基的组成及培养嗜热链霉菌（Streptomyces thermonitrificans）的条件可根据FEMS Microbiol.Lett.，40，61-66（1987）by C.Edwards和A.S.Ball中描述的常规步骤来调整。培养完毕后，离心培养物得其上清液，然后将硫酸铵加入上清液至其浓度达到20-60%（wt/vol）的重量比，优选为30-50%（wt/vol）;向含有适当浓度的硫酸铵的上清液中加入叔丁醇，则含有硫酸铵的上清液形成三相分离层（R.Lovrien et al.，Protein purification Micro to Macro，Al an R.Liss，Inc.，New York，pp131-148（1987））这样即可得到作为底层的澄清液（第一次三相分离）;向该澄清液中按70-100%（wt/vol）的浓度比例，优选为80-90%（wt/vol），加入硫酸铵，生成物再次进行形成三相分离的程序，得到含有以欲得蛋白的中间层，该中间层在叔丁醇层（上相），水层（下相）之间以凝集态存在（第二次三相分离）;将中间层溶于缓冲液中，并经过例如S-琼脂糖柱的阳离子交换色谱和以如FPLC mono-S柱的FPLS（快速液相色谱）来得到高纯度的氨基肽酶。
本发明的氨基肽酶可用以制备野生型重组蛋白。一个产生于如大肠杆菌的微生物体内的N-蛋氨酰重组蛋白，在适宜的条件及适当的反应缓冲液下，如含有50mM  Tris（pH8.0），10mM NaCl，2%及1mM  PMSF的缓冲液中，与氨基肽酶反应以消去其N端蛋氨酸。
本发明的氨基肽酶可与从诸如大肠杆菌和酵母菌等的宿主细胞中制得的N-蛋氨酰重组蛋白质反应，通过消去其N端蛋氨酸而得到野生型重组蛋白质。考虑到N-蛋氨酰重组蛋白质的分子量及浓度的不同以决定氨基肽酶适当的用量。如N-蛋氨酰人类生长激素，0.2到20单位的氨基肽酶可用在每毫克的生长激素中。
用于消去N端蛋氨酸的反应缓冲液，如Tris-HCl，其pH值范围可从7.5到9.5，优选为8-8.5;NaCl的浓度范围为0-300mM，优选为0-100mM。
反应可在20-50℃的范围内进行，优选为30-40℃下反应10-20小时。
以下的实施例用来进一步阐明本发明而非限定其范围，除非另有声明，根据所述的参考例，用于实施例中的实验方法都是可行的。
而且，除非具体指出，在以下出现的固体物质在固体混合物中的百分数，液体在液体中的及固体在液体中的百分数，分以wt/wt、vol/vol和wt/vol为基数。
参考例：
氨基肽酶的活性可由在Meth，Enzymol.，19，514-521（1970）中的Pfleiderer描述的方法测定。
将一定量的氨基肽酶加入含有溶解于50%二甲基亚砜（Sigma，USA）中的20μl的25mg/ml亮氨酸-对硝基苯酰胺（leucine-paranitroanilide，Sigma，USA）的1ml作为底物的缓冲液。生成的溶液在37℃下反应1分钟，然后测量405nm（OD405nm）时其光密度。氨基肽酶活性的1个单位定义为能使光密度值（OD405nm）1的酶的量。
实施例1：根据培养基中碳源种类的不同而引起的氨基肽酶产量的变化。
以下实验用来测定在嗜热硝基链霉菌（Streptomyces thermonitrificans）（ATCC 23385）中碳源的不同对氨基肽酶产量的影响。
将嗜热硝基链霉菌（Streptomyces thermonitrificans）（ATCC23385）的菌丝体以湿细胞重量为准，按10-30%的浓度比悬于含有25%（vol/vol）的甘油、1.0%的蛋白胨、0.5%的酪蛋白氨基酸;0.55%的磷酸氢二钾、0.05%的磷酸二氢钾、3.0%的D-半乳糖的菌种保存培养基中，取1ml该菌丝体接种于含有1%蛋白胨、0.5%酵母浸膏和2.0%的碳源的培养基中，其中碳源可选自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、乳糖或蔗糖，然后于50℃下培养，并分别于19、24、39小时时各取1ml该培养基，于13，000xg下离心5分钟，可得其上清液。
以在含有半乳糖为碳源的培养基中培养所说的微生物39小时时所得到酶活性为100%，来测得各上清液中氨基肽酶的活性。其结果如表1所示：
表1：1ml培养于不同碳源中的培养物中氨基肽酶的活性。
实施例2：嗜热硝基链霉菌（Streptomyces thermonitrificans）的培养
培养嗜热硝基链霉菌（Streptomyces thermonitrificans）来生产本发明的新型氨基肽酶，可采用以下步骤：
向1升的烧瓶中加入含有2.0%半乳糖、1%的胰蛋白胨、0.5%的酪蛋白氨基酸，0.6%的磷酸盐、0.01%的硫酸镁、0.01%的氯化亚铁、0.01%的二氯化锰和0.01%的氯化锌的消毒的菌种培养基300ml（最终pH值为7.4-7.6）。将嗜热硝基链霉菌（ATCC 23385）的菌丝体以湿细胞重量为准，按10-30%的浓度比悬于含有25%（vol/vol）的甘油，1.0%的蛋白胨，0.5%的酪蛋白氨基酸，0.55%的磷酸氢二钾，0.05%的磷酸二氢钾和3.0%的D-半乳糖的菌种作为培养基中，取1ml该菌丝体接种在上述消毒的菌种培养基中并针其作为种子培养物（seed culture）在50℃下培养20小时。
向四个5升的发酵装置中加入含有3.0%的半乳糖、0.3%的胰蛋白胨、0.3%的酪蛋白氨基酸、1.4%的脱脂牛奶、0.6%的磷酸盐、0.01%的硫酸镁，0.01%的氯化亚铁，0.01%的二氯化锰和0.01%的氯化锌的消毒的培养基3升（最终pH值为7.4-7.6）。将70ml的上述所得到种子培养物接种到以上各消毒的培养基中，在500rpm的速度搅拌，50℃及通气率为1vvm的条件下，培养18到22小时。
实施例3：氨基肽酶的纯化。
按以下步骤，由实施例2培养物中得到纯化的氨基肽酶：
由实施例2中得到的约10升的培养物在10，000xg用离心机（JA10 rotor，Beckman，USA）离心30分钟，得其上清液。然后将该上清液通过一个Amicon螺旋管（分子量剪切：10kd，Amicon，USA）;使其浓缩至2升。
100%的硫酸铵溶液加入到上述浓缩液中至终浓度为33%，再将等容积的叔丁醇加入以上液体中，搅拌生成的溶液1小时。生成物10，000xg下离心10分钟，得到一个处于底层的澄清液（第一次三相分离）。
向上述澄清液中加入硫酸铵粉末至终浓度为90%，生成物再以经过三相分离的步骤进行分离，得到处于中间蛋白质凝聚层，其上层为叔丁醇，其下层为水层（第二次三相分离）。
该蛋白质凝聚物溶解在20mM的磷酸钠缓冲液（pH6.8）中，所得溶液相对于相同的缓冲液进行彻底的透析，并经过一个用相同的缓冲液平衡过的S-琼脂糖凝胶柱（5cm×10cm，Pharmacia，Sweden），然后向柱中加入含有线性梯度浓度0-0.1M的氯化钠的同一缓冲液，以洗脱氨基肽酶。
收集显示氨基肽酶活性的洗脱部分，并相对于20mM的磷酸钠缓冲液（pH6.8）进行彻底的透析。所得溶液通过一个经相同的缓冲液平衡过的FPLC Mono-S柱（0.5cm×5cm，Pharmacia，Sweden），并用含有0.3M氯化钠的相同缓冲液洗涤该柱，然后将含有线性浓度梯度0.3-0.8M的氯化钠的相同缓冲液加入该柱，以洗脱氨基肽酶。
实施例4：新型氨基肽酶的性质
本发明的氨基肽酶的性质由以下各方法测得：
（1）分子量的测定
用SDS-PAGE测定实施例3中得到的氨基肽酶的分子量，其结果如图1所示，其中：
泳道1所示为标准分子量标记蛋白，从凝胶顶部往下分别为：97、67、42、31、22和14kd。
泳道2所示为从S-琼脂糖凝胶柱洗脱下来的氨基肽酶部分;和
泳道3所示为最终提纯的氨基肽酶
以上结果表明，从嗜热硝基链霉菌（Streptomyces thermonitrificans）中得到的氨基肽酶的分子量，用SDS-PAGE测定为约41-45kd。
另外，用FPLC Superose 12柱（1cm×30cm，Pharmacia，Sweden）以凝胶过滤色谱法来测定处于自然状态的氨基肽酶的分子量。洗脱重组人类生长激素（rhGH）时，可得到分子量与分离系数之间的标准函数关系曲线。卵蛋白和牛血清白蛋白作为标准蛋白质，则蛋白质的分离系数可由以下关系式得出：
分离系数＝ (洗脱体积-空体积)/(总体积-空体积)
在与以上相同的条件下洗脱实施例3中得到的氨基肽酶，并计算其分离系数，这样其分子量即可由标准曲线测定。其结果证实了处于自然状态下的本发明的氨基肽酶的分子量约为36-40kd（图2）。
（2）氨基酸序列分析
氨基肽酶的N端氨基酸序列可通过自动的Edman降解反应（Geoffrey Zubay，Biochemistry，2nd ed.，47-48（1988））用一个氨基酸测序仪（Model 471A，Applied Biosystem，U.S.A）来测得。所得的联结乙内酰苯硫脲的氨基酸残基经过反相高压液相色谱柱（220mm×2.1mm，model PTH-222，Applied Biosystems，U.S.A），测得每一个联结乙内酰苯硫脲的氨基酸残基的保留时间，并与使用同样色谱柱所测得的标准氨基酸残基的保留时间做比较，其结果，证实了本发明的氨基肽酸的N端氨基酸序列为Lys-Phe-Ser-Lys-Lys-Phe-Asn-Glu。
本发明的氨基肽酶的中段氨基酸序列用以下步骤证实。
2mg提纯的氨基肽酶溶解在500μl的超纯蒸馏水中，煮沸30分钟以灭活该氨基肽酶，冻干，再将其溶于800μl 1mM氢氧化钠溶液中。向上述溶液中加入100μl 10X的胰蛋白酶消化缓冲液（1M Tris-HCl，10mM CaCl2，pH8.3）和100μl 0.1mg/ml的胰蛋白酶（Boehringer Mannheim，Germany），该混合物在25℃下反应24小时以使氨基肽酶完全消化。反应中得到的肽通过一个反相高压液相色谱柱（3.9mm×300mm，μBondapack C18，Millipore，U.S.A.）得到一色谱（图3）。收集对应于图3中标有＊的峰的组分，用上述的分析N端氨基酸序列的方法证实它们的氨基酸序列。其结果是，保留时间为17.5分钟的肽的氨基酸序列为Glu-Pro-Gly-Thr-Gly-Ala-Leu-Glu-Pro，保留时间为19分钟的则是Asn-Pro-Asp-Ile-Val-Tyr。
（3）最适pH值的测定
为测定对于氨基肽酶的活性最适的pH值，检测了其在含有溶于50%二甲基亚砜中的20μl的25mg/ml的亮氨酸对硝基苯酰胺的通用缓冲液（100mM的柠檬酸，100mM的磷酸钠、100mM的硼酸和100mM的磷酸）中的活性，pH值变化范围为3.0-9.5。用5N的氢氧化钠调节缓冲液的pH值。其结果如图4所示，这里可以看到pH值由7.5-9.0变化时，氨基肽酶具有活性，而在pH值为8.0-8.5时，其活性最高。
（4）热稳定性：
为证实本发明的氨基肽酶的热稳定性，将18个装有等量的于实施例3中制得的氨基肽酶的试管分别放于30℃、50℃和70℃中静置0.5、1、2、3、5和7小时，然后按参考例中的方法分别测定每个试管中酶的活性。其结果如图5所示，其中，氨基肽酶在50℃和30℃时是稳定的。
（5）邻菲咯啉对酶活性的影响
为证实邻菲咯啉对氨基肽酶活性的影响，将邻菲咯啉加入于实施例3中得到的氨基肽酶部分中，至最终浓度分别为0mM，1mM和5mM。以上所得溶液都在37℃下反应1分钟，然后测定氨基肽酶的活性。其结果如下面表2所示，表明本发明的氨基肽酶是一种金属蛋白酶。
表2：邻菲咯啉对酶活性的影响
邻菲咯啉的浓度（mM) 活性(%)
015 100272
（6）底物的特异性
氨基肽酶的底物特异性用以下方法测定。向分别含有10mM亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸-脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸和甘氨酸-苯丙氨酸的对硝基苯酰胺的100mM  Tris缓冲液（pH8.0）中加入1个单位的氨基肽酶，所得混合物都在37℃下反应。根据底物来调整反应时间，以使对硝基苯酰胺按一个固定的速率产生。按参考例的方法测定底物的氨基肽酶的活性，并以底物为亮氨酸-对硝基苯酰胺时的活性为100%将它们相互比较。其结果如下表3所示：
表3：底物的特异性
底物（10mM)                              活性（％）
亮氨酸－对硝基苯酰胺                      100蛋氨酸－对硝基苯酰胺                      3.6甘氨酸－脯氨酸－对硝基苯酰胺              0.80丙氨酸－对硝基苯酰胺                      0.60赖氨酸－对硝基苯酰胺                      0.03甘氨酸－对硝基苯酰胺                      0.04甘氨酸－苯丙氨酸－对硝基苯酰胺             0.11
实施例5：消去N-蛋氨酰肽的N端蛋氨酸的最适反应条件的测定。
分别制备以下各种缓冲液：pH值分别为7、7.5、8、8.5和9的含有200μg N-蛋氨酰胺肽（Met-Phe-Pro-Thr-Glu-Pro-Ser）作为底物的0.1M Tris缓冲液;pH值分别为6、6.5、7和7.5的含有相同量底物的0.1M磷酸钠缓冲液;pH值分别为8.5、9、9.5和10的含有相同量底物的碳酸氢钠缓冲液。然后向1ml的各种缓冲液中加入4个单位的氨基肽酶，各混合物都在37℃下反应10分钟，这样即可测定每个反应混合物中氨基肽酶的活性。其结果如图6所示，表明缓冲液在pH值为7.5-9.5时氨基肽酸具有高活性。
而且，上述底物分别用处于含有最终氯化钠浓度分别为0，0.1，0.2、0.3、0.4和0.5M的100mM  Tris缓冲液（pH8.0）中的氨基肽酶处理，以确证为保持氨基肽酶的活性而需要的最适离子强度。其结果如图7所示，其中表明随着氯化钠浓度的增加而氨基肽酶的活性都减小。然而，离子强度对长时间保持酶的稳定性是必要的，所以优选加入反应缓冲液中的氯化钠浓度为0-100mM。
实施例6：野生型重组人类生长激素的制备。
8个单位的本发明的氨基肽酶加入大约600μg依公布号为92-99的韩国专利上的方法制备的蛋氨酰人类生长激素里，相对于-反应缓冲液（5mM Tris（pH8.0），100mM氯化钠和1mM PMST）充分地透析该混合物。用一个2ml体积的centricon（Amicon，U.S.A.）浓缩所得透析液至0.6ml，并将该浓缩液在37℃水溶下反应24小时。24小时后，相对于20mM Tris缓冲液（pH8.0）再次充分透析该反应混合物，并将其通过一个以前经同一缓冲液平衡过的DEAE-琼脂糖凝胶柱。用相同的缓冲液洗涤该柱，然后将含有20mM Tris和100mM氯化钠的缓冲液加入上述柱中以洗脱人类生长激素。
实施例7：野生型重组人类生长激素的性质
用N端氨基酸测序仪（Applied Biosystems，model 471A蛋白质测序仪）及由实施例6中得到的野生型重组人类生长激素来证实N端蛋氨酸的消去。其结果如图8A和8B所示，它们代表了在用氨基肽酶处理前后的N端测序结果。从图8B中可以看出，重组人类生长激素在用氨基肽酶处理后的第一个氨基酸残基是苯丙氨酸，而蛋氨酸峰几乎看不到了。这个结果表明，本发明的氨基肽酶可以特异地从重组人类生长激素中除去N端蛋氨酸残基。
该野生型重组人类生长激素的性质可用SDS-PAGE得以证实，其结果如图9所示。
该最终纯化的野生型重组人类生长激素的效能用放射受体分析法（I.Tsushima和H.G.Frieson，Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，37，334（1973））测定，其结果发现该激素具有2.7IU/mg的效能，这与由世界卫生组织（WHO）提供的，从脑垂体中得到的人类生长激素（Journal of Korean endocrinology society，Vol.5，No.3（1990））的效能2.5IU/mg相似。
本发明虽经以上内容的描述，但应认识到，各种修改和变动都有可能进行，不过都应在权利要求限定的本发明的范围内。

Claims (13)

1、一种由嗜热硝基链霉菌(Streptomyces  thermonitrificans)培养基中分离出的新型氨基肽酶。
2、根据权利要求1所述的氨基肽酶，包含其N端为Lys-Phe-Ser-Lys-Lys-Phe-Asn-Glu的氨基酸序列和其他区域为Glu-Pro-Gly-Thr-Gly-Ala-Len-Glu-Pro及Asn-Pro-Asp-Ile-Val-Thr的氨基酸序列。
3、根据权利要求1所述的氨基肽酶，其分子量在还原状态时为41-45kd，在自然状态下为36-40kd。
4、根据权利要求1所述的氨基肽酸，其具备活性的pH值范围为7.5-9.0，温度范围为30-50℃。
5、制备如权利要求1-4中任一项所述的氨基肽酶的方法，包含在含有半乳糖为碳源的培养基中培养嗜热硝基链霉菌（Streptomyecs thermonitrificans）及从培养基中回收氨基肽酶的步骤。
6、根据权利要求5所述的方法，其中培养基中半乳糖的浓度范围以培养基的总重量计为1-5%。
7、根据权利要求5或6所述的方法，进一步包括以下步骤：
（A）离心嗜热硝基链霉菌（Streptomyces themonitrificans）培养物，并分离其上清液;
（B）向该上清液中加入硫酸铵;
（C）向上清液中加入叔丁醇，然后进行三相分离，分离底层的澄清液;
（D）向该澄清液中加入硫酸铵，且重复步骤（C），但分离位于所述的叔丁醇层和水层之间的中间层;
（E）将由所述的步骤（D）中得到的中间层通过阳离子交换色谱，以得到含有氨基肽酶的部分;及
（F）将上述部分通过快速液相色谱（FPLC），得到高纯度的氨基肽酶。
8、根据权利要求7所述的方法，其中在所述的步骤（B）和（D）中加入硫酸铵使其浓度范围分别是35-50%（wt/vol）和80-90%（wt/vol）。
9、根据权利要求7所述的方法，其中所述的阳离子交换色谱是采用S-琼脂糖凝胶柱进行的。
10、根据权利要求7所述的方法，其中所述的快速液相色谱使用的是FPLC mono-S柱进行的。
11、通过从微生物中产生的N-蛋氨酰重组蛋白质中消除蛋氨酸来制备野生型重组蛋白质的方法，是通过将N-蛋氨酰重组蛋白质与在权利要求1中引用的氨基肽酶在反应缓冲液反应来完成的。
12、根据权利要求11所述的方法，其中重组蛋白质为重组人类生长激素。
13、根据权利要求11或12中所述的方法，其中缓冲液中含有氯化钠，其浓度范围为0-100mM，其pH值范围为7.5-9.5。
CN94107221A 1993-06-17 1994-06-17 氨基肽酶及该酶和其蛋白的制备方法 Pending CN1098742A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR93-11107 1993-06-17
KR1019930011107A KR970010135B1 (ko) 1993-06-17 1993-06-17 신규 아미노펩티다제

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1098742A true CN1098742A (zh) 1995-02-15

Family

ID=19357590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN94107221A Pending CN1098742A (zh) 1993-06-17 1994-06-17 氨基肽酶及该酶和其蛋白的制备方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5569598A (zh)
EP (1) EP0629695B1 (zh)
JP (1) JP2890168B2 (zh)
KR (1) KR970010135B1 (zh)
CN (1) CN1098742A (zh)
AT (1) ATE206159T1 (zh)
BR (1) BR9402461A (zh)
CO (1) CO4230106A1 (zh)
DE (1) DE69428395T2 (zh)
EG (1) EG21684A (zh)
ES (1) ES2160605T3 (zh)
MY (1) MY110997A (zh)
PE (1) PE50794A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111449318A (zh) * 2020-03-18 2020-07-28 同曦集团有限公司 一种抗菌抗病毒口罩及其制备方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100327971B1 (ko) * 1999-04-07 2002-03-14 허영섭 아미노 말단 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α의 제조방법
KR100365838B1 (ko) * 2000-03-24 2002-12-26 한국생명공학연구원 브레비바실러스 보스테렌시스 ｂｃｓ-1 에서 유래한 신규내열성 ｄ-입체특이적 디펩티다아제 및 이를 이용한ｄ-아미노산 함유 펩타이드의 합성 방법
WO2002010370A1 (fr) * 2000-07-31 2002-02-07 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de production d'une proteine recombinee
MX2009005764A (es) * 2006-11-30 2009-08-24 Biocon Ltd Metodo para producir polipeptidos libres de metionina n-terminal en celulas huesped microbianas.
EP2206777B1 (en) 2007-10-29 2014-01-15 JCR Pharmaceuticals CO., LTD. Method for producing aminopeptidase

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1536822A (en) * 1976-05-31 1978-12-20 Sumitomo Chemical Co Immobilized non-specific proteases
DK55685A (da) * 1985-02-07 1986-08-08 Nordisk Gentofte Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet
DE122004000009I1 (de) * 1984-08-16 2004-11-18 Savient Pharmaceuticals Inc Methode zur Herstellung von menschlichen Wachstumshormonen.
WO1986007380A1 (en) * 1985-06-04 1986-12-18 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for preparing polypeptide
GB8703015D0 (en) * 1987-02-10 1987-03-18 Biogen Nv Aminopeptidase
KR910000458B1 (ko) * 1988-12-31 1991-01-25 주식회사 럭키 인간성장호르몬 발현 벡터 pYLBC-GAP-HGH
IL91235A (en) * 1989-08-07 1994-10-07 Univ Ramot Aminopeptidase and a process for its purification
KR920000099B1 (ko) * 1990-03-15 1992-01-09 주식회사 럭키 효모에서 발현된 인간성장호르몬의 정제방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111449318A (zh) * 2020-03-18 2020-07-28 同曦集团有限公司 一种抗菌抗病毒口罩及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE206159T1 (de) 2001-10-15
EG21684A (en) 2002-02-27
MY110997A (en) 1999-07-31
DE69428395T2 (de) 2002-06-06
CO4230106A1 (es) 1995-10-19
DE69428395D1 (de) 2001-10-31
EP0629695A1 (en) 1994-12-21
KR970010135B1 (ko) 1997-06-21
JP2890168B2 (ja) 1999-05-10
US5569598A (en) 1996-10-29
PE50794A1 (es) 1995-01-14
BR9402461A (pt) 1995-01-24
JPH07147979A (ja) 1995-06-13
EP0629695B1 (en) 2001-09-26
ES2160605T3 (es) 2001-11-16
KR950000889A (ko) 1995-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5614379A (en) Process for preparing anti-obesity protein
Telkov et al. Proteins of the Rpf (resuscitation promoting factor) family are peptidoglycan hydrolases
NO311142B1 (no) Fusjonerte proteiner og fremgangsmåte for enzymatisk spalting av rekombinante proteiner ved anvendelse av IgA-proteaser ogfremgangsmåte for fremstilling av rekombinant G-CSF
Kwon et al. Extracellular alkaline proteases from alkalophilic Vibrio metschnikovii strain RH530
IE870980L (en) Cloned lysostaphin
HRP960078B1 (en) Dna sequence coding for a protein of a. thaliana having a delta-5, 7 sterol, delta- 7 reductase activity, delta-7-red protein, production process, strains of transformed yeasts, uses
Faotto et al. The primary structure of D-amino acid oxidase from Rhodotorula gracilis
CN106939315B (zh) 一种草酸脱羧酶的制备方法及应用
CN1098742A (zh) 氨基肽酶及该酶和其蛋白的制备方法
Yonemura et al. Isolation and characterization of nucleases from a clinical isolate of Serratia marcescens kums 3958
AU629430B2 (en) Bacterial collagenase gene
EP0300459A2 (en) Human pancreatic secretory trypsin inhibitor
CN112852788B (zh) 一种碱性底物选择性提高的枯草蛋白酶e突变体及其应用
CN1159206A (zh) 由酵母生产和分泌重组血纤维蛋白原
Ustáriz et al. Fermentation of individual proteins for protease production by Serratia marcescens
EP0975742B1 (en) Aminopeptidase derived from bacillus licheniformis and process for preparation of natural type proteins
Takagi et al. Random mutagenesis into the conserved Gly154 of subtilisin E: isolation and characterization of the revertant enzymes.
KR0180103B1 (ko) 바실러스 서브틸리스 속 균주 유래의 혈전용해효소
WO1998031817A3 (en) Human lysosomal sialidase and therapeutic uses thereof
Oda et al. Purification and characterization of alkaline serine proteinase from photosynthetic bacterium, Rubrivivax gelatinosus KDDS1
JP4054577B2 (ja) アルカリプロテアーゼ生産菌
Hare Characterization and regulation of serine exoproteases and collagenase in vibrio alginolyticus
KR20020021424A (ko) 내열성을 갖는 포스포리파제 ａ1의 돌연변이체 및 그의제조방법
JP3516318B2 (ja) 新規エンドペプチダーゼ
JPH02291294A (ja) ポリペプチドの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C06 Publication
PB01 Publication
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication