RU2089613C1 - Recombinant phage dna m13 pol t7 and recombinant strain of phage m13 - a producer of phage t7 rna-polymerase - Google Patents
Recombinant phage dna m13 pol t7 and recombinant strain of phage m13 - a producer of phage t7 rna-polymerase Download PDFInfo
- Publication number
- RU2089613C1 RU2089613C1 RU94014602A RU94014602A RU2089613C1 RU 2089613 C1 RU2089613 C1 RU 2089613C1 RU 94014602 A RU94014602 A RU 94014602A RU 94014602 A RU94014602 A RU 94014602A RU 2089613 C1 RU2089613 C1 RU 2089613C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phage
- dna
- rna polymerase
- recombinant
- m13polt7
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную фаговую ДНК M13polT7, содержащую ген РНК-полимеразы фага T7 и штамм фага M13polT7-продуцент РНК-полимеразы фага T7. The invention relates to biotechnology, in particular to genetic engineering, and is a recombinant phage DNA M13polT7 containing the gene of RNA polymerase of phage T7 and a phage strain M13polT7 producing RNA polymerase of phage T7.
РНК-полимераза фага T7 широко используется при получении РНК-зондов для блот-гибридизации; получения биологически активных РНК, изучения процессинга эукариотических РНК, экзон-интрон картирования геномной ДНК [1] Кроме того, фермент может быть использован для мечения РНК с помощью радиоактивных или биотинилированных нуклеозидтрифосфатов, а в определенных системах для секвенирования нуклеиновых кислот [2]
Однако, штамм E.coliHMS174, трансформированный данной плазмидой, продуцирует T7 РНК-полимеразу с низким уровнем, который составляет лишь 10-20% от суммарного белка.Phage T7 RNA polymerase is widely used in the preparation of RNA probes for blot hybridization; for producing biologically active RNAs, studying the processing of eukaryotic RNAs, exon-intron mapping of genomic DNA [1] In addition, the enzyme can be used for labeling RNA using radioactive or biotinylated nucleoside triphosphates, and in certain systems for nucleic acid sequencing [2]
However, the E. coliHMS174 strain transformed with this plasmid produces T7 RNA polymerase with a low level, which is only 10-20% of the total protein.
В последнее время в качестве клонирующих векторов начали активно использовать нитчатые фаги E.coli. Созданы различные векторные производные фагов: M13, fd и fi [4] Преимуществом векторов данного типа является то, что нитчатые фаги в процессе инфекции не лизируют бактериальные клетки, а копийность репликативной формы фаговой ДНК в клетке достигает 200-300 молекул, что обеспечивает высокую дозу клонированного гена, а следовательно,и достаточно высокий выход РНК-полимеразы фага T7. Кроме того, фаговую ДНК легче выделять и использовать по сравнению с плазмидной ДНК. Recently, filamentous phages of E. coli have been actively used as cloning vectors. Various vector derivatives of phages have been created: M13, fd, and fi [4] The advantage of vectors of this type is that filamentous phages do not lyse bacterial cells during infection, and the copy number of the replicative form of phage DNA in a cell reaches 200-300 molecules, which ensures a high dose the cloned gene and, consequently, a rather high yield of RNA polymerase of phage T7. In addition, phage DNA is easier to isolate and use compared to plasmid DNA.
Известен фаг M13polT7-1, используемый в векторной системе, способной обеспечить экспрессию чужеродных генов в клетках E.coli, находящихся под контролем поздних промоторов фага T7. Known phage M13polT7-1, used in a vector system capable of expressing foreign genes in E. coli cells under the control of late promoters of T7 phage.
Данная векторная система основана на раздельном введении генов в бактерию путем предварительной трансформации клеток E.coli плазмидой с экспрессируемым геном с последующим инфицированием их бактериофагом M13polT7-1, который выступает только в качестве носителя гена РНК-полимеразы, но не является ее продуцентом. This vector system is based on the separate introduction of genes into the bacterium by preliminary transformation of E. coli cells with a plasmid with the expressed gene, followed by infection with the bacteriophage M13polT7-1, which acts only as a carrier of the RNA polymerase gene, but is not its producer.
Известна рекомбинантная плазмида PAR1219, содержащая ген РНК-полимеразы фага T7. Known recombinant plasmid PAR1219 containing the gene for RNA polymerase of phage T7.
Технической задачей предлагаемого изобретения является увеличение выхода РНК-полимеразы фага T7 в клетках E.coli. The technical task of the invention is to increase the yield of RNA polymerase of phage T7 in E. coli cells.
Задача решается конструированием рекомбинантного фага M13polT7, обеспечивающего повышенный синтез фермента РНК-полимеразы фага T7 в бактериальных клетках. The problem is solved by the construction of the recombinant phage M13polT7, which provides increased synthesis of the enzyme RNA polymerase of phage T7 in bacterial cells.
Фаговая ДНК M13polT7, содержащая фрагмент ДНК, кодирующий РНК-полимеразу фага T7, имеет молекулярную массу 6,6 МДа (размер 9949 н.п.) и состоит из следующих элементов:
векторного BamHI фрагмента фага M13mp10, размером 7244 н.п.M13polT7 phage DNA containing a DNA fragment encoding T7 phage RNA polymerase has a molecular weight of 6.6 MDa (size 9949 n.p.) and consists of the following elements:
of the BamHI vector fragment of the phage M13mp10, size 7244 n.p.
Sau3A-Sau3A фрагмента плазмиды PAR1219, содержащего ген РНК-полимеразы фага T7, размером 2705 н.п. Sau3A-Sau3A fragment of the plasmid PAR1219 containing the gene of RNA polymerase of phage T7, size 2705 N. p.
plac-lacuv5 промотора;
имеет:
уникальный сайт рестрикции: BamHI;
маркерный ген: lacZ.plac-lacuv5 promoter;
It has:
unique restriction site: BamHI;
marker gene: lacZ.
Штамм фага M13polT7 имеет следующие культуральные и морфологические свойства. The strain of phage M13polT7 has the following cultural and morphological properties.
Морфология негативных колоний на твердой среде: образует прозрачные бляшки диаметром 2 мм. Morphology of negative colonies on a solid medium: forms transparent plaques with a diameter of 2 mm.
Функциональные свойства: нелизирующий фаг. Functional properties: non-lysing phage.
Оптимум роста: (37+1)oC на YT среде.Growth optimum: (37 + 1) o C on YT medium.
Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером ВКПМ РН-714. The strain is deposited in the All-Union Collection of Industrial Microorganisms of the Institute "VNIIgenetika" under the number VKPM RN-714.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что фрагмент ДНК, кодирующий РНК-полимеразу фага T7, вводят в векторную фаговую ДНК нитчатого фага M13. Полученный рекомбинантный фаг обеспечивает синтез РНК-полимеразы фага T7 в клетках E.coli. The essence of the invention lies in the fact that a DNA fragment encoding an RNA polymerase of phage T7 is introduced into the vector phage DNA of filamentous phage M13. The resulting recombinant phage provides the synthesis of T7 phage RNA polymerase in E. coli cells.
Способ конструирования M13polT7 состоит в следующем: в исходный фаг M13mp10 [6] по уникальному сайту BamHI вводят фрагмент из плазмиды PAR1219 [3] кодирующий РНК-полимеразу фага T7. The method of constructing M13polT7 is as follows: a fragment from plasmid PAR1219 [3] encoding RNA polymerase of phage T7 is introduced into the original M13mp10 phage [6] using the unique BamHI site.
Полученный фаг M13polT7 в клетках E.coli обеспечивает синтез РНК-полимеразы фага T7 (25-30% от суммарного белка). The obtained M13polT7 phage in E. coli cells provides the synthesis of T7 phage RNA polymerase (25-30% of the total protein).
Таким образом, впервые получена фаговая ДНК, обеспечивающая в инфицированных ею клетках E.coli синтез белка, обладающего свойствами РНК-полимеразы фага T7, за счет экспрессии гена РНК-полимеразы фага T7. Thus, phage DNA was obtained for the first time, which ensures the synthesis of a protein possessing the properties of phage T7 phage RNA polymerase in E. coli cells infected by expression of the phage T7 phage RNA polymerase gene.
На фиг.1 дана схема конструирования фага M13polT7 со следующими обозначениями: polT7 ген РНК-полимеразы фага T7, SD сайт связывания рибосом, plac-lacuv5 промотор, lacZ часть гена β галактозидазы; на фиг.2 -денситограмма электрофоретически разделенных лизатов клеток E.coli, инфицированных фагом M13polT7. Заштрихован пик, соответствующий белку polT7. Figure 1 shows the design scheme of phage M13polT7 with the following notation: polT7 gene of RNA polymerase of phage T7, SD ribosome binding site, plac-lacuv5 promoter, lacZ part of the β galactosidase gene; figure 2 is a densitogram of electrophoretically separated lysates of E. coli cells infected with phage M13polT7. The peak corresponding to the polT7 protein is shaded.
Сущность предлагаемого изобретения раскрывается в следующих примерах. The essence of the invention is disclosed in the following examples.
Пример 1. Способ конструирования рекомбинантного фага M13polT7. 1 мкг ДНК векторного фага M13mp10 [6] расщепляют эндонуклеазой рестрикции BamHI (10 единиц) в буфере, содержащем 10mM трис-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2,1mM дитиотрейтола. Реакцию проводят 1 ч при 37oC. Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза. Препарат депротеинизируют с помощью фенольной экстракции, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в TE-буфере, содержащем 10mM трис-HCl pH 8,0 и 1 mM ЭДТА.Example 1. A method of constructing a recombinant phage M13polT7. 1 μg of DNA of the vector phage M13mp10 [6] was digested with BamHI restriction endonuclease (10 units) in a buffer containing 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol. The reaction is carried out for 1 h at 37 o C. Analysis of the completeness of hydrolysis is carried out using electrophoresis. The drug is deproteinized using phenolic extraction, the DNA is precipitated with ethanol and resuspended in TE buffer containing 10mM Tris-HCl pH 8.0 and 1 mM EDTA.
Препарат индивидуального фрагмента размером 2705 н.п. содержащего ген РНК-полимеразы фага T7, получают при Sau3A гидролизе плазмиды pAR1219 [3] Выделение индивидуального фрагмента осуществляют путем электрофоретического разделения в 6%-ном полиакриламидном геле с последующей электроэлюцией. Individual fragment preparation 2705 n.p. of the T7 phage RNA polymerase gene containing Sau3A by plasmid pAR1219 hydrolysis [3] Isolation of an individual fragment is carried out by electrophoretic separation in a 6% polyacrylamide gel followed by electroelution.
Лигирование смеси гидролизованного фага M13mp10 (0,1 мкг) и фрагмента, кодирующего ген РНК-полимеразы (0,1 мкг),проводят с помощью ДНК-лигазы фага T4 (4 единицы) в объеме 30 мкл (инкубацию ведут в течение 10 ч при 12oC).The ligation of a mixture of hydrolyzed phage M13mp10 (0.1 μg) and a fragment encoding the RNA polymerase gene (0.1 μg) is carried out using T4 DNA phage ligase (4 units) in a volume of 30 μl (incubation is carried out for 10 h at 12 o C).
Полученные фаги, не имеющие синюю окраску на индикаторных чашках с Ygal (0,1 мкг/мл) и IPTG (1 Mm), анализируют рестрикционным анализом репликативной формы этих фагов с помощью эндонуклеазы рестрикции HaeIII. The resulting phages that do not have a blue color on indicator plates with Ygal (0.1 μg / ml) and IPTG (1 Mm) are analyzed by restriction analysis of the replicative form of these phages using a HaeIII restriction endonuclease.
Рекомбинантная фаговая ДНК, имеющая в своем составе фрагмент, содержащий ген T7 РНК-полимеразы в нужной ориентации (под контролем lacuv5 промотора), обозначена M13polT7. Recombinant phage DNA, which contains a fragment containing the T7 RNA polymerase gene in the desired orientation (under the control of the lacuv5 promoter), is designated M13polT7.
Пример 2. Экспрессия гена РНК-полимеразы фага T7 в составе фага M13. Для исследования экспрессии гена РНК-полимеразы фага T7 клетки E.coli DΗ5αF′ инфицируют фагами: M13polT7 и M13mp10. Клетки E.coli DΗ5αF′ подращивают до оптической плотности (ОП) 0,6-0,7 ед. (590 нм) на LB среде при 37oC. Затем вносят фаг M13polT7, а в контрольном опыте фаг M13mp10; а также индуктор - IPTG (изопропил β D тиогалактозид) (0,1 мМ). Соотношение клетка: фаг - 1:1 (множественность заражения).Example 2. Expression of the RNA polymerase gene of phage T7 in the composition of phage M13. To study the expression of the phage T7 RNA polymerase gene, E. coli DΗ5αF ′ cells are infected with phages: M13polT7 and M13mp10. E. coli DΗ5αF ′ cells are grown to an optical density (OD) of 0.6-0.7 units. (590 nm) on LB medium at 37 o C. Then add the phage M13polT7, and in the control experiment the phage M13mp10; as well as an inductor, IPTG (isopropyl β D thiogalactoside) (0.1 mM). The ratio of cell: phage is 1: 1 (multiplicity of infection).
Суспензию культивируют в течение 6 ч, что позволяет получать максимальный выход целевого белка в случае фага M13polT7. The suspension was cultured for 6 h, which allows to obtain the maximum yield of the target protein in the case of phage M13polT7.
На электрофореграмме разделения белков из клеток E.coli, инфицированных фагом M13polT7, идентифицируют белок (М.в.98000), отсутствующий в клетках, инфицированных векторным фагом M13mp10. On the electrophoregram for the separation of proteins from E. coli cells infected with M13polT7 phage, a protein (M.v. 98000) is identified that is absent in cells infected with the vector phage M13mp10.
Определение ферментной активности проводят, используя в качестве специфической матрицы ДНК фага T7. Determination of enzyme activity is carried out using T7 phage DNA as a specific template.
Исходя из данных электрофореза уровень продукции РНК-полимеразы, синтезированной рекомбинантным фагом, составляет примерно 25-30% от суммарного белка. Based on the data of electrophoresis, the level of production of RNA polymerase synthesized by a recombinant phage is approximately 25-30% of the total protein.
Пример 3. Выделение и титрование фага. К культуральной жидкости после отделения инфицированных клеток добавляют 0,25 исходного объема раствора ПЭГ (содержит полиэтиленгликоль 6000 20 г, NaCl 10 г, воду до 100 мл) и оставляют на 15 мин при 20oC. Фаг отделяют центрифугированием (15 мин) и ресуспендируют в буферном растворе, содержащем 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 20 мМ NaCl, 1мМ ЭДЕА (1/10 исходного объема). Титрование фага проводят по стандартной методике. Обычно получают препараты фага с титром 10-10 БОЕ/мл.Example 3. Isolation and titration of phage. After separation of the infected cells, 0.25 of the initial volume of PEG solution (containing polyethylene glycol 6000 20 g, NaCl 10 g, water up to 100 ml) was added to the culture fluid and left for 15 min at 20 o C. The phage was separated by centrifugation (15 min) and resuspended in a buffer solution containing 20 mm Tris-HCl pH 7.5, 20 mm NaCl, 1 mm EDEA (1/10 of the original volume). Phage titration is carried out according to standard methods. Usually phage preparations with a titer of 10-10 PFU / ml are obtained.
Пример 4. Очистка рекомбинантной РНК-полимеразы фага T7. Клетки E.coli DH5αF′, инфицированные фагом M13polT7, осаждают центрифугированием. 6 г биомассы суспендируют в 160 мл 50 мМ трис-HCl буфера pH 7,9,содержащего 2 мМ ЭДТА, 0,1 мМ дитиотрейтола, 200 мМ NaCl, 5% глицерина и 10 мг лизоцима. Клетки разрушают ультразвуком в течение 1 мин и центрифугируют 30 мин при 1000 об/мин. К супернатанту добавляют раствор стрептомицинсульфата до конечной концентрации 0,2% при постоянном перемешивании в течение 5 мин. Осадившиеся нуклеиновые кислоты удаляют центрифугированием при 15000 об/мин в течение 20 мин. Example 4. Purification of recombinant RNA polymerase of phage T7. E. coli DH5αF ′ cells infected with the M13polT7 phage are pelleted by centrifugation. 6 g of biomass are suspended in 160 ml of 50 mM Tris-HCl pH 7.9 buffer containing 2 mM EDTA, 0.1 mM dithiothreitol, 200 mM NaCl, 5% glycerol and 10 mg lysozyme. Cells are destroyed by ultrasound for 1 min and centrifuged for 30 min at 1000 rpm. A streptomycin sulfate solution is added to the supernatant to a final concentration of 0.2% with constant stirring for 5 minutes. Precipitated nucleic acids are removed by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes.
К супернатанту, содержащему РНК-полимеразу фага T7, добавляют сульфат аммония до 50% -ного насыщения. Суспензию центрифугируют 30 мин при 10000 об/мин. Осадок растворяют в 40 мл 10 мМ калий-фосфатного буфера pH 8,0, содержащего 10 mM β -меркаптоэтанола, 1 mM ЭДТА, 12% глицерины (буфер А) и 0,15М NACl, подвергают диализу против этого же буфера в течение 12 ч. Ammonium sulfate was added to the supernatant containing RNA polymerase of phage T7 to 50% saturation. The suspension is centrifuged for 30 minutes at 10,000 rpm. The precipitate is dissolved in 40 ml of 10 mM potassium phosphate pH 8.0 buffer containing 10 mM β-mercaptoethanol, 1 mM EDTA, 12% glycerol (buffer A) and 0.15 M NACl, dialyzed against the same buffer for 12 hours .
Обессоленный раствор фермента наносят на колонку (1.5•1.5) с фосфоцеллюлозой Р11. The desalted enzyme solution is applied to a column (1.5 • 1.5) with P11 phosphocellulose.
РНК-полимеразу фага T7 элюируют с колонки градиентом NaCl (0,25М-0,5М) в буфере А РНК-полимераза элюируется при концентрации NaCl 0,25М-0,4М. Фракции, содержащие фермент, объединяют и наносят на колонку (1,5х6 см) с голубой декстран-сефарозой. Колонку промывают сначала 40 мл буфера А, содержащего 0.25М NaCl, затем 20 мл буфера А, содержащего 1 мМ ГТФ и 1 мМ АТФ. Phage T7 RNA polymerase was eluted from the column with a NaCl gradient (0.25M-0.5M) in buffer A. RNA polymerase was eluted at a 0.25M-0.4M NaCl concentration. Fractions containing the enzyme are combined and applied to a column (1.5 x 6 cm) with blue dextran-sepharose. The column is washed first with 40 ml of buffer A containing 0.25 M NaCl, then 20 ml of buffer A containing 1 mM GTP and 1 mM ATP.
Фермент элюируют 0,55М калий-фосфатным буфером pH 8,0, содержащим 1,5 мМ дитиотрейтола, 40 мМ ЭДТА и 12% глицерина. The enzyme is eluted with 0.55M potassium phosphate buffer pH 8.0 containing 1.5 mM dithiothreitol, 40 mM EDTA and 12% glycerol.
Фракции, содержащие РНК-полимеразу фага T7, собирают и диализуют против буфера А, а затем концентрируют против 10мМ калий-фосфатного буфера pH 8.0, 10mM b меркаптоэтанола, 50% глицерина и 180 мМ KCl. Fractions containing phage T7 RNA polymerase were collected and dialyzed against buffer A, and then concentrated against 10 mM potassium phosphate buffer pH 8.0, 10 mM b mercaptoethanol, 50% glycerol and 180 mM KCl.
Таким образом, в результате разработанной схемы очистки получают 12•106 ед.акт. гомогенной РНК-полимеразы фага T7.Thus, as a result of the developed purification scheme, 12 • 10 6 units of act are obtained. homogeneous RNA polymerase of phage T7.
Выход по ферменту составляет 25% от исходно содержащегося фермента в биомассе. The yield of the enzyme is 25% of the initial enzyme in the biomass.
С 1 г влажной биомассы получают 2•106 ед.акт. гомогенного фермента.With 1 g of wet biomass get 2 • 10 6 units. homogeneous enzyme.
Список литературы:
1. KKrieg,P.A. Melton,D.A.Methods Enzymoll.155,397(1987).Bibliography:
1. KKrieg, PA Melton, DAMethods Enzymoll. 155,397 (1987).
2. Axelrood,V.D.Rramer,F.R. Biochemistry 24,5716(1985). 2. Axelrood, V. D. Rramer, F. R. Biochemistry 24.5716 (1985).
3. Davanloo,P. et al.Proc.Natl.Acad.Sci:USA 81,2035(1984). 3. Davanloo, P. et al .Proc. Natl. Acad. Sci: USA 81,2035 (1984).
4. Messing J. and Vieira J. Gene,1982,v.19.p7269-276. 4. Messing J. and Vieira J. Gene, 1982, v.19.p7269-276.
5. А.А. Ильичев, Н.В.Меламенд, А.И.Закабунин и др. ДАН, 1988,т.303,N2,c. 496-498. 5. A.A. Ilyichev, N.V. Melamend, A.I. Zakabunin and others, DAN, 1988, v.303, N2, p. 496-498.
6. Single-atranded DNA Phages (1978). eds.Dehardt D.T.Dressler D.H. and Ray D.S. Cold Spring Harbor Laboratory,11724 Cold Spring Harbor,New York. 6. Single-atranded DNA Phages (1978). eds.Dehardt D.T.Dressler D.H. and Ray D.S. Cold Spring Harbor Laboratory, 11724 Cold Spring Harbor, New York.
Claims (2)
и содержащая маркерный ген lac Z; уникальный сайт рестрикции Bam HI.1. Recombinant phage DNA M13 polT7, having a size of 9949 bp a molecular weight of 6.6 MDa, consisting of a Bam HI DNA fragment of the vector phage M13 mp 10 measuring 7244 bp Sau 3A Sau 3A DNA fragment size 2705 bp from plasmid pAR 1219 encoding T7 phage RNA polymerase; plac lacuv 5 promoter,
and containing the lac Z marker gene; unique Bam HI restriction site.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94014602A RU2089613C1 (en) | 1994-04-19 | 1994-04-19 | Recombinant phage dna m13 pol t7 and recombinant strain of phage m13 - a producer of phage t7 rna-polymerase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94014602A RU2089613C1 (en) | 1994-04-19 | 1994-04-19 | Recombinant phage dna m13 pol t7 and recombinant strain of phage m13 - a producer of phage t7 rna-polymerase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94014602A RU94014602A (en) | 1996-10-20 |
| RU2089613C1 true RU2089613C1 (en) | 1997-09-10 |
Family
ID=20154991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94014602A RU2089613C1 (en) | 1994-04-19 | 1994-04-19 | Recombinant phage dna m13 pol t7 and recombinant strain of phage m13 - a producer of phage t7 rna-polymerase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2089613C1 (en) |
-
1994
- 1994-04-19 RU RU94014602A patent/RU2089613C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Ильичев А.А. и др. Докл. АН СССР. Т. 303, N 2, с. 496, 1988. 2. Davanloo et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81, 2035, 1984. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU94014602A (en) | 1996-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fleckenstein et al. | Cloning of the complete human cytomegalovirus genome in cosmids | |
| Shizuya et al. | Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. | |
| US5168062A (en) | Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence | |
| JPH0665305B2 (en) | Method for stabilizing host cell containing recombinant DNA | |
| Midgley et al. | T4 polynucleotide kinase; cloning of the gene (pseT) and amplification of its product. | |
| Barnes | Construction of an M13 histidine-transducing phage: a single-stranded cloning vehicle with one EcoRI site | |
| US5128256A (en) | DNA cloning vectors with in vivo excisable plasmids | |
| EP0155189A2 (en) | Expression of cell wall degrading proteins and host cells harboring dna encoding such protein | |
| Esche et al. | In vitro translation of adenovirus type 12-specific mRNA isolated from infected and transformed cells | |
| Nierlich et al. | Transfer RNA synthesis in vitro | |
| Kuo et al. | The lysogenic cycle of the filamentous phage Cflt from Xanthomonas campestris pv. citri | |
| RU2089613C1 (en) | Recombinant phage dna m13 pol t7 and recombinant strain of phage m13 - a producer of phage t7 rna-polymerase | |
| van Meeteren et al. | Transcription of bacteriophage Mu: II. Transcription of the repressor gene | |
| Anderson et al. | Simian virus 40-specific polypeptides in AD2+ ND1-and Ad2+ ND4-infected cells | |
| Konings | Synthesis of phage M13 specific proteins in a DNA-dependent cell-free system | |
| JPH06237773A (en) | A type inclusion @(3754/24)ati) promoter of poxvirus and exogenote expression vector comprising prophase promoter | |
| Heidekamp et al. | Studies of the recognition sequence of φX174 gene A protein. Cleavage site of φX gene A protein in St-1 RFI DNA | |
| Ray et al. | Cloning the gene for ribonuclease E, an RNA processing enzyme | |
| US5863730A (en) | Procedure for the polymerization of nucleic acid sequences and its applications | |
| Bouet et al. | Direct PCR sequencing of the ndd gene of bacteriophage T4: identification of a product involved in bacterial nucleoid disruption | |
| EP0286200B1 (en) | DNA cloning vector with in vivo excisable plasmids | |
| Krisch et al. | Construction and properties of a recombinant plasmid containing gene 32 of bacteriophage T4D | |
| Champness et al. | Bacteriophage T4 gol site: sequence analysis and effects of the site on plasmid transformation | |
| EP0067071B1 (en) | Plasmid and production thereof | |
| US4845031A (en) | Recombinant DNA process for producing useful polypeptides |