JPH07250690A - ウマガンマーインターフェロンをコードするｄｎａ を含有する宿主生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 EqIFN −ガンマの生物学的、免疫学的性質を
有し、必要に応じて天然のグリコシル化を有しないこと
を特徴とする実質的に純粋形のポリペプチドをコードす
るDNA 分子を含有するかあるいはプラスミドpAHlllであ
る組換DNA 分子で形質転換されていることを特徴とする
宿主生物。 【効果】 ウマガンマーインターフェロンを産生するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はウマガンマーインターフ
ェロン（ウマインターフェロン−ガンマー、EqIFN-γ）
をコードするＤＮＡを含有する宿主生物に関する。

【０００２】

【従来技術】インターフェロンはウィルス感染または他
の刺激後に真核細胞によって分泌するたん白質でありウ
ィルス感染からこれら細胞を防御し得る。３種類のイン
ターフェロンが現在公知であり、これらはインターフェ
ロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロ
ン−γと称されている（IFN-α、IFN-βおよびIFN-γと
略記する）。即ち、インターフェロンは免疫系の細胞の
調節効果を有し得るかあるいは細胞の分化および腫瘍の
増殖に影響し得る。１９６５年、F. Wheelock はウィル
ス感染からある種の細胞を防御するポリペプチドを発見
した〔サイエンス（Science)、１４９、３１０（１９６
５）〕。これらの性質を有するポリペプチドは免疫イン
ターフェロン、タイプIIインターフェロン、インターフ
ェロン−ガンマーまたはIFN-γと称されるが、これらは
リンホカインのクラスに属するポリペプチドである。ヒ
トインターフェロン−γ以外に、ウシ、マウスおよびラ
ットインターフェロン−γも公知になっている。従来公
知のγ−インターフェロンはすべてグリコシル化形で生
ずるが、グリコシル化は生物学的活性に影響しない〔Ke
ller等、J. Biol. Chem.、２５８、８０１０（１９８
３）〕。

【０００３】永い間、インターフェロンは種特異活性を
有するものと考えられていた。しかしながら、インビト
ロ試験はウシからのＩＦＮ調製物がサルおよびヒト中で
抗ウィルス活性を誘起し得ることを示唆していた〔Tove
y 、M.G.等、J. Gen. Virol.、３６、３４１−３４４
（１９７７）〕。この種相互活性は恐らく遺伝子または
たん白質の幾分大きい相同性に関係していたのかもしれ
なかった：この仮説は動物のインターフェロンが微量で
あるため試験することができなかった。見い出された種
相互活性にもかかわらず、抗原性のような副作用が異な
る種からのインターフェロンを用いたときは観察され、
これら副作用は治療において許容され得ない。しかしな
がら、動物管理および家庭内ペットの保護は極めて経済
的な重要性を有するので、獣医によって使用できる各種
の動物種用のインターフェロンが求められている。

【０００４】各種の動物種の高度に精製したインターフ
ェロンはヒトに転用できるモデルに到達するためのイン
ターフェロンの活性メカニズムを研究する良い機会を与
えるであろう。動物インターフェロンによる最初の研究
は天然細胞物質由来の調製物を用いて行なわれたが、こ
の方法で調製したインターフェロンの収量と純度はその
調製物を薬剤の調製に適しないものとしている。組み換
えＤＮＡ技術を発展させることによって、異種たん白質
を微生物から産生させることが可能である。この方法に
おいて、例えば、ヒトインターフェロン（Hu−IFN)は調
製されており、極く最近、種々の非ヒトインターフェロ
ンも取得されている。

【０００５】

【発明の目的および内容】本発明の１つの目的は遺伝子
技術によってウマγ−インターフェロンを調製すること
およびそれに必要なＤＮＡ配列を調製することである。
上記目的はいわゆるプローブ技術を用いることによって
本発明によって達成される。使用するプローブはヒト−
γ−インターフェロン由来の文献公知のＤＮＡ配列であ
る〔GrayおよびGoeddel ; Nature２９８、８５９−８６
３（１９８２）〕。しかしながら、他のγ−インターフ
ェロンの部分または完全配列もプローブとして適当であ
る。研究用の出発物質は正常ウマ貯蔵組織から得たＤＮ
Ａライブラリーであった。この方法において、次のよう
な式Ｉのフランキング領域を有するEqIFN-γ用の遺伝子
コードが初めて単離されている：

【０００６】

【化１０】

【０００７】

【化１１】

【０００８】

【化１２】

【０００９】式 I 重要なことは、従来公知のすべてのγ−インターフェロ
ン同様に、EqIFN-γは構造遺伝子を遮断している長い配
列を有する遺伝子によって当該生物体中にコードされて
いることである：この遺伝子はエクソンとイントロンと
からなり、エクソンのみが上記たん白質をコードしてい
る。イントロンは単にある種の系、例えば、動物細胞中
の系によってのみ理解され得るものである。イントロン
を含むＤＮＡ配列は他の系、例えば、E. coli.中では使
用できない。従って、本発明の別の目的はEqIFN-γをコ
ードするイントロンなしのＤＮＡ配列を調製することで
ある。

【００１０】この目的は主に２つの方法で達成できる。 1. 転写が起る細胞核から、イントロンは細胞質中で切
除され、エクソン−ＲＮＡフラグメントをスプライシン
グすることにより、真核たん白質のmRNAが産生される。
このmRNAは酵素、即ち、逆転写酵素によってコピーDNA
(cDNA) と称されるＤＮＡに再コピーされる。

【００１１】

【化１３】

【００１２】式II このイントロンなしのＤＮＡは、その後、適当な宿主生
物、例えば、E.coliと共に使用できる適当なプラスミド
中に挿入して、この場合においてはEqIFN-γからの真核
たん白質を産生し得る。この方法の１つの欠点は遺伝子
コードの縮退である。事実、この縮退は異種生物体に同
じアミノ酸の異なるコドンを使用させている。従って、
使用するＤＮＡを最適に適合化しないならば、それは原
核系中に真核たん白質の欠陥発現を生じ得る。 2. 真核遺伝子用のイントロンなしのＤＮＡ配列を取得
する他の可能性ある方法は、染色体ＤＮＡ配列が公知で
あるときは、イントロンなしのＤＮＡ配列を化学的に合
成することである。式 IIIによるＤＮＡは本発明の問題
を解決するのに特に適することが証明された：

【００１３】

【化１４】

【００１４】式 III これはそれ自体公知の方法により製造し得る。１６種の
オリゴヌクレオチドは２つの変異形で合成された。第１
の完全変異体は１４６個のアミノ酸と出発メチオニンを
有する成熟EqIFN-γをコードしており、また第２の変異
体はアミノ末端で３個のアミノ酸で短縮されたポリペプ
チドをコードしている。

【００１５】

【化１５】

【００１６】式 IIIａ 両変異体は疎水性シグナルペプチドをコードする配列上
にメチオニンをコードするＡＴＧの代りに式IVの配列を
加えることによって容易に修飾できる。

【００１７】

【化１６】

【００１８】式IV この種のシグナル配列は、ある種の宿主生物において
は、細胞質からの所望のポリペプチドの分泌をもたらす
であろう。そこから、たん白質はプロセッシングを受け
シグナルペプチドが断裂し；成熟たん白質が得られる。
シグナルペプチド配列を含むポリペプチドとプロセッシ
ングすることのできない宿主生物例えばE.coliからの細
胞は“未成熟”ポリペプチドを単離するために破壊され
なければならない。完全または不完全シグナルペプチド
配列を有するこれらの“未成熟”EqIFN-γもまた本発明
の目的である。

【００１９】出発メチオニンは公知の方法、例えば、CN
BrまたはCNClを用いて分離し成熟EqIFN-γを得ることが
できる。このＤＮＡ配列はEqIFN-γをコードするがE.co
liによって高度に発現したコドンを例外的に含み、この
コドンは細胞に対して未変性（native) の遺伝子で使用
する〔GouyおよびGautier 、Nucl. Acids Res.１０、７
０５５（１９８２）〕。本発明のさらなる目的はEqIFN-
γを純粋な均質形で初めて調製することである。前述し
たように、天然細胞物質からのEqIFN-γの単離精製はこ
の問題を満足できる方法で解決することができなかっ
た。従って、本発明によれば、式II、 IIIおよびIIIaに
よるＤＮＡ配列を用いてこの問題を解決する。これらの
配列は、相応する制御配列を有しており、適当なベクタ
ーに挿入され、それによって形質転換された適当な宿主
生物または宿主細胞組織が培養される。形成したポリペ
プチドはそれ自体公知の方法で単離され精製される。得
られたポリペプチドは次の式に相当する：

【００２０】

【化１７】

【００２１】式Ｖ または、

【００２２】

【化１８】

【００２３】式Ｖａ 染色体配列（式II）を用いるときは、動物細胞の形質転
換後、EqIFN-γはその天然由来グリコシル化形で得られ
る（標準EqIFN-γ）。式II、 IIIおよびIIIaによる配列
は微生物中でのEqIFN-γの調製、特に、E.coli中でのEq
IFN-γの調製に特に適しており、ポリペプチドは非グリ
コシル化形で発現する。本発明のさらに別の目的は天然
EqIFN-γの修飾物を調製することである。たん白質の修
飾物はそのたん白質を誘導するが、そのたん白質を酵素
消化により断片化するか、あるいはそのたん白質をコー
ドするＤＮＡ配列を欠落または断片化によって修飾し、
この配列を適当な宿主生物中で発現することによって得
ることができる。

【００２４】本発明によれば、EqIFN-γの修飾物をコー
ドするＤＮＡ配列は化学的に合成する。遺伝子の単純操
作を行って個々の部分を変化させるためには、複数の単
一制限酵素切断サイトが完全ＤＮＡ配列に挿入される。
EqIFN-γの他の修飾形は種々のオリゴヌクレオチドを適
当なベクター中に単独または相応する制御配列を有する
組合せでもって挿入し、それによって形質転換された宿
主生物を培養し、得られたたん白質を単離精製すること
によって本発明によって取得される。

【００２５】上述の各目的を達成するためには、高分子
ＤＮＡをウマ組織、好ましくは肝臓からBlinおよびStaf
ford〔Blin、N.およびStafford、P.W.、Nucl. Acids Re
s.(１９７６）、３、２３０３−２３０８〕による変形
方法を用いて単離し特別のエンドヌクレアーゼを用いて
統計的に断片化した。かくして得られた異なる大きさの
フラグメントはその大きさに従って好ましくは１０〜２
３kbのフラグメントに分画しベクター例えばラムダベク
ター例えばラムダEMBL3A中でクローニングした。次いで
これらのベクターは形質転換後宿主生物例えばE.coli中
に複製した。このウマＤＮＡライブラリーはヒトガンマ
ー−インターフェロンプローブにより非緊縮ハイブリダ
イゼーション条件下に試験した。低レベルの緊縮性がプ
ローブと異なるＤＮＡ配列を見い出すのを可能にする。

【００２６】上記のプローブは文献公知のプラスミドを
制限酵素により消化することによりあるいはオリゴヌク
レオチドを合成する公知方法を用いる化学合成により調
製できる。このプローブはHuIFN-γをコードする配列を
有する。５個のラムダクローンを同定して陽性のハイブ
リダイゼーションシグナルを得た。ＤＮＡはこれらの単
離組換えファージから通常の方法により単離した。ファ
ージＤＮＡは、各種制限酵素により消化し次いでHuIFN-
γプローブによるハイブリダイゼーションによりサウサ
ーン分析（Southern、J. Mol. Biol. ９８：５０３−５
１７、１９７５）を行ったのち、特徴付した。クローン
ラムダEq−γ₂ の4.６kb長単−ハイブリッド形成性BamH
I フラグメントを単離しプラスミドpUC9のBamHI 切断サ
イト中にクローニングした（VieiraおよびMessing 、Ge
ne１９：２５９−２６８、１９８２）。

【００２７】E.coli例えばJM 101の形質転換後、プラス
ミドＤＮＡを得られたコロニーからミニ調製法（Birnbo
imおよびDoly、Nucl. Acids Res.７：１５１３−１５２
３、１９７９）により調製し制限酵素により消化によっ
て特徴付した。所望のBamHI挿入物を有するプラスミド
はpAH 111 と表示した。M13mp8またはM13mp9ベクター
（VieiraおよびMessing 、Gene１９、２５９−２６８、
１９８２）への導入後、プラスミドpAH 111 のBamHI 挿
入物の末端をジデオキシ法（Sanger等、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA７４：５４６３−５４６７、１９７７）に
よりシーケンシングした。ヒトガンマーインターフェロ
ン遺伝子との配列比較（GrayおよびGoeddel 、Nature２
９８：８５９−８６３、１９８２）は末コードの５′−
および３′−領域と高度の相同を示した。従って、完全
EqIFN-γ遺伝子を単離したものと結論付けた。

【００２８】プラスミドpAH 111 の4.６kb長のBamHI 挿
入物はジデオキシ法によって全体的にシーケンシイング
した。BamHI フラグメントの全配列は、制限フラグメン
ト（EcoRI 、HindIII 、PstI、PstI-BglII、HindIII-Ba
mHI ）の直接クローニングにより得たM13 サブクローン
からの部分配列を相応する切断M13mp8またはM13mp9ベク
ター中に組み込むことによって決定した。他の部分配列
は2.０kb長のBamHI-BglII フラグメントまたは2.０kb長
のPstIフラグメントをM13mp8ベクターに“ショットガ
ン”法によりクローニングすることによって得た。得ら
れた部分配列はコンピュータープログラムによって組み
込み、図１〜図３で示す全配列4664bp長を得た。（図
中、コードされたアミノ酸配列とイントロンの位置が示
されている。負の数を有するアミノ酸は疎水性シグナル
ペプチドを示す。位置８６−８８での成熟EqIFN-γの唯
一の潜在的Ｎ−グリコシル化サイトはアンダーラインさ
れている。ＲＡＮポリメラーゼの結合に重要な配列 CCA
TCおよびTATAAAA は mRNA(AATAAA) のポリアデニル化用
の２個のシグナル配列であるようにアンダーラインされ
ている。）

【００２９】開放読みフレームのコンピューター分析お
よび他の種のガンマー−インターフェロン遺伝子との比
較（GrayおよびGoeddel 、Nature２９８：８５９−８６
３；GrayおよびGoeddel 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
８０：５８４２−５８４６；Dijkema 等、EMBO J. ４：
７６１−７６７、１９８５；Gerretti等、J. Immunolog
y １３６：４５６１−４５６４、１９８６）により、ウ
マガンマーインターフェロン遺伝子のたん白質コード領
域を決定した。このたん白質コード領域は３つのイント
ロンで遮断されており、第１エクソンは成熟EqIFN-γポ
リペプチドの２０アミノ酸長と１８アミノ酸である疎水
性シグナルペプチド（塩基３６６−４７９）をコードし
ている。第２エクソンはアミノ酸１９−４１（塩基１６
３９−１７０７）をコードしており、第３エクソンはア
ミノ酸４２−１０２をコードしており、第４エクソンは
アミノ酸１０３−１４６（塩基３３０７−３４４１）を
有するカルボキシ末端をコードしている。位置４０１０
および４０２０では、mRNAのポリアデニリル化用の２つ
のシグナル配列（AATAAA) がある。成熟EqIFN-γポリペ
プチドの位置８６−８８には単一潜在Ｎ−グリコシル化
サイト（ASN-Ser-Ser)があり、これはウシガンマーイン
ターフェロンの第２Ｎ−グリコシル化サイト（Asn-Gly-
Ser)と一致する（図４）。（図中、数に“Ｓ”の付いた
アミノ酸はシグナルペプチドを示す。“コンセンサス”
配列は大文字ではすべてのγ−インターフェロンにおい
て一致したアミノ酸を示し、一方、小文字は７５％以上
のγ−インターフェロンにおいて生じたアミノ酸を示
す）。驚くべきことに、成熟EqIFN-γポリペプチドは位
置３で唯一の単一システィン基を含み、また、ヒトおよ
びマウスガンマーインターフェロンと同様に、第１の３
個のアミノ末端アミノ酸（この場合、Tyr-Tyr-Cys)は恐
らく体内でたん白質分解的に断裂する。

【００３０】エスシエリシア コリ（Escherichia col
i) 中で成熟形の組換えEqIFN-γを発現させるために
は、合成遺伝子をオリゴヌクレオチドから構築する。こ
れは天然EqIFN-γ遺伝子と同じアミノ酸配列をコードし
ているが、E.coliによって高度に発現した未変性細胞遺
伝子中で使用する個々のアミノ酸のコドンのみを含んで
いる（GouyおよびGautier 、Nucl. Acids Res.１０：７
０５５−７０７４、１９８２）。さらに、幾つかの単一
制限酵素切断サイトが挿入され、個々の部分を変化させ
るための遺伝子の操作を容易にしている。EqIFN-γ用の
合成遺伝子は総計１６種のオリゴヌクレオチドから２つ
の変異形で構築した。第１の変異形は１４６個のアミノ
酸と出発メチオニンを含む成熟EqIFN-γをコードし、第
２形は、天然生物中でも恐らく生じているであろうアミ
ノ末端で３個のアミノ酸（Tyr-Tyr-Cys)によって短縮さ
れたポリペプチドと出発メチオニンとをコードしてい
る。合成EqIFN-γの構造は図５に示している。（図中、
個々のオリゴヌクレオチドの長さおよびその番号が示さ
れる。合成遺伝子内でわずか１回生ずる制限切断サイト
が番号付されている。）その調製に用いたオリゴヌクレ
オチドはアプライドバイオシステムズモデル381A DNAシ
ンセサイザーを用いて合成し、電気泳動により精製し、
脱塩した。図５で特徴付されているオリゴヌクレオチド
は次の構造を有している：

【００３１】

【化１９】

【００３２】合成EqIFN-γ遺伝子は２つの部分に一緒に
挿入した。SalI切断サイトまでの遺伝子の第１部分は８
個のオリゴヌクレオチドEC−１〜EG−８を用いて産生さ
せ、一方、SalI切断サイトからBamHI 切断サイトまでの
遺伝子の第２半分は６個のオリゴヌクレオチドEG−９〜
EG−１４から調製した。アミノ末端で３個のアミノ酸に
より短縮したEqIFN-γ形においては、オリゴヌクレオチ
ドEG−１５とEG−１６をオリゴヌクレオチドEG−１とEG
−２の代りに用いた。

【００３３】本発明は本発明によるインターフェロンを
特異的にコードする遺伝子配列に関するだけでなく、突
然変位、分解、転位または付加によっても容易にかつ日
常的に取得し得る修飾物にも関する。本発明のインター
フェロンをコードし（即ち、前述して活性の生物学的ス
ペクトルを有する）かつ開示したものと比較して変性し
た任意の配列も包含するもので；当業者がコード領域の
DNA 配列を変性し得るものも包含される。同様に、本発
明のインターフェロンの活性スペクトルを有するポリペ
プチドをコードしかつ開示した配列（またはその一部）
と緊縮条件（例えば、８５％以上好ましくは９０％以上
の相同性に対して選択する条件）下でハイブリット化す
る任意の配列も包含される。

【００３４】ハイブリダイゼーションは６×ＳＳＣ／５
×Denhardt^, s 溶液／0.１％ＳＤＳ中で６５℃で行う。
緊縮度は洗浄段階で決定される。即ち、約８５％以上の
相同性を有するDNA 配列の使用においては、適当な条件
は0.２×ＳＳＣ／0.０１％ＳＤＳ／６５℃であり、約９
０％以上の相同性を有するDNA 配列の使用においては適
当な条件は0.１×ＳＳＣ／0.０１％ＳＤＳ／６５℃であ
る。本発明のインターフェロン遺伝子は任意の生物体に
高収率を得る条件下で挿入し得る。適当な宿主およびベ
クターは当業者においては良く知られており、例えば、
EP-A-0093619を参照されたい。

【００３５】原核生物、例えば、E.coliＫ１２、菌株２
９４（ATCC No.31 446）またはE.coli×１７７６（ATCC
No.31537)は発現に特に好ましい。上記菌株以外にも、
E.coliＷ３１１０（Ｆ^- 、ラムダ^- 、原栄養体、ATCC N
o.27325)、バシラス サブチリス(Bacillus subtilis)
のようなバシリー(Bacilli) 類、サルモネラ チフィム
リウム(Salmonella typhimurim) またはセラチア マル
セセンス(Serratia marcescens) のような他のエンテロ
バクテリアシア(Enterobacteriaceae)、および種々のシ
ュードモナス(Pseudomonads)を使用することもできる。

【００３６】一般に、宿主細胞と適合性のある種由来の
制御配列を含有するプラスミドベクターは上記の宿主と
組合せて使用できる。ベクターは、通常、複製サイト以
外に、認識配列を有し、これが形質転換細胞を表現型的
に選択することを可能にする。例えば、E.coliは種E.co
li由来のプラスミドであるpBR322によって通常形質転換
される〔Bolivar 等、Gene２、９５（１９７７）〕。pB
R322はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性をコー
ドしている遺伝子を含み従って形質転換細胞を同定する
簡単な方法を与える。さらに、pBR322プラスミドまたは
他のプラスミドはプロモーター自体も含むべきでありあ
るいはそれ自体のたん白質の発現のための微生物によっ
て使用できるプロモーターを含むように修飾されるべき
である。組換えDNA の調製に最も多く使用されるプロモ
ーターにはベーターラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）お
よびラクトースプロモーター系〔Chang 等、Nature２７
５、６１５（１９７８）；イタクラ等、Science １９
８、１０５６（１９７７）；Goeddel 等、Nature２８
１、５４４（１９７９）〕、およびトリプトファン（tr
p)プロモーター系〔Goeddel 等、Nucleic Acids Res.
８、４０５７（１９８０）；Ep-A-0036776〕がある。こ
れらは最も普通に使用されるプロモーターであるが、他
の微生物プロモーターも開発され使用されている。本発
明によるインターフェロン用の遺伝子配列は、例えば、
バクテリアファージラムダ(P_L ) の左方向プロモーター
の制御下で使用できる。このプロモーターは特に強力で
あることが知られているプロモーターの１つでありまた
制御可能でもある。制御は隣接の制限切断サイトが公知
であるラムダリプレッサーによって可能になる。このリ
プレッサー遺伝子の温度感受性対立遺伝子はEqIFN-γ配
列を含むベクター中に挿入できる。温度を４２℃に上昇
させた場合、リプレッサーは不活性化され、プロモータ
ーは活性化される。

【００３７】この系を使用することによって、官能性IF
N 配列をリボソーム結合サイトにラムダ P_L プロモータ
ーから変化距離でもって閉じて挿入するクローンバンク
を確立することができる。これらのクローンはその後試
験して最高収率のものを選択できる。本発明のたん白質
をコードする配列の発現および翻訳も未形質転換形の生
物体に ^"相同性^" あるものと見なし得る他の調節系の制
御下で行うことができる。即ち、例えば、ラクトース依
存性E.coliからの染色体DNA はラクトースまたは酵素ベ
ーターガラクトーシダーゼを分解することによってラク
トースの分解を起すlac −オペロンを含む。lac −制御
要素はE.coliに感染性であるバクテリオファージラムダ
ーplac５から得ることができる。このファージのlac −
オペロンは同じバクテリア種より形質導入によって得る
ことができる。本発明方法に使用できる調節系はその生
物体にとって未変性のプラスミドDNAから生じ得る。lac
−プロモーター−オペレーター系はIPTGによって誘起
し得る。

【００３８】他のプロモーター−オペレーター系または
その一部は同等の良好な効果でもって使用できる：例え
ば、アラビノースオペレーター、コリシンE₁−オペレー
ター、ガラクトーゼオペレーター、アルカリ性ホスホタ
ーゼオペレーター、trp オペレーター、キリロース−Ａ
オペレーター、tac −プロモーター等である。原核生物
以外にも、酵母培養物のような真核微生物も使用でき
る。サッカロミセス セレビシェ（Saccharomyces cere
visiae) は最も普通に使用される真核微生物である。た
だし、多くの他の種も一般に取得可能であるサッカロミ
セスにおける発現においては、例えば、プラスミドYRp7
〔Stinchcomb等、Nature２８２、３９（１９７９）；Ts
chumper 等、Gene１０、１５７（１９８０）〕およびプ
ラスミドYEp １３〔Bwach 等、Gene８、１２１−１３
３、（１９７９）〕を普通に使用できる。プラスミドYR
p7はトリプトファン不含培地中では増殖できない酵母ミ
ュータント中の選択性マーカーであるTRP1遺伝子を含
み、例えば、ATCC No.44076 である。

【００３９】酵母宿主ゲノムの特徴としてのTRP1欠損の
存在は形質転換を検出する有効な促進物を構成し、培養
をトリプトファンなしで実施する。極めて同様なことが
プラスミドYEp13 にもあてはまり、該プラスミドはLEU
−２−マイナスミュータントを相補するのに使用できる
酵母遺伝子LEU ２を含む。酵母ベクター用の適当なプロ
モーター配列はADHIの5 ′−フランキング領域〔Ammere
r G.、Methods of Enzymology １０１、１９２−２０１
（１９８３）〕、３−ホスホグリセレート−キナーゼ
〔Hitzeman等、J.Biol.Chem.２５５、２０７３（１９８
０）〕、またはエノローゼ、グリセルアルデハイド−３
−ホフフェートデヒドロギナーゼ、ヘクソキナーゼ、ピ
ルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ、グルコース−６−ホスフェート イソメラーゼ、ホ
スホグルコース イソメラーゼおよびグルコナナーゼの
ような他のグリコシル化酵素〔KawasakiおよびFraenke
l、BBRC１０８、１１０７−１１１２（１９８２）〕を
含有する。適当な発現プラスミドを構築することによっ
て、これら遺伝子に会合した末端配列も発現すべき配列
の３′末端で発現ベクターに挿入してmRNAのポリアデニ
ル化および終止を確実にすることができる。

【００４０】増殖条件によって制御された転写の利点を
も有する他のプロモーターはアルコールデヒドロゲナー
ゼ−２、イソシトクロムＣ、酸ホスホターゼ、チッ素代
謝に結合する分解酵素、上述のグリセルアルデヒド−３
−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびアルトースと
ガラクトースのプロセッシングに応答し得る酵素に対し
ての遺伝子のプロモーター領域である。酵母交配タイプ
の座によって調節されるプロモーター、例えば、遺伝子
BAR1、MFα1 、STE2、STE3およびSTE5のプロモーターは
温度依存性sir 変位体の使用により温度調節系において
使用できる〔Rhine 、Ph.D.Thesis 、University of Or
egon、Eugene、Oregon(1979)；HerskowitzおよびOshim
a、The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyc
es 、PartＩ、１８１−２０９（１９８１）、Cold Spri
ng Harbour Laboratory) 〕。これらの変位体は静止交
配タイプの酵素カセットに影響を与えかくして交配タイ
プ依存性プロモーターに間接的に影響を与える。しかし
ながら、一般的には、酵母親和性プロモーター、複製の
オリジンおよび終止配列を含む任意のプラスミドベクタ
ーは適している。

【００４１】微生物以外には、多細胞生物の培養物も適
切な宿主生物体である。理論的には、脊椎動物または非
脊椎動物培養物のいずれから取得したこれらの培養物も
使用できる。しかしながら、最大の興味は、培養（組織
培養）での脊椎動物細胞の操作が近年、普通の方法とな
っている結果からして、脊椎動物細胞にある〔TissueCu
lture、Academic Press版、編者Kruse およびPatterson
、（１９７３）〕。この種の有用な宿主細胞系の例に
はVEROおよびHeLa細胞、CHO 細胞、およびWI38、BHK 、
COS-7 およびMDCK細胞系がある。これら細胞用の発現系
は、一般に（必要に応じて）、複製サイト、任意の必要
なリボソーム結合サイトと一緒の発現すべき遺伝子の前
にあるプロモーター、RNA スプライシイングサイト、ポ
リアデニル化サイトおよび転写終止配列を含む。

【００４２】動物細胞で使用する場合、発現ベクターの
調節機能は多くの場合ウィルス物質より得られる。例え
ば、通常使用するプロモーターはポリオマアデノウィル
ス２に由来し特にしばしばシミアンウィルス４０（ＳＶ
４０）に由来する。ＳＶ４０の初期および後期プロモー
ターは共に、ウィルスから、ＳＶ４０のウィルス複製サ
イトを含むフラグメントとして容易に取得できるので特
に有用である〔Fiers等、Nature２７３、１１３（１９
８７）〕。また、ＳＶ４０のより大きいまたはより小さ
いフラグメントも、これらがウィルス複製サイト中でHi
ndlll 切断サイトからBgll切断サイトまで延びる約２５
０bp長の配列を含む場合には、使用することができる。
さらにまた、所望の遺伝子配列に通常結合しているプロ
モーターまたは制御配列もこれら配列が宿主細胞系と親
和性がある場合には使用することができ、またその使用
が多くの場合望ましい。

【００４３】複製出発点は外来遺伝子サイトを例えばＳ
Ｖ４０または他のウィルス源（例えば、ポリオマ、アデ
ノ、ＶＳＶ、ＰＢＶ等）から挿入するために相応するベ
クター構築によって与えることができるかあるいは宿主
細胞の染色体複製機構によって与えることができる。ベ
クターを宿主細胞染色体に一体化するならば、後者の度
合は通常十分である。好ましいのは、本発明のDNA 配列
も発現プラスミドpER103〔E.Rast1-Dworkin等、Gene２
１、２３７−２４８（１９８３）および１９８３年１２
月２０日にNo.DSM2773としてDSM に寄託されたEP-A-011
5613〕、プラスミドparpER33(EP-A-0115613)またはプラ
スミドpRH100中で発現させることである。何故ならば、
これらのベクターはすべてクローン化遺伝子に高発現率
を与える調節要素を含むからである。本発明によれば、
Serretiamarcescen s からの調節可能なトリフトファン
プロモーターと人工リボソーム結合サイトを含むプラス
ミドpRH100を合成EqIFN-γ遺伝子の発現ベクターとして
使用する。発現プラスミドpRH100を調製するには、プラ
スミドpER103(Eva Dworkir-Rastl等、Gene２１（１９８
３）２３７−２４８、EP-A-0115613) を制限エンドヌク
レアーゼHind IIIで線状化し、５′末端ホスフェート残
基を除去した。

【００４４】このプラスミドDNA をリン酸化オリゴヌク
レオチドｄ（AGCTTAAAGATGAGCT) およびｄ（CATCTTTA)
と混合し結合させた。リガーゼ反応は制限エンドヌクレ
アーゼSacIで消化しＴ⁴ −PNK の添加によって結合させ
た。オリゴヌクレオチドはEP-A-0115613に記載された方
法と同じくして調製した。適格E.coli HB101をこのリガ
ーゼ反応と混合しインキュベートした。得られたバクテ
リアコロニーのうち、１２ケをランダムに選択し、それ
からプラスミドを顕微鏡スケール上で単離した〔Birnlo
inおよびDoly、Nucl.Acids Res. ７（１９７９）１５１
３−１５２３〕。得られたDNA を制限エンドヌクレアー
ゼSacIで切断し、DNA をアガロースゲル（１％、１xTBE
バッファー）上で分離した。約4,400bp の大きさの線状
分子としてのDNA の移動がSacI認識サイトのプラスミド
への挿入を確認した。これらプラスミドの１つをランダ
ムに選択した。E.coli HB101を再び会合ミニ調製物から
のDNA で形質転換させた。得られた形質転換バクテリア
のうち、１つのコロニーを選択し大スケールで培養し
た。それから単離したプラスミドを制限エンドヌクレア
ーゼEcoRI およびBamHI で切断し、DNA を１％アガロー
スゲル上で分離し、小さ目のフラグメントをゲルから電
気溶出により単離した。このE.coRI−BamHI DNA フラグ
メント（約４６０bp長) をSanger(F.Sanger 等、Proc.N
atl.Acad.Sci.(１９７７）５４６３−５４６７）従って
シーケンシングした。かくして分析したプラスミドをpR
H100と表示した。

【００４５】プラスミドをSacIで全体的に切断し、過つ
り下り（overhanging)DNA 末端を４種のデオキシヌクレ
オチドトリホスフェートすべての存在下にケレノウ（Kl
enow) フラグメントによる処理によって線状化した。反
応はフェノール／クロロホルムによる抽出によって停止
させ、DNA をエタノール沈澱によって濃縮する。この処
理はトリプトファンプロモーターを加えかつほん訳出発
コドン ^"ATG ^" で終端する平滑DNA 末端をもたらす。線
状化プラスミドDNA を再びBamHI で切断しベクター画分
を単離する。

【００４６】かくして調製したpRH100プラスミドベクタ
ーを結合（連鎖反応）オリゴヌクレオチドEG−１〜EG−
８およびEG−９〜EG−１４と混合し連鎖反応バッファー
中でT⁴DNA リガーゼでインキュベートする。適格化され
ているE.coli、好ましくはJM101 を上記連鎖反応混合物
で形質転換し一夜インキュベートする。得られた形質転
換物から、プラスミドDNA をミニ調製法によって単離
し、構造を制限分析およびHindIII-BamHI 挿入物をシー
ケンシングすることによって決定する。成熟EqIFN-γを
発現するための所望の構造を有するプラスミドはpEqG-Y
YCl と表示する。全体的に同様な方法で、オリゴヌクレ
オチドEG−１５、１６、EG−３〜EG−８およびEG−９〜
EG−１４をpRH100中にクローン化して３個のアミノ酸で
短縮されたEqIFN-γを得る。所望構造のプラスミドをpE
qG-QAA1 と表示する。

【００４７】細胞のベヒクルによる形質転換は多くの方
法によって行うことができる。例えば、カルシウムを用
い、細胞をマグネシウム中で洗浄しDNA をカルシウム中
に懸濁させた細胞に加えるかあるいは細胞をDNA とリン
酸カルシウムの共沈物に供することによって行うことが
できる。引き続く遺伝子発現中は、細胞を形質転換細胞
用に選択した培地に移す。プラスミドpEqG-YYCl または
pEqG-QAA1 を含むE.coli JM101によるインターフェロン
活性の発現を検出するためには、適当な培地でのインキ
ュベーション後、バクテリアを破壊し、滅菌濾過した上
清を、VSV またはEMCVの細胞変性効果（CPE)を測定する
アッセイにおいてインターフェロン活性について試験す
る。水泡性口内炎ウィルス(VSV) で感染させたNBL-6 細
胞(ATCC CCL 57、ウマ表皮細胞) および／または脳心筋
炎ウィルス（EMCV) で感染させたＡ５４９（ATCC CCL１
８５、ヒト肺ガン細胞系）をこの目的に用いる。

【００４８】発現したウマインターフェロンはマキシ細
胞中でたん白質を標識することによって検出する。プラ
スミドコードたん白質はマキシ細胞技術を用いてインビ
ボで選択的に標識できる〔Sancar、A.等、J.Bacteriol.
１３７、６９２−６９３（１９７９）〕。E.coli菌株CS
R603(CGSC 5830) はＵＶ照射によりDNA に生じた劣下の
回復用の機構を有していない。適当な照射量のＵＶ線照
射は微生物染色体を破壊するが、細胞当り幾つかのコピ
ー中に存在する実質的に小さいプラスミドDNAの幾つか
は官能性のまま残存する。劣下してない複製性細胞すべ
てが抗菌性Ｄ−シクロセリンで殺菌されまた外来mRNAを
使用してしまったのち、プラスミド上に依然としてコー
ドされている遺伝子のみが複製され残存細胞中でほん訳
される。形成されたたん白質は放射活性的に標識され³⁵
Ｓ−メチオニンの導入によって検出される。E.coli CSR
603 は発現プラスミドによって通常の方法によって形質
転換され、形質転換バクテリア用のアンピシリン含有寒
天皿上に選択される。マキシ細胞の調製およびたん白質
の標識化はA.Sancarにより開示された方法を用いて行
う。¹⁴Ｃ−メチル化たん白質混合物（アメシャム社）を
分子量標準物として用いる。使用するコントロールは何
らのインターフェロン遺伝子を有さないプロモーターの
みを含むプラスミドpER103およびヒトIFN-α２arg 遺伝
子の２つのコピーを含むプラスミドpER 21／１である。

【００４９】本発明による産生物はインターフェロン用
の公知の生物学的および免疫学的アッセイによって都合
良く特徴付できる。IFN-α、−βおよび−γはすべてPF
U およびCPE アッセイにおいて検出できる抗ウィルス特
性を有するので、インターフェロンの抗原性の差異を本
発明のEqIFN-γをEqIFN-αおよび／または−βと区別す
るのに使用できる。本発明によるポリペプチドはEqIFN-
αおよび／またはEqIFN-βに対する抗血清によっては中
和されない。さらに明確な規準は本発明のポリペプチド
の酸不安定性およびそのドデシル硫酸ナトリウム（SDS)
に対する感応性である。0.２％SDS溶液によるインキュ
ベーションおよび４℃、数時間のpH２でのポリペプチド
のインキュベーションは共に抗ウィルス活性の殆んど完
全な損失をもたらす。EqIFNおよびEqIFN-βは同じ条件
下で安定である。

【００５０】インターフェロン遺伝子との高相同性を有
するウマゲノム中の配列総数を検出するには、高分子量
ウマDNA を全体的に相応する制限酵素で消化し、この切
断DNA を大きさに従って分割する。ニトロセルロースフ
ィルター上へのサウサーン転写し、DNA を変性し固定し
たのち、各フィルターをニックほん訳プローブでハイブ
リッド化する。EqIFN-γ用に用いるプローブは全成熟イ
ンターフェロン用のコード配列を含むプラスミドpEqG-Y
YCl のフラグメントである。次いで、各フィルターを緊
縮条件下で洗浄する。オートラジオグラフィーをダュポ
ンコロネックスＸ線フィルム上でコダックラネックス−
レギュラーインテンシファィアフィルムを用いて−８０
℃で７時間で実施する。

【００５１】本発明のたん白質が発現する条件下での宿
主の形質転換、遺伝子の発現および発酵即ち細胞培養を
行ったのち、産生物は、通常、公知のクロマトグラフィ
分離法によって抽出してリーダーおよび末尾配列を含む
または含まないたん白質を含有する物質を得ることがで
きる。本発明によるインターフェロンはＮ末端でリーダ
ー配列（プレーIFN)を含んで発現できるが、この配列は
ある宿主細胞によって除去できる。そうでない場合、リ
ーダーポリペプチド（存在する場合）は成熟IFN を得る
ためには断裂しなければならない。一方、IFN クローン
は成熟たん白質がプレーIFN の代りに微生物中に直接産
生するように修飾することもできる。この場合、酵母接
合フェロモンMF−アルファー１のプレカーサー配列を用
いて融合たん白質の正確な ^"変異^" および増殖培地また
は細胞周辺腔への産生物の分泌を確実にすることができ
る。官能性または成熟IFN のDNA 配列はMF−アルファー
１に開始コドンATG から出発する位置２５６での仮想カ
テプシン様切断サイト（Lys-Arg の後) で結合され得る
（Kurjan、Herskowitz、Cell３０、９３３−９４３（１
９８２）〕。

【００５２】EqIFN-γを例えばバクテリアから精製でき
る方法は次の一般的やり方で説明する。 1. 高圧下でホモジナイザーを通すことによる高伝導度
の溶解バッファー（約pH８）中での細胞の抽出；放出流
を氷浴中で冷却する。 2. 撹拌しながら、例えば４℃でポリエチレンイミンを
加えることによるDNA の沈澱。 3. 微生物たん白質のpH沈澱、EqIFN-γは液中に再び残
存する。 4. ４℃での遠心処理による固形分の除去。 5. 例えば限外濾過による上清（pH再調整後の）の濃
縮。 6. 低伝導度のバッファーに対する濃縮物の透析。 7. 遠心処理による固形分の除去、EqIFN-γは液中に残
存。 ８．カルボキシメチルセルロース上でのイオン交換クロ
マトグラフィー、増加中のイオン強度勾配による溶出。

【００５３】９．リン酸カルシウムゲルでのクロマトグ
ラフィーおよび増加中のイオン強度勾配での溶出。 10. わずかに変性条件でのカルボキシメチルセルロース
でのイオン交換クロマトグラフィーおよび増加中のイオ
ン強度勾配での溶出。 11. ゲル濾過クロマトグラフィーによる分離。 上記の方法は９５％以上の純度を有する物質の収率を与
える。

【００５４】ところで、本発明のインターフェロンはこ
れまで詳細したインターフェロンばかりでなく実質的に
ウマγ−IFN 活性を変えないこれらペプチドの任意の修
飾物も包含するということを強調しなければならない。
これらの修飾には、例えば、分子の例えばＮまたはＣ未
満での短縮、アミノ酸の他の基による置換、分子の不活
性または活性である他の分子への化学的または生物学的
結合がある。後者の修飾には、例えば、本発明の１種以
上のインターフェロンおよび／または公知のα−または
β−インターフェロンからのハイブリッド分子がある。
その生物学的活性スペクトルにより、本発明の新規なイ
ンターフェロンは公知のインターフェロンも使用されて
いる任意のタンプの処理用に使用することができる。そ
れには、例えば、ヘルペス、ライノウィルス、ウム発育
不全ウィルス、各種タイプのガン等がある。この新規な
インターフェロンは単独であるいは他の公知のインター
フェロンまたは生物学的活性物質例えばIFN −α、ＩＬ
−２、他の免疫調節剤等と組合せて使用することができ
る。

【００５５】本発明のインターフェロンは抗腫瘍または
抗ウィルス処理を必要とする場合および免疫調節特性が
明らかな場合には非経口ルートにより投与できる。投与
量および投与速度は臨床的にIFN 物質で通常用いられて
いるものと同様であり、例えば、約（１〜１０）×１０
⁶ 単位／日および、１％以上の純度を有する製剤の場合
には５×１０⁷ 単位／日であり得る。

【００５６】本発明の実質的に均質な微生物産生IFN の
有利な投与形の例としては、非経口用途では、３mgのEq
IFN-γを２５mlの５％動物血清アルブミン好ましくはウ
マ／イヌ血清アルブミンに溶解させる。この溶液を、そ
の後、生物学的フィルターに通し、濾過した溶液を無菌
的に１００バイアルに小分けする。各バイアルは非経口
投与に適する６×１０⁶ 単位の純粋IFN を含んでいる。
使用前は、各バイアルは好ましくは冷（−２０℃）で保
存する。本発明の物質は公知の方法で配合して薬学用途
に適する組成物を得ることができ、また本発明のポリペ
プチドは薬学上許容されるキャリヤー物質と混合され得
る。適当なキャリヤー物質およびその調合物はE.W.Mart
inによる " Remington's Pharmacoutical Sciences "に
記載されている。本発明のインターフェロンは適当な量
のキャリヤーと混合して受け入れ者（患者）に対する有
効な投与に適する製薬組成物を調製する。非経口投与が
好ましい。

【００５７】本発明はさらに本発明のポリペプチドに対
するモノクローナル抗体、そのような抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞およびそれらの調製方法にも関する。
ハイブリドーマ細胞系およびそれによって産生されEqIF
N −ガンマーと特異的に反応するモノクローナル抗体は
好ましいものである。そのようなモノクローナル抗体を
調製する方法は小動物例えばウサギまたはマウスを本発
明のポリペプチドで免疫し、これら免疫した動物のＢ−
リンパ球をミエローマ細胞と融合し、形成してハイブリ
ドーマ細胞をクローン化し、次いでインビトロまたはマ
ウスに注入することによって培養し、抗体を培養物から
単離することに特徴を有する。

【００５８】本発明はさらにイムノ−アフィニティクロ
マトグラフィカラムおよびこれら抗体を含むイムノアッ
セイ用試験キットにも関する。本発明の方法を使用する
ことにより、マウス例えばBalb/cマウスをそれ自体公知
の方法により免疫する。好ましい実施態様においては、
本発明のポリペプチドを多少弱くあるいは例えば５〜１
２週の数週間の長目の間隔で十分な数の抗体産生性Ｂ−
リンパ球が形成されるまで注射する。

【００５９】免疫したマウスからのＢ−リンパ球例えば
ひ臓細胞を含む臓器を採取し、変異の結果として選択性
培地では増殖しないミエローマ細胞と融合させる。これ
らミエローマ細胞は公知であり、例えばＸ６３−Ag８、
Ｘ６３−Ag８．６．５．３、Mpc −１１、NS1 −Ag4/1
、MOPC−２１ NS/1 またはSP2/０として表示されるも
のであり得る。好ましい実施態様においては：免疫した
マウスからのひ臓細胞は細胞系Ｘ６３−Ag８．６．５．
３のミエローマ細胞と融合する。融合はそれ自体公知の
方法によりＢ−リンパ球とミエローマ細胞を混合しポリ
エチレングリコール、センダイウィルス、塩化カルシウ
ムまたはリソレシチンのような細胞融合剤を添加するこ
とによって行う。好ましいのは、融合を例えば分子量１
０００〜４０００を有するポリエチレングリコールの存
在下で実施することである。融合後、得られたハイブリ
ッドを、それ自体公知の方法により、ハイポキサンチ
ン、アミノプテリンおよびチミジンを補給した選択性培
地（HAT 培地）中で培養する。融合していないミエロー
マ細胞はこの培地中では増殖できず、正常リンパ球そう
であるように死滅する。

【００６０】ハイブリドーマ培養物からの上清をその特
異性抗体について公知方法、例えば、ラジオイムノアッ
セイまたは凝集法により試験し得る。所望の特異性を有
する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を融合によって
産生した種々のハイブリドーマ細胞混合物をクローニン
グすることによって選択する。これを実施するために
は、培養を単一増殖細胞から“限定稀釈”と称されるそ
れ自体公知の方法を用いて開始する。

【００６１】大量生産には、所望の特異性を有する抗体
を産生するハイブリドーマ細胞クローンをそれ自体公知
の培地でインビトロで培養するかあるいは複製用のマウ
スに注入する。好ましい実施態様においては、ハイブリ
ドーマ細胞をフリスタンで予じめ処理したマウスに注入
し、腹水を採取し、抗体をそれから硫酸アンモニウム液
による沈澱によって単離する。これらハイブリドーマ細
胞を用いて得た特異性抗体はそれ自体公知の方法でイム
ノアフィニティクロマトグラフィーカラムの製造に使用
できる。本発明の好ましい実施態様においては、適当な
担体物質（バッファー液に懸濁させた）を抗体溶液と結
合させ、すべての未結合部分を洗い出し担体物質の未吸
着部分をブロックする。抗体は治療においても使用でき
る。

【００６２】ハイブリドーマ細胞を用いて得た特異性抗
体はそれ自体公知の方法で検査キットを製造するのにも
使用できる。これら検査キットは種々の方法、例えば、
ラジオイムノアッセイ、ラテックス凝集法、スポット試
験、競合またはサンドウィッチラジオイムノアッセイ、
酸素イムノアッセイ、イムノ蛍光またはイムノ化学酵素
試験に基づき得る。

【００６３】本発明は、特に、次のことに関する：ウマ
インターフェロン−γ（EqIFN −ガンマー）の生物学
的、免疫学的特性を有し；動物起源の他のたん白質を実
質的に含まず；未変性グリコシル化のない；Ｎ−末端の
第１アミノ酸の前にアミノ酸メチオニンを含有し；リー
ダーペプチドを含有し；アミノ酸配列：

【００６４】

【化２０】

【００６５】または

【００６６】

【化２１】

【００６７】を含有する；実質的に純粋な形のポリペプ
チド。EqIFN-γの生物学的、免疫学的性質を有するポリ
ペプチドをコードし；上述したポリペプチドをコード
し；成熟EqIFN-γをコードしている；DNA 分子。EqIFN-
γの完全天然遺伝子を含み；次の各ヌクレオチドを含
み；

【００６８】

【化２２】

【００６９】

【化２３】

【００７０】または、

【００７１】

【化２４】

【００７２】

【化２５】

【００７３】または、

【００７４】

【化２６】

【００７５】または、

【００７６】

【化２７】

【００７７】または、

【００７８】

【化２８】

【００７９】または、ATG 、を任意にかつ追加的に含有
しているDNA 分子。上記配列は前述のDNA 分子の１つと
８５％以上好ましくは９０％以上の相同性を示す条件下
でハイブリッドしており、一方これらDNA 分子は天然、
合成または半合成起源を有しまた突然変異、ヌクレオチ
ド置換、ヌクレオチド欠落、ヌクレオチド挿入およびヌ
クレオチドの逆転によるDNA 分子であり得、EqIFN-γの
生物学的、免疫学的活性を有するポリペプチドをコード
している。

【００８０】

【化２９】

【００８１】

【化３０】

【００８２】を含有し、EqIFN-γの部分領域と上記ＤＮ
Ａ分子によってコードされたポリペプチドをコードして
おり；上記のＤＮＡ分子の１つと約８５％以上好ましく
は９０％以上の相同性を示す条件下でハイブリッドして
おり、一方ＤＮＡ分子は天然、合成または半合成起源を
有し得、突然変異、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠
落、ヌクレオチド挿入およびヌクレオチドの逆転による
ＤＮＡ分子に関係し得、さらにEqIFN-γの部分領域およ
びこれらＤＮＡ分子によってコードされたポリペプチド
をコードしているＤＮＡ分子。

【００８３】組換えＤＮＡ分子、例えば、ベクター、好
ましくはプラスミド、これは： −上述のポリペプチドをコードする挿入物を含有してい
る； −組換えＤＮＡ分子、例えばベクター、好ましくはプラ
スミド、これは： −上述のポリペプチドをコードする挿入物を含有してい
る； −上述のＤＮＡ分子； −原核生物例えばE.coli、真核生物例えばサッカロミセ
ス セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae) のような
微生物および動物細胞例えばウマ細胞中で、発現制御配
列と官能的に結合している上記ＤＮＡ分子； −原核生物例えばE.coli、真核生物例えばサッカロミセ
ス セレビシェのような微生物および動物細胞例えば、
ウマ細胞中で他の１つと任意の所望の組合せでかつ発現
制御配列と官能的に結合しているＥＧ−１〜ＥＧ−１６
と表示された少なくとも２つのＤＮＡ分子を含有してい
る。

【００８４】プラスミド pAH１１１、 pRH２８１／５、
pRH２８２／５、 pGN１、 pGN３、pGN２０、pEqG-QAA
２またはpEqG-QQA３のような組換えＤＮＡ分子。上記の
組換えＤＮＡ分子の１つで形質転換された宿主生物、例
えば、原核生物好ましくはE.coli、より好ましくはE.co
li ＪＭ１０１またはＨＢ１０１、真核生物例えばサッ
カロミセス セレビシェまたは動物細胞系好ましくはウ
マ細胞系。 次の各工程を含む本発明のポリペプチドの調製方法： ａ） 適当な宿主生物、例えば、上述したものを、本発
明のポリペプチドをコードする遺伝子情報で、好ましく
は上述の組換ＤＮＡ分子で形質転換すること、 ｂ） 本発明のポリペプチドを産生する情報を上記宿主
生物中で発現させること、および ｃ） 本発明のポリペプチドを単離すること。

【００８５】これら方法によって調製し得るポリペプチ
ド。治療用および／または免疫化用または薬学上の製剤
調製用の本発明のポリペプチドの用途。薬学的に不活性
の担体以外に有効量の本発明のポリペプチドの一つを含
有することを特徴とする、例えばウマの治療剤。

【００８６】宿主動物を本発明のポリペプチドの１つで
免疫し、これら宿主動物のＢ−リンパ球をミエローマ細
胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ッド細胞系をサブクローニングしインビトロまたはイン
ビボにて培養することを特徴とする本発明のポリペプチ
ドに対するモノクローナル抗体の調製方法。本発明のポ
リペプチドの１つに対するモノクローナル抗体を産生す
るハイブリッド細胞系。

【００８７】本発明のポリペプチドの活性を全体的また
は部分的に特異的に中和するか、本発明のポリペプチド
の１つに特異的に結合するモノクローナル抗体。治療用
および／または本発明のポリペプチドの１つの定性およ
び／または定量測定用の上記モノクローナル抗体の用
途。本発明のポリペプチドの１つの精製用の上記モノク
ローナル抗体の用途。上記モノクローナル抗体を含有す
る本発明のポリペプチド測定用検査キット。

【００８８】実施例 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定さるべきではない。材料 出発物質はある場合には商業的に入手し、その他の場合
は、ハイデルベルグのＥＭＢＬから入手した。E.coli
ＪＭ１０１、ＰＵＣ９およびＭ１３mp８はBethesda Res
earch Laboratories社から入手し、サープレッサーファ
クターsupFを有するE.coli菌株、例えばＮＭ５２６、５
３８および５３９、およびベクターラムダＥＭＢＬ３ま
たは３ＡはＥＭＢＬから入手したが、これらはStehelin
/Basle社（スイス）からも入手可能である。

【００８９】１．ウマＤＮＡの単離 凍結組織、例えば、ウマ肝臓を液体窒素中で粉砕して粉
末とし、0.５Ｍ ＥＤＴＡ、１０mMトリス−HClpH 8.
０、0.５％ＳＤＳおよび0.１mg／ｌのプロティンナーゼ
Ｋ（２０ml／組織ｇ）中で５５℃、３時間インキュベー
トした。得られた粘稠溶液をたん白質からフェノール抽
出およびフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ
ール（２５／２４／１容量比）による３回抽出により分
離し、５０mMトリス−HClpH 8.０、１０mM ＥＤＴＡお
よび１０mM NaCl に対して透析し、ＤＮＡを２容量のエ
タノールで沈澱させた。真空中で完全に乾燥させたの
ち、ＤＮＡをＴＥバッファー（１０mMトリス−HClpH 8.
０、１mM ＥＤＴＡ）中溶液に４℃で加え、溶液ml当り
1.２７３ｇのCsClで６２時間、４0,０００rpm 、２０℃
で遠心処理した（ソルバール５０Tiローター）。CsCl勾
配を落とし、ＤＮＡを含むフラクションをＴＥバッファ
ーに対して透析し、ＤＮＡを２容量のエタノールで沈降
させ、７０％エタノールで洗浄し、ＴＥバッファー（４
℃）に再溶解させた。

【００９０】最終ＤＮＡ調製物をＲＮＡおよび５０kb以
上のもの（0.４５％アガロースゲルで電気泳動で測定し
たとき）から分離した。 ２．部分エンドヌクレアーゼ消化およびウマＤＮＡのサ
イズ（大きさ）分画 ２回、５０mcg のウマＤＮＡを1.６単位の Sau３Ａと４
５０mcl の反応培地（１０mMトリス−HClpH 7.５、１０
mM MgCl₂、１mMジチオスレイトール）中でインキュベー
トした。１５分、２５分および４０分後、１５０mcl ア
リコートを採取し、１５mM ＥＤＴＡと混合した。７０
℃に加熱１０分後に、反応を停止した。0.３Ｍ酢酸ナト
リウム、pH６を添加したのち、ＤＮＡを2.５容量のエタ
ノールで沈降させた。ＴＥバッファーに再溶解後、ＤＮ
ＡをＴＢＥバッファー（１0.８ｇ／ｌトリス、5.５ｇ／
ｌほう酸、0.９３ｇ／ｌ Na₂ ＥＤＴＡ）中の0.４５％
アガロースゲル上で約１Ｖ／cmで大きさに従って一夜電
気泳動により分離した。サイズマーカー（EcoRI とHind
III で消化およびHindIII で消化の２回消化させたラム
ダーＤＮＡ）を用いて、ＤＮＡ１０−２３kb長を有する
ゲルフラグメントを切り出し、ＤＮＡをゲルから透析チ
ューブ中で３時間３００Ｖで電気溶出させ（バッファー
0.１×ＴＢＥ）、エルチップ−Ｄカラム（Schleicher a
nd Scull社)上で製造者使用説明書に従って精製し、次
いでエタノールで沈降させた。

【００９１】ウマＤＮＡフラグメントの自己連結反応
（これはウマＤＮＡ配列の人工的ハイブリッドを与え、
またラムダファージ中にパッケージされ得ない過度に大
きいＤＮＡフラグメントを与える）を防止するために、
サイズ分画したウマＤＮＡフラグメントを脱リン酸化し
た。これを行うには、ＤＮＡを１４０mcl の反応培地
（５０mMトリス−HClpH 9.５、１０mM MgCl₂、0.１mM酢
酸亜鉛、１mMスペルミジン）中で５単位のウシ腸ホスホ
ターゼと３０分間、３７℃でインキュベートし、さらに
５単位の酵素を加え、得られた混合物を３０分間インキ
ュベートした。ＥＤＴＡを加え最終濃度２５mMを得たの
ち、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコール（２５／２４／１容量比）で１回、クロロホル
ム／イソアミルアルコール（２４／１容量比）で２回お
よびジエチルエーテルで３回抽出し、エタノールで沈降
させ、乾燥し、0.１xTE バッファーに再溶解させた。

【００９２】３．ウマゲノムＤＮＡライブラリーの構築 脱リン酸化１０−２３kbウマＤＮＡフラグメントをラム
ダベクター、例えば、ラムダーＥＭＢＬ３または３Ａ
〔Frischauf 、A.M.等、J.Mol.Biol. 、１７０、８２７
−８４２（１９８３）〕中で、ファージＤＮＡの内部Ba
mHI フラグメントを除去することによって得たＧ−Ａ−
Ｔ−Ｃ付着末端でクローニングした。ベクターをサープ
レッサーファクターsup F を有するE.coli菌株例えばE.
coliＮＭ５２６、５３８または５３９〔Frischauf 、A.
M.等、J.Mol.Biol. 、１７０、８２７−８４２（１９８
３）〕中で、ＬＢ培地（Miller；Experiments in Molec
ular Genetics ; Cold Spring Harbor Lab. 、ニューヨ
ーク州、ゴールドスプリングハーバー〕中で５mM MgSO₄
で増殖させ、ポリエチレングリコールで沈降させ、CsCl
密度勾配（0.７／ｇCsCl／ml溶液、４5,０００rpm 、２
０℃で４０時間）で２回遠心することによって精製し
た。ＴＥバッファーに対する透析の後、ファージＤＮＡ
をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（２５／２４／１容量比）による２回抽出およびクロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２４／１容量比）によ
る２回抽出によってたん白質より分離し、エタノール沈
澱により濃縮した。ＥＭＢ３Ａの末端フラグメントを得
るためには、５０mcg のファージＤＮＡを４５０mcl の
反応培地（１０mMトリス−HClpH 7.５、１０mM MgCl₂、
１mMジチオスレイトール）中で２時間、３７℃でBamHI
で全体的に消化し、反応を１５mMＥＤＴＡにより７０℃
で１０分間で停止し、ＤＮＡをエタノールで沈降させ
た。

【００９３】再連反応を防止するため、中央のフラグメ
ントをEcoRI で再切断し、減衰したオリゴヌクレオチド
をイソプロパノール沈降により除去した。BamHI 消化ラ
ムダＤＮＡを４５０mcl の１０mMトリス−HClpH 7.５、
１００mMNaClおよび１０mM MgCl₂中で２時間、３７℃で
EcoRI により全体的に消化し、反応を１５mM ＥＤＴＡ
を加え１０分間、７０℃に加熱して停止した。酢酸ナト
リウムを加えて最終濃度0.３Ｍを得たのち、３つの大Ｄ
ＮＡフラグメントを0.６容量のイソプロパノールで１５
分間、０℃で沈降させ、0.４５Ｍ酢酸ナトリウム／0.６
容量イソプロパノールで２回、0.３Ｍ酢酸ナトリウム／
2.５容量エタノールで１回洗浄し、１５mcl の0.１xTE
バッファーに溶解させた。BamHI/EcoRI インカーはこの
手順中は溶液に残存する。ＥＭＢＬ３Ａフラグメント
（８mcg)を約５mcg の１０−２３kbウマＤＮＡと１０単
位のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＮ）と結合させ、５０
mcl の連結反応培地（６６mMトリス−HClpH 7.２、0.１
Ｍ NaCl、１０mM MgCl₂ 、１mM ＥＤＴＡ、５mMジチ
オスレイトール、0.５mM ＡＴＰ）中で一夜１４℃でさ
らに１日４℃でインキュベートした。結合ＤＮＡ混合物
を成熟ラムダファージ粒子中にインビトロラムダパッケ
ージィング系を用いてパックした〔Scalenghe 、F.等、
Chromosama、８２、２０５−２１６（１９８１）〕。

【００９４】上記系の諸成分、即ち、超音波抽出物（Ｓ
Ｅ）、凍結−解凍溶解液（ＦＴＬ）、バッファーＭ１お
よびＡは〔Scalenghe 、F.等、Chromosoma、８２、２０
５−２１６（１９８１）〕に従って調製した。結合ＤＮ
Ａ混合物の１０mcl アリコートを２５mcl のＳＥ（ＦＴ
Ｌ同様、３０分間氷から解凍されている）で２分間、周
囲温度でインキュベートし、１００mcl のＦＴＬを混合
し、周囲温度で６０分間再インキュベートした。パッキ
ング混合物を１５０mcl のラムダ希釈剤（１００mMトリ
ス−HClpH 7.５、１０mM MgSO₄、１mM ＥＤＴＡ）で希
釈し４℃で保存した。

【００９５】４．ウマガンマー−インターフェロン（Eq
IFN-γ）の遺伝子のクローニングおよびシーケンシング Ａ．完全EqIFN-γ遺伝子クローンの単離 ウマＤＮＡライブラリーを用いてE.coli菌株ＮＭ５２８
（supF) を感染させた。ＬＢ栄養溶液（１０ｇ／ｌトリ
プトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌNaCl、pH7.
４）中で0.２％マルトースで一夜増殖させた微生物培養
物を１０mM MgSO₄中で光学密度（６００nm）2.０に調整
した。この懸濁液の0.５mlバッチをＤＮＡライブラリー
からのラムダファージ５0,０００pfu(プラーグ形成単
位）で感染させ、軟質ＬＢ寒天層を用いて１０mM MgSO₄
を含むＬＢ寒天プレート（１3.５cm径）上に分布させ
た。すべてにおいて、1.５×１０⁶ 組換えラムダファー
ジをスクリーニングした。３７℃で一夜インキュベート
したのち、２つのレプリカを各プレート上のファージか
らニトロセルロース上に調製した（BentonおよびDavis
、Science １９６：１８０−１８２、１９７７）。

【００９６】ファージＤＮＡの変性し（0.５Ｎ NaOH、
1.５Ｍ NaCl中で１分）、中和し（0.５Ｍトリス−HClp
H 7.５、1.５Ｍ NaCl中で３分２日）、洗浄し（２×Ｓ
ＳＣ、１×ＳＳＣ、0.１５Ｍ NaCl、１５mMクエン酸ナ
トリウム中で１分）したのち、各フィルターを空乾し、
ＤＮＡを２時間８０℃でベーキングすることによって固
定させた。各フィルターを1.５Ｍ NaCl、１０mMトリス
−HCl 、pH8.０、0.１％ＳＤＳの溶液中で一夜６５℃で
洗浄し、６５℃で４〜６時間プレハイブリッド化した
（ハイブリッド化用溶液：0.９Ｍ NaCl、５０mM NaH₂P
O₄、pH7.４、５mMＥＤＴＡ、0.１％フィコール、0.１％
ポリビニルピロリドン、0.１％ウシ血清アルブミン、0.
１％ＳＤＳ、２０mg／mlの音波処理し変性したサーモン
精子ＤＮＡ）。ハイブリダイセーションは通常の方法で
放射標識し６５℃で２０時間保持したHuIFN-γプローブ
をフィルター当り１０⁶cpmで含む溶液中で行った。各フ
ィルターを３×ＳＳＣ、0.１％ＳＤＳ中で、６５℃にて
非緊縮条件下で洗浄し、乾燥し、オートラジオグラフィ
ーを行った。３回のプラーグ精製処理の後、５ケのラム
ダクローンを同定して陽性のハイブリダイセーションシ
グナルを得た。

【００９７】これらの単離した組換えファージから、Ｄ
ＮＡを通常の方法で精製した（Maniatis等、前出) 。フ
ァージＤＮＡは各種の制限酵素による消化およびその後
のHuIFN-γプローブによるハイブリダイセーション後の
サウサーン分析によって特徴付した（Southern、J.Mol.
Biol. ９８：５０３−５１７、１９７５）、クローンラ
ムダEq−γ２の単一ハイブリッド4.６kb長BamHI フラグ
メントを単離しプラスミド pUC９のBamHI 切断サイトに
クローニングした（VieiraおよびMessing 、Gene１９：
２５９−２６８、１９８２）。E.coli ＪＭ１０１のほ
ん訳後、プラスミドＤＮＡをミニ調製法により得たコロ
ニーから調製し（BirnboimおよびDoly、Nucl.Acids Re
s. ７：１５１３−１５２３、１９７９）、制限酵素に
よる消化により特徴付した。所望のBamHI 挿入物を有す
るプラスミドを pAH１１１と表示した。プラスミド pAH
１１１のBamHI 挿入物の末端はＭ１３mp８とＭ１３mp９
ベクター（VieiraおよびMessing 、Gene１９、２５９−
２６８、１９８２）への導入後ジデオキシ法によってシ
ーケンシングした（Sanger等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
７４：５４６３−５４６７、１９７７）。ヒトガンマー
インターフェロン遺伝子（GrayおよびGoeddel 、Nature
２９８：８５９−８６３、１９８２）との比較はコード
してない５′および３′領域により高度の相同性を示し
た。このことから完全EqIFN-γ遺伝子は単離れていると
結論した。

【００９８】Ｂ．クローンラムダEq−γ₂ からのウマガ
ンマーインターフェロン遺伝子のシーケンシング プラスミド pAH１１１の4.６kb長BamHI 挿入物をジデオ
キシ法を用いて完全にシーケンシングした。BamHI の全
配列フラグメントは、制限フラグメント（EcoRI 、Hind
III 、PstI、PstI-BglII、HindIII-BamHI)の直接クロー
ニングにより得たＭ１３サブクローンの部分配列を相応
して切断したＭ１３mp８またはＭ１３mp９ベクター中に
結合することによって決定した。他の部分配列は2.０bb
長のBamHI-BglII フラグメントまたは2.０kb長のPstIフ
ラグメントを“ショットガン”法によりＭ１３mp８ベク
ター中にクローニングすることによって得た。２つのＤ
ＮＡフラグメントは超音波により小片に分割し、ＤＮＡ
末端を４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェートの
各々の0.１mMの存在下にE.coliＤＮＡポリメラーゼＩ
（Klenowフラグメント）でインキュベーションすること
によって平滑化した（反応バッファー：５０mMトリス−
HClpH 7.５、１０mM MgCl₂、１mMジチオスレイオール、
0.５mg／mlウシ血清アルブミン；２５℃、１時間）。ア
ガロースゲル中でのサイズ分画後、約0.４〜1.０kb長を
有するＤＮＡフラグメントを単離し、Ｍ１３mp８ベクタ
ーのSmaI切断サイトに結合させた。得られた部分配列を
コンピュータープログラムにより結合させて図１〜図３
に示す全配列４６６４bp長を得た。

【００９９】開放読みフレームのコンピューター分析お
よび他の種のガンマー−インターフェロンとの比較（Gr
ayおよびGoeddel 、Nature２９８：８５９−８６３；Gr
ayおよびGoeddel 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA８０：５８
４２−５８４６、１９８３；Dijkema 等、ＥＭＢＯ J.
４：７６１−７６７、１９８５；Cerretti等、J.Immuno
logy１３６：４５６１−４５６４、１９８６）により、
ウマインターフェロン遺伝子のたん白質コード領域を決
定した。たん白質コード領域は３つのイントロンによっ
て遮断されており、第１エクソンは成熟EqIFN-γポリペ
プチドの２０アミノ酸長と１８アミノ酸である疎水性シ
グナルペプチドをコードしている（塩基３６６−４７
９）。

【０１００】第２エクソンはアミノ酸１９−４１（塩基
１６３９−１７０７）をコードし、第３エクソンはアミ
ノ酸４２−１０２（塩基１８０３−１９８２）をコード
し、第４エクソンはアミノ酸４２−１０２（塩基３３０
７−３４４１）を有するカルボキシル末端をコードして
いる。位置４０１０と４０２０では、ｍＲＮＡのポリア
デニル化用の２つのシグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）が存
在している。成熟EqIFN-γポリペプチドの位置８６−８
８には、ウシガンマーインターフェロンの第２Ｎ−グリ
コシル化サイトと一致する単一潜在Ｎ−グリコシル化サ
イト（Asn-Ser-Ser)がある（図４）。驚くべきことに
は、成熟EqIFN-γポリペプチドは位置３で単一システィ
ン基を含み、また天然のヒトおよびマウスガンマー−イ
ンターフェロンと同様に、第１の３つのアミノ末端アミ
ノ酸（この場合、Tyr-Tyr-Cys)は多分生物体中でたん白
質分解的に断裂している。

【０１０１】５．成熟EqIFN-γの合成遺伝子の調製 E.coli 中で成熟形で組換えEqIFN-γを発現させるために
は、合成遺伝子をオリゴヌクレオチドから構築した。こ
の組換え体は天然EqIFN-γ遺伝子と同じアミノ酸配列を
含んでいるが、E.coliによって高度に発現させた未変性
細胞遺伝子中で使用する個々のアミノ酸用のコドンのみ
を含んでいる（GouyおよびGautier 、Nucl.Acids Res.
１０：７０５５−７０７４、１９８２）。さらに、数個
の単一制限酵素切断サイトが導入され、これが個々の部
分を変化させるための遺伝子の操作を容易にしている。
EqIFN-γ用の合成遺伝子を総計１６種のオリゴヌクレオ
チドから２つの変形で構築した。第１変異体は１４６個
のアミノ酸と出発メチオニンを有する成熟EqIFN-γをコ
ードし、第２形は、天然の生物体で推定上生じ得るよう
に、アミノ末端で３つのアミノ酸（Tyr-Tyr-Cys)で短縮
されたポリペプチドと出発メチオニンをコードしてい
る。

【０１０２】合成EqIFN-γ遺伝子の構造は図５に示して
いる。その調製に用いたオリゴヌクレオチドはアプライ
ドバイオシステムズモデル３８１Ａ ＤＮＡシンセサイ
ザーを用いて合成し、変性用１２％ポリアクリルアミド
ゲル（７Ｍ尿素）中での電気泳動により精製し、セファ
デックスＧ−２５（ファルマシア）上での除外クロマト
グラフィーにより脱塩した。オリゴヌクレオチドを結合させての合成EqIFN-γ遺伝子
の調製 合成EqIFN-γ遺伝子を２つの部分で調製した。Sal I 切
断サイトまでの遺伝子の第１の部分は８種のオリゴヌク
レオチドＥＧ−１〜ＥＧ−８を用いて調製し、一方Sal
I 切断サイトからBamHI 切断サイトまでの第２の半分の
遺伝子は６種のオリゴヌクレオチドＥＧ−９〜ＥＧ−１
４から調製した。アミノ末端で３つのアミノ酸で短縮さ
れたEqIFN-γ形においては、オリゴヌクレオチドＥＧ−
１５とＥＧ１６をオリゴヌクレオチドＥＧ−１およびＥ
Ｇ−２の代りに用いた。

【０１０３】互いに相補するオリゴヌクレオチドを対で
５′末端でリン酸化した。１００ｐモルの２つのオリゴ
ヌクレオチド（例えば、ＥＧ−３とＥＧ−４、またはＥ
Ｇ−５とＥＧ−６等）を１０単位のＴ４−ポリヌクレオ
チドキナーゼ（New EnglandBiolabs 社）９mcl のキナ
ーゼバッファー（７０mMトリス−HClpH 7.６、１０mMMg
Cl₂ 、５mMジチオスレイト−ル）、２mcCi〔γ−³²ｐ〕
ＡＴＰ（アメルシャム社）中で３７℃、１０分間インキ
ュベートした。次いで、１mcl の１０mM ＡＴＰ溶液を
加え、混合物を３７℃でさらに５０分間インキュベート
した。反応を９５℃に１０分間加熱して停止した。ＤＮ
Ａ末端のその後の結合を防止するため、オリゴヌクレオ
チドＥＧ−１、ＥＧ−１５、ＥＧ−９およびＥＧ−１４
はリン酸化しなかった。ポリヌクレオチドキナーゼの脱
活性化後、相補オリゴヌクレオチドを混合し、９５℃に
５分間加熱し、周囲温度に冷却した。

【０１０４】オリゴヌクレオチド混合物ＥＧ−１＋２
（または第２バッチにおいてはＥＧ−１５＋１６）、Ｅ
Ｇ−３＋４、ＥＧ−５＋６およびＥＧ−７＋８を結合さ
せ、１mcl の５Ｍ NaCl と混合し、７０℃に５分間加熱
し、周囲温度に冷却した。５mcl の１０mM ＡＴＰ、２
mcl のジチオスレイトール、1.５mcl の１０×連結反応
バッファー（0.６６Ｍトリス−HClpH 7.２、１Ｍ NaCl
、１００mM MgCl₂、１０mM ＥＤＴＡ、５０mMジチオ
スレイトール）および８０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(N
ew England Biolabs社) を上記溶液に加え、次いで４℃
で４８時間インキュベーションした。このリガーゼ反応
を５％未変性ポリアクリルアミドゲル中での反応の小部
分からのＤＮＡフラグメントゲル−電気泳動分離および
その後のオートラジオグラフィーによりモニターした。

【０１０５】同じ方法で、６種のオリゴヌクレオチドを
一緒に結合させた。反応をフェノール／クロロホルムに
よる抽出で停止させ、ＤＮＡをエタノール沈降によって
回収した。 ６．発現プラスミドpRH １００の構築 すべての酵素反応を製造者が明示した条件下で実施し
た。７mcl のプラスミドpER １０３〔Eva Dworking-Ras
tl等、Gene２１（１９８３）、２３７−２４８：ＥＰ−
Ａ−０１５５６１３〕を制限エンドヌクレアーゼHindII
I を含む５０mcl の反応培地中で線状化した。３７℃で
の１時間のインキュベーション後、５０mcl の２×ＣＩ
Ｐバッファーを加えた（２×ＣＩＰバッファー＝２０mM
トリス、pH＝9.２、0.２mM ＥＤＴＡ）。２単位の子牛
腸アルカリホスホターゼ（ＣＩＰ）を加えて、５′末端
リン酸残基を除去し、インキュベーションを４５℃で３
０分行った。反応を４mcl の0.５Ｍ ＥＤＴＡ溶液を加
え、１０mcl の１Ｍトリス、pH＝8.０溶液を加えること
によって停止した。たん白質をフェノールで２度、フェ
ノール／クロロホルムで１度抽出して除去した。ＤＮＡ
を0.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液pH5.５および２５
０mcl のエタノールを加えた後、水相から沈降させ、Ｄ
ＮＡ沈澱物を遠心し７０％エタノール溶液で１度洗浄し
た。ＤＮＡを乾燥し、ペレットを２０mcl のＴＥバッフ
ァー（１０mMトリスpH8.０、１mM ＥＤＴＡ）中に溶解
させた。

【０１０６】合成したオリゴヌクレオチドｄ（ＡＧＣＴ
ＴＡＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴ）およびｄ（ＣＡＴＣＴＴＴ
Ａ）の各１mcl バッチを１０単位のＴ４−ＰＮＫ（ポリ
ヌクレオチドキナーゼ）および１mMのｒＡＴＰを添加し
た１０mcl の反応溶液中でリン酸化した。反応は３７℃
で起り４５分で終った。反応を７０℃に１０分間加熱し
て停止した。プラスミド溶液とリン酸化オリゴヌクレオ
チドの各５mcl バッチを一緒に混合し７０℃に５分間加
熱した。次に、溶液を０℃に冷却し、２mcl の１０×リ
ガーゼバッファー（５００mMトリス、pH＝7.５、１００
mM MgCl₂、２００mM ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、
１mM ｒＡＴＰ、５００mcg ／mlＢＳＡ（ウシ血清アル
ブミン）〕、２mcl の水および１０単位のＴ４−ＤＮＡ
リガーゼを加えた。反応を４０時間続行し４℃で行っ
た。７０℃に１０分間加熱することによって反応を停止
した。

【０１０７】２mcl の上記リガーゼ反応を１０単位の制
限エンドヌクレアーゼSacIで３７℃、３時間総計３０mc
l の溶液中で消化した。反応を７０℃に十分間加熱する
ことによって停止させた。この反応混合物５mcl を総計
３０mcl 中で１０単位のT4-PMKを添加して１４℃、１６
時間で連結反応させた。２００mcl の適格E.coli HB 10
1 を１０mcl の上記リガーゼ反応と混合した。上記バク
テリアを氷上で４５分間保持し次いで４２℃、２分間加
熱してＤＮＡの取込みを行った。バクテリア懸濁液を再
び０℃で１０分間インキュベートした。最後に、形質転
換バクテリアを５０mcg ／mlのアンピシリン含有ＬＢ寒
天上に拡散させた。

【０１０８】形成したバクテリアコロニーのうち、１２
をランダムに選び、それからプラスミドを小スケール上
で単離した〔BirnboimおよびPoly、Nucl.Acids Res. ７
（１９７９）、１５１３〜１５２３〕。得られたＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼSacIで切断し、ＤＮＡをアガ
ロースゲル（１％、1xTBE バッファー）上で溶解した。
約４４００bp長の線状分子としてのＤＮＡの移動によ
り、SacI認識サイトがプラスミド中に挿入されたことを
確認した。これらプラスミドの１つをランダムに選択し
た。もう一度、E.coli HB 101 を会合ミリ調製物からの
ＤＮＡで形質転換した。得られた形質転換バクテリアの
うち、１つのコロニーを選び大き目のスケール上で培養
した。それより単離したプラスミドを制限エンドヌクレ
アーゼEcoRI および BamHIで切断し、ＤＮＡを１％アガ
ロースゲル上に溶解し、小さ目のフラグメントをゲルよ
り電気溶出によって単離した。この約４６０bp長の Eco
RI−BamHI ＤＮＡフラグメントをサンガー法〔F.Sanger
等、Proc. Natl. Acad. Sci（１９７７）、５４６３−
５４６７〕に従ってシーケンシングした。かくして分析
したプラスミドをpRH 100 と表示した。

【０１０９】7. 合成EqIFN-γ遺伝子の発現プラスミド
pRH 100 への挿入 １００mcg のプラスミドpRH 100 を１００mcl の反応バ
ッファー中でSacIで全体的に切断し、酵素を７０℃に１
０分間加熱することによって不活化した。吊り下りＤＮ
Ａ末端をKlenowフラグメント（アメルシャム社）による
１０mcM の各４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェ
ートの存在下での処理によって直接化した（３０分間、
２５℃）。反応をフェノール／クロロホルムによる抽出
によって停止し、ＤＮＡをエタノール沈降によって濃縮
した。この処理はトリプトファンプロモーターを加える
ことによって平滑ＤＮＡ末端を産生し、この末端はほん
訳出発コドン“ＡＴＧ”で終端する。線状化プラスミド
ＤＮＡを BamHIで再切断し、ベクター部分をアガロース
ゲルからの電気泳動分離後に単離する。

【０１１０】上記したようにして調製したpRH 100 プラ
スミドベクター５０ngを２０ｐモルの結合オリゴヌクレ
オチドＥＧ−１〜ＥＧ−８およびＥＧ−９〜ＥＧ−１４
と混合し、１０mcl の連結反応バッファー（６６mMトリ
ス− HClpH７.2、１００mM NaCl 、１０mM MgCl₂、１mM
EDTA 、５mMジチオスレイトール、１mM ATP）中で１単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマインハイム）
と２４時間、１４℃でインキュベートした。塩化カルシ
ウムによる処理で適格化したE.coli JM 101 をこの連結
反応混合物で形質転換し、一夜３７℃でインキュベート
した。得られた形質転換物から、プラスミドＤＮＡをミ
ニ調製法により単離し、その構造を制限分析およびHind
III−BamHI 挿入物のシーケンシングにより決定した。
成熟 EqIFN-γの発現用の所望構造を有するプラスミド
はpEqG-YYCl と表示した。全く同様に、オリゴヌクレオ
チドＥＧ−１５、ＥＧ−１６、ＥＧ−３〜ＥＧ−８、お
よびＥＧ−９〜ＥＧ−１４をpRH 100 ベクター中にクロ
ーニングして３つのアミノ酸で短縮されたEqIFN-γを得
た。所望構造のプラスミドをpEqG-QAA1 と表示する。

【０１１１】8. プラスミドpEq-YYClまたはpEqG-QAA1
を含むE.coli JM 101 によるインターフェロン活性の発
現 １００mlのバクテリア培養物を激しく振とうしながら、
３７℃で、次のトリプトファンなしの培地（培地リット
ル当りの量）：１０ｇ（NH₄)₂PO₄、3.５ｇ KH₂PO₄ pH
７.3（NaOHによる）、0.５ｇNaCl、２１ｇカザミノ酸
（酸−加水分解物）、１１ｇグルコース、１mM MgSO₄、
0.１mM CaCl₂、１mgチアミン− HCl、２０mgＬ−システ
ィン、２０mg３−β−インドールアクリル酸（ＩＡＡ、
トリプトファン−オペロンの誘起剤）および任意成分と
しての５０〜１００mgのアンピシリン中でインキュベー
トした。次いで、バクテリアを４０００rpm で５分間遠
心によりペレット化し、培養物容量の1/10の氷冷５０mM
トリス− HCl、pH８.0、３０mMNaCl で懸濁し、超音波
プローブ（２０KHz 、１００ワット）を用いて氷で冷却
しながら３０秒間で２回破壊した。細胞片を10,000rpm
で１０分間の遠心により除去し、滅菌濾過したのち、上
清を、水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）または脳心筋炎
ウィルス（ＥＭＣＶ）の細胞変性効果（ＣＰＥ）を測定
するアッセイにおいて、インターフェロン活性について
試験した。

【０１１２】試験系：ＮＢＬ−６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ５７、ウマ表皮細胞）／ＶＳＶＡ５４９（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ １８５、ヒト肺ガン細胞系／ＥＭＣＶ Ａ５４９細胞のタイターをヒトインターフェロン標準物
を用いて国際単位に標準化する。 9. マキシ細胞中でたん白質を標識することによる発現
ウマインターフェロンの検出 プラスミドコードしたたん白質はマキシ細胞法を用いて
インビボにて選択的に標識できる。

【０１１３】E.coli CSR 603を通常の方法で発現プラス
ミドによって形質転換しアンピシリン含有寒天プレート
上で形質転換バクテリアから選択した。マキシ細胞の調
製およびたん白質の標識化はA. Sancar により開示され
たようにして行った。細胞を１５mlのインドールアクリ
ル酸を含まない培地（実施例８参照）中で３７℃でＯＤ
_600nm ＝0.５まで培養し、この培養物１０mlをペトリ皿
中で５秒間、５０cmの距離でＵＶ殺菌灯（１５ワット）
で回転させながら照射し、さらに１時間、３７℃でイン
キュベートした。培養物を１００mcg ／mlのＤ−シクロ
セリンと混合し、３７℃で１４時間インキュベートし、
次いでバクテリアを遠心により収獲した。細胞を５mlの
Hershey 塩溶液で２回洗浄し、２０mcg ／mlのインドー
ルアクリル酸を含む５mlのHershey 培地中に懸濁し、３
７℃で２時間インキュベートした。５mcCi／mlの³⁵Ｓ−
メチオニン（１０００Ci／ｍモル）を各培養物に加え、
次いで３７℃で１時間振とうさせた。細胞を収獲し、Ｓ
ＤＳおよび２−メルカプトエタノールを含む電気泳動プ
ローブバッファー中で溶解し、たん白質を１５％ポリア
クリルアミドゲルで分離した。

【０１１４】 Hershey 塩水溶液 Hershey 培地 （リットル当り） （Hershey 塩水溶液１００ml当り） 5.４ｇ NaCl ２ml ２０％グルコース 3.０ｇ KCl 0.５ml ２％スレオニン 1.１ｇ NH₄Cl 1.０ml １％ロイシン １５mg CaCl₂ ・2H₂O 1.０ml ２％プロリン 0.２ｇ MgCl₂・6H₂O 1.０ml ２％アルギニン 0.２mg FeCl₃・6H₂O 0.１ml 0.１％チアミン ８７mg KH₂PO₄ １2.１ｇトリス−HCl pH 7.4

【０１１５】乾燥ゲルのオートラジオグラムを、コダッ
クラネックス−レギュラーインテンシファイアーフィル
ムを用いデュポンコロネックスＸ線フィルム上に−８０
℃で２日露出したのち調製した。¹⁴Ｃ−メチル化たん白
質混合物（アメルシャム社）を分子量標準物として用い
た。使用したコントロールはプロモーターは含むがイン
ターフェロン遺伝子を含まないプラスミドpER 103 、お
よびヒトＩＦＮ−α２arg 遺伝子の２つのコピーを含む
プラスミドpER 21/1であった。 10. EqIFN-γでハイブリッド化したゲノムウマＤＮＡ
中の配列の検出

【０１１６】次の手順を用いてインターフェロン遺伝子
EqIFN-γと高度の相同性を示すウマゲノム中の配列の総
数を検出した。３０mcg の高分子ウマＤＮＡ（実施例
１）を１００単位の相応する制限酵素で３００mcl の反
応容量中で全体的に消化し、１０mlのこの切断ＤＮＡを
各トラック中の大きさに従って0.８％アガロースゲル上
で溶解した。ニトロセルロースフィルター上にサウサー
ン転写し、ＤＮＡを変性し固定したのち、各フィルター
を約６×１０⁶ cpm の放射標識“プローブ”（６５℃で
１７時間、５×ＳＳＣ、５×Denhardt溶液、0.１％ＳＤ
Ｓ：２０mcg ／mlの変性サーモン精子ＤＮＡ）でハイブ
リッド化した。EqIFN-γ用に用いたプローブは全成熟イ
ンターフェロンのコード配列を含有するプラスミドpEqG
-YYCl であった。次いで各フィルターを緊縮条件下〔0.
３×ＳＳＣ（４５mM NaCl 、4.５mM Na₃シトレート）、
0.１％ＳＤＳで６０℃で４５分間、４回〕で洗浄した。
オートラジオグラフィーをデュポンクロネックスＸ線フ
ィルム上でコダックラネックスレギュラーインテンシフ
ァイアーフィルムを用いて７日間−８０℃で行った。

【０１１７】11. E.coli HB 101 ／pEqG-QAA2 および
HB 101 ／pEqG-QQA３中でウマインターフェロン−ガン
マー（ＱＡＡ）の発現 一層良好な発現を達成するために、ａ）改良された発現
ベクターおよび ｂ）改良されたリボソーム結合サイト
を用いた。改良された発現ベクターは−３５領域を塩基
交換によってコンセンサス−３５領域に調節されている
セラッチア マルセッセンス（Serratia marcescenc)
(S. ma)からのtrp プロモーター（pRH 281 ）をベース
とするかあるいはE.coliの第１のＡ／Ｔリッチ領域また
は第２Ａ／Ｔリッチ領域とS. ma のプロモーターを有す
るハイブリッドtrp プロモーター（pRH 282 、S. Itoh
、 Gene ４４（１９６６）、２９−３６）をベースと
する。使用したリボソーム結合サイトはE.coliエンテロ
トキシンIIのリボソーム結合サイトである。

【０１１８】ａ） pRH 281 ／５ 次のオリゴヌクレオチドをアプライド バイオシステム
ズＤＮＡシンセサイザーを用いて調製した：

【０１１９】

【化３１】

【０１２０】１００ｐモルのオリゴヌクレオチドTrp-２
〜Trp-５を１０mcl 中で別々にリン酸化した。Trp-１と
−２、Trp-３と−４およびTrp-５と−６を煮沸しゆっく
り冷却することによってハイブリッド化した。各オリゴ
ヌクレオチド対の溶液を混合しＴ４ＤＮＡリガーゼの添
加により連結反応させた。３mcg のpAT 153 をEcoRIお
よび ClaI で２重に切断した。大きいフラグメントを、
精製したのち、約２０ｐモルのオリゴヌクレオチドと混
合し連結反応させた。ＤＮＡを引き続いてE.coli HB 10
1 中に形質転換し、いくつかの得られたコロニーからの
プラスミドを単離した。プロモーターを含む Pst−Hind
IIIフラグメントをシーケンシングした。所望の配列を
確認したのち、プラスミドを選択しpRH 281 ／５と表示
した。プロモーター部分の配列は次のように読める：

【０１２１】

【化３２】

【０１２２】この新規な発現ベクターの利点は次のとお
りである。 １） trp −S. ma プロモーター中の最適な−３５領域 ２） リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）の前の単一XhoI
サイトがＲＢＳを他と交換する。 ３） 発現プラスミドがＲＢＳの５個のヌクレオチドの
間隔でほん訳出発ＡＴＧを含有する。 ４） このＡＴＧのＧはSstI認識配列（ＧＡＧＣＴＣ）
の第１塩基である。SstIで切断し次いで菌末端を産生す
ることにより、ほん訳出発ＡＴＧが与られ、これには外
来遺伝子を読みフレームの第１塩基よって出発して連結
反応できる。 ５） ＧまたはＣを含まないＲＢＳ−ＡＴＧ連結 ６） ５′末端でのオリゴヌクレオチド配列の選択によ
り、元のEcoRI 切断サイトを破壊できる。結果として、
SstI、EcoRI 、ClaIおよびHind IIIからなる多クローニ
ングサイト（すでにpAT 153 部中で）をプロモーターの
３′末端で産生できる。 ｂ） pRH 282 ／５ 発現ベクターpRH 282 ／５は同じ方法で構築できる。オ
リゴヌクレオチドTrp-１およびTrp-２はオリゴヌクレオ
チドTrp-７およびTrp-８で置き換えた：

【０１２３】

【化３３】

【０１２４】pRH 282 ／５中のプロモーター部分の配列
は次の如く読める：

【０１２５】

【化３４】

【０１２６】

【化３５】

【０１２７】ｃ） pGN 1 １mcg のpUC l ８を BamHIとSalIで二重に切断した。１
０mcg のEqG-QAA l から、再び BamHI−SalIで二重切断
することにより、合成ウマガンマー−インターフェロン
遺伝子の第２半分を単離し脱リン酸化した。約２０ngの
ベクターを１００ngの挿入物と連結反応させ、ＤＮＡを
E.coli JM 101 中で形質転換させた。１つのコロニーの
プラスミドを制限酵素消化により試験しpGN 1 と表示し
た。 ｄ） pGN 3 合成遺伝子の第１半分をオリゴヌクレオチドからリボソ
ーム結合サイトと一緒に調製した：

【０１２８】

【化３６】

【０１２９】各オリゴヌクレオチドの５０ｐモルをリン
酸化した：７mcl 中でEqG-２をEqG-５を一緒に、各８mc
l 中でEqG-３とEqG-８をそれぞれ独自に。キナーゼ反応
１００℃に加熱して停止させた。５０ｐモルのEqG-４
（１mcl ）をEqG-３に加え、５０ｐモルのEqG-１（１mc
l ）をEqG-８に加えた。溶液を再び１００℃に加熱しゆ
っくり冷却した。オリゴヌクレオチド対の各溶液を混合
し、総計３０mcl 中でＴ４−ＤＮＡリガーゼで連結反応
させ、２mcg のpUC 18をEcoRI と Bind III で二重に切
断し、ベクター部分をゲル精製して５０mcl の水中に溶
解させた。４０ngのベクターと２ｐモルの連結反応させ
たオリゴヌクレオチドと１０mcl 中で連結反応させ、次
いでＤＮＡをE.coli JM 101 中に形質転換させた。いく
つかの得られたプラスミドのEcoRI − Hind 挿入物をＭ
１３mp９中に再クローニングし、配列をチェックした。
予想した配列を有するプラスミドを選びpGN 3 と表示し
た。

【０１３０】ｅ） pGN 20 約３mcg のpGN １またはpGN ３を、それぞれ、Hind III
とSalIで二重に切断した。pGN ３挿入物およびベクター
／pGN １からのＥｑ−γインターフェロン遺伝子の第２
半分をゲル精製した。0.２mcg のpGN ３を約0.０５mcg
のpGN ３挿入物と連結反応させ、ＤＮＡをE.coli JM 10
1 中に形質転換させた。制限パターンをチェックしたの
ち、得られたクローンのプラスミドを選びpGN 20と表示
した。 ｆ） pEqG-QAA２およびpEqG-QAA３ 約１０mcg のpGN 20から、合成ウマγ−インターフェロ
ン遺伝子をE.coliエンテロトキシンのリボソーム結合サ
イト〔C. H. Lee 等、Infect. Immun.４２（１９８
３）、２６４−２６８； S. L. Moseley等、Infect. Im
mun.３９（１９８３）、１１６７−１１７４〕を一緒に
含有するXhoI−EcoRI 挿入物を単離した。pRH 281 ／５
またはpRH 282 ／５をXhoIとEcoRI で二重に切断した。
２０ngのベクターを２０ngの挿入物と連結反応させ、Ｄ
ＮＡをE.coli HB 101 中に形質転換させた。いくつかの
コロニーを選び、プラスミドを単離し、制限分析により
チェックした。１つのプラスミドを各ケースにおいて選
び、pEqG-QAA２（ベクター：pRH 281 ／５）またはpEqG
-QAA３（ベクター：pRH 282 ／５）と表示した。

【０１３１】ｇ） インターフェロン−γ活性の溶解物
試験E.coli HB 101 ／pEqG-QAA２または HB 101 ／pEqG-QAA
３の一夜培養物をLB/Amp（ＬＢ：１０ｇ／ｌトリプト
ン、５ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／l NaCl、５０mg／ｌア
ンピシリン）で１：１００に稀釈し、さらに３７℃でイ
ンキュベートした。光学密度（６００nm）0.３に達した
とき、５０mg／ｌのインドールアクリル酸を加え、培養
物をさらに２時間、３７℃でインキュベートした。バク
テリアを遠心により分離し超音波を用いて破壊した。滅
菌濾過した上清をＮＢＬ−６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ５
７）上で水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）をウィルスと
して用いてγ−インターフェロン活性について試験し
た。両形質転換バクテリア培養物（E.coli HB 101 ／pE
qG-QAA２および HB 101 ／pEqG-QAA３）の溶解物は約0.
１〜１×１０⁶ 単位／mlのインターフェロン活性を示し
た。コントロールとして、同様に調製したE.coli HB 10
1 ／pRH 281 溶解物を試験した。このコントロール溶解
物１００単位／ml以下の活性を示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】ラムダＥｑ−γ２からの４６６４bp長の BamHI
フラグメントのＤＮＡ配列の第１〜第1689の塩基を示し
ている。

【図２】ラムダＥｑ−γ２からの４６６４bp長の BamHI
フラグメントのＤＮＡ配列の第1690〜第3393の塩基を示
している。

【図３】ラムダＥｑ−γ２からの４６６４bp長の BamHI
フラグメントのＤＮＡ配列の第3394〜第4464の塩基を示
している。

【図４】異なる種のγ−インターフェロンのアミノ酸配
列の比較を示している。

【図５】ウマγ−インターフェロン遺伝子の全合成に用
いたオリゴヌクレオチドの略図的例示を示している。

【図６】E.coli 中での発現用に最適に設計した天然遺
伝子（eq）と合成遺伝子（syn)の成熟EqIFN −γのコー
ド配列の比較。異なる塩基は星印でマークされている。

【図７】成熟EqIFN −γに用いたコドンを示す表。第１
塩基は左側に示され、第２塩基は中央に示され、コドン
の第３塩基は右側に示されている。表は天然遺伝子中の
当該アミノ酸に用いたコドンの数を示し、一方、合成遺
伝子のそれはカッコ内に示されている。

【図８】発現プラスミドpRH 100 の構築を示している。

【図９】pGN 20の構築および制限マップを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アドルフ ヒムラー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94080サウス サンフランシスコ メモリ アル ドライヴ 25−800 (72)発明者 ペーター スヴェットリ オーストリア国 アー1130 ウィーン ヒ ーツィンゲル ハウプトシュトラーセ 40 ベー

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記〜のいずれかに記載されたDNA
   分子を含有するかあるいはプラスミドpAHlllである組換
   DNA 分子で形質転換されていることを特徴とする宿主生
   物。 EqIFN −ガンマの生物学的、免疫学的性質を有し、
   必要に応じて天然のグリコシル化を有しないことを特徴
   とする実質的に純粋形のポリペプチドをコードするDNA
   分子。 上記のDNA 分子と８５％以上の相同性を示す条件
   下でハイブリッドしており、一方、天然、合成または半
   合成起源を有し得、上記のDNA 分子に突然変異、ヌク
   レオチド置換、ヌクレオチド欠落、ヌクレオチド挿入お
   よびヌクレオチドの逆転によって関係しており、さらに
   EqIFN −ガンマの生物学的、免疫学的活性を有するポリ
   ペプチドをコードしているDNA 分子。 DNA分子が式 EG1、EG2 、EG3 、EG4 、EG5 、EG6 、
   EG7 、EG8 、EG9 、EG10、EG11、EG12、EG13、EG14、EG
   15またはEG16に相応し、これらDNA 分子の少なくとも２
   つが任意の所望の組合せで一緒に結合されており、ある
   いは１種以上のトリプレットが同じアミノ酸をコードし
   ている他のトリプレットで置換されていることを特徴と
   するＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 DNA 分子が 【化１】 （式中、Ｘは水素、リーダーTyr Tyr Cys 、リーダーMe
   t Tyr Tyr Cys 、H-TyrTyr Cys またはMet を示す）の
   アミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNA
   分子である請求項１記載の宿主生物。
3. 【請求項３】 DNA 分子が、ヌクレオチド： 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】 【化９】 を含有し、１種以上のトリプレット用に同じアミノ酸を
   コードする他のトリプレットを含有し、相補ヌクレオチ
   ドを含有しあるいはこれら相補体から構成された二重鎖
   DNA である請求項１記載の宿主生物。
4. 【請求項４】 組換DNA 分子が、含まれるDNA 分子を発
   現制御配列に官能的に結合させ、DNA 分子が微生物中
   で、あるいは動物細胞中で複製可能であり、あるいはDN
   A 分子がプラスミドpEqG-GAA1 、pEqG-QAA2 またはpEqG
   -QAA3 であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか
   １項記載の宿主生物。