KR20080018960A - 대장균에서 높은 수준의 리소스타핀 분비 발현 방법 - Google Patents

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Abstract

대장균(Escherichia coli)에서 높은 수준의 리소스타핀의 분비 발현 방법으로, 성숙한 리소스타핀을 암호화하는 일부 또는 전체 유전자 서열 전에 대장균에서의 분비 발현에 적절한 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 클로닝하고, 상기 클로닝된 서열을 프로모터에 연결하여 발현 벡터를 구성하고; 대장균(Escherichiacoli)을 상기 발현 벡터로 형질전환하고, 배양 및 발효하고, 그 후 발효 배양액의 상층액으로부터 리소스타핀을 분리하는 단계를 포함한다. 상기 분비 발현의 장점은 상기 발현 생성물이 상기 배지 내에 활성 형태로 존재할 수 있으며, 따라서 봉입체의 복원을 위한 과정이 요구되지 않고; 발효 배양액의 상층액으로부터 빠른 회수 속도로 정제하기가 보다 용이하며; 숙주의 단백질로부터의 오염이 적다.
리소스타핀, 분비 발현, 대장균, 재조합, 발효

Description

대장균에서 높은 수준의 리소스타핀 분비 발현 방법{A METHOD OF SECRETION EXPRESSION OF LYSOSTAPHIN IN ESCHERICHIA COLI AT HIGH LEVEL}
본 발명은 재조합 DNA기술을 이용한 단백질 또는 폴리펩티드 약의 생산에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대장균(Escherichia coli)에서 분비 발현(secretory expression)에 의한 리소스타핀의 생산 방법에 관한 것이다.
리소스타핀은 Schindler 및 Schuhard(미국 특허 번호 3,278,378; 1966)에 의해 스타필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans)의 배양에서 1964년에 최초로 발견되었으며, 27kDa의 분자량을 가지고 246 개의 아미노산으로 구성된다. 상기 리소스타핀은 엔도펩티다아제(endopeptidase)이며, 스타필로코커스 세포 벽의 펩티도글리칸에서 가교하는 펜타글리신(pentaglycine)을 용해하여 작용하고, 그에 따라 세포벽의 안전성을 붕괴시키고 박테리아 세포체를 용해시킨다. 상기 리소스타핀 유전자는 중국 및 외국에서 분자 클로닝(cloning) 방법을 이용하여 1980년대부터 대장균(에쉐리키아 콜리(Escherichiacoli)), 바실러스 섭브틸리스(Bacillus subtitlis) 및 바실러스 스파이리쿠스(Bacillus sphaericus) 등에서 발현되어 왔 다. 박테리아를 죽이는 독특한 메커니즘 때문에, 리소스타핀은 스타필로코커스의 세포벽을 낮은 농도에서도 신속하게 용해할 수 있고, 따라서 이것은 박테리아에 대한 직접적인 작용이고 확실한 활동이다. 나아가, 리소스타핀에 의한 내성 박테리아 균주가 거의 유도되지 않고, 리소스타핀은 특이적인 항박테리아 스펙트럼을 가진다. 고순도의 재조합 리소스타핀은 현재 중국 및 외국에서 상업적으로 제조될 수 있고, 세균학, 소독, 및 효소학, 그리고 임상적으로 항-박테리아 치료의 연구에서 널리 이용되어왔다.
스타필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans)는 병원균에 속하고 제한된 양의 리소스타핀만을 생산하며, 최근 분자 생물학 기술의 발달에 의해 미국의 Recsei 등은 분자 클로닝 방법을 이용하여 1987년에 대장균(Escherichia coli) JM 105, 바실러스 섭브틸리스(Bacillus subtitlis) 및 바실러스 스파이리쿠스(Bacillus sphaericus)에서 리소스타핀 유전자를 발현하였다. 대장균 JM 105에서 발현된 리소스타핀의 양은 3μg/ml이며 그 중 65%가 배양 상층액, 15%가 주변세포질(periplasm), 그리고 20%가 세포질에 존재한다. 1990년에 특허 번호 4931390으로 특허가 허여되었으며, 여기서 1.5kb 리소스타핀-암호화 DNA 분획을 pUC8, pBC16, pBD64 또는 pSPV1 벡터로 삽입하여 재조합 플라스미드 pRG5, pJP1, pDF8 또는 pRP1을 각각 형성하는 것을 개시한다. pRG5는 대장균 JM 105를, pJP1, pDF8 또는 pRP1은 여러 바실러스(바실러스 서브틸리스(bacillus subtilis) BD170, 바실러스 스파이리쿠스(Bacillus sphaericus) 00)를 형질전환하기 위해 사용되었고, 이로써 생산된 리소스타핀은 면역학적 기술 및 전기영동에 의해 확인되고, 그 후 스타필로코 커스 시물란스(S. simulans)에 의해 생산된 리소스타핀과 비교되었다. 바실러스 스파이리쿠스(Bacillus sphaericus) 형질전환주(transformant)로부터 생산된 리소스타핀(150 mg/L)의 양은 스타필로코커스 시물란스(S. simulans)에 의해 생산된 리소스타핀 양의 5배였다. 상기 언급된 특허는 또한 1.5 kb DNA 서열을 제공하며, 389 아미노산의 프로리소스타핀의 전구체를 암호화하고, 상기 전구체는 번역 후 성숙한 리소스타핀으로 가공된다. 최근 리소스타핀이 이질성(heterogenous) N-말단을 가지며, 이들 중 대부분이 야생형 리소스타핀 보다 두 개의 아미노산이 짧은 것이 발견되었다.
독일로부터 WALTER P.HAMMES 등은 1996년에 전구체가 삭제된 리소스타핀 유전자를 미트 락토바실리(Meat Lactobacilli)(하나의 락토바시러스(lactobacillus))에서 발현시켰다. 전구체를 삭제한 목적은 미트 락토바실리에서 안정한 발현을 획득하기 위함이며, 특허 번호 EP0759473; 1997을 참고할 수 있으나, 상기 방법은 세포 내 발현에 머무른다.
1999 년에, 인도의 한 회사, Biotechnology International Limited가 재조합 성숙 리소스타핀과 관련된 특허인 공개 번호 WO 01/29201을 출원하였으며, 여기서 상기 리소스타핀 전구체 및 신호 펩티드 부분이 삭제되고, 상기 시작 코돈 ATG(최초의 아미노산인 메티오닌을 암호화하는 코돈)이 재조합 완성 리소스타핀 유전자 전에 직접 첨가되었고, 상기 설계된 서열은 pET11b 내로 T7 프로모터 뒤에 위치하여 복제되었고, 그 후 상기 리소스타핀의 발현이 IPTG에 의해 유도되었다. 상기 참고 특허 출원에서, 상기 리소스타핀은 대장균에서 봉입체(inclusion body)로서 발 현되며, 바라는 단백질이 세포 내에 불용성 봉입체로서 저장되고, 상기 단백질은 박테리아 세포의 분쇄에 의해서만 분리가 가능하다. 상기에서 분리하는 동안, 단백질 변성제가 사용되어야 하고, 상기 단백질은 복원(renature)되어야 한다. 그러나, 복원시 여러 분자는 서로 부정확하게 결합하고 비정상적인 구조를 형성한다. 이와 함께, 상기 세포체 잔여물은 유전적으로-조작된(genetically-engineered) 약의 제조 공정 과정에서 세척되기 어려우며, 따라서 재조합 생성물의 품질에 부정적인 영향을 미친다.
대장균(Escherichiacoli)에서 리소스타핀의 분비 발현을 위한 고효율적인 방법은 없다. 분비 발현은 하기의 장점을 갖는다: 상기 발현된 단백질은 배지 내에 최종 활성 형태로서 존재하므로, 봉입체를 복원할 필요가 없으며; 상기 바라는 단백질을 배지로부터 고수율로 분리하기가 비교적 용이하며; 그리고 숙주에 의한 단백질의 오염이 적다.
본 발명에 의해 해결되어야 하는 기술적인 문제는 당해 기술 분야의 문제점을 극복하기 위해 분비(secretion)에 의하여 대장균(Escherichia coli)에서 고효율로 리소스타핀을 발현하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일반적인 기술적 사상은 하기와 같다:
1960년에 리소스타핀의 발견으로부터 지금까지 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 특히 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)의 약-내성 균주에 대한 이 효소의 뛰어난 살균 활성의 관점에서, 인간에서의 의학적 용도에 대한 연구가 국내외에서 수행되고 신약 허가 신청의 단계에 이르렀다. 그러나, 재조합 리소스타핀은 지금까지 바실러스 스파이리쿠스(Bacillus sphaericus)에서만 성공적으로 발현되었으며, 이렇게 조작된 박테리아 균주는 지금까지 약 용도로 허가받지 않았고, 인간 약을 위한 상기 원핵세포 발현 숙주는 대장균(Escherichiacoli) 및 효모이다. 이것이 새로운 약의 허기를 위해 전세계의 연구 집단들이 대면하고 해결하려고 노력하는 문제이다.
관심 있는 효소의 발현을 위해 대장균(Escherichia coli)을 사용하기 위한 시도가 수년간 이루어져 왔다. 1997년에 독일의 과학자 그리고 2003년에 미국의 과학자는 바실러스 스파이리쿠스(Bacillus sphaericus) 대신 유산균을 이용하여 리소스타핀을 발현하였으나, 유산균은 약 용도로 허가되지 않았으며, 따라서 상기 문제는 새로운 약의 적용에도 존재한다. 나아가, 상기 유산균에 의한 발현은 세포내에서의 가용성(intracellularly soluble expression) 발현으로 이러한 발현에 대한 비용은 고가이다.
인도의 과학자는 대장균(Escherichia coli)을 이용하여 리소스타핀을 봉입체(inclusion body)의 형태로 발현시켰고, 상기 발현된 리소스타핀 단백질은 세포 내에 불용성 봉입체로서 저장되었다. 상기 단백질을 분리하기 위해, 상기 박테리아 봉입체는 사전에 분쇄되어야 한다. 분리 과정 중, 단백질 변성제가 사용되어야 하고, 그 후 상기 단백질은 의약 용도로 사용하기 위해 최종적으로 복원(renaturation)되어야 한다. 그러나, 이때 복원 과정에서 잘못된 결합에 의해 형성된 비정상적인 구조를 가지는 수많은 분자들이 존재한다. 또한 상기 봉입체 단백질은 유전공학 약을 제조하는 동안 세척되기 어려운 물질이며, 따라서 재조합 생산품의 품질에 부정적인 영향을 미친다.
지금까지, 인간의 약을 위한 리소스타핀 발현 시스템 분야에서 국내 및 해외 모두에서 해결 방안이 없었고, 동일한 문제가 산업화 및 신약 적용에 존재한다. 따라서, 대장균(Escherichia coli)에서 리소스타핀 유전자의 분비 발현을 획득할 수 있다면, 중국에서 독점 IP 권리였던 신약에 대한 적용 과정을 촉진시킬 수 있고, 수많은 경제적 및 사회적 이익을 가져온다.
본 발명은 성숙한 리소스타핀의 서열을 암호화 하기 전에 대장균(Escherichia coli)에서 분비 발현을 유도하는 단일 펩티드 서열의 신호 펩타이드 단편을 추가하여, 대장균(Escherichia coli)에서 리소스타핀을 분비 발현하는 것을 목적으로 한다. 당해 기술 분야에는 대장균(Escherichia coli)에서 프로리소스타핀(prolysostaphin)이 존재하지 않는 리소스타핀의 분비 발현에 대한 보고가 존재하지 않는다.
본 발명의 기술적 해결은 하기와 같다:
본 발명은 하기의 단계를 포함하며, 대장균(Escherichiacoli)에서 리소스타핀을 분비 발현하는 방법을 제공한다:
(1) 성숙한 리소스타핀의 일부 또는 전체 유전자 서열 전에 단일 펩티드-암호화 서열을 클로닝하고, 상기 설계된 서열을 프로모터에 연결하는 단계를 포함하는, 발현 벡터를 구성하는 단계;
(2) 대장균(Escherichia coli)을 (1) 단계에서 구성된 벡터로 형질전환하고, 형질전환된 대장균(Escherichia coli)을 발효로 배양하는 단계;
(3) 발효액의 상층액으로부터 리소스타핀을 분리하는 단계.
여기서 상기 리소스타핀은 야생형 리소스타핀과 동일한 서열을 가지고, N-말단의 두 개의 알라닌이 삭제된 돌연변이와 같은 돌연변이 또한 포함된다.
여기서 단일의 펩티드는 Omp A, pho A, Lysn, pelB 중 하나이다.
OmpA 단일 펩티드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
SEQ.ID.NO:3:MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ A
pho A 단일 펩티드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
SEQ.ID.NO:5: MKKMSLFQNM KSKLLPIAAV SVLTAGIFAG A
Lysn 단일 펩티드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
SEQ.ID.NO:6: MKKTKNNYYT RPLAIGLSTF ALASIVYGGI QNETHAS
pelB 단일 펩티드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
SEQ.ID.NO:7: MKRLCLWFTV FSLFLVLLPG KALG
여기서 (2) 단계의 리소스타핀 발현 유형은 유도 발현(inducible expression)이다.
여기서 상기 벡터는 대장균(Escherichia coli)에 대한 발현 벡터이며, pUC 시리즈, pET 시리즈 또는 pGEX 시리즈, 또는 pBV220 중 하나로부터 선택될 수 있다.
여기서 상기 프로모터는 T7 프로모터, PIPr 프로모터 또는 lacUV5 프로모터 중 하나로부터 선택될 수 있다.
특히, 상기 단계들은 하기와 같다: 먼저, 한 쌍의 적절한 프라이머를 합성하고, 그 후 피로베스트(Pyrobest) 효소(고 적합도(fidelity) DNA 중합효소) 및 스타필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans)(NRRL B-2628)의 전체 DNA를 주형으로 이용한 PCR 방법으로 상기 리소스타핀 서열을 선택적으로 증폭한다. 상기 증폭된 생성물은 에티듐 브로마이드을 함유하는 아가로스 상의 전기영동을 통해 결정되고 회수된다. 상기 정제된 증폭 생성물을 NdeI 및 HindIII로 절단한다. 상기 절단된 단편은 NdeI 및 HindIII로 동일하게 절단된 벡터에 T4 DNA 리가아제(ligase)를 이용하여 16℃에서 2시간 동안 연결된다. 상기 결합 혼합물은 대장균(Escherichia coli)의 형질전환을 위해 사용되며, 따라서 재조합된 플라스미드를 획득한다.
상기 재조합 플라스미드는 자동 DNA 서열분석기(automatic DNA sequencer)에 의해 서열화된다. 상기 서열은 신호 펩티드 및 성숙한 리소스타핀 유전자를 암호화하는 알려진 서열과 비교되고, 상기 비교 결과는 이러한 서열이 동일하다는 것을 나타낸다.
대장균(Escherichia coli)은 재조합 플라스미드로 형질전환된다. 양의 클론(positive clone)을 골라 50 ml LB 배양액(30 mg/ml 카나마이신 함유)에 접종하고, 37℃에서 교반하면서, 배양액의 OD600가 0.6일 때까지 인큐베이션 하고, 그 후 IPTG를 최종 농도 0.05 mM로 첨가하여 관심 단백질의 발현을 유도하고, 3시간 동안 배양을 더욱 계속한다. 상기 발효 배양액을 원심분리하고, 그 후 상기 상층액 내의 리소스타핀 활성이 분광투과율(spectrophotometric) 분석을 통해 결정된다.
본 발명에 의해 제공되는 대장균(Escherichia coli)에서 높은 수준의 리소스타핀을 분비 발현하는 방법의 장점은 상기 발현 생성물이 배지에 활성의 성숙 리소스타핀의 형태로 존재하며, 반면 봉입체에 대한 복원 단계가 요구되지 않는 것이다; 이는 배양 상층액으로부터 관심 단백질을 정제하는 것이 비교적 쉽고 편리하며, 숙주 세포로부터의 단백질 오염이 적고; 상기 발현 생성물의 양이 약 200-400mg/L까지이며, 60% 이상의 수율을 갖는다.
도 1은 스타필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans)(NRRL B-2628) 전체 DNA로부터 PCR에 의해 증폭된 성숙한 리소스타핀 유전자를 나타내며,
레인(lane) 1: 스타필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans)(NRRL B-2628)의 전체 DNA를 주형으로, SEQ.ID.NO:1 및 SEQ.ID.NO:2를 크기 887bp의 한쌍의 프라이머로 사용하여 증폭된 생성물의 밴드이며;
레인 M: 표준 단백질 분자량 마커이며;
도 2는 재조합 리소스타핀을 위한 분비 발현 벡터의 설계를 나타내며;
도 3은 정제된 리소스타핀의 SDS-PAGE 전기영동을 나타내며;
레인 1: 개략적으로 정제된 샘플
레인 2-3: 더욱 정제된 샘플
레인 4: 정련된 정제 샘플
레인 M: 표준 단백질 분자량 마커
도 4는 정제된 리소스타핀의 SDS-PAGE 전기영동 및 웨스턴 블롯 분석을 나타내며;
레인 A: SDS-PAGE
레인 B: 웨스턴 블롯
레인 M: 표준 단백질 분자량 마커이며;
도 5는 MALDI-TOF에 의해 분자량이 26927Da로 결정된 정제된 리소스타핀을 나타낸다.
실시예 1: 재조합 리소스타핀의 분비 발현 벡터의 구성, 즉 OmpA 신호 펩티드 및 성숙한 리소스타핀 융합 유전자의 클로닝.
먼저, 상기 올리고-뉴클레오티드 서열이 하기와 같이 결정되고 합성된다:
SEQ.ID.NO:1
Figure 112008005345560-PCT00001
SEQ.ID.NO:2
Figure 112008005345560-PCT00002
SEQ.ID.NO:1의 설계에서, 5'말단에 NdeI 제한효소 자리(이탤릭체 부분)의 유전자 서열 및 OmpA 신호 펩티드(밑줄 친 부분)를 암호화하는 유전자 서열이 추가되 었다.
SEQ.ID.NO:2의 설계에서, 5'말단에 HindIII 제한 효소 자리(이탤릭체 부분)의 유전자 서열이 추가되었다.
상기 리소스타핀 서열을 피로베스트(pyrobest) 효소(고 적합도(fidelity) DNA 중합효소) 및 스타필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans)(NRRL B-2628)의 전체 DNA를 주형으로, 그리고 SEQ.ID.NO:1 및 SEQ.ID.NO:2를 한 쌍의 프라이머로 이용한 PCR 방법을 통해 선택적으로 증폭한다. 상기 증폭된 생성물은 에티듐 브로마이드를 함유하는 아가로스 상의 전기영동을 통해 결정되고 회수된다. 도 1에서 나타난 바와 같이 M은 분자량 마커의 레인을 나타내고, 레인 1은 887bp 크기의 생성물 밴드를 나타내며, 이는 스타필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans)(NRRL B-2628)의 전체 DNA를 주형으로, 그리고 SEQ.ID.NO:1 및 SEQ.ID.NO:2를 한 쌍의 프라이머로 이용하여 증폭된다.
상기 정제된 증폭 생성물을 NdeI 및 HindIII으로 절단한다. 상기 절단된 단편은 NdeI 및 HindIII에 의해 동일한 방식으로 절단된 pET30a 벡터에 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 2 시간 동안 연결된다. 상기 연결된 혼합물은 대장균(Escherichia coli) DH5a를 형질전환하기 위해 사용되고, 따라서 도 2에 나타난 바와 같은 제조합 플라스미드 pET-OmpAlss를 획득한다.
상기 재조합 플라스미드는 자동 DNA 서열분석기(automatic DNA sequencer)에 의해 서열화된다. 그 서열은 신호 펩티드 및 성숙한 리소스타핀 유전자를 암호화하는 알려진 서열과 비교되고, 상기 비교 결과는 이러한 서열이 동일하다는 것을 나 타낸다.
상기 설계된 재조합 플라스미드 pET-OmpAlss의 OmpA 신호 펩티드를 암호화하는 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112008005345560-PCT00003
상기 재조합 플라스미드 pET-OmpAlss의 성숙한 리소스타핀을 암호화하는 상기 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112008005345560-PCT00004
실시예 2: 분비(secretion) 방식에 의해 재조합 리소스타핀을 발현하는 조작된(engineered) 박테리아의 확립
대장균(Escherichia coli) 균주 TOP10, JM109(DE3), BL21(DE3)을 재조합 플라스미드 pET-OmpAlss로 각각 형질전환시켰다. 양의 클론(positive clone)을 골라 50 ml LB 배양액(30 mg/ml 카나마이신 함유)에 접종하고, 37℃에서 교반하면서, 배양액의 OD600이 0.6일 때까지 인큐베이션 하고, 그 후 IPTG를 최종 농도 0.05 mM로 첨가하여 관심 단백질의 발현을 유도하고, 3시간 동안 배양을 더욱 계속한다. 상기 발효 배양액을 원심분리하고, 그 후 상기 상층액 내의 리소스타핀 활성이 분광투과율(spectrophotometric) 분석을 통해 결정된다.
실시예 3: 분광투과율(spectrophotometric) 분석에 의한 리소스타핀 활성의 결정
실시예 2의 재조합 플라스미드 pET-OmpAlss를 함유하는 대장균(Escherichia coli) 균주 TOP10, JM109(DE3), BL21(DE3)을 이용하여 분광투과율 분석에 의해 리소스타핀 활성을 결정하였다. 특히, 상기 결정 방법은 하기와 같다:
1. 원리
리소스타핀의 양적 분석이 커플링된(coupled) KNR 밝은 청색으로 염색된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 세포벽 펩티도글라이칸(KNR-PG)을 색 공급 기질로 이용하여 분광투과율 분석에 의해 수행되었다. 효소 활동 과정 동안 양적으로 방출되는 KNR 염색 부를 가지는 용해성 단편 생성물의 작은 분자의 양에 따라, 상기 상층액은 비색적으로(colorimetrically) 결정되고 효소의 활성을 계산한다. 이러한 방법은 높은 민감도 및 시각화와 함께 용이하며, 편리하다.
2. 도구 및 시약
2.1 도구:
2.1.1 자외선-가시광선분광기(Ultra violet-visible spectrophotometer) 또는 효소-표지된 도구;
2.1.2 고속 동결 데스크탑 원심분리(high speed freezing desktop centrifuge);
2.1.3 전자 저울;
2.1.4 전자 항온 수조;
2.1.5 10μl, 20μl, 200μl, 1000μl 피펫 및 팁(tip);
2.1.6 보텍스(vortex)
2.2 시약:
2.2.1 출원인에 의해 제조된 리소스타핀 작용 샘플;
2.2.2 후에 사용하기 위한 0.2mol/L Gly-NaOH 완충제(pH10.0) 내에 1:5의 비율(m/v)로 균질하게 부유하며 출원인에 의해 제조된 색 공급 기질 KNR-PG;
2.2.3 글리신 및 NaOH는 분석용 등급(analytical grade)이고, 후에 사용하기 위해 0.2 mol/L Gly-NaOH 완충제로 제조된다(pH 10.0);
2.2.4 Tris는 후에 사용하기 위해 0.05mol/L Tris-HCl 완충제로 제조된다(pH 7.5);
2.2.5 95% 에탄올, 분석용 등급.
3. 실험 단계
3.1 리소스타핀 작용 샘플의 제조
상기 리소스타핀 작용 샘플은 눈금 측정 후 -20℃에서 저장된다. 사용하기 직전에, 1.0 ml의 0.05mol/L Tris-HCl 완충제(pH 7.5)를 정확히 첨가하고, 용해하 여 90.0 U/ml의 참고 샘플을 획득하고, 그 후 몇몇의 Eppendorf 튜브에 각 튜브 당 50μl씩 분취하고, -30℃ 미만의 냉동실에서 저장한다. 사용 직전에 450 μl의 0.05mol/L Tris-HCl 완충제(pH 7.5)를 이러한 튜브에 첨가하고 9.0 U/ml 참고 용액으로 희석한다. 각 튜브는 일 회 사용하고 반복되는 해동 및 냉동을 피한다.
3.2 표준 곡선의 준비
여섯 개의 깨끗하고 건조된 Eppendorf 튜브에 번호를 붙이고, 표 1의 순서에 따라 상응하는 양의 리소스타핀 참고 용액을 첨가하고, 그 후 다양한 양의 0.2mol/L Gly-NaOH 완충제를 추가한다.
그 후 130μl의 색 공급 기질 KNR-PG를 번호의 순서에 따라 추가하고, 상기 기질을 추가한 후 각 튜브를 신속하게 혼합하여 튜브 내 내용물을 균질하게 한다.
그 후 상기 추가된 용액을 함유하는 Eppendorf 튜브를 37℃의 워터 배쓰(water bath)에 옮기고 2-분간 인큐베이션 한다.
상기 Eppendorf 튜브를 워터 배쓰로부터 꺼내고, 300μl의 95% 에탄올을 번호의 순서에 따라 추가하여 반응을 멈추고, 10,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 0 번의 튜브를 공시험 대조군으로 하여 상기 상층액의 흡수도를 595nm에서 결정하였다.
상기 선형 회귀곡선(regression curve)은 결정된 흡수도 값 및 상기 대응하는 참고 샘플 농도(U/ml)에 따라 좌표를 정한다:
A=KC + B
상기 식에서 K는 기준 기울기이며, B는 절편, A는 흡수도, C는 농도이다(U/m).
표 1 표준 곡선의 준비
Figure 112008005345560-PCT00005
3.3 샘플링 분석
상기 분석 방법은 표준 곡선에 대한 방법과 같다. 상기 분석될 샘플은 0.05 mol/l Tris-HCl 희석 완충제(pH 7.5)로 예비-희석되고, 50 μl가 분석을 위해 사용되며, 각 샘플은 중복으로 분석되고, 상기 결과는 두 번의 측정에 대한 평균이다.
4. 상기 결과의 계산
계산식:
C0=N×Cmeasure×0.9/0.05
상기 식에서: Cmeasure는 샘플에 대한 측정 값(U/ml), N은 희석 시간, C0은 샘플 원래의 활성도(U/ml), 0.9는 반응 부피(ml), 0.05는 추가된 샘플 부피(ml)이다.
5. 결과
재조합 플라스미드 pET-OmpAlss를 포함하는 대장균(Escherichia coli) 균주 TOP10, JM109(DE3), BL21(DE3)는 각각 56U/ml, 45U/ml, 70U/ml의 리소스타핀 발현 활성을 갖는다.
실시예 5: 재조합 리소스타핀의 확인
TOP10 포함 재조합 플라스미드 pET-OmpAlss를 50ml LB 배양액(30 mg/ml 카나마이신 함유)에 접종하고, 37℃에서 16시간 동안 교반하면서 인큐베이션 한 후, 3 리터 LB 배양액(30 mg/ml 카나마이신 함유)에 재접종 하고, 37℃에서 5시간 동안 교반하면서 인큐베이션한 다음, IPTG를 최종 농도 0.05mM로 추가하고, 3시간 동안 더 배양하여 단백질의 발현을 유도한다; 그 다음, 상기 발효 배양액을 원심분리하고, 양이온 컬럼 크로마토그래피, 소수성 컬럼 크로마토그래피, 젤 여과에 의해 정제하여 최종적으로 순도 95% 이상이며 특이적 활성도 1103U/mg인 83mg의 리소스타핀 생성물을 획득하며, 이는 Sigma로부터 획득한 리소스타핀의 특이적 활성도와 비교된다.
상기 정제된 리소스타핀은 SDS-PAGE 전기영동 및 웨스턴 블롯에 의해 도 3 및 도 4와 같이 확인되고, 여기서 레인 1-4는 각각 발효 상층액, 양이온 컬럼 크로마토그래프 정제된 샘플, 소수성 크로마토그래프 정제된 샘플, 젤 여과 정제된 샘플이며; 레인 5는 Sigma로 부터 획득한 리소스타핀 샘플, 레인 M은 낮은 분자량 마커, 그리고 레인 6-9는 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸다.
상기 정제된 리소스타핀은 MALDI-TOF에 의해 분자량이 26927Da로 확인되었고(도 5에 나타난 바와 같이), 이론적으로 계산된 분자량 26927Da, 그리고 Sigma 리소스타핀의 분자량 26912Da와 매우 근접하다.
정제된 리소스타핀의 상기 N-말단 아미노산 잔기 분석 결과: N-말단의 상기 최초 15 아미노산은 자연의 리소스타핀과 동일하였고, 즉 AATHEHSAQWLNNYK였다.
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Claims (7)

  1. (1) 성숙한 리소스타핀의 일부 또는 전체 유전자 서열 전에 신호 펩티드 암호화 서열을 클로닝하고, 상기 설계된 서열을 프로모터에 연결하는 단계를 포함하는, 발현 벡터를 구성하는 단계;
    (2) 대장균(Escherichia coli)을 (1) 단계에서 구성된 벡터로 형질전환하고, 형질전환된 대장균을 발효로 배양하는 단계;
    (3) 발효 배양액의 상층액으로부터 리소스타핀을 분리하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장균에서 리소스타핀의 분비 발현 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 리소스타핀은 그 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장균에서 리소스타핀의 분비 발현 방법.
  3. 제 2항에 있어서, (1) 단계의 상기 신호 펩티드는 phoA, OmpA, Lysn 또는 pelB 중 하나인 것을 특징으로 하는, 대장균에서 리소스타핀의 분비 발현 방법.
  4. 제 3항에 있어서, (2) 단계의 상기 리소스타핀 발현은 유도(inducive) 발현인 것을 특징으로 하는, 대장균에서 리소스타핀의 분비 발현 방법.
  5. 제 1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 대장균에서의 발현을 위한 벡터인 것을 특징으로 하는, 대장균에서 리소스타핀의 분비 발현 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 대장균에서의 발현을 위한 벡터는 pUC 시리즈, pET 시리즈 또는 pGEX 중 하나인 것을 특징으로 하는, 대장균에서 리소스타핀의 분비 발현 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 대장균에서의 발현을 위한 벡터는 pBV220인 것을 특징으로 하는, 대장균에서 리소스타핀의 분비 발현 방법.
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