ES2314978T3 - Canales de sodio especificos del sistema ner5vioso periferico, dna que los codifica, exploracion de farmacos y metodos para obtenerlos y usarlos. - Google Patents

Abstract

SE FACILITAN VECTORES DE SUMINISTRO, VIRALES, DE EXPRESION Y DE CLONADO ASI COMO RECEPTORES QUE CONTIENE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA AL MENOS UN PEPTIDO DE CANAL DE SODIO (SCP) ESPECIFICO DEL SISTEMA NERVIOSO PERIFERICO (PNS), PNS Y SCP AISLADOS, Y COMPUESTOS, COMPOSICIONES Y METODOS PARA AISLAR, CRISTALIZAR, MODELAR DE FORMA MOLECULAR EL ANALISIS POR RAYOS-X, EL DISEÑO DE MEDICAMENTOS RACIONAL, LA SELECCION, CONSTRUCCION Y UTILIZACION DE AGENTES TERAPEUTICOS O DIAGNOSTICOS O LIGANTES QUE TIENEN AL MENOS UNA ACTIVIDAD MODULADORA DEL CANAL DE SODIO (SC) ESPECIFICA DEL SISTEMA NERVIOSO PERIFERICO.

Description

Canales de sodio específicos del sistema nervioso periférico, DNA que los codifica, exploración de fármacos y métodos para obtenerlos y usarlos.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud es una continuación en parte de la Solicitud de EE.UU. nº 08/482.401, presentada el 7 junio de 1995, que es una continuación en parte de la Solicitud de EE.UU. nº 08/334.029, presentada el 2 noviembre de 1994, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

Declaración relativa a los derechos sobre inventos realizados bajo investigación y desarrollo federalmente patrocinados

El presente invento se realizó con apoyo del Gobierno de EE.UU. Por lo tanto, el Gobierno de EE.UU. posee ciertos derechos sobre el invento.

Campo del invento

El presente invento está en los campos de la biotecnología, la purificación y cristalización de proteínas, el análisis por difracción de rayos X, el modelado molecular tridimensional por ordenador, y el diseño racional de fármacos (RDD; del inglés, rational drug design). El invento se dirige a proteínas del canal de sodio (SCPs; del inglés, sodium channel proteins) aisladas, específicas del sistema nervioso periférico (PNS; del inglés, peripheral nervous system), y al ácido nucleico codificador. También se describen compuestos, composiciones y métodos para seleccionar, crear y utilizar agentes terapéuticos o diagnósticos que tienen actividad moduladora del canal de sodio. También se describe el modelado informático tridimensional de las SCP del PNS, y el RDD, basándose en el uso de datos de rayos X y/o datos de secuencias de aminoácidos presentes en medios informáticamente legibles.

Antecedentes del invento

Los canales iónicos sensibles al voltaje son una clase de proteínas transmembranales que proporcionan una base para la excitabilidad celular, en cuanto a la capacidad para transmitir información a través de potenciales de membrana iónicamente generados. En respuesta a cambios en los potenciales de membrana, estas moléculas medían en un rápido flujo de iones a través de poros muy selectivos de la membrana de una célula nerviosa. Si la densidad de canales es bastante elevada, resulta una adecuada despolarización regenerativa, denominada "potencial de acción".

A menudo, el canal de sodio sensible al voltaje es el canal iónico más responsable de la generación del potencial de acción en células excitables. Aunque los potenciales de acción basados en sodio parecen similares en diferentes tejidos excitables [B. Hille en Ionic Channels of Excitable Membranes, redactado por B. Hille, Sinauer, Sunderland, Massachusetts, EE.UU. (1984), página 70-71], estudios electrofisiológicos recientes indican que los canales de sodio de células diferentes difieren tanto en sus propiedades estructurales como en sus propiedades funcionales, y se han identificado ahora muchos canales de sodio con distintas estructuras primarias. Véase, por ejemplo, Mandel, J. Membrane Biol. 125:193-205 (1992).

Se han descrito canales de sodio funcionalmente distintos en una diversidad de tipos de células neuronales [Llinas et al., J. Physiol. 305:197-213 (1980); Kostyuk et al., Neuroscience 6: 2423-2430 (1981); Bossu et al., Neurosci. Lett. 51: 241-246 (1984); Gilly et al., Nature 309: 448-450 (1984); French et al., Neurosci. Lett. 56: 289-294 (1985); Ikeda et al., J. Neurophysiol. 55: 527-539 (1986); Jones et al., J. Physiol. 389: 605-627 (1987); Alonso y Llinas, 1989; y Gilly et al., J. Neurosci. 9: 1362-1374 (1989)] y en el músculo esquelético [Gonoi et al., J. Neurosci. 5: 2559-2564 (1985); y Weiss et al., Science 233: 361-364 (1986)]. También se puede distinguir la cinética de las corrientes de sodio en células gliales y neuronas [Barres et al., Neuron 2: 1375-1388 (1989)].

Los genes de tipo II y tipo III, muy expresados en el sistema nervioso central (CNS; del inglés, central nervous system), se expresan con niveles muy bajos en algunas células del PNS [S. Beckh, FEBS Lett. 262: 317-322 (1990)]. Los mRNAs de los tipos II y III apenas eran detectables, mediante análisis por transferencia Northern, en el ganglio de la raíz dorsal (DRG; del inglés, dorsal root ganglion), nervios craneales y nervios ciáticos. Por otro lado, el mRNA de tipo I estaba presente en cantidades moderadamente elevadas en el DRG y el nervio craneal, pero en bajos niveles en el nervio ciático. Una comparación de la cantidad de los tres mRNAs del cerebro, con respecto al mRNA total del canal de sodio detectado con una sonda de cDNA conservada, sugirió la presencia de tipos de canal de sodio adicionales, hasta ahora no identificados, en neuronas del DRG. Consistentemente con los estudios sobre mRNA, estudios inmunoquímicos mostraron que ni las subunidades alfa del canal de sodio de tipo I ni las del tipo II representan un componente significativo de los canales de sodio totales en el ganglio cervical superior o el nervio ciático [Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8682-8686 (1987)].

En el DRG de vertebrados se ha identificado electrofisiológicamente una población de neuronas que contiene, además de los canales más convencionales, un tipo distinto de canal de sodio; este canal del DRG tiene para TTX una k_{D} aproximadamente 10 veces mayor que la k_{D} de los canales de sodio en el músculo esquelético o el corazón [Jones et al., J. Physiol. 389: 605-627 (1987)].

La localización de canales de sodio diferentes en regiones específicas del sistema nervioso apoya la posibilidad de que la regulación celularmente específica de esta familia génica es a nivel transcripcional. Por analogía con otros genes eucarióticos, pueden estar presentes elementos de DNA distintos que medien en la regulación celularmente específica y temporal de genes del canal de sodio individuales.

Los estudios de la regulación génica del canal de sodio han sido facilitados por el uso de líneas celulares bien caracterizadas, tales como células de feocromocitoma (PC12), un popular modelo celular para la diferenciación neuronal [Green et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 2424-2428 (1976); y Halegoua et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 165: 119-170 (1991)]. Además de extender neuritas e iniciar la síntesis de ciertos neurotransmisores, las células PC12 tratadas con factor de crecimiento nervioso (NGF; del inglés, nerve growth factor) adquieren la capacidad para generar potenciales de acción basados en sodio [Dichter et al., Nature 268: 501-504 (1977)]. Esta capacidad es conferida por un aumento de la densidad de canales de sodio funcionales en las membranas de las células tratadas con NGF [Rudy et al., J. Neurosci. 7: 1613-1625 (1987); Mandel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 924-928 (1988); y O'Lague et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1701-1705 (1980)]. Un análisis por transferencia Northern reveló que las células PC12 indiferenciadas contenían un nivel basal de mRNA de canal de sodio que aumentaba coincidentemente con el aumento de actividad del canal observado después del tratamiento con NGF [Mandel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 924-928 (1988)].

Existe la antigua necesidad de diagnosticar y/o tratar patologías relativas a una conducción nerviosa alterada en el sistema nervioso periférico (PNS), asociada con una lesión en el PNS o con estados genéticos u otros estados morbosos, tales como aquellos en que están implicados faltas o defectos en los canales de sodio (SCs) del PNS. A la vista de la posibilidad de canales de sodio celular o tisularmente específicos, el descubrimiento y el uso de SCs del PNS aislados y del ácido nucleico codificador proporcionaría una oportunidad para diagnosticar o tratar tales patologías mediante la exploración de adecuados fármacos o moléculas (por ejemplo, analgésicos) moduladores de SCs del PNS o mediante el uso de SCs del PNS recombinantes para terapia génica in situ o in vivo, para sustituir o complementar SCs del PNS en al menos una porción del sistema nervioso periférico de un paciente mamífero que padece una patología relacionada con SCs del PNS.

Y. Oh et al., "The beta 1 subunit mRNA of the rat brain Na+ channel is expressed in glial cells", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA (PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A), 1994, 91/21 (9985-9989), discuten la expresión de mRNA para la subunidad \beta1 del canal de Na+ de cerebro de rata en células gliales.

Y. Oh et al., "Rat brain Na+ channel mRNAs in non-excitable Schwann cells", FEBS LETTERS (FEBS LETT.), 1994, 350/2-3 (342-346), discuten la expresión de mRNAs de los subtipos II y III (pero no del subtipo I) del canal de Na+ de cerebro de rata en células de Schwann de nervios ciáticos.

S. Beckh, "Differential expression of sodium channel mRNAs in rat peripheral nervous system and innervated tissues", FEBS LETTERS (FEBS LETT.), 1990, 262/2 (317-322), describe análisis de hibridación por transferencia de RNA usando sondas para los canales I, II y III de sodio en tejidos del sistema nervioso periférico.

S. Gautron et al., "The glial voltage-gated sodium channel: Cell- and tissue-specific mRNA expression", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES AND THE UNITED STATES OF AMERICA (PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A.), 1992, 89/15 (7272-7276), describen el aislamiento de un cDNA que codifica la porción C-terminal de una supuesta subunidad \alpha del canal de Na glial.

En el Documento US 4500530 se describe el uso de lidoflazina en la inhibición de la entrada de Ca++ extracelular en glóbulos rojos.

Sumario del invento

El presente invento (en adelante, el "invento") proporciona péptidos del canal de sodio (SCPs) específicos del sistema nervioso periférico (PNS), ácido nucleico codificador, vectores, células huésped y anticuerpos, así como métodos para preparar y usar los mismos, incluyendo la expresión recombinante, la purificación, y la exploración de fármacos basada en células. También se describe terapia génica, cristalización y análisis por difracción de rayos X, así como la determinación de la estructura por ordenador y el diseño racional de fármacos utilizando al menos un dato de secuencia de aminoácidos y/o difracción de rayos X de SCP de PNS proporcionado en medios informáticamente legibles.

El presente invento proporciona polipéptidos y polinucleótidos del canal de sodio del sistema nervioso periférico, como se definen en las reivindicaciones adjuntas. El invento también incluye sondas oligonucleotídicas específicas para secuencias que codifican SCPs del PNS, así como métodos para la detección en una muestra en los que la sonda está marcada. El invento incluye además métodos para producir una SCP de PNS, que comprenden cultivar un huésped en un medio de cultivo que comprende un ácido nucleico de SCP de PNS, y aislar el SCP de PNS de dicho huésped o de dicho medio de cultivo.

El invento incluye además un anticuerpo que se une a un epítopo específico para una SCP de PNS, así como células huésped que expresan el anticuerpo. También se describen métodos diagnósticos o terapéuticos en los que se utiliza el anticuerpo.

El invento incluye además vectores de distribución para terapia génica que comprenden un ácido nucleico que codifica, o es complementario de, al menos una SCP de PNS, y composiciones farmacéuticamente aceptables de los mismos.

También se describe una terapia génica mediante métodos con los que se administra un ácido nucleico antisentido de SCP de PNS a un animal en una cantidad eficaz para proporcionar un efecto modulador del SC de PNS, tal como un efecto analgésico.

También se describen métodos para purificar y cristalizar una SCP de PNS que puede ser analizada para obtener patrones de difracción de rayos X con una resolución suficientemente elevada para que sean útiles para el modelado molecular tridimensional de la proteína. Los datos de difracción de rayos X, las coordenadas atómicas y/o las secuencias de aminoácidos proporcionadas en un medio legible por ordenador se modelan en sistemas informáticos, utilizando métodos del invento, para generar estructuras secundarias, terciarias y/o cuaternarias de una SCP de PNS, estructuras que contribuyen a su estructura tridimensional global, así como sitios ligantes y activos de la SCP de PNS.

También se describen aquí métodos para modelado molecular y sistemas informáticos para el diseño racional de fármacos (RDD). En estos métodos para diseño de fármacos se usarán programas informáticos de modelado para hallar posibles ligandos o agentes que son calculados para que se unan a sitios o dominios de la SCP de PNS. Los posibles ligandos o agentes son luego explorados en cuanto a su actividad moduladora o ligante. Dichos métodos de exploración pueden ser seleccionados a partir de ensayos para al menos una actividad biológica de la proteína, según se asocia con una patología o trauma relacionado con SCPs de PNS, de acuerdo con ensayos del canal de sodio conocidos. Los ligandos resultantes proporcionados por los métodos del presente invento son sintetizados y son útiles para tratar, inhibir o prevenir en un mamífero al menos una patología o trauma relacionado con SCPs de PNS.

Otros objetos, características, utilidades, realizaciones y/o ventajas del presente invento resultarán evidentes a partir de la descripción adicional aquí proporcionada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa una secuencia de 323 aminoácidos y la correspondiente secuencia de 969 nucleótidos de una SCP de PNS, como los aminoácidos 233-555 de la ID. SEC. nº 2 y los nucleótidos 699-1665 de la ID. SEC. nº 1, como estructura primaria del Dominio III de la subunidad alfa del canal de sodio de nervio periférico de tipo 1 (PN1; del inglés, peripheral nerve type 1) tanto para la secuencia de aminoácidos como para la secuencia de DNA. Se utiliza el código de aminoácidos sencillo para indicar los aminoácidos deducidos. YJ1 y YOIC se refieren a los cebadores oligonucleotídicos utilizados para obtener el fragmento inicial de PCR del cDNA de PN1.

Las Figuras 2A-B muestran un análisis por transferencia Northern del mRNA de la subunidad \alpha del canal de sodio en células de feocromocitoma (PC12) de rata tratadas con factor de crecimiento nervioso. En la Figura 2(A), la sonda utilizada es pRB211, que codifica el cuarto dominio repetido muy conservado del canal de sodio de tipo II de rata. Con estas sondas se detectan mRNAs tanto de tipo H como de PN1. En la Figura 2(B), la sonda utilizada contiene secuencias específicas para PN1. Los niveles de mRNA del canal de sodio son cuantificados con respecto a la cantidad de mRNA de ciclofilina, según se indica. Las células testigo son células PC 12 cultivadas en ausencia de NGF.

Las Figuras 3A-B muestran un ejemplo de distribución tisularmente específica de mRNA de PN1. La Figura 3(A) presenta un análisis por transferencia Northern utilizando cantidades iguales de RNA de tejidos. El mRNA de PN1 se indica mediante el guión. 28S se refiere al rRNA 28S. La sonda contiene secuencias específicas para el gen PN1. Adviértase la ausencia de mRNA de PN1 en el músculo esquelético y el músculo cardíaco y los bajos niveles de mRNA de PN1 en la médula espinal. La Figura 3(B) muestra un análisis de protección del mRNA de PN1 frente a RNasa. PH1 se refiere a la sonda PN1 protegida por mRNA de las diferentes muestras tisulares. Actina se refiere a secuencias de la sonda de actina protegidas por el mismo mRNA.

Las Figuras 4A-F muestran la localización de mRNA de PN1 en tejidos del ganglio cervical superior (SCG; del inglés, superior cervical ganglion) y del ganglio de la raíz dorsal (DRG) mediante un análisis de hibridación in situ. Las Figuras 4A-4B representan neuronas hibridadas con una sonda de RNA antisentido específica para PN1. Las Figuras 4C-4D representan neuronas hibridadas con la sonda de PN1 radiomarcada, en presencia de DNA competidor de PN1 no marcado. Las Figuras 4E-4F representan cortes tisulares hibridados con una sonda de tipo II antisentido.

La Figura 5 muestra un análisis por transferencia en que se comparan niveles de mRNA de subunidad \alpha de tipo I de PN1 y cerebro en SCG. La sonda de canal de sodio conservada pRB11 detecta transcritos tanto de tipo II/IIA como de PN1.

Las Figuras 6A-B muestran un análisis por transferencia Northern que revela la expresión diferencial de mRNAs del canal de sodio de PN1 y de tipo I durante el desarrollo posnatal de ratas. La Figura 6(A) muestra un autorradiograma representativo de una transferencia Northern en que, como sonda, se usa RNA antisentido radiomarcado de pRB211. Se muestran los días posnatales 7 (P7) a 42 (P42). La Figura 6(B) muestra un gráfico de cuantificación de las transferencias Northern que muestra una disminución de mRNA de tipo I con el tiempo después del nacimiento.

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Las Figuras 7A-D muestran la deducida estructura primaria de una porción clonada de cDNA de la subunidad \alpha de PN1 como una secuencia parcial de 3033 nucleótidos (ID. SEC. nº 1) y una secuencia parcial de 1011 aminoácidos (ID. SEC. nº 2).

Las Figuras 8A-D muestran una comparación de secuencias primarias deducidas de aminoácidos de PN1 (1-988 de la ID. SEC. nº 2) y de la subunidad \alpha de tipo II/IIA de cerebro (ID. SEC. nº 7). También se muestra una secuencia de consenso (ID. SEC. nº 8).

Las Figuras 9A-D muestran la secuencia completa de DNA para una SCP de PNS de PN1 de rata (ID. SEC. nº 9).

La Figura 10 muestra la secuencia completa de aminoácidos para una SCP de PNS de PN1 de rata (ID. SEC. nº 10).

Las Figuras 11A-11E muestran secuencias de aminoácidos para PN1 de rata ("RATPN1") (ID. SEC. nº 10) y dos esperadas secuencias de PN1 humanas: "HUMPN1A" (ID. SEC. nº 11), "HUMPN1B" (ID. SEC. nº 16), "HUMPN1C" (ID. SEC. nº 15) y "HUMPN1D" (ID. SEC. nº 12). Secuencias alternativas incluyen aquellas en que "X" es 0, 1, 2 ó 3 de los mismos o diferentes aminoácidos, que se pueden seleccionar opcionalmente de la Tabla 1 o la Tabla 2.

La Figura 12 muestra un sistema informático adecuado para la determinación de estructuras tridimensionales y/o el diseño racional de fármacos.

Las Figuras 13A-B muestran una secuencia de DNA representativa que codifica un PN1 humano (HUMPN1A; ID. SEC. nº 13).

Las Figuras 14A-B muestran una secuencia de DNA representativa que codifica un PN1 humano (HUMPN1B; ID. SEC. nº 14).

Descripción detallada del invento

Existe la necesidad de modular la actividad de al menos un canal de sodio (SC) específico del sistema nervioso periférico (PNS). Dicha modulación podría proporcionar posiblemente agentes analgésicos o diagnósticos para el dolor o patologías asociadas con la conducción nerviosa en el PNS.

Se han descubierto ahora que ciertos canales de sodio, que corresponden a SCPs del PNS del invento, se expresan preferente o selectivamente en el sistema nervioso periférico (PNS). Estos canales de sodio modulan preferentemente la conducción de impulsos nerviosos periféricos en el PNS. El presente invento proporciona péptidos de canal de sodio (SCPs) específicos del sistema nervioso periférico (PNS), ácido nucleico codificador, vectores, células huésped y anticuerpos, así como métodos para preparar y utilizar los mismos, incluyendo la expresión recombinante, la purificación y la exploración de fármacos basada en células. También se describe terapia génica, cristalización y análisis por difracción de rayos X, así como la determinación de la estructura por ordenador y el diseño racional de fármacos utilizando al menos un dato de secuencia de aminoácidos y/o difracción de rayos X de SCP de PNS proporcionado en medios informáticamente legibles.

Los SCPs de PNS del invento son como se definen en las reivindicaciones adjuntas. También se describen aquí péptidos de canal de sodio del PNS (SCP de PNS), tal como, por ejemplo, un subconjunto de canales de sodio (SC) de PNS que tienen actividad SC, como un fragmento, secuencia de consenso o unidad de repetición. Se puede preparar un SCP de PNS del invento mediante:

(a)

métodos de DNA recombinante;

(b)

digestión proteolítica de la molécula intacta o de un fragmento de la misma;

(c)

métodos químicos de síntesis peptídica bien conocidos en la técnica; y/o

(d)

cualquier otro método capaz de producir un SCP de PNS que tenga una conformación similar a una porción activa de un SCP de PNS y que tenga actividad SC. La actividad SC puede ser explorada de acuerdo con ensayos de exploración conocidos para actividad de canal de sodio, in vitro, in situ o in vivo. Como aquí se describe, la secuencia peptídica mínima que tiene actividad se basa en la unidad más pequeña que contiene o comprende una particular región, dominio, secuencia de consenso o unidad de repetición de los mismos, de al menos una SCP de PNS.

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Como aquí se describe, una SCP de PNS incluye una asociación de dos o más dominios polipeptídicos, tales como dominios transmembranales, de revestimiento de poro o fragmentos de los mismos, que corresponden a una SCP de PNS, tal como 1-40 dominios o cualquier intervalo o valor incluido en este intervalo. Los dominios transmembranales, citoplásmicos, de revestimiento de poro u otros dominios de una SCP de PNS del invento pueden tener al menos un 74% de homología, tal como un 74-100% de homología o identidad global, o cualquier intervalo o valor incluido en este intervalo, con respecto a uno o más dominios de SC correspondientes como los aquí descritos (por ejemplo, cómo se presentan en las Figuras 1, 7, 8, 10 y 11). Como entenderá quien tiene una experiencia normal en la técnica, la anterior configuración de dominios se proporciona como parte de una SCP de PNS del invento, de modo que una SCP de PNS funcional, cuando se exprese en una célula adecuada, sea capaz de transportar iones sodio a través de una bicapa lipídica, una membrana celular o un modelo de membrana. En células intactas que tienen suficientes canales de sodio, la célula puede ser capaz de generar alguna forma de un potencial de acción, tal como en una célula que expresa al menos una SCP de PNS del presente invento. Dicho transporte, según se mide mediante ensayos de actividad SC adecuados, establece la actividad SC de una o más SCPs de PNS del invento.

Una SCP de PNS del invento tiene al menos un 90% de identidad con respecto a la Figura 7 (secuencia de aminoácidos). La SCP de PNS del invento puede tener un 90-99, 91-99, 92-99, 93-99, 94-99, 95-99, 96-99, 97-99 o 98-99% de identidad. También se describen aquí péptidos que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de SC que corresponde sustancialmente a al menos un fragmento de 20 a 2005 aminoácidos y/o una secuencia de consenso de una SCP de PNS o un grupo de SCPs de PNS, en que la SCP de PNS tiene una homología o identidad de al menos 74-99%, tal como una homología de 88-99% (o cualquier intervalo o valor de dicho intervalo, tal como, por ejemplo, 87-99, 88-99 o 89-99), con respecto a al menos una secuencia o secuencia de consenso de las Figuras 1, 7, 8, 10 y 11. Las SCPs de PNS del invento mantienen la actividad SC biológica. Se prefiere que una SCP de PNS del invento no se encuentre en la naturaleza o que se encuentre en la naturaleza pero en una forma purificada o aislada que no se encuentra en la naturaleza. Como aquí se describe, una SCP de PNS corresponde sustancialmente a un conjunto de dominios de PN1, que tienen al menos 10 aminoácidos contiguos de las Figuras 1, 7, 8, 10 y 11, o al menos un 74% de homología con respecto a los mismos.

También se describe aquí una SCP de PNS que puede comprender al menos un dominio que corresponde a dominios de canal de sodio conocidos, tales como dominios de SC de cerebro o médula espinal de rata, tales como dominios transmembranales, dominios de revestimiento de poro, dominios citoplásmicos o dominios extracelulares, tales como IIs6 [por ejemplo, 1-3 a 14-17 (IIs6), 18-23 a 210-214 (citoplásmico), 229-236 a 254-258 (IIIs1), 268-272 a 293-297 (IIIs2), 300-304 a 321-325 (IIIs3), 326-330 a 347-351 (IIIs4), 368-374 a 389-393 (IIIs5), 474-478 a 500-504 (IIIs6), 553-559 a 577-583 (IVs1), 589-593 a 611-615 (IVs2), 619-623 a 642-646 (IVs3), 654-658 a 678-682 (IVs4), 690-694 a 711-715 (IVs5), 779-783 a 801-805 (IVs6), 348-352 a 368-372, 501-505 a 550-554, 233-553, 676-678 a 689-693, 554-557 a 941-945, o cualquier intervalo o valor de dichos intervalos], que corresponden a la ID. SEC. nº 2 como se presenta en la Figura 7A-7D o a variantes de la misma como las sustituciones presentadas en la Tabla 1 o la Tabla 2, que tienen una homología global de 74-100% o cualquier intervalo o valor de dicho intervalo. Al menos uno de dichos dominios está presente en las SCPs de PNS presentadas en la Figura 11A-E, o fragmentos del mismo. También se codifican dominios alternativos por DNA que se hibrida bajo condiciones rigurosas con al menos 30 nucleótidos contiguos de las Figuras 1, 7, 9, 13 y 14, o que tiene codones sustituidos que codifican el mismo aminoácido que un codón particular. Además, como reconocerán los expertos en la técnica, también se consideran dominios de fosforilación (por ejemplo, PKA y PKC) cuando se proporciona una SCP de PNS o un ácido nucleico codificador como los aquí descritos.

El porcentaje de homología o identidad puede ser determinado, por ejemplo, comparando información sobre secuencias utilizando el programa informático GAP, versión 6.0, asequible del University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch [J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), del modo revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]. En resumen, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y de 0 para las no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids. Res. 14: 6745 (1986), como describen Schwartz y Dayhoff, redactores, ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, páginas 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,3 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo de cada hueco; y (3) sin penalización para los huecos finales. En un caso, el péptido de la descripción corresponde a una porción biológicamente activa de SC de la ID. SEC. nº 2, o una variante de la misma, como se presenta, por ejemplo, en la Figura 11A-D.

De esta manera, quien tiene una experiencia normal en la técnica, dadas las enseñanzas y la orientación presentadas en la presente memoria descriptiva, sabrá cómo añadir, suprimir o sustituir otros restos de aminoácido en otras posiciones de un SC para obtener una SCP de PNS, incluyendo variantes sustituidas, suprimidas o adicionales, por ejemplo, con una sustitución como la presentada más adelante en las Tablas 1 y 2.

Una SCP de PNS aquí descrita también incluye una variante en que al menos un resto de aminoácido del péptido ha sido conservativamente sustituido, añadido o suprimido por al menos un aminoácido diferente. Para una descripción detallada de la química y la estructura de proteínas, véanse, por ejemplo, Schultz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, EE.UU., 1978, y T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, EE.UU., 1983, que se incorporan aquí por referencia. Para una presentación de sustituciones en secuencias de nucleótidos, tales como las preferencias de codones, véanse Ausubel et al., redactores, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., New York, EE.UU. (1987, 1992, 1993, 1994, 1995), párrafos A.1.1-A.1.24, y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU. (1989), apéndices C y D.

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Las sustituciones conservativas de una SCP de PNS del invento incluyen una variante en que al menos un resto de aminoácido del péptido ha sido conservativamente sustituido, añadido o suprimido por al menos un aminoácido diferente. Dichas sustituciones se realizan preferiblemente de acuerdo con la siguiente lista presentada en la Tabla 1, sustituciones que pueden ser determinadas mediante una experimentación rutinaria para obtener unas propiedades estructurales y funcionales modificadas de una molécula peptídica sintetizada mientras se mantiene la actividad SC biológica, según se determina mediante ensayos de actividad SC conocidos. En el contexto del invento, las expresiones "SCP de PNS" y "que corresponde sustancialmente a" incluyen dicha sustituciones.

TABLA 1

1

Alternativamente, otro grupo de sustituciones de SCPs de PNS del invento son aquellas en que se ha eliminado al menos un resto de aminoácido de la molécula proteica y se ha añadido en su lugar un resto diferente de acuerdo con la Tabla 2 siguiente. Los tipos de sustituciones que pueden realizarse en la molécula proteica o peptídica del invento se pueden basar en el análisis de las frecuencias de cambios de aminoácidos entre una proteína homóloga de especies diferentes, tales como los presentados en las Tablas 1-2 de Schultz et al., infra. Basándose en dicho análisis, las sustituciones conservativas alternativas se definen aquí como cambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes:

TABLA 2

2

La mayoría de las supresiones, adiciones y sustituciones de acuerdo con el invento son aquellas que no producen cambios radicales en las características de la molécula proteica o peptídica. "Características" se define de un modo no inclusivo para definir tanto cambios en la estructura secundaria, por ejemplo, en la hélice \alpha o la lámina \beta, como cambios en la actividad fisiológica, por ejemplo, en ensayos de unión a receptores.

En consecuencia, basándose en los anteriores ejemplos de sustituciones específicas, se pueden hacer sustituciones alternativas mediante una experimentación rutinaria para proporcionar SCPs de PNS alternativas del invento, tal como, por ejemplo, haciendo una o más sustituciones conservativas de fragmentos de SC que proporcionen actividad SC. Sin embargo, cuando se ha de confirmar el efecto exacto de la sustitución, supresión o adición, un experto en la técnica apreciará que el efecto de al menos una sustitución, adición o supresión será evaluado mediante al menos un ensayo de exploración de actividad de canal de sodio, tal como, pero sin limitarse a, inmunoensayos o bioensayos, para confirmar la actividad biológica, tal como, pero sin limitarse a, la actividad de canal de sodio.

También se pueden preparar variantes de secuencias de aminoácidos de una SCP de PNS del invento mediante mutaciones en el DNA. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, supresiones, adiciones o sustituciones de restos en la secuencia de aminoácidos. Para llegar a la construcción final, se puede hacer cualquier combinación de supresión, adición y sustitución con tal de que la construcción final posea cierta actividad SC. Preferiblemente, se encuentra una actividad SC mejorada con respecto a la del péptido no variante. Obviamente, las mutaciones que se realicen en el DNA que codifica la variante no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura ni crearán preferiblemente regiones complementarias que puedan producir una estructura de mRNA secundaria (véanse, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente EP nº 75.444; Ausubel, infra; y Sambrook, infra). A nivel genético, estas variantes se preparan normalmente por mutagénesis, dirigida al sitio, de nucleótidos del DNA que codifica una SCP de PNS, produciendo por ello el DNA que codifica la variante, y haciendo luego que se exprese el DNA en un cultivo celular recombinante. Estas variantes presentan típicamente la misma actividad biológica cualitativa que el SC presente en la naturaleza (véanse, por ejemplo, Ausubel, infra; y Sambrook, infra).

Una vez que se ha determinado una estructura o unas características de canal de sodio de PNS, se pueden producir recombinante o sintéticamente SCPs de PNS, y opcionalmente se pueden purificar, para proporcionar cantidades comercialmente útiles de SCPs de PNS para uso en aplicaciones de diagnóstico o investigación, de acuerdo con operaciones metódicas conocidas (véanse, por ejemplo, Ausubel, infra; y Sambrook, infra; referencias que se incorporan aquí en su totalidad por referencia).

Para obtener una SCP de PNS aislada del invento, se puede utilizar una diversidad de metodologías conocidas en la técnica. En una realización, el péptido se purifica a partir de tejidos o células que producen naturalmente el péptido. Alternativamente, los anteriormente descritos fragmentos de ácido nucleico aislados podrían ser utilizados para que se expresara la proteína SCP de PNS en cualquier organismo. Las muestras del invento incluyen células, extractos proteínicos o extractos membranales de células, y fluidos biológicos. La muestra variará dependiendo del formato de ensayo, el método de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos utilizados como muestra.

Las células y/o tejidos pueden incluir, por ejemplo, células o tejidos animales normales o patológicos, tales como el sistema nervioso periférico, y extractos o cultivos celulares de los mismos, proporcionados in vivo, in situ o in vitro, como células y/o tejidos cultivados, sometidos a pasajes, no sometidos a pasajes, transformados, recombinantes o aislados.

Cualquier organismo eucariótico superior puede ser usado como fuente de al menos una SCI de PNS o SCP de PNS del invento con tal de que el organismo fuente contenga naturalmente dicho péptido. Como se utiliza aquí, "organismo fuente" se refiere al organismo original del cual procede la secuencia de aminoácidos del péptido, independientemente del organismo en que se expresa el péptido y/o del que se aísle finalmente el péptido. Los organismos preferidos como fuentes de al menos una SCI de PNS o del ácido nucleico codificador pueden ser cualquier animal vertebrado, tales como mamíferos, aves, peces óseos, anguilas eléctricas, ranas y sapos. Entre los mamíferos, los receptores preferidos son mamíferos de los órdenes Primata (incluyendo seres humanos, simios y monos), Artiodactyla (incluyendo caballos, cabras, vacas, ovejas y cerdos), Rodentia (incluyendo ratones, ratas, conejos y hámsteres) y Carnivora (incluyendo gatos y perros). Los organismos fuente más preferidos son los seres humanos.

Un experto en la técnica puede seguir fácilmente métodos conocidos para aislar proteínas con objeto de obtener el péptido libre de contaminantes naturales. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a: inmunocromatografía, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de alta eficacia en fase líquida (HPLC; del inglés, high performance liquid chromatography), cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de inmunoafinidad. Véanse, por ejemplo, Ausubel, infra; y Sambrook, infra; y Colligan, infra.

Moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican péptidos SCP de PNS

En una realización, el presente invento se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a nuevos SCPs de PNS como los definidos en las reivindicaciones adjuntas. También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos de SCP de PNS con una identidad u homología global superior al 70% con respecto a al menos una secuencia de 60 nucleótidos presente en la ID. SEC. nº 1 (preferiblemente superior al 80%, más preferiblemente superior al 90%, tal como 70-99% o cualquier intervalo o valor incluido en dicho intervalo). En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos de SCP de PNS que corresponde a la Figura 7. También se describen aquí secuencias de nucleótidos que codifican al menos un dominio de las Figuras 1, 7, 8, 10 y 11.

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Dentro del alcance de este invento también se incluyen los equivalentes funcionales de las aquí descritas moléculas de ácido nucleico aisladas y derivados de las mismas en la medida en que queden abarcados por la reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, cómo se presentó anteriormente para las secuencias de aminoácidos de SCP de PNS, las secuencias de ácido nucleico representadas en la ID. SEC. nº 1 pueden ser alteradas mediante sustituciones, adiciones o supresiones que proporcionen moléculas funcionalmente equivalentes. A causa de la degeneración de las secuencias de codificación nucleotídicas, en la práctica del invento se pueden utilizar otras secuencias de DNA que codifiquen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos de una SCP de PNS. Se describen aquí secuencias de ácido nucleico que codifican todas, o porciones de, las secuencias de aminoácidos de SCP de PNS de las Figuras 1, 8, 10 y 11, que están alteradas mediante la sustitución de diferentes codones que codifican un resto de aminoácido funcionalmente equivalente dentro de la secuencia, produciéndose de este modo un cambio silente.

Dichas alteraciones funcionales de una secuencia de ácido nucleico dada proporcionan una oportunidad para promover la secreción y/o el procesamiento de proteínas heterólogas codificadas por secuencias de ácido nucleico extrañas fusionadas con ella. Por lo tanto, todas las variaciones de la secuencia de nucleótidos del gen SCP de PNS permitidas por el código genético están incluidas en este invento en la medida en que están abarcadas por las reivindicaciones adjuntas. Véanse, por ejemplo, Ausubel, infra; y Sambrook, infra. También se describen fragmentos de la SCP de PNS.

Además, la secuencia de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que resulte de la adición, supresión o sustitución de al menos un nucleótido en el extremo 5' y/o el extremo 3' de una secuencia de ácido nucleico que corresponda a la Figura 7. También se describen aquí secuencias de ácido nucleico que codifican al menos una porción de las Figuras 1, 8, 10 y 11, o una variante de la misma. A este respecto, se puede utilizar cualquier nucleótido o polinucleótido con tal de que su adición, supresión o sustitución no elimine la actividad de canal de sodio que es codificada por la secuencia de nucleótidos. Además, la molécula de ácido nucleico del invento puede tener, según sea necesario, sitios de reconocimiento por endonucleasas de restricción que no eliminen la actividad de la SCP de PNS codificada.

Además, es posible suprimir codones o sustituir uno o más codones por codones distintos de los codones degenerados, para producir un péptido estructuralmente modificado, pero uno que tenga sustancialmente la misma utilidad o actividad que el péptido producido por la molécula de ácido nucleico no modificada. Como se reconoce en la técnica, los dos péptidos son funcionalmente equivalentes, como lo son las dos moléculas de ácido nucleico que dan lugar a su producción, aun cuando las diferencias entre las moléculas de ácido nucleico no estén relacionadas con la degeneración del código genético. Véanse, por ejemplo, Ausubel, infra; y Sambrook, infra.

Aislamiento de ácido nucleico

En otro aspecto del presente invento, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican péptidos que tienen secuencias de aminoácidos que corresponden a una SCP de PNS. En particular, la molécula de ácido nucleico puede ser aislada de una muestra biológica que contiene ácido nucleico de mamífero, como la correspondiente a una sonda específica para un SC de PNS obtenido de un organismo eucariótico superior.

La molécula de ácido nucleico puede ser aislada de una muestra biológica que contiene ácido nucleico usando técnicas conocidas, tales como, pero sin limitarse a, multiplicación con cebadores o clonación de cDNA.

La molécula de ácido nucleico puede ser aislada de una muestra biológica que contiene DNA genómico o de un banco genómico. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células o tejidos animales normales o patológicos, tales como líquido cefalorraquídeo, sistema nervioso periférico (neuronas y ganglios) y porciones, células del corazón, músculo liso, esquelético o cardíaco, sistema nervioso autónomo, y extractos o cultivos celulares de los mismos, proporcionados in vivo, in situ o in vitro, como células y/o tejidos cultivados, sometidos a pasajes, no sometidos a pasajes, transformados, recombinantes o aislados. El método para obtener la muestra biológica variará dependiendo de la naturaleza de la muestra.

Un experto en la técnica se dará cuenta de que un genoma de mamífero puede estar sometido a ligeras variaciones alélicas entre individuos. Por lo tanto, la molécula de ácido nucleico aislada está también destinada a incluir variaciones alélicas, con tal de que la secuencia codifique una SCP de PNS de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas. Cuando un alelo de SCP de PNS no codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a la hallada en la Figura 8, puede ser aislada e identificada como SCP de PNS utilizando las mismas técnicas aquí usadas, y especialmente técnicas de multiplicación de ácido nucleico para multiplicar el gen apropiado con cebadores basándose en la secuencia aquí descrita. Dichas variaciones se presentan, por ejemplo, en la Figura 11 y en las Tablas 1 y 2.

La clonación de cDNAs grandes es igual (por ejemplo, PN1, como una SCP de PNS del invento, incluye clones solapantes de aproximadamente 13 kDa) pero requiere más experimentación rutinaria que la de cDNAs más pequeños. Un método útil se basa en la exploración de bancos de bacteriófagos de cDNA (véase, por ejemplo, Sambrook, infra; o Ausubel, infra). Las sondas para la exploración son marcadas con, por ejemplo, hexámeros aleatorios y enzima de Klenow (sistema Pharmacia). Si no se obtienen cDNAs 5' con estos planteamientos, se puede preparar un sub-banco de cDNA en que se utilicen cebadores de PN1 específicos para cebar la reacción de transcripción inversa en lugar de oligodT o cebadores aleatorios. El sub-banco de cDNA es luego clonado en vectores estándares, tal como lambda zap, y es explorado utilizando técnicas convencionales. Esta estrategia fue utilizada previamente [Noda et al., Nature 320: 188-192 (1986); Noda et al., Nature 322: 826-828 (1986)] para clonar los cDNAs de canales de sodio de tipos I y II de cerebro. La construcción de un cDNA de longitud completa se lleva a cabo subclonando fragmentos solapantes en un vector de expresión (procariótico o eucariótico). Esta tarea es más difícil con cDNAs grandes a causa de la escasez de sitios de restricción únicos, pero se utiliza una restricción, clonación o PCR rutinaria para unir los fragmentos.

Síntesis de ácido nucleico

En las moléculas de ácido nucleico aisladas del presente invento se quieren incluir también las químicamente sintetizadas. Por ejemplo, se puede diseñar una molécula de ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos que codifica el producto de expresión de un gen SCP de PNS y, si es necesario, se puede dividir en fragmentos apropiados más pequeños. Luego se puede sintetizar un oligómero que corresponda a la molécula de ácido nucleico o a cada uno de los fragmentos divididos (por ejemplo, de 10-6015 nucleótidos o de cualquier intervalo o valor de dicho intervalo, tal como 10-100 nucleótidos). Dichos oligonucleótidos sintéticos pueden ser preparados, por ejemplo, mediante técnicas conocidas (Véase, por ejemplo, Ausubel, infra; o Sambrook, infra) o utilizando un sintetizador de DNA automatizado.

Una sonda oligonucleotídica marcada es obtenida sintéticamente o por clonación. Si es necesario, los extremos 5' de los oligómeros pueden ser fosforilados utilizando la polinucleótido cinasa de T4. La fosforilación de cadenas sencillas antes de la hibridación o para marcación puede ser llevada a cabo usando la enzima en exceso. Si la fosforilación es para la marcación de la sonda, el ATP puede contener radioisótopos de elevada actividad específica. El oligómero de DNA puede ser luego sometido a hibridación y ligación con ligasa de T4 o similar.

Una sonda de ácido nucleico para la detección específica de SCP de PNS

En otra realización, el presente invento se refiere a una sonda de ácido nucleico de 15-6000 nucleótidos para la detección específica de la presencia de SCP de PNS en una muestra, que comprende las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas o al menos un fragmento de las mismas que se une bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que codifica al menos una SCP de PNS.

La sonda de ácido nucleico puede ser utilizada para explorar un apropiado banco cromosómico o de cDNA mediante operaciones conocidas de métodos de hibridación, para obtener una molécula de ácido nucleico del invento que codifica SCP de PNS. Se puede preparar un banco de DNA cromosómico o de cDNA a partir de células apropiadas de acuerdo con métodos reconocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Ausubel, infra; y Sambrook, infra).

Alternativamente, se lleva a cabo una síntesis química orgánica para obtener sondas de ácido nucleico que tienen secuencias de nucleótidos que corresponden a porciones adecuadas de la secuencia de aminoácidos de la SCP de PNS. De esta manera, las sondas de ácido nucleico sintetizadas pueden ser utilizadas como cebadores en operaciones metódicas para multiplicación de ácido nucleico.

Por lo tanto, el invento puede proporcionar métodos para la multiplicación de DNA y/o RNA utilizando cebadores nucleotídicos entrecruzados térmicamente estables, cebadores entrecruzados del invento que proporcionan ácidos nucleicos que codifican SCPs de PNS de acuerdo con el invento.

Los métodos de multiplicación de RNA o DNA son bien conocidos en la técnica y pueden ser utilizados de acuerdo con el invento sin una experimentación excesiva basándose en la enseñanza y la orientación aquí presentadas. De acuerdo con el invento, el uso de ácidos nucleicos que codifican porciones de SCPs de PNS de acuerdo con el invento, como cebadores de multiplicación, permite ventajas con respecto a los cebadores de multiplicación conocidos debido al aumento de sensibilidad, selectividad y/o velocidad de multiplicación.

Los métodos conocidos para multiplicación de DNA o RNA incluyen, pero no se limitan a, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction) y procedimientos de multiplicación relacionados (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. números 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159 y 4.965.188, concedidas a Mullis et al.; 4.795.699 y 4.921.794, concedidas a Tabor et al.; 5.142.033, concedida a Innis; 5.122.464, concedida a Wilson et al.; 5.091.310, concedida a Innis; 5.066.584, concedida a Gyllensten et al.; 4.889.818, concedida a Gelfand et al.; 4.994.370, concedida a Silver et al.; 4.766.067, concedida a Biswas; 4.656.134, concedida a Ringold; 5.340.728, concedida a Grosz et al.; 5.322.770, concedida a Gelfand et al.; 5.338.671, concedida a Scalice et al.; PCT WO 92/06200, concedida a Cetus Corp.; y PCT WO 94/14978, concedida a Strack et al., descripciones de patentes que se incorporan aquí por referencia en su totalidad), y multiplicación mediada por RNA, en la que se utiliza RNA antisentido hacia la secuencia diana como molde para la síntesis de DNA de doble cadena (Patente de EE.UU. nº 5.130.238, concedida a Malek et al., con el nombre comercial NASBA), contenidos completos de patentes y referencias que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Mullis [Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986)], Saiki et al. [Bio/Technology 3: 1008-1012 (1985)] y Mullis et al. [Meth. Enzymol. 155: 335-350 (1987)] proporcionan revisiones de la PCR. Un experto en la técnica puede diseñar fácilmente dichas sondas basándose en la secuencia aquí descrita y utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como la alineación informática y el análisis de secuencias. Véanse, por ejemplo, Ausubel, infra; y Sambrook, infra.

Las sondas de hibridación del invento pueden ser marcadas mediante técnicas de marcación estándares, tal como con un radiomarcador, un marcador enzimático, un marcador fluorescente, un marcador de biotina-avidina, quimioluminiscencia, y otros marcadores conocidos y adecuados. Después de la hibridación, las sondas pueden ser visualizadas utilizando métodos conocidos. Las sondas de ácido nucleico del invento incluyen sondas de RNA así como sondas de DNA, sondas que son generadas utilizando técnicas conocidas en este campo técnico (véanse, por ejemplo, Ausubel, infra; y Sambrook, infra). En una realización del método anteriormente descrito, se inmoviliza una sonda de ácido nucleico sobre un soporte sólido. Los ejemplos de dichos soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, plásticos tales como policarbonato, hidratos de carbono complejos tales como agarosa y Sepharose, y resinas acrílicas tales como glóbulos de poliacrilamida y de látex. Las técnicas para copular sondas de ácido nucleico con dichos soportes sólidos son bien conocidas en este campo técnico (véanse, por ejemplo, Ausubel, infra; y Sambrook, infra).

Las muestras de ensayo adecuadas para los métodos de sondeo de ácido nucleico del invento incluyen, por ejemplo, células o extractos de ácido nucleico de células, y fluidos biológicos. La muestra utilizada en los métodos anteriormente descritos variará dependiendo del formato de ensayo, el método de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos que se van a examinar. Los métodos para preparar extractos de ácido nucleico de células son bien conocidos en la técnica y pueden ser fácilmente adaptados con objeto de obtener una muestra que sea compatible con el método utilizado.

Métodos para detectar la presencia de ácido nucleico que codifica SCP de PNS en una muestra biológica

En otra realización, el presente invento se refiere a métodos para detectar la presencia de ácido nucleico que codifica SCP de PNS en una muestra. Dichos métodos pueden comprender (a) poner la muestra en contacto con la sonda de ácido nucleico anteriormente descrita, bajo unas condiciones tales que tenga lugar una hibridación, y (b) detectar la presencia de una sonda marcada unida al ácido nucleico de SCP de PNS. Un experto en la técnica puede seleccionar una adecuada sonda de ácido nucleico marcada, de acuerdo con técnicas conocidas en este campo técnico como las anteriormente descritas. Las muestras que se van a ensayar incluyen, pero no se limitan a, muestras de RNA de tejido de mamífero.

Se ha hallado que la SCP de PNS se expresa en células nerviosas periféricas y células de ganglio de raíz dorsal. En consecuencia, las sondas de SCP de PNS pueden ser utilizadas para detectar la presencia de RNA procedente de células PN en dicha muestra biológica. Además, unos niveles de expresión alterados de RNA de SCP de PNS en un individuo, en comparación con los niveles normales, puede indicar la presencia de una enfermedad. Las sondas de SCP de PNS pueden ser además utilizadas para analizar la actividad celular en general y específicamente en tejido del sistema nervioso periférico.

Un sistema para detectar la presencia de SCP de PNS en una muestra

También se describe un sistema para detectar la presencia de SCP de PNS en una muestra, que comprende al menos un recipiente en el que está dispuesta la sonda de ácido nucleico anteriormente descrita. El sistema puede comprender además otros recipientes que comprendan uno o más de los elementos siguientes: reactivos de lavado y reactivos capaces de detectar la presencia de la sonda de ácido nucleico unida. Los ejemplos de reactivos de detección incluyen, pero no se limitan a, sondas radiomarcadas, sondas enzimáticamente marcadas (peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) y sondas marcadas para afinidad (biotina, avidina o estreptavidina) (véanse, por ejemplo, Ausubel, infra; y Sambrook, infra).

Un sistema dividido en compartimentos incluye cualquier sistema en el que los reactivos están contenidos en recipientes separados. Dichos recipientes incluyen pequeños recipientes de vidrio, recipientes de plástico o tiras de plástico o papel. Dichos recipientes permiten la transferencia eficaz de reactivos de un compartimento a otro compartimento de modo que las muestras y los reactivos no resulten cruzadamente contaminados y los reactivos o disoluciones de cada recipiente puedan ser añadidos de un modo cuantitativo de un compartimento a otro. Dichos recipientes incluirán un recipiente que recogerá la muestra de ensayo, un recipiente que contiene la sonda o los cebadores utilizados en el ensayo, recipientes que contienen reactivos de lavado (tales como disolución salina tamponada con fosfato, tampones de TRIS, y similares) y recipientes que contienen los reactivos utilizados para detectar la sonda hibridada, el anticuerpo unido, el producto multiplicado, o similar.

Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que las sondas de ácido nucleico descritas en el invento pueden ser fácilmente incorporadas a uno de los formatos de sistema establecidos, que son bien conocidos en la técnica.

Construcciones de DNA que comprenden una molécula de ácido nucleico de SCP de PNS, y huéspedes que contienen estas construcciones

Una secuencia de ácido nucleico que codifica una SCP de PNS del invento puede ser combinada con un DNA vector de acuerdo con técnicas convencionales, incluyendo extremos romos o extremos escalonados para ligación, digestión con enzimas de restricción para obtener extremos apropiados, compleción de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable, y ligación con ligasas apropiadas. Las técnicas para dichas manipulaciones son descritas, por ejemplo, por Ausubel et al., infra, y son bien conocidas en este campo técnico.

Se dice que una molécula de ácido nucleico, tal como DNA, es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de nucleótidos que contienen información reguladora de la transcripción y la traducción y dichas secuencias están "operativamente enlazadas" a secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido. Un enlace operativo es un enlace en que las secuencias de DNA reguladoras y la secuencia cDNA que se busca expresar están conectadas de tal modo que permiten la expresión génica como SCPs de PNS o fragmentos de anticuerpo en cantidades recuperables. La naturaleza exacta de las regiones reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar de organismo a organismo, como es bien conocido en la técnica análoga (véanse, por ejemplo, Sambrook, infra; y Ausubel, infra).

En consecuencia, el invento abarca la expresión de una SCP de PNS en células procarióticas o eucarióticas, aunque se prefiere la expresión eucariótica.

Los huéspedes preferidos son huéspedes bacterianos o eucarióticos, incluyendo células de bacterias, levaduras, insectos, hongos, aves y mamíferos, sea in vivo o sea in situ, o células huésped procedentes de mamífero, insecto, ave o levadura. Se prefiere que la célula o tejido de mamífero proceda de ser humano, primate, hámster, conejo, roedor, vaca, cerdo, oveja, caballo, cabra, perro o gato, aunque se puede utilizar cualquier otra célula de mamífero.

Los huéspedes eucarióticos pueden incluir células de levaduras, insectos, hongos y mamíferos, sean in vivo o en cultivo tisular. Los huéspedes eucarióticos preferidos pueden incluir también, pero no se limitan a, células de insectos y células de mamífero, sean in vivo o en cultivo tisular. Las células de mamífero preferido incluyen ovocitos de Xenopus, células de origen fibroblástico tales como VERO y CHO-K1, y células de origen linfoide y sus derivados.

Las células de mamífero proporcionan modificaciones postraduccionales a las moléculas proteínicas, incluyendo la plegadura o la glicosilación correctas en sitios correctos. Las células de mamífero que pueden ser útiles como huéspedes incluyen células de origen fibroblástico tales como, pero sin limitarse a, NIH 3T3, VERO y CHO, células de origen linfoide tales como, pero sin limitarse a, el hibridoma SP2/O-Ag14 y el mieloma murino P3-X63Ag8, y líneas celulares de hámster (por ejemplo, CHO-K1 y sus progenitores, por ejemplo, CHO-DUXB11) y sus derivados. Un tipo preferido de células de mamífero son las células que están destinadas a sustituir la función de las células genéticamente deficientes in vivo. Las células de origen neuronal son preferidas para la terapia génica de trastornos del sistema nervioso. Para una célula huésped de mamífero, se dispone de muchos sistemas vectores posibles para la expresión de al menos una SCP de PNS. Se puede emplear una gran variedad de secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción, dependiendo de la naturaleza del huésped. Las señales reguladoras de la transcripción y la traducción pueden proceder de fuentes víricas tales como, pero sin limitarse a, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus símicos, y similares, en los que las señales reguladoras están asociadas con un gen concreto que presenta un nivel de expresión elevado. Alternativamente, promotores procedentes de productos de expresión de mamífero, tales como, pero sin limitarse a, actina, colágeno, miosina y producción proteica. Véanse, por ejemplo, Ausubel, infra; y Sambrook, infra.

Cuándo se van a utilizar insectos vivos, las orugas del gusano de seda y los vectores baculovíricos son los huéspedes actualmente preferidos para la producción de SCP de PNS a gran escala de acuerdo con el invento. La producción de SCPs de PNS en insectos puede ser llevada a cabo, por ejemplo, infectando el insecto huésped con un baculovirus creado para que exprese al menos una SCP de PNS, mediante métodos conocidos por los expertos en las técnicas relacionadas. Véase Ausubel et al., redactores, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, párrafos 16.8-16.11 (1987, 1992, 1993, 1994).

En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos introducida se incorporará a un vector plasmídico o vírico capaz de replicación autónoma en el huésped receptor. Con este fin se puede emplear cualquiera de una gran variedad de vectores. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., infra, párrafos 1.5, 1.10, 7.1, 7.3, 8.1, 9.6, 9.7, 13.4, 16.2, 16.6 y 16.8-16.11. Los factores que tienen importancia a la hora de seleccionar un vector plasmídico o vírico concreto incluyen: la facilidad con que las células receptoras que contienen el vector pueden ser reconocidas y seleccionadas con respecto a las células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un huésped concreto; y si es deseable poder "lanzar" el vector entre células huésped de especies diferentes.

Las diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación traduccionales y postraduccionales (por ejemplo, glicosilación y escisión) de proteínas. Las líneas celulares o sistemas huésped apropiados pueden ser elegidos para asegurar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína extraña expresada. Por ejemplo, se puede utilizar la expresión en un sistema bacteriano para producir un producto de proteína nuclear no glicosilado. La expresión en levadura producirá un producto glicosilado. Se puede utilizar la expresión en células de mamífero para asegurar la glicosilación "nativa" de la proteína SCP de PNS heteróloga. Además, sistemas de expresión de vector/huésped diferentes pueden efectuar reacciones de procesamiento tales como escisiones proteolíticas en diferentes grados.

Como se discutió anteriormente, la expresión de SCP de PNS en huéspedes eucarióticos requiere el uso de regiones reguladoras eucarióticas. Dichas regiones incluirán, en general, una región promotora suficiente para dirigir el inicio de la síntesis de RNA. Véanse, por ejemplo, Ausubel, infra; y Sambrook, infra.

Una vez que la molécula vector o de ácido nucleico que contiene la(s) construcción(es) ha sido preparada para expresión, la(s) construcción(es) de DNA puede(n) ser introducida(s) en una célula huésped apropiada mediante cualquiera de una diversidad de medios adecuados; es decir, transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, tecnología del cañón de partículas, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, y similares. Después de la introducción del vector, las células receptoras son cultivadas en un medio selectivo que selecciona el crecimiento de las células que contienen el vector. La expresión de la(s) molécula(s)
génica(s) clonada(s) da lugar a la producción de al menos una SCP de PNS. Esto puede tener lugar tal cual en las células transformadas, o después de inducir la diferenciación de estas células (por ejemplo, mediante la administración de bromodesoxiuracilo a células de neuroblastoma o similares).

Aislamiento de SCP de PNS

Las proteínas o fragmentos de SCP de PNS de este invento se pueden obtener por expresión de DNA recombinante del modo anteriormente descrito. Alternativamente, se puede purificar una SCP de PNS a partir de material biológico. Si así se desea, la al menos una SCP de PNS expresada puede ser aislada y purificada de acuerdo con operaciones metódicas convencionales, tales como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis y similares. Por ejemplo, las células que expresan al menos una SCP de PNS con niveles adecuados pueden ser recogidas por centrifugación, o con tampones adecuados, y lisadas, y la proteína puede ser aislada por cromatografía en columna, por ejemplo, en DEAE-celulosa, fosfocelulosa, poli(ácido ribocitidílico)-agarosa o hidroxiapatito, o por electroforesis o inmunoprecipitación. Alternativamente, se pueden aislar SCPs de PNS mediante el uso de anticuerpos específicos, tales como, pero sin limitarse a, un anticuerpo contra SC o SCP de PNS. Dichos anticuerpos pueden ser obtenidos mediante operaciones metódicas conocidas (véase, por ejemplo, Colligan, infra; y Ausubel, infra).

Para los fines del invento, un método de purificación que es ilustrativo sin ser limitante consiste en las operaciones siguientes. Una primera operación de la purificación de una SCP de PNS incluye la extracción de la fracción de SCP de PNS de una muestra biológica, tal como tejido nervioso periférico o ganglios de la raíz dorsal (DRG), en tampones, con o sin agentes solubilizantes tales como urea, ácido fórmico, detergente o tiocianato. Una segunda operación incluye someter el material solubilizado a cromatografía de intercambio iónico en columnas Mono-Q o Mono-S (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.; Piscataway, New Jersey, EE.UU.). Similarmente, el material solubilizado puede ser separado por cualquier otro proceso en que las moléculas puedan ser separadas, por ejemplo, de acuerdo con la densidad de cargas, la distribución de cargas y el tamaño molecular. La elución de la SCP de PNS de la resina de intercambio iónico es controlada mediante un inmunoensayo, tal como M-IRMA, realizado sobre cada fracción. Los picos inmunorreactivos serían entonces sometidos a diálisis, liofilizados y sometidos a un tamiz molecular, o a cromatografía en gel. En una tercera operación, la cromatografía en tamiz molecular o gel es un tipo de cromatografía de reparto en la que la separación se basa en el tamaño molecular. Para este tipo de separación, se utilizan comúnmente geles de dextrano, poliacrilamida y agarosa. Un gel útil para el invento es SEPHAROSE 12 (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.). Sin embargo, para separar eficazmente las moléculas basándose en su tamaño, se pueden utilizar otros métodos conocidos por quienes tienen experiencia en la técnica. Una cuarta operación de un protocolo de purificación para una SCP de PNS puede incluir un análisis de los picos inmunorreactivos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE; del inglés, sodium dodecyl sulfate-poly-acrylamide gel electrophoresis), otra operación de purificación cromatográfica en gel, y una tinción, tal como, por ejemplo, una tinción con plata. Una quinta operación de un método de purificación puede incluir someter la SCP de PNS obtenida después de la SDS-PAGE a cromatografía de afinidad o a cualquier otro procedimiento basado en la afinidad entre una sustancia que se va a aislar y una molécula a la cual se puede unir específicamente. Para una purificación adicional de una SCP de PNS, se puede utilizar una cromatografía de afinidad sobre SEPHAROSE conjugada con anticuerpos monoclonales anti-SCP de PNS (anticuerpos monoclonales específicos, generados frente a SCP de PNS sustancialmente pura). Son útiles métodos alternativos tales como HPLC en fase inversa y cualquier otro método caracterizado por una rápida separación con buena resolución de picos.

Se apreciará que el método preferido anteriormente descrito puede ser sustituido por otras operaciones de purificación. Los expertos en la técnica podrán crear esquemas de purificación alternativos sin una experimentación excesiva.

Un anticuerpo que tiene afinidad de unión por un péptido SCP de PNS, y un hibridoma que contiene el anticuerpo

En otra realización, el invento se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica por un péptido SCP de PNS como el anteriormente descrito o por un fragmento del mismo. Aquellos que se unen selectivamente a SCP de PNS serían escogidos para uso en métodos que podrían incluir, aunque no se limitarían a, el análisis de la expresión alterada de SCP de PNS en un tejido que contiene SCP de PNS.

Las proteínas SCP de PNS del invento pueden ser utilizadas en una diversidad de procedimientos y métodos, tales como la generación de anticuerpos, para uso en la identificación de composiciones farmacéuticas y para estudiar la interacción DNA/proteína.

El péptido SCP de PNS del invento puede ser usado para producir anticuerpos o hibridomas. Un experto en la técnica reconocerá que si se desea un anticuerpo, se generaría dicho péptido del modo aquí descrito y se utilizaría como un inmunógeno.

Los anticuerpos del invento incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos de estos anticuerpos. El invento incluye además anticuerpos de cadena única. Mediante técnicas conocidas se pueden generar fragmentos de anticuerpo que contengan el idiotipo de la molécula.

Con el término "anticuerpo" se quiere incluir anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos quiméricos, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) hacia anticuerpos que pueden estar marcados en forma soluble o unida, así como fragmentos de los mismos proporcionados mediante cualquier técnica conocida, tal como, pero sin limitarse a, escisión enzimática, síntesis peptídica o técnicas recombinantes. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo procedentes de sueros de animales inmunizados con un antígeno. Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos para antígenos, población que contiene sitios ligantes de epítopo sustancialmente similares. Se pueden obtener mABs mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Patente de EE.UU. nº 4.376.110; Ausubel et al., redactores, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, New York. EE.UU. (1987, 1992); Harlow y Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y Colligan et al., redactores, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, New York, EE.UU. (1992, 1993), referencias cuyos contenidos se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase inmunoglobulínica, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas. Un hibridoma que produzca un mAb del invento puede ser cultivado in vitro, in situ o in vivo. La producción de títulos elevados de mAbs in vivo o in situ hacen de éste el método de producción actualmente preferido.

Los anticuerpos quiméricos son moléculas con diferentes porciones que proceden de diferentes especies animales, tales como aquellos que tienen una región variable procedente de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana, que se utilizan esencialmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y para aumentar los rendimientos en la producción, por ejemplo, cuando los mAbs murinos presentan mayores rendimientos en los hibridomas pero una mayor inmunogenicidad en seres humanos, por lo que se usan mAbs quiméricos humanos/murinos. En la técnica se conocen anticuerpos quiméricos y métodos para su producción [Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125023; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., Solicitud de Patente Europea 171496; Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173494; Neuberger et al., Solicitud PCT WO 86/01533; Kudo et al., Solicitud de Patente Europea 184187; Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173494; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., Publicación de Patente Internacional nº PCT/US86/02269; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); y Harlow, infra. Estas referencias se incorporan aquí por referencia en su totalidad].

Un anticuerpo antiidiotípico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio ligante de antígenos de un anticuerpo. Se puede preparar un anticuerpo Id al inmunizar un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, una raza de ratón) que la fuente del mAb, con el mAb contra el que se prepara un anti-Id. El animal inmunizado reconocerá los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante y responderá produciendo un anticuerpo contra esos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id). Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 4.699.880, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

El anticuerpo anti-Id puede ser también utilizado como un "inmunógeno" para provocar una respuesta inmune en aún otro animal, produciendo un llamado anticuerpo anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al mAb original que provocó el anti-Id. De este modo, utilizando anticuerpos contra los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresen anticuerpos de idéntica especificidad.

En consecuencia, los mAbs generados contra una SCP de PNS del invento pueden ser utilizados para provocar anticuerpos anti-Id en animales adecuados, tales como ratones BALB/c. Se utilizan células esplénicas de dicho ratones inmunizados, para producir hibridomas anti-Id que secreten mAbs anti-Id. Además, los mAbs anti-Id pueden ser copulados con un vehículo, tal como hemocianina de lapa Fissurella (KLH), y utilizados para inmunizar ratones BALB/c adicionales. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-Id que tendrán las propiedades ligantes del mAb original específico para un epítopo específico de SCP de PNS. De esta manera, los mAbs anti-Id tienen sus propios epítopos idiotípicos, o "idiotopos", estructuralmente similares al epítopo que se
evalúa.

Con el término "anticuerpo" también se quiere incluir tanto moléculas intactas como fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab y F(ab')_{2}, que son capaces de unirse al antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, son más rápidamente aclarados de la circulación y pueden presentar menos unión tisular inespecífica que un anticuerpo intacto [Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)]. Se apreciará que Fab, F(ab')_{2} y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en el invento pueden ser utilizados para la detección y/o cuantificación de una SCP de PNS de acuerdo con los métodos aquí descritos para moléculas de anticuerpo intactas. Dichos fragmentos se producen típicamente por escisión proteolítica utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) y pepsina [para producir fragmentos F(ab')_{2}]. Se dice que un anticuerpo es "capaz de unirse a" una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para que se unan por ello la molécula y el anticuerpo. Con el término "epítopo" se quiere referir a la porción de cualquier molécula capaz de ser unida por un anticuerpo, que puede ser también reconocida por ese anticuerpo. Los epítopos o "determinantes antigénicos" consisten normalmente en agrupamientos químicamente activos de la superficie de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares, y tienen características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas.

Un "antígeno" es una molécula o porción de molécula capaz de ser unida por un anticuerpo, que es además capaz de provocar que un animal produzca un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener un epítopo o más de un epítopo. Con la reacción específica anteriormente referida se quiere indicar que el antígeno reaccionará, de un modo muy selectivo, con su correspondiente anticuerpo y no con la multitud de anticuerpos distintos que pueden ser producidos por otros antígenos.

Inmunoensayos

Los anticuerpos del invento, dirigidos contra una SCP de PNS, pueden ser utilizados para detectar o diagnosticar un SC de PNS o una patología relacionada con SC de PNS. Los métodos de exploración proporcionados por el invento pueden incluir, por ejemplo, inmunoensayos en que se emplean metodologías de radioinmunoensayo (RIA) o de ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA; del inglés, enzyme-linked immunosorption assay), basándose en la producción de anticuerpos específicos (monoclonales o policlonales) contra una SCP de PNS. Para estos ensayos, se obtienen muestras biológicas mediante una biopsia nerviosa o mediante muestreo de otros tejidos del sistema nervioso periférico. Por ejemplo, en una forma de RIA, la sustancia bajo ensayo es mezclada con antisuero diluido en presencia de antígeno radiomarcado. En este método, la concentración de la sustancia de ensayo será inversamente proporcional a la cantidad de antígeno marcado unido al anticuerpo específico y estará directamente relacionada con la cantidad de antígeno marcado libre. Otros métodos de exploración adecuados resultarán evidentes a quienes tienen experiencia en la técnica.

Además, un experto en la técnica puede adaptar fácilmente los procedimientos actualmente disponibles, así como las técnicas, métodos y sistemas anteriormente descritos en relación con anticuerpos, para generar péptidos capaces de unirse a una secuencia peptídica específica con objeto de generar péptidos antipéptidos racionalmente diseñados; véanse, por ejemplo, Hurby et al., "Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides" en "Synthetic Peptides, A User's Guide", W. H. Freeman, New York, EE.UU., páginas 289-307 (1992), y Kasprzak et al., Biochemistry 28: 9230-8 (1989).

Una realización para llevar a cabo el ensayo diagnóstico del invento sobre una muestra biológica que contiene una SCP de PNS comprende:

(a)

poner un anticuerpo específico para SCP de PNS, detectablemente marcado, en contacto con un soporte sólido para efectuar la inmovilización de dicho anticuerpo específico para SCP de PNS o por la inmovilización de un fragmento del mismo;

(b)

poner una muestra sospechosa de contener una SCP de PNS, en contacto con dicho soporte sólido;

(c)

incubar dicho anticuerpo específico para SCP de PNS, detectablemente marcado, con dicho soporte durante el tiempo suficiente para permitir que el anticuerpo inmovilizado específico para SCP de PNS se una a la SCP de PNS;

(d)

separar el soporte en fase sólida de la mezcla de incubación obtenida en la operación (c); y

(e)

detectar el marcador unido y detectar y cuantificar por ello la SCP de PNS.

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Se pueden variar las concentraciones específicas del anticuerpo detectablemente marcado y de la SCP de PNS, la temperatura y el tiempo de incubación, así como otras condiciones de ensayo, dependiendo de factores diversos que incluyen la concentración de una SCP de PNS en la muestra, la naturaleza de la muestra, y similares. La actividad ligante de una partida dada de anticuerpo anti-SCP de PNS puede ser determinada de acuerdo con métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica podrán determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando una experimentación rutinaria. Se pueden añadir a los ensayos otras operaciones, tales como lavado, agitación, sacudimiento, filtración y similares, según sea habitual o necesario para la situación concreta.

La detección puede ser llevada a cabo utilizando cualquiera de una diversidad de ensayos. Por ejemplo, al marcar radiactivamente los anticuerpos específicos para SCP de PNS o los fragmentos de anticuerpo, es posible detectar SCP de PNS por medio del uso de radioinmunoensayos. En Colligan, infra, y Ausubel, infra, incorporados aquí por referencia en su totalidad, se puede hallar una buena descripción de un radioinmunoensayo. Preferiblemente, la detección de células que expresan una SCP de PNS puede ser llevada a cabo mediante técnicas de formación de imágenes in vivo, con las cuales se proporcionan anticuerpos marcados (o fragmentos de los mismos) a un sujeto y se detecta la presencia de la SCP de PNS sin extracción previa de muestra tisular alguna. Dichos procedimientos de detección in vivo tienen la ventaja de ser menos invasivos que otros métodos de detección y ser además capaces de detectar la presencia de SCP de PNS en un tejido que no puede ser fácilmente extraído del paciente, tal como el tejido cerebral.

Hay muchos marcadores y métodos de marcación in vivo diferentes, conocidos por quienes tienen una experiencia normal en la técnica. Los ejemplos de tipos de marcadores que pueden ser utilizados en el invento incluyen isótopos radiactivos e isótopos paramagnéticos. Quienes tienen una experiencia normal en la técnica conocerán otros marcadores adecuados para unir a los anticuerpos utilizados en el invento o serán capaces de determinar los mismos utilizando una experimentación rutinaria. Además, la unión de estos marcadores a los anticuerpos puede realizarse utilizando técnicas estándares comunes a quienes tienen una experiencia normal en este campo.

Para la formación diagnóstica de imágenes in vivo, el tipo de instrumento de detección disponible es un factor fundamental a la hora de seleccionar un radionucleido dado. El radionucleido elegido debe tener un tipo de desintegración que sea detectable por un tipo dado de instrumento. En general, se puede utilizar de acuerdo con este invento cualquier método convencional para la visualización de imágenes diagnósticas. Por ejemplo, para visualizar imágenes diagnósticas, se pueden utilizar detectores para tomografía por emisión de positrones (PET; del inglés, positron emission tomography), gamma, beta, y para formación de imágenes por resonancia magnética (MRI; del inglés, magnetic resonance imaging).

Los anticuerpos útiles en el invento pueden ser también marcados con isótopos paramagnéticos con fines de diagnóstico in vivo. Los elementos que son particularmente útiles como en la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) incluyen ^{157}Gd, ^{55}Mn, ^{162}Dy y ^{56}Fe.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) del invento son también particularmente adecuados para uso en inmunoensayos in vitro para detectar la presencia de una SCP de PNS en un tejido corporal, fluidos (tal como el líquido cefalorraquídeo) o extractos celulares. En dichos inmunoensayos, los anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo) pueden ser utilizados en fase líquida o, preferiblemente, unidos a un soporte en fase sólida, como se describió anteriormente.

La detección in situ puede ser llevada a cabo extrayendo una muestra histológica de un paciente y proporcionando la combinación de anticuerpos marcados del invento a dicha muestra. El anticuerpo (o el fragmento) se proporciona preferiblemente aplicando el anticuerpo (o fragmento) marcado a una muestra biológica o cubriendo ésta con aquél. Mediante el uso de dicho procedimiento, es posible determinar no sólo la presencia de una SCP de PNS sino también la distribución de una SCP de PNS en el tejido examinado. Utilizando el invento, quienes tienen experiencia normal percibirán rápidamente que se puede modificar cualquiera de una gran variedad de métodos histológicos (tales como los procedimientos de tinción) con objeto de alcanzar dicha detección in situ.

Cómo se utiliza aquí, una cantidad eficaz de un reactivo diagnóstico (tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) es aquélla capaz de conseguir la discriminación diagnóstica deseada, y variará dependiendo de factores tales como la edad, el estado, el sexo, el grado de enfermedad del sujeto, las contraindicaciones, si las hubiera, y otras variables que han de ser ajustadas por el médico. Las cantidades de tales materiales que se utilizan típicamente en un ensayo diagnóstico son generalmente entre 0,1 y 5 mg, y preferiblemente entre 0,1 y 0,5 mg.

El ensayo del invento es también perfectamente adecuado para la preparación de un sistema. Dicho sistema puede comprender un medio vehicular que está separado en compartimentos para admitir, en estrecho confinamiento con él, uno o más medios recipientes tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada uno de dichos medios recipientes los elementos separados del inmunoensayo.

Por ejemplo, puede haber un medio recipiente que contenga un primer anticuerpo inmovilizado sobre un soporte en fase sólida, y otro medio recipiente que contenga un segundo anticuerpo detectablemente marcado en disolución. Otros medios recipientes pueden contener disoluciones estándares que comprendan diluciones sucesivas de la SCP de PNS que se va a detectar. Las disoluciones estándares de una SCP de PNS pueden ser utilizadas para preparar una curva patrón con la concentración de SCP de PNS trazada en abscisas y la señal de detección en ordenadas. Los resultados obtenidos a partir de una muestra que contiene una SCP de PNS pueden ser interpolados de dicha gráfica para obtener la concentración de la SCP de PNS.

Exploración y tratamiento diagnósticos

Se ha de entender que, aunque la discusión siguiente está específicamente dirigida a pacientes humanos, las enseñanzas son también aplicables a cualquier animal que exprese al menos una SCP de PNS. Los métodos de diagnóstico y exploración aquí descritos son especialmente útiles para un paciente del que se sospecha que presenta riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con un nivel de expresión alterado de SCP de PNS basándose en su historia familiar, o para un paciente en el que se desea diagnosticar una enfermedad relacionada con SCP de PNS.

De acuerdo con esta descripción, la exploración presintomática de un individuo que necesita dicha exploración es ahora posible al utilizar DNA que codifica la proteína SCP de PNS del invento. El método de exploración del invento permite un diagnóstico presintomático, incluyendo un diagnóstico prenatal, de la presencia de un gen SC de PNS ausente o aberrante en un individuo y, por lo tanto, una opinión relativa a la probabilidad de que dicho individuo desarrolle o haya desarrollado una enfermedad asociada con SC de PNS. Esto es especialmente valioso para la identificación de vehículos de genes SC de PNS alterados o ausentes en, por ejemplo, individuos con una historia familiar de una patología relacionada con SC de PNS. También se desea un diagnóstico precoz para maximizar una intervención oportuna apropiada.

En un ejemplo preferido del método de exploración, se extraería una muestra de tejido de dicho individuo y se exploraría en cuanto a (1) la presencia del gen SCP de PNS "normal", (2) la presencia de mRNA de SCP de PNS y/o (3) la presencia de proteína SCP de PNS. El gen humano normal puede ser caracterizado basándose en, por ejemplo, la detección de patrones de digestión de restricción en DNA "normal" frente a DNA del paciente, incluyendo análisis de RFLP (polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción), usando sondas de DNA preparadas contra la secuencia de SCP de PNS (a un fragmento funcional de la misma) enseñada en el invento. Similarmente, el mRNA de SCP de PNS puede ser caracterizado y puede ser comparado con (a) niveles y/o (b) tamaños normales de mRNA de SCP de PNS como los hallados en una población humana que no presenta riesgo de desarrollar enfermedades asociadas con SCP de PNS, usando sondas similares. Finalmente, la proteína SCP de PNS puede ser (a) detectada y/o (b) cuantificada utilizando un ensayo biológico para actividad SCP de PNS o utilizando un ensayo inmunológico y anticuerpos contra SCP de PNS. Cuando se ensaya la proteína SCP de PNS, se prefiere el ensayo inmunológico por su rapidez. Un (1) patrón aberrante de tamaños de DNA de SCP de PNS, y/o (2) tamaños o niveles aberrantes de mRNA de SCP de PNS, y/o (3) niveles aberrantes de proteína SCP de PNS indicarían que el paciente presenta riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con SCP de PNS.

Los métodos de exploración y diagnóstico del invento no requieren que para la sonda se utilice el DNA completo de SCP de PNS que codifica la secuencia. En vez de ello, sólo es necesario utilizar un fragmento o tramo de ácido nucleico que sea suficiente para detectar la presencia del gen SCP de PNS en una preparación de DNA procedente de un individuo normal o afectado, la ausencia de dicho gen o una propiedad física alterada de dicho gen (tal como un cambio en el patrón de migración electroforética).

El diagnóstico prenatal puede ser llevado a cabo cuando se desee utilizando cualquier método conocido para obtener células fetales, incluyendo la amniocentesis, el muestreo de vellosidades coriónicas (CVS; del inglés, chorionic villous sampling) y la fetoscopia. Se puede utilizar un análisis prenatal de cromosomas para determinar si la porción del cromosoma que posee el gen SCP de PNS normal está presente en un estado heterocigoto.

Revisión de métodos de purificación y cristalización de SCP de PNS

En general, una SCP de PNS, como una proteína de membrana, es purificada en forma soluble utilizando detergentes (por ejemplo, octilglucósidos) u otras moléculas anfipáticas adecuadas. La SCP de PNS resultante tiene una pureza y una concentración suficientes para la cristalización. La SCP de PNS purificada es luego aislada y es analizada en cuanto a actividad biológica y falta de agregación (que interfiere en la cristalización). La SCP de PNS purificada y escindida se mueve como una sola banda en electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) reductores o no reductores (se utilizan condiciones no reductoras para evaluar la presencia de puentes de cisteína). La SCP de PNS purificada es preferiblemente cristalizada bajo condiciones variables de al menos una de las siguientes: pH, tipo de tampón, concentración de tampón, tipo de sal, tipo de polímero, concentración de polímero, otros ligandos precipitantes y concentración de la SCP de PNS purificada y escindida, mediante métodos conocidos. Véanse, por ejemplo, Michel, Trends in Biochem. Sci 8: 56-59 (1983); Deisenhofer et al., J. Mol. Biol. 180: 385-398 (1984); Weiss et al., FEBS Lett. 267: 268-272 (1990); Blundell et al., "Protein Crystalography", Academic Press, Londres (1976); Oxender et al., redactores, Protein Engineering, Liss, New York (1986); McPherson, "The Preparation and Analysis of Protein Crystals", Wiley, New York (1982); o los métodos proporcionados en un sistema comercial tal como CRYSTAL SCREEN (Hampton Research, Riverside, California, EE.UU.). También se ensaya la proteína cristalizada en cuanto a al menos una actividad SC, y se ensayan además cristales de diferentes tamaños y formas en cuanto a su idoneidad para difracción de rayos X. Generalmente, los cristales más grandes proporcionan una mejor cristalografía que los cristales más pequeños, y los cristales más gruesos proporcionan una mejor cristalografía que los cristales más delgados. Véanse, por ejemplo, Blundell, infra; Oxender, infra; McPherson, infra; y Wyckoff et al., redactores, "Diffraction Methods for Biological Macromolecules", volúmenes 114-115, Methods in Enzymology, Orlando, Florida, EE.UU., Academic Press (1985).

Métodos para cristalización de proteínas

Se utiliza preferiblemente el método de la gota pendiente para cristalizar una proteína SCP cristalizada soluble de PNS. Véanse, por ejemplo, Taylor et al., J. Mol. Biol. 226: 1287-1290 (1992); Takimoto et al. (1992), infra; y CRYSTAL SCREEN, Hampton Reserach. Una mezcla de la proteína y el agente precipitante puede incluir lo siguiente: \bullet pH (por ejemplo, 4-10); \bullet tipo de tampón [por ejemplo, trometamina (TRIZMA), azida sódica, fosfato, cacodilato sódico, acetatos, imidazol, Tris-HC y Hepes sódico]; \bullet concentración del tampón (por ejemplo, 0,1-100 mM); \bullet tipo de sal (por ejemplo, azida sódica, cloruro cálcico, citrato sódico, cloruro magnésico, acetato amónico, sulfato amónico, fosfato potásico, acetato magnésico, acetato de zinc y acetato cálcico); \bullet tipo y concentración del polímero [por ejemplo, polietilenglicol (PEG) al 1-50%, tipo 6000-10.000]; \bullet otros ligandos precipitantes (sales: tartrato de potasio y sodio, sulfato amónico, acetato sódico, sulfato de litio, formiato sódico, citrato sódico, formiato magnésico, fosfato sódico y fosfato potásico; productos orgánicos: 2-propanol; productos no volátiles: 2-metil-2,4-pentanodiol); y \bullet concentración de la SCP de PNS purificada [por ejemplo 0,1-100 mg/ml, con moléculas anfipáticas añadidas (detergentes tales como octilglucósidos)]. Véase, por ejemplo, CRYSTAL SCREEN, Hampton
Research.

Se usan las mezclas anteriores y se explora la variación de al menos uno de: pH, tipo de tampón, concentración de tampón, tipo o concentración de la sal precipitante, tipo de PEG, concentración de PEG y concentración de la proteína escindida. En 1-14 días se forman cristales con un tamaño que varía de 0,1 a 1,5 mm. Estos cristales difractan los rayos X hasta una resolución de al menos 1,0 nm, tal como 0,15-1,00 nm, o cualquier intervalo o valor de dicho intervalo, tal como 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, 0,25, 0,26, 0,27, 0,28, 0,29, 0,30, 0,31, 0,32, 0,33, 0,34, 0,35 ó 0,36, prefiriéndose 0,35 nm o menos para la mayor resolución. Además de los patrones de difracción que tienen esta máxima resolución, se puede utilizar además una menor resolución, tal como 2,5-0,35 nm.

Cristales proteicos

Aparecen cristales después de 1-14 días y continúan creciendo los días subsiguientes. Algunos de los cristales son retirados, lavados y analizados en cuanto a actividad biológica, actividad que se prefiere para uso en caracterizaciones ulteriores. Otros cristales lavados son preferiblemente desarrollados en un gel teñido, y se utilizan preferiblemente aquellos que migran en la misma posición que la SCP de PNS escindida y purificada. Se observan de dos a cien cristales en una gota, y se pueden producir formas cristalinas tales como, pero sin limitarse a, piramidal, romboidal y cúbica. Se espera que los análisis iniciales con rayos X indiquen que dichos cristales difractan con una resolución de moderadamente elevada a elevada. Cuando se producen menos cristales en una gota, pueden tener un tamaño mucho mayor, tal como, por ejemplo, 0,2-1,5 mm.

Métodos de cristalografía de SCP de PNS por rayos X

Los cristales de SCP de PNS así producidos son analizados con rayos X utilizando una fuente de rayos X adecuada. Se obtiene un número adecuado de patrones de difracción. Los cristales son preferiblemente estables durante al menos 10 horas en el haz de rayos X. Se utilizan opcionalmente cristales congelados (por ejemplo, de -220 a -50ºC) para exposiciones más prolongadas a rayos X (por ejemplo, 4-72 horas), cristales que en estado congelado son relativamente más estables frente a los rayos X. Para recoger el número máximo de reflexiones útiles, se recogen opcionalmente múltiples imágenes conforme el cristal es girado en el haz de rayos X durante, por ejemplo, 12-96 horas. Se prefieren cristales mayores (> 0,2 mm) para aumentar la resolución de la difracción de rayos X. Los cristales son preferiblemente analizados utilizando una fuente sincrotrónica de rayos X de alta energía. Al utilizarse cristales congelados los datos de difracción de rayos X se recogen sobre cristales que difractan con una resolución de 1,0-0,15 nm, siendo útiles resoluciones menores tales como 2,5-1,0 nm, suficiente para resolver la estructura tridimensional de una SCP de PNS con un detalle considerable, como aquí se presenta.

Realizaciones relacionadas con ordenadores

Se puede "proporcionar" una secuencia de aminoácidos de una SCP de PNS y/o de datos de difracción de rayos X, útiles para el modelado molecular informático de una SCP de PNS o una porción de la misma, en una diversidad de medios para facilitar el uso de los mismos. Como se utiliza aquí, "proporcionar" se refiere a un producto manufacturado que contiene una secuencia de aminoácidos de SCP de PNS y/o datos de difracción de rayos X del presente invento, tal como, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 1, 8, 10 ó 11, un fragmento representativo de la misma, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80-100% de identidad global con un fragmento de 5-2005 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de las Figuras 11A-D o una variante de la misma. Dichos métodos proporcionan la secuencia de aminoácidos y/o datos de difracción de rayos X en una forma que permite que un técnico experto analice y modele molecularmente la estructura tridimensional de una SCP de PNS o de un subdominio de la misma.

En una aplicación como la aquí descrita, la secuencia de aminoácidos de SCP de PNS, o de al menos un subdominio de la misma, y/o datos de difracción de rayos X como los aquí descritos, son registrados en un medio legible por ordenador. Como se utiliza aquí, "medio legible por ordenador" se refiere a cualquier medio que puede ser leído por un ordenador y al que accede directamente un ordenador. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a, medios de almacenamiento magnético, tales como disquetes, un medio de almacenamiento en disco duro y una cinta magnética; medios de almacenamiento óptico, tales como discos ópticos o CR-ROM; medios de almacenamiento eléctrico, tales como RAM y ROM; e híbridos de estas categorías, tales como medios de almacenamiento magnético/óptico. Un técnico experto puede apreciar fácilmente cómo cualquiera de los medios elegibles por ordenador actualmente conocidos puede ser utilizado para crear un producto manufacturado que comprenda un medio legible por ordenador que tenga registrados en él una secuencia de aminoácidos y/o datos de difracción de rayos X aquí descritos.

Cómo se utiliza aquí, "registrado" se refiere a un procedimiento para almacenar información en un medio legible por ordenador. Un técnico experto puede adoptar cualquiera de los métodos actualmente conocidos para registrar información en un medio legible por ordenador con objeto de generar productos manufacturados que comprendan una secuencia de aminoácidos y/o una información sobre datos de difracción de rayos X como los aquí descritos.

Un técnico experto dispone de una diversidad de estructuras para almacenamiento de datos con objeto de crear un medio legible por ordenador que tenga registrados en él una secuencia de aminoácidos y/o datos de difracción de rayos X como los aquí descritos. La elección de la estructura para almacenamiento de datos se basará generalmente en el medio elegido para acceder a la información almacenada. Además, se puede utilizar una diversidad de formatos y programas procesadores de datos para almacenar la secuencia y la información sobre datos de rayos X aquí descritos en un medio legible por ordenador. La información sobre secuencias se puede representar en un archivo de texto de un procesador de palabras, formateado con un software comercialmente asequible tal como WordPerfect o Microsoft Word, o representado en forma de un archivo ASCII almacenado en una aplicación de base de datos tal como DB2, Sybase, Oracle o similar. Un técnico experto puede adaptar fácilmente cualquier número de formatos estructuradores de los procesadores de datos (por ejemplo, un archivo de texto o una base de datos) con objeto de obtener un medio legible por ordenador que tenga registrada en él la información aquí descrita.

Al obtener la secuencia de SCP de PNS y/o los datos de difracción de rayos X en un medio legible por ordenador, un técnico experto puede acceder rutinariamente a la secuencia y los datos de difracción de rayos X para modelar una SCP de PNS, un subdominio de la misma, o un ligando de la misma. Se dispone pública y comercialmente de algoritmos informáticos que permiten que un técnico experto acceda a estos datos, proporcionados en un medio legible por ordenador, y los analice para el modelado molecular y/o el RDD.

También se describen sistemas, particularmente sistemas basados en ordenador, que contienen la secuencia y/o los datos de difracción aquí descritos. Dichos sistemas están diseñados para realizar el modelado molecular y el RDD para una SCP de PNS o al menos un subdominio de la misma.

Como aquí se utiliza, un "sistema basado en ordenador" se refiere a los medios de hardware, medios de software y medios para almacenamiento de datos, utilizados para analizar la secuencia y/o los datos de difracción de rayos X aquí descritos. El medio de hardware mínimo del sistema basado en ordenador aquí descrito comprende una unidad central de procesamiento (CPU; del inglés, central processing unit), medios de entrada, medios de salida y medios para almacenamiento de datos. Un técnico experto puede apreciar fácilmente que los sistemas basados en ordenador actualmente disponibles son adecuados para el uso aquí descrito.

Como se afirmó anteriormente, los sistemas basados en ordenador aquí descritos comprenden un medio para almacenamiento de datos que tiene almacenados en él una secuencia de SCP de PNS o de un fragmento y/o datos de difracción de rayos X del presente invento, y los medios de hardware y medios de software necesarios para soportar e implementar un medio de análisis. Como aquí se utiliza, "medio para almacenamiento de datos" se refiere a una memoria que puede almacenar la secuencia o los datos de difracción de rayos X aquí descritos, o a un medio de acceso a memoria que puede acceder a productos manufacturados que tienen registrados en ellos la secuencia o los datos de rayos X aquí descritos.

Como aquí se utiliza, un "medio de búsqueda" o "medio de análisis" se refiere a uno o más programas que son implementados en el sistema basado en ordenador para comparar una secuencia diana o un motivo estructural diana con la secuencia o los datos de rayos X almacenados en el medio para almacenamiento de datos. Los medios de búsqueda se utilizan para identificar fragmentos o regiones de una SCP de PNS que se corresponden con una secuencia diana o motivo diana particular. Se han descrito públicamente diversos algoritmos conocidos, y hay una diversidad de software comercialmente asequible para llevar a cabo búsquedas que puede ser utilizado en los sistemas basados en ordenador aquí descritos. Un técnico experto puede reconocer fácilmente que cualquiera de los algoritmos o conjuntos informáticos de implementación disponibles para llevar a cabo análisis por ordenador puede ser adaptado para uso en los presentes sistemas basados en ordenador.

Como se utiliza aquí, un "motivo estructural diana" o "motivo diana" se refiere a cualquier secuencia o combinación de secuencias racionalmente seleccionada en que la(s) secuencia(s) es(son) elegida(s) basándose en un mapa de densidad electrónica o configuración tridimensional que se forma tras la plegadura del motivo diana. Hay una variedad de motivos diana conocidos en la técnica. Los motivos diana de proteínas incluyen, pero no se limitan a, sitios activos enzimáticos, subdominios estructurales, epítopos, dominios funcionales y secuencias señal. Se puede utilizar una diversidad de formatos estructurales para los medios de entrada y salida, para introducir y sacar la información en los sistemas basados en ordenador aquí descritos.

Se puede utilizar una diversidad de medios de comparación para comparar una secuencia diana o un motivo diana con los medios de almacenamiento de datos, para identificar motivos estructurales de los mapas de densidad electrónica. Un técnico experto puede reconocer fácilmente que, como medio de búsqueda para los sistemas basados en ordenador aquí descritos, se puede utilizar cualquiera de los programas de modelado por ordenador públicamente disponibles.

En la Figura 12 se proporciona una aplicación aquí descrita. La Figura 12 proporciona un diagrama de bloques de un sistema informático 102. El sistema informático 102 proporciona un procesador 106 conectado a un bus 104. Al bus 104 están también conectadas una memoria principal 108 (preferiblemente implementada como una memoria de acceso aleatorio, RAM) y una diversidad de memorias secundarias 110 de almacenamiento, tales como un disco duro 112 y un medio extraíble 114 para almacenamiento. El dispositivo 114 para almacenamiento en medios extraíbles puede representar, por ejemplo, una disquetera, una unidad para CD-ROMs, una unidad para cintas magnéticas, etc. En el dispositivo 114 para almacenamiento en medios extraíbles se puede insertar un medio extraíble 116 de almacenamiento (tal como un disquete, un disco compacto, una cinta magnética, etc.) que contiene una lógica de control y/o unos datos registrados en él. El sistema informático 102 incluye el software apropiado para leer la lógica de control y/o los datos desde el dispositivo 114 para almacenamiento en medios extraíbles una vez insertado en el dispositivo 114 para almacenamiento en medios extraíbles. Se puede utilizar un monitor 120 conectado al bus 104 para visualizar los datos de determinación de estructuras.

La secuencia de aminoácidos, la secuencia nucleotídica codificadora u otra secuencia y/o los datos de difracción de rayos X aquí descritos pueden ser almacenados de un modo bien conocido en la memoria principal 108, cualquiera de los dispositivos secundarios 110 de almacenamiento y/o un dispositivo extraíble 116 de almacenamiento. El software para acceder y procesar la secuencia de aminoácidos y/o los datos de difracción de rayos X (tal como herramientas de búsqueda, herramientas de comparación, etc.) reside en la memoria principal 108 durante la ejecución.

Determinación de la estructura tridimensional

Se utilizan una o más operaciones de modelado informático y/o uno o más algoritmos informáticos para obtener un modelo molecular tridimensional de una SCP de PNS escindida, utilizando datos de secuencias de aminoácidos procedentes de las Figuras 1, 8, 10 y 11 (o variantes de las mismas) y/o datos de difracción de rayos X. Si solamente se utiliza la secuencia de aminoácidos, para la determinación de la estructura tridimensional se puede utilizar entonces un programa de modelado adecuado tal como, por ejemplo, LINUS [Rose et al., Proteins: Structure, Function and Genetics (Junio de 1995) y las referencias ahí citadas]. Se prefiere que el modelo de SCP de PNS no tenga restos ni restos sustituidos por Ala (para la superficie) en regiones prohibidas del diagrama de Ramachandran y proporcione un perfil 3D-1D positivo [Luthy et al., Nature 356: 83-85 (1992)], lo que sugeriría que todos los restos están en entornos aceptables [Kraulis (1991), infra]. Alternativamente, las regiones prohibidas pueden ser corregidas mediante el uso de algoritmos adecuados, tal como el programa RAVE aquí descrito. Se utiliza opcionalmente la determinación de fases para resolver la estructura tridimensional de una SCP de PNS escindida. Esta estructura puede ser luego utilizada para el RDD de moduladores de SCP de PNS, neuraminidasa, endotelina, catepsina A u otra actividad biológica que, por ejemplo, sea relevante para una patología relacionada con SCP de PNS.

Modificación de densidades e interpretación de mapas

Se pueden calcular mapas de densidad electrónica utilizando programas tales como los del paquete informático CCP4 [SERC (Reino Unido) Collaborative Computing Project 4, Daresbury Laboratory, Reino Unido, 1979]. Además, se pueden utilizar ciclos de cálculo doble del promedio, tal como con el programa RAVE [Kleywegt y Jones, Bailey et al. editores, "First Map to Final Model", SERC Daresbury Laboratory, Reino Unido, páginas 59-66 (1994)] y una expansión gradual del modelo. Para la visualización de mapas y creación de modelos se puede utilizar un programa tal como "O" [Jones (1991), infra].

Refinación, y validación del modelo

Se puede llevar a cabo un refinación posicional y de cuerpo rígido usando un programa tal como X-PLOR (Brünger (1992), infra] con, por ejemplo, los parámetros estereoquímicos de Engh y Huber [Acta Cryst. A47: 392-400 (1991)]. Si, en los mapas promediados, el modelo de esta fase aún pierde restos (por ejemplo, al menos 5-10 por subunidad), algunos o todos los restos perdidos pueden ser incorporados al modelo durante ciclos adicionales de refinación posicional y creación de modelos. Se puede iniciar el procedimiento de refinación usando datos de menor resolución (por ejemplo, de 2,5-1,0 nm a 1,0-0,30 nm, y ampliándolos gradualmente para incluir datos de 1,2-0,6 nm a 0,30-0,15 nm). Los valores de \beta para átomos individuales pueden ser refinados una vez que se han añadido los datos entre 0,29 y 0,15 nm. Posteriormente, se pueden añadir gradualmente aguas. Se puede usar un programa tal como ARP [Lamzin y Wilson, Acta Cryst. D49: 129-147 (1993)] para añadir aguas cristalográficas y como una herramienta para comprobar zonas erróneas en el modelo. Se pueden utilizar programas tales como PROCHECK [Lackowski et al., J. Appl. Cryst. 26: 283-291 (1993)], WHATIF [Vriend. J. Mol. Graph. 8: 52-56 (1990)] y PROFILE 3D [Luthy et al., Nature 356: 83-85 (1992)], así como el análisis geométrico generado por X-PLOR, para comprobar la estructura en cuanto a errores. Para el ciclo final de refinación, el 20-5% de los datos más débiles pueden ser rechazados usando un corte IF_{obs}I/\sigma y un cambio anisotrópico de escala entre F_{obs} y F_{cate}, aplicados después de una cuidadosa evaluación de la calidad y compleción de los datos.

Análisis de estructuras

Se puede usar un programa tal como DSSP para asignar los elementos estructurales secundarios [Kabsch y Sander (1983), infra]. Se puede usar un programa tal como SUPPOS (del paquete informático cristalográfico BIOMOL) para alguna o todas las superposiciones por mínimos cuadrados de diversos modelos y partes de modelos. Usando programas tales como GRASP [Nicholls et al. (1991), infra] se pueden calcular superficies accesibles y potenciales electrostáticos.

Determinación de estructuras

De esa manera, la estructura de una SCP de PNS puede ser resuelta con el procedimiento de sustitución molecular, tal como utilizando X-PLOR [Brünger (1992), infra]. Se puede construir un modelo de búsqueda parcial para el monómero utilizando una proteína relacionada, tal como la estructura de la serina carboxipeptidasa de trigo [Liao et al. (1992), infra]. Se puede utilizar la función de rotación y traslación para producir dos o más orientaciones y posiciones para dos subunidades con objeto de formar un dímero fisiológico, según se determina basándose en sus interacciones. También se puede realizar el cálculo cíclico doble de promedios de densidades usando el programa RAVE, y luego se puede usar la expansión del modelo para añadir restos perdidos para cada monómero, lo que da lugar a un modelo con el 95-99,9% del número total de restos. El modelo se puede refinar en un programa tal como X-PLOR [Brünger (1992), supra] hasta un R_{factor} cristalográfico adecuado. Los datos del modelo son luego guardados en un medio legible por ordenador para uso en un análisis ulterior, tal como un diseño racional de fármacos.

Diseño racional de fármacos que interaccionan con la SCP de PNS

La determinación de la estructura tridimensional de una SCP de PNS escindida, como aquí se describe, proporciona una base para el diseño de ligandos nuevos y específicos para el diagnóstico y/o el tratamiento de al menos una patología relacionada con SCP de PNS. Se pueden elegir diversos planteamientos para el uso de la estructura cristalina de una SCP de PNS en el diseño racional de ligandos de esta proteína. Opcionalmente se realiza un examen manual, asistido por ordenador, de la estructura de los sitios activos. Se utiliza un software tal como GRID [Goodford, J. Med. Chem. 28: 849-857 (1985)], un programa que determina los sitios de interacción probables entre sondas con diversas características de grupos funcionales y la superficie de la enzima, para analizar el sitio activo con objeto de determinar las estructuras de compuestos inhibidores. Se utilizan los cálculos del programa, con adecuadas moléculas y grupos inhibidores (por ejemplo, aminas primarias protonadas) como sondas, para identificar posibles puntos críticos alrededor de posiciones accesibles con niveles de perfil energético adecuados. Los ligandos adecuados, como composiciones o compuestos moduladores que inhiben o estimulan, son luego examinados en cuanto a actividades moduladoras de al menos una SCP de PNS.

Como aquí se describe, un ligando diagnóstico o terapéutico modulador de SCP de PNS puede ser, pero no se limita a, al menos uno seleccionado entre un ácido nucleico, un compuesto, una proteína, un elemento, un lípido, un anticuerpo, un sacárido, un isótopo, un hidrato de carbono, un agente formador de imágenes, una lipoproteína, una glicoproteína, una enzima, una sonda detectable, un anticuerpo o un fragmento del mismo, o cualquier combinación de los mismos, que puede ser detectablemente marcado como para la marcación de anticuerpos. Dichos marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores enzimáticos, compuestos o elementos radioisotópicos o radiactivos, compuestos o metales fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. Alternativamente, se puede utilizar cualquier otro agente diagnóstico o terapéutico conocido.

Una vez que se han realizado los experimentos preliminares para determinar la K_{a} del sustrato con cada actividad enzimática de una SCP de PNS, se determinan los valores de K_{i} para la naturaleza de la modulación del ligando, dependiente del tiempo [por ejemplo, mediante el método de Henderson (Biochem. J. 127: 321-333, 1972)]. Por ejemplo, se preincuban el sustrato (o el blanco, cuando sea apropiado) y la enzima en un tampón. Se inician las reacciones mediante la adición del sustrato. Se toman partes alícuotas a lo largo de un periodo adecuado de tiempo y se sofocan mediante la adición de una disolución sofocante adecuada (por ejemplo, hidróxido sódico en etanol acuoso). Se determina la concentración del producto, por ejemplo, fluorométricamente, utilizando un espectrómetro. Los gráficos de fluorescencia frente al tiempo pueden ser casi lineales durante el período de ensayo, y se utilizan para obtener los valores para la velocidad inicial en presencia (V_{i}) o ausencia (V_{o}) de ligando. En un gráfico de Henderson, el error está presente en ambos ejes, lo que le hace inapropiado para un análisis de regresión estándar [Leatherbarrow, Trends Biochem. Sci. 15: 455-458 (1990)]. Por lo tanto, se obtienen los valores de K_{i} a partir de los datos por ajuste a una versión modificada de la ecuación de Henderson para la inhibición competitiva:

100

en que [usando la notación de Henderson (Biochem. J. 127: 321-333, 1972)]:

101

\vskip1.000000\baselineskip

Esta ecuación se resuelve para la raíz positiva con la condición siguiente:

102

usando PROCNLIN de SAS (SAS Institute Inc, Cary, North Carolina, EE.UU.), que lleva a cabo una regresión no lineal utilizando técnicas de mínimos cuadrados. El método iterativo utilizado es opcionalmente el método de la secante multivariable, similar al método de Gauss-Newton salvo por que las derivadas de la serie de Taylor se estiman a partir del histograma de iteracciones en lugar de ser proporcionadas analíticamente. Se utiliza opcionalmente un criterio de convergencia adecuado, por ejemplo, cuando hay un cambio en la función de pérdida inferior a 10^{-a}.

Una vez que se han hallado los ligandos moduladores y se han aislado o sintetizado, se llevan a cabo estudios cristalográficos de los compuestos complejados con una SCP de PNS. Como un ejemplo no restrictivo, se remojan cristales de SCP de PNS durante 2 días en ligando 0,01-100 mM y se recogen datos de difracción de rayos X con un detector de área y/o un detector de placas de imágenes (por ejemplo, un detector Mar de placas de imágenes) usando una fuente anódica giratoria de rayos X. Los datos se recogen con la mayor resolución posible, tal como, por ejemplo, 0,15-0,35 nm, y se fusionan con un factor R sobre las intensidades adecuadas. Se construye un modelo atómico del inhibidor en el mapa Fourier de diferencias (F-F). El modelo puede ser refinado hasta una solución en un ciclo de hibridación simulada [Brünger (1987), infra] que implica 10-500 ciclos de refinación energética, 100-10.000 operaciones I-FS de dinámica a temperatura ambiental y/o 10-500 ciclos más de refinación energética. También se usan restricciones armónicas para la refinación atómica, salvo para átomos situados dentro de un radio de 1,0-1,5 nm del inhibidor. Se selecciona un factor R para el modelo, tanto para las desviaciones r.m.s. de las longitudes de enlace ideales como para los ángulos, respectivamente. Mediciones directas de la inhibición enzimática proporcionan una confirmación ulterior de que los ligandos modelados son moduladores de al menos una actividad biológica de una SCP de PNS.

De este modo, también se describen ligandos de una SCP de PNS basándose en la estructura cristalina de esta enzima. También es importante la demostración de los niveles clínicamente útiles, tal como, por ejemplo, la actividad in vivo. Se evalúan inhibidores de la actividad biológica de SCP de PNS en modelos animales (por ejemplo, rata, ratón y conejo) utilizando diversas vías de administración orales y parenterales. Utilizando este planteamiento, se espera que se produzca la modulación de una SCP de PNS en modelos animales adecuados utilizando los ligandos descubiertos mediante modelado molecular y cristalografía por rayos X. Como aquí se describe, el ligando puede ser, pero no se limita a, al menos uno seleccionado entre un ácido nucleico, un compuesto, una proteína, un elemento, un lípido, un anticuerpo, un sacárido, un isótopo, un hidrato de carbono, un agente formador de imágenes, una lipoproteína, una glicoproteína, una enzima, una sonda detectable, un anticuerpo o un fragmento del mismo, o cualquier combinación de los mismos, que puede ser detectablemente marcado como para la marcación de anticuerpos, como aquí se describe. Dichos marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores enzimáticos, compuestos o elementos radioisotópicos o radiactivos, compuestos o metales fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. Alternativamente, se puede utilizar cualquier otro agente diagnóstico o terapéutico conocido.

Un agente terapéutico como el aquí descrito puede ejercer un efecto terapéutico sobre la célula diana, tal como una célula o neurona del sistema nervioso periférico. Un agente terapéutico suministrado a una célula diana por medio de administración farmacéutica o por medio de un vector de distribución puede proporcionar un efecto seleccionado entre, pero que no se limita a: corregir un gen o una proteína defectuosos, una acción farmacológica, un efecto tóxico, un efecto estimulador del crecimiento, un efecto inhibidor del crecimiento, un efecto metabólico, un efecto catabólico, un efecto anabólico, un efecto neurohumoral, un efecto estimulador de la diferenciación celular, un efecto inhibidor de la diferenciación celular, un efecto neuromodulador, un efecto estimulador de células madre pluripotenciales, y cualesquier otros efectos terapéuticos que modulen al menos un SC en una célula del sistema nervioso periférico.

Un ácido nucleico terapéutico es un agente terapéutico que puede ejercer, aunque no se limita a ello, al menos uno de los siguientes efectos terapéuticos sobre una célula diana: inhibir la transcripción de una secuencia de DNA, inhibir la traducción de una secuencia de RNA, inhibir la transcripción inversa de una secuencia de RNA o DNA, inhibir una modificación postraduccional de una proteína, inducir la transcripción de una secuencia de DNA, inducir la traducción de una secuencia de RNA, inducir la transcripción inversa de una secuencia de RNA o DNA, inducir una modificación postraduccional de una proteína, transcripción del ácido nucleico como un RNA, traducción del ácido nucleico como una proteína o enzima, e incorporación del ácido nucleico a un cromosoma de una célula diana para expresión constitutiva o transitoria del ácido nucleico terapéutico.

Los efectos terapéuticos de los ácidos nucleicos terapéuticos pueden incluir, pero no se limitan a: desconexión de un gen defectuoso o procesamiento de la expresión del mismo, tal como RNA o DNA antisentido; inhibición de la replicación o la síntesis vírica; terapia génica como expresión de un ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína terapéutica o corrige una proteína defectuosa; modificación de un defecto o infraexpresión de un RNA, tal como un hnRNA, un mRNA, un tRNA o un rRNA; codificación de un fármaco o profármaco, o de una enzima que genera un compuesto como fármaco o profármaco en células patológicas o normales que expresan el receptor quimérico; y cualesquier otros efectos terapéuticos conocidos.

Un ácido nucleico terapéutico que codifica, o proporciona el efecto terapéutico de, cualquier toxina, profármaco o fármaco génico conocido para distribución a células nerviosas patógenas puede también incluir genes bajo el control de una secuencia reguladora de la transcripción (TRS; del inglés, transcriptional regulatory sequence) tisularmente específica para células que contienen SC patógeno. Dichas TRSs limitarían además la expresión del agente terapéutico en la célula diana, de acuerdo con métodos conocidos.

Los ejemplos no restrictivos de dichos ligandos o agentes moduladores de SCP de PNS aquí descritos y de los métodos para los mismos incluyen compuestos de piperizina sustituidos con metilo/halofenilo, tal como lidoflazina (véanse, por ejemplo, Merck Index Monograph 5311 y la Patente de EE.UU. nº 3.267.104, ambas incorporadas aquí por referencia en su totalidad). Se analizaron dichos compuestos y se halló que inhibían la actividad de canal de sodio de al menos una SCP de PNS del presente invento en líneas celulares que expresan al menos una SCP de PNS, tales como PC12, PK1-4 y otras células aisladas o recombinantes que expresan al menos una SCP de PNS del presente invento. En consecuencia, se describen ligandos o agentes moduladores de SCP de PNS como piperizinas sustituidas con metilo/halofenilo. Las sustituciones pueden incluir piperizinas sustituidas con alquilo y/o halofenilo.

Administración farmacéutica diagnóstica

Utilizando composiciones o compuestos moduladores de SCP de PNS (incluyendo antagonistas y agonistas como los anteriormente descritos), se describe un método para modular la actividad de la proteína SCP de PNS en una célula. En general, los agentes (antagonistas o agonistas) que han sido identificados por inhibir o potenciar la actividad de SCP de PNS pueden ser formulados para que el agente pueda entrar en contacto con una célula que expresa una proteína SCP de PNS in vivo. La entrada en contacto de dicha célula con dicho agente da lugar a la modulación in vivo de la actividad de las proteínas SCP de PNS. Con tal de que no exista una barrera de formulación ni una barrera de toxicidad, los agentes identificados en los ensayos anteriormente descritos serán eficaces para uso in vivo.

También se describe un método para administrar SCP de PNS o una composición o compuesto modulador de SCP de PNS (incluyendo antagonistas y agonistas de SCP de PNS) a un animal [preferiblemente, un mamífero (específicamente, un ser humano)] en una cantidad suficiente para originar un nivel alterado de SCP de PNS en el animal. El SC de PNS administrado o la composición o compuesto modulador de SCP de PNS administrado podría efectuar específicamente funciones asociadas con SCP de PNS. Además, puesto que la SCP de PNS se expresa en tejido del sistema nervioso periférico, la administración de SC de PNS o de una composición o compuesto modulador de SCP de PNS podría ser utilizada para alterar los niveles de SCP de PNS en el sistema nervioso periférico.

Se pueden usar antagonistas de SCP de PNS para tratar el dolor debido a traumas o una patología que afecta al sistema nervioso central o periférico, o patologías relacionadas con unos niveles de expresión anormalmente elevados de al menos un canal de sodio (SC) presente en la naturaleza y específico del sistema nervioso (NS), en que un antagonista de SCP de PNS también inhibe al menos un SC de PNS, o en que el dolor es mediado en cierto grado por SC de PNS. Dichas patologías incluyen, pero no se limitan a: enfermedades inflamatorias, neuropatías (por ejemplo, neuropatía diabética), distrofias (por ejemplo, distrofia simpática refleja y neuralgia posherpética); traumas (daño tisular por cualquier causa); y dolor local por cualquier causa.

Las enfermedades inflamatorias pueden incluir, pero no se limitan a, patologías inflamatorias crónicas y patologías inflamatorias vasculares. Las patologías inflamatorias crónicas incluyen, pero no se limitan a, sarcoidosis, enfermedad inflamatoria intestinal crónica, colitis ulcerosa y patología de Crohn, y las patologías inflamatorias vasculares incluyen, pero no se limitan a, coagulación intravascular diseminada, aterosclerosis y patología de Kawasaki.

Se pueden utilizar agonistas de SCP de PNS para tratar patologías que afectan al sistema nervioso central o periférico, o patologías relacionadas con unos niveles de expresión anormalmente bajos de al menos un canal de sodio (SC) presente en la naturaleza y específico del sistema nervioso (NS), en que un agonista de SCP de PNS potencia o estimula al menos un SC de NS. Dichas patologías incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades del tracto gastrointestinal debidas a una disfunción del sistema nervioso entérico (por ejemplo, colitis, ileítis y síndrome inflamatorio intestinal), enfermedades del sistema cardiovascular (por ejemplo, hipertensión e insuficiencia cardíaca congestiva), enfermedades del tracto genitourinario que afectan a la inervación simpática y parasimpática (por ejemplo, hiperplasia benigna de próstata e impotencia) y enfermedades del sistema neuromuscular (por ejemplo, distrofia muscular, esclerosis múltiple y epilepsia).

Las enfermedades neurodegenerativas pueden incluir, pero no se limitan a, enfermedades desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple y mielitis transversa aguda; trastornos de movimiento hipercinético, tales como corea de Huntington y corea senil; trastornos de movimiento hipocinético, tal como la enfermedad de Parkinson; parálisis supranuclear progresiva; degeneraciones espinocerebelosas, tales como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones de múltiples sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager y Machado-Joseph), y trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoproteinemias, ataxia, telangiectasia y trastorno mitocondrial multisistémico); trastornos centrales desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple y mielitis transversa aguda; y trastornos de la unidad motora, tales como atrofias musculares neurogénicas (degeneración celular del cuerno anterior, tal como esclerosis lateral a-
miotrófica, atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil); y cualquier subconjunto de los mismos.

La administración farmacéutica/diagnóstica de una composición o compuesto diagnóstico/farmacéutico del invento para una patología relacionada con SC de PNS puede ser llevada a cabo mediante cualquier medio con que se alcance su pretendida finalidad, tal como, por ejemplo, tratar o prevenir un cáncer o un estado precanceroso.

Como se utiliza aquí, el término "protección", como en "protección de una infección a una enfermedad", abarca "prevención", "supresión" o "tratamiento". "Prevención" implica la administración de una composición farmacéutica antes de la inducción de la enfermedad. "Supresión" implica la administración de la composición antes de la aparición clínica de la enfermedad. "Tratamiento" implica la administración de la composición protectora después de la aparición de la enfermedad. Se entenderá que, en medicina y veterinaria, no siempre es posible distinguir entre "prevenir" y "suprimir" ya que el proceso o los procesos inductivos finales pueden ser desconocidos o latentes, o el paciente no es examinado hasta bien después de la aparición del proceso o los procesos. Por lo tanto, es habitual utilizar el término "profilaxis" como distinto de "tratamiento" para abarcar tanto "prevenir" como "suprimir", como aquí se definen. Como se utiliza aquí, con el término "protección" se quiere incluir la "profilaxis". Véanse, por ejemplo, Berker, infra; Goodman, infra; Avery, infra; y Katamg, infra; que se incorporan aquí por referencia en su totalidad, incluyendo todas las referencias en ellos citadas. No es necesario que la "protección" proporcionada sea absoluta; es decir, no es necesario que la enfermedad sea totalmente prevenida o erradicada con tal de que haya una mejoría estadísticamente significativa con respecto a una población de control. La protección puede limitarse a mitigar la gravedad o la rapidez de inicio de los síntomas de la enfermedad.

Al menos una composición o compuesto modulador de SC de PNS aquí descrito puede ser administrado por cualquier medio con que se alcance la finalidad pretendida, utilizando una composición farmacéutica como la previamente descrita.

Por ejemplo, la administración puede ser por diversas vías parenterales, tales como las vías subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, intracraneal, transdérmica o bucal. Alternativa o simultáneamente, la administración puede ser por la vía oral. La administración parenteral puede ser por inyección en bolo o por perfusión gradual a lo largo del tiempo.

Un modo adicional de uso de una composición o compuesto diagnóstico/farmacéutico aquí descrito es mediante aplicación tópica. Una composición o compuesto diagnóstico/farmacéutico del invento puede ser incorporado a vehículos de aplicación tópica tales como pomadas o ungüentos.

Para aplicación tópica, se prefiere administrar una cantidad eficaz de una composición o compuesto diagnóstico/farmacéutico de acuerdo con el invento a una zona específica, por ejemplo, superficies cutáneas, membranas mucosas y similares, que esté adyacente a las neuronas periféricas que se van a tratar. Esta cantidad variará generalmente de aproximadamente 0,0001 mg a aproximadamente 1 g de un compuesto modulador de SC de PNS por aplicación, dependiendo del área que se va tratar, si el uso es diagnóstico, profiláctico o terapéutico, la gravedad de los síntomas y la naturaleza del vehículo tópico empleado. Una preparación tópica preferida es un ungüento, en el que se utiliza de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 50 mg de ingrediente activo por cm^{3} de base para ungüento.

Un régimen típico para tratamiento o profilaxis comprende la administración de una cantidad eficaz a lo largo de un período de uno a varios días, hasta, e incluyendo, entre una semana y aproximadamente seis meses.

Se entiende que la dosificación de una composición o compuesto diagnóstico/farmacéutico del invento, administrado in vivo o in vitro, dependerá de la edad, el sexo, la salud y el peso del receptor, la clase del tratamiento concurrente, si lo hubiera, la frecuencia de tratamiento y la naturaleza del efecto diagnóstico/farmacéutico deseado. Los intervalos de las dosis eficaces aquí proporcionados no están destinados a ser restrictivos y representan intervalos de dosis preferidos. Sin embargo, la dosificación más preferida se adaptará al sujeto individual, como es entendido y determinable por un experto en las técnicas pertinentes. Véanse, por ejemplo, Berkow et al., redactores, "The Merck Manual", 16ª edición, Merck and Co., Rahway, New Jersey, EE.UU., 1992; Goodman et al., redactores, "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8ª edición, Pergamon Press, Inc., Elmsford, New York, EE.UU. (1990); "Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics", 3ª edición, ADIS Press, Ltd., Williams y Wilkins, Baltimore, Mariland, EE.UU. (1987); Ebadi, "Pharmacology", Little, Brown and Co., Boston, EE.UU. (1985); Osol et al., redactores, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18ª edición, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, EE.UU. (1990); y Katzung, "Basic and Clinical Pharmacology", Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut, EE.UU. (1992). Las moléculas del invento, como se definen en las reivindicaciones adjuntas, pueden ser utilizadas en el diagnóstico o la terapia, como aquí se discute.

La dosis total requerida para cada tratamiento puede ser administrada mediante dosis múltiples o en una sola dosis. La composición o compuesto diagnóstico/farmacéutico puede administrarse solo o junto con otros compuestos diagnósticos y/o farmacéuticos dirigidos a la patología o dirigidos a otros síntomas de la patología.

Las cantidades eficaces de una composición o compuesto diagnóstico/farmacéutico del invento son de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, administrados a intervalos de 4-72 horas, durante un período de 2 horas a 1 año y/o durante cualquier intervalo o valor de dicho intervalo, tal como 0,0001-1,0, 1-10, 10-50 y 50-100, 0,0001-0,001, 0,001-0,01, 0,01-0,1, 0,1-1,0, 1,0-10, 5-10, 10-20, 20-30 y 50-100 mg/kg, a intervalos de 1-4, 4-10, 10-16, 16-24, 24-36, 36-48 o 48-72 horas, durante un periodo de 1-14, 14-28 o 30-44 días, o 1-24 semanas, o cualquier intervalo o valor de dichos intervalos.

Los receptores de la administración de compuestos y/o composiciones del invento pueden ser cualesquier animales vertebrados, tales como mamíferos, aves, peces óseos, anguilas eléctricas, ranas y sapos. Entre los mamíferos, los receptores preferidos son mamíferos de los órdenes Primata (incluyendo seres humanos, simios y monos), Artiodactyla (incluyendo caballos, cabras, vacas, ovejas y cerdos), Rodentia (incluyendo ratones, ratas, conejos y hámsteres) y Carnivora (incluyendo gatos y perros). Entre las aves, los receptores preferidos son los pavos, las gallinas y otros miembros del mismo orden. Los receptores más preferidos son los seres humanos.

Terapia génica

Un vector de distribución del presente invento puede ser, pero no se limita a, un vector vírico, un liposoma, un anticuerpo anti-SCP de PNS o anti-SC, o un ligando de SC; vectores de distribución de los cuales uno o más están asociados con un agente diagnóstico o terapéutico.

El vector de distribución puede comprender cualquier agente diagnóstico o terapéutico que ejerza un efecto terapéutico o diagnóstico sobre la célula diana. De esta forma, la especificidad del vector de distribución con respecto a la célula diana es proporcionada por el uso de un vector de distribución específico para la célula diana.

El vector de distribución puede ser también un vector vírico recombinante que comprenda al menos un dominio ligante seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo o un fragmento del mismo, un anticuerpo o fragmento del mismo con sitio ligante quimérico, una célula diana o un ligando específico, un receptor que se une a un ligando de la célula diana, un anticuerpo antiidiotípico, un liposoma u otro componente que sea específico para la célula diana. Una SCP de PNS puede estar ya asociada con la célula diana, o el vector de distribución puede unirse a la célula diana a través de un ligando para un receptor de la célula diana, o viceversa.

De este modo, el agente terapéutico o diagnóstico, tal como un ácido nucleico, proteína, fármaco, compuesto, composición o similar terapéutico o diagnóstico, es distribuido preferentemente a la célula diana, donde, por ejemplo, el ácido nucleico se incorpora preferiblemente al cromosoma de la célula diana, con la exclusión parcial o completa de células no diana.

El invento se destina así a proporcionar vectores de distribución que contienen uno o más agentes terapéuticos y/o diagnósticos, incluyendo vectores adecuados para terapia génica.

En un método para tratar una enfermedad asociada con SCP de PNS en un paciente que necesita dicho tratamiento, se puede proporcionar DNA funcional de SCP de PNS a las células del PNS de dicho paciente de una manera y en una cantidad que permitan la expresión de la proteína SCP de PNS proporcionada por dicho gen, durante un tiempo y en una cantidad suficientes para tratar a dicho paciente, tal como un vector de distribución adecuado. En la técnica se conocen muchos sistemas vectores que proporcionan dicha distribución a pacientes humanos que necesitan un gen o proteína que falta en la célula. Por ejemplo, se pueden utilizar sistemas de retrovirus, especialmente sistemas de retrovirus modificados y especialmente sistemas del virus herpes símplex. Dichos métodos se proporcionan en, por ejemplo, las enseñanzas de Breakefield et al., The New Biologist 3: 202-218 (1991); Q. Huang et al., Experimental Neurology 115: 303-316 (1992), el Documento WO93/03743 y el Documento WO90/09441. La distribución de una secuencia de DNA que codifica una proteína SCP funcional de PNS repondrá eficazmente el gen SCP perdido o mutado de PNS del invento.

Alternativamente, la composición o compuesto modulador de SCP de PNS se expresa como un gen recombinante en una célula, de modo que las células pueden ser trasplantadas a un mamífero, preferiblemente un ser humano, que necesite terapia génica. Para proporcionar terapia génica a un individuo, una secuencia genética que codifica la composición o compuesto modulador de SCP de PNS es añadida a un vector e introducida en una célula huésped. Los ejemplos de enfermedades que pueden ser adecuadas para terapia génica incluyen, pero no se limitan a, enfermedades o trastornos neurodegenerativos, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, epilepsia, neoplasias y cáncer. Los ejemplos de vectores que pueden ser utilizados en terapia génica incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovíricos o adenovíricos defectuosos u otros vectores víricos [R. C. Mulligan, Science 260: 926-932 (1993)]. Véanse Anderson, Gene Therapy, 246 J. Amer. Med. Assn. 2737 (1980); Friedmann, "Progress toward human gene therapy", 244 Science 1275 (1989); Anderson, 256 Science 808 (1992); protocolos de terapia génica humana publicados en Human Gene Therapy, Mary Ann Liebert Publishers, New York (1990-1994); Bank et al., 565 Ann. N.Y. Acad. Sci. 37 (1999); "LTR-Vectors" (Patente de EE.UU. nº 4.405.712); Ausubel, infra, párrafos 9.10-9.17; y Jon A. Wolff, redactor, "Gene Therapeutics: methods and applications of direct gene transfer", Birkhäuser, Boston (1994).

Los medios por los cuales se puede introducir el vector que lleva el gen en la célula incluyen, pero no se limitan a, microinyección, electroporación, transducción o transfección utilizando DEAE-dextrano, lipofección, uso de fosfato cálcico y otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica (Sambrook, infra: Ausubel, infra).

Las preparaciones para administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Son ejemplos de disolventes no acuosos: propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tal como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tal como el oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua y disoluciones, emulsiones y suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo disolución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro sódico; dextrosa y cloruro sódico de Ringer, disolución de Ringer con lactato, y aceites no volátiles. Los vehículos intravenosos incluyen agentes que reponen fluidos y nutrientes, agentes que reponen electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. También puede estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Véase, en general, Osol et al., redactores, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16ª edición (1980).

También se describe una composición farmacéutica que comprende una composición o compuesto modulador de SC de PNS o SCP de PNS en una cantidad suficiente para alterar la actividad asociada con SCP de PNS, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las concentraciones y los tamaños de dosificación unitarios apropiados pueden ser fácilmente determinados por un experto en la técnica [véanse, por ejemplo, Osol et al., redactores, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16ª edición, Mack, Easton, Pennsylvania, EE.UU. (1980), y el Documento WO 91/19008].

También se describen aquí composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de al menos un oligonucleótido antisentido de SCP de PNS, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichos oligonucleótidos antisentido incluyen, pero no se limitan a, al menos una secuencia de nucleótidos de 12-500 bases de longitud que es complementaria de una secuencia de DNA de la ID. SEC. nº 1, o una secuencia de DNA que codifica al menos 4 aminoácidos de la ID. SEC. nº 2 o la Figura 11A-11E.

Alternativamente, se puede combinar el ácido nucleico de SCP de PNS con un vehículo lipófilo tal como uno cualquiera de diversos esteroles, incluyendo colesterol, colato y ácido desoxicólico. Un esterol preferido es el colesterol.

Los ácidos nucleicos de SCP de PNS para terapia génica y las composiciones farmacéuticas del invento se pueden administrar mediante cualquier medio con que se alcance su finalidad pretendida. Por ejemplo, la administración puede ser por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o transdérmica. La dosis administrada dependerá de la edad, la salud y el peso de receptor, la clase del tratamiento concurrente, si lo hubiera, la frecuencia de tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.

Las composiciones incluidas dentro del alcance de este invento incluyen todas las composiciones en que el ácido nucleico de SCP de PNS (como se define en las reivindicaciones adjuntas) está contenido en una cantidad eficaz para conseguir una expresión potenciada de al menos una SCP de PNS en una neurona o ganglio del sistema nervioso periférico. Aunque las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos de las cantidades eficaces de cada componente está dentro de la experiencia de la técnica. Típicamente, el ácido nucleico de SCP de PNS puede ser administrado a mamíferos, por ejemplo, a seres humanos, en una dosis de 0,005 a 1 mg, o una cantidad equivalente de la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por kg de peso corporal del mamífero que se trata y por día.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas del ácido nucleico de SCP de PNS en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones oleosas para inyección apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen ácidos grasos, tal como, por ejemplo, aceite de sésamo, y ésteres sintéticos de ácidos grasos, tales como, por ejemplo, oleato de etilo y triglicéridos. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores.

Alternativamente, al menos una SCP de PNS puede ser codificada por construcciones de DNA que son administradas en forma de viriones, los cuales son preferiblemente incapaces de replicarse in vivo (véase, por ejemplo, Taylor, Documento WO 92/06693). Alternativamente, secuencias de RNA antisentido de SCP de PNS, ribozimas de SCP de PNS y EGS de SCP de PNS pueden ser codificadas por construcciones de RNA que son administradas en forma de viriones, tales como retrovirus o adenovirus recombinantes, deficientes en cuanto a la replicación. La preparación de vectores retrovíricos es bien conocida en la técnica [véase, por ejemplo, Brown et al., "Retroviral Vectors" en DNA Cloning: A Practical Approach, volumen 3, IRL Press, Washington, Distrito de Columbia, EE.UU. (1987)].

Se puede conferir especificidad para la expresión génica en el sistema nervioso periférico utilizando apropiadas secuencias reguladoras celularmente específicas, tales como potenciadores y promotores celularmente específicos. Puesto que la fosforilación de proteínas es crítica para la regulación neuronal [Kennedy, "Second Messengers and Neuronal Function" en An Introduction to Molecular Neurobiology, redactado por Hall, Sinauer Associates, Inc. (1992)], se pueden usar secuencias promotoras de proteína cinasas para alcanzar unos niveles suficientes de expresión del gen SCP de PNS.

Por lo tanto, la terapia génica puede ser utilizada para aliviar una patología relacionada con el canal de sodio al inhibir la expresión inapropiada de una forma particular de SC de PNS. Además, la terapia génica puede ser utilizada para aliviar dichas patologías al proporcionar el nivel de expresión apropiado de una forma particular de SCP de PNS. En este caso, las secuencias de ácido nucleico de SCP de PNS particulares pueden ser codificadas por construcciones de DNA o RNA que son administradas en forma de virus, como se describió anteriormente.

Una vez descrito ahora el invento de forma general, el mismo será más fácilmente entendido por referencia a los ejemplos siguientes, los cuales se proporcionan a modo de ilustración y no están destinados a ser restrictivos del invento, a menos que así se especifique.

Ejemplo 1 Clonación y secuenciación de un ácido nucleico que codifica SC de PNS Materiales y métodos Cultivo celular

Se cultivaron células C12 y subclones PKI-4 PC12 del modo previamente descrito (Mandel et al., 1988). Se añadió NGF (subunidad de 2,5 S, amablemente proporcionada por el Dr. S. Halegous, SUNY en Stony Brook) al medio de cultivo en una concentración final de 110 ng/ml. El subclón PKI-4 PC12 que expresa la proteína inhibidora de cinasas dependientes de cAMP (PKI) fue también proporcionado por el Dr. S. Halegous [véase D'Arcangelo et al., J. Cell Biol. 122: 915-921 (1993)].

Multiplicación por PCR

Se aisló el RNA celular total, de acuerdo con el método de Cathals et al., DNA 2: 329-335 (1983), a partir de un subclón de PC12 (PKI-4) que expresa niveles elevados de la proteína inhibidora de proteína cinasas dependientes de cAMP. Se utilizaron 2 \mug de RNA total preparado a partir de células PKI-4 tratadas con NGF, para sintetizar el cDNA de primera cadena utilizando cebadores hexámeros aleatorios para la reacción de la transcriptasa inversa. El cDNA servía entonces como molde para la multiplicación por PCR utilizando una pareja de cebadores oligonucleotídicos degenerados que especificaban una región de 400 pares de bases (bp; del inglés, base pairs) dentro del dominio III de repetición del gen de la subunidad \alpha del canal de sodio. El cebador 5' [denominado YJ1: GCGAAGCTT(TC)TIATTTT(TI)I(GATC)IAT-(ATC)ATGGG (ID. SEC. nº 3); la zona subrayada indica un sitio de restricción de HindIII] correspondía a los aminoácidos FWLIFSIM (ID. SEC. nº 4) de las posiciones 1347-1354 del gen del canal de sodio de tipo U. El cebador 3' [denominado YOIC: GCAGGATCC(AG)TT(AG)AAA(AG)TT(AG)TC(AGT)AT(AGT)AT(AGCT)AC(AGCT)CC (ID. SEC. nº 5); la zona subrayada indica un sitio de restricción de BamHI] correspondía a los aminoácidos GVIIDNFN (ID. SEC. nº 6) de las posiciones 1470-1447 del gen de tipo II. La mezcla de la reacción de multiplicación consistía en 5% del cDNA, MgCI_{2} 1 mM, dNTPSs 0,2 mM, cada cebador 0,5 M y Taq polimerasa (Perkin-Elmer) en un tampón que consistía en KCl 0,1 M, TRIS-HCl 0,1 M (pH de 8,3) y gelatina (1 mg/ml). La reacción se llevó a cabo en un termociclador Perkin-Elmer del modo siguiente: 5 ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 min), hibridación (37ºC, 1 min) y extensión (72ºC, 1 min), seguidos de 25 ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 min), hibridación (50ºC, 1 min) y extensión (72ºC, 1 min). Los productos de PCR fueron extraídos de un gel de agarosa de bajo punto de fusión (SEAPLAQUE GTG, FMC BIOPRODUCTS) y fueron subclonados en un vector plasmídico Bluescript II SK previamente restringido con HindIII y BamHI. Los clones fueron explorados en cuanto a insertos de cDNA mediante un kit miniprep (Sambrook et al., infra) y fueron secuenciados en ambas direcciones mediante el método didesoxi de terminación de cadena (sistema Sequenase 2.0, UNITED STATES BIOCHEMICAL). Los datos de secuencias fueron compilados y analizados utilizando el software GENWORKS (INTELLIGENETICS, Inc., Mountain View, California, EE.UU.).

Construcción y exploración de bancos de cDNA

Se purificó mRNA poli(A)+ a partir del subclón PKI-4 PC12 (kit de purificación de mRNA, PHARMACIA) y se usó para construir un banco de cDNA en Lambda ZAP II, aleatoriamente cebado con oligo(dT) (STRATAGENE Corp., La Jolla, California, EE.UU.). El banco consistía en 5,6 x 10^{4} clones independientes antes de la multiplicación. La exploración de aproximadamente 4 x 10^{4} recombinantes usando el producto de PCR clonado pPC12-1, marcado con cebadores aleatorios (kit de PHARMACIA), dio lugar al aislamiento de 5 cDNAs cuyo tamaño variaba entre 1 y 3 kb. El análisis de las secuencias y la comparación con secuencias publicadas estableció que dos de los cDNAs codificaban conjuntamente 3033 pares de bases de la nueva subunidad \alpha del canal de sodio, PN1.

Análisis por transferencia Northern y ensayos de protección frente a ribonucleasas

Se aisló el RNA celular total del cerebro, médula espinal, ganglio cervical superior, ganglio de la raíz dorsal, músculo esquelético, músculo cardíaco y glándula suprarrenal de ratas Sprague-Dawley adultas utilizando el método estándar de Chirgwin, Biochemistry 18: 5294-5299 (1979). El RNA fue sometido a electroforesis y fue transferido a una membrana de nailon del modo previamente descrito [Cooperman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8721 (1987)] (DURALON-UV; STRATAGENE Corp.). Las transferencias de RNA fueron entrecruzadas con el nailon utilizando el agente entrecruzador Stratalinker UV (STRATAGENE Corp.) y fueron hibridadas con sondas de RNA antisentido marcadas con ^{32}P-UTP, generadas a partir de los moldes linealizados siguientes: pRC12-1 pRB211 (Cooperman, infra), p1B15 [ciclofilina; Danielson et al., DNA 7: 261-267 (1988)] y el tipo 1 de cerebro de rata, que contiene 51 bp de secuencia intrónica 5' no traducida y 267 bp de secuencia codificadora del canal de sodio de tipo I. Las sondas de RNA se transcribieron con RNA polimerasa de T3 (pC12-1), T7 (pNach1) o SP6 (pRB211, p1B15) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (PROMEGA Corp., Madison, Wisconsin, EE.UU.). Las transferencias se lavaron una vez en SSC 2x, dodecilsulfato sódico al 0,1%, durante 15 minutos a 68ºC, lo que fue seguido de dos lavados en SSC 0,2x, dodecilsulfato sódico al 0,1%, durante 15 minutos a 68ºC. Se utilizó una autorradiografía con película XAR-5 preactivada (EASTMAN KODAK Co., Rochester, New York, EE.UU.) para la cuantificación de mRNA por densitometría.

Los ensayos de protección frente a ribonucleasas se llevaron a cabo mediante el uso de un kit (RPA II, AMBION Inc., Austin, Texas, EE.UU.). Se hibridó el RNA total con 10^{-4} cpm de sonda de RNA antisentido generada a partir de pPC12-1. Para controlar las diferencias en la cantidad de RNA total entre las muestras, se incluyó una sonda de RNA antisentido para actina P, transcrita a partir de pTRI-\beta-actina.

Hibridación in situ

Se llevaron a cabo una preparación tisular y una hibridación utilizando una modificación del procedimiento descrito por Yokouchi et al., Develop. 113: 431-444 (1991). Se disecaron el SCG y el DRG de ratas Sprague-Dawley adultas y se fijaron en paraformaldehído al 4% (en PBS 0,1 M) durante 2-6 horas a 4ºC. El tejido fue luego enjuagado durante \approx 5 minutos en PBS 0,1 M (pH de 7,3), crioprotegido en sacarosa al 30% (en PBS 0,1 M) durante 2 horas a 4ºC y embebido en O.C.T. (TISSUETEK). Se recogieron cortes (14 \mum) por criotomo en portaobjetos SUPERFROST/Plus (FISHER SCIENTIFIC), se secaron durante \approx 2 horas a temperatura ambiental y luego se almacenaron a -80ºC.

Inmediatamente antes de la prehibridación, los cortes fueron llevados a la temperatura ambiental y fueron rehidratados en PBS 0,1 M (pH 7,3) que contenía Triton X-100 al 0,3% durante 5 minutos. Los cortes fueron luego tratados con HCl 0,2 N durante 20 minutos, lavados en PBS 0,1 M durante 5 minutos y sometidos a digestión con proteinasa K (5 \mug/ml en PBS 0,1 M) durante 40 minutos a 37ºC. Los cortes fueron luego posfijados con paraformaldehído al 4% (en PBS 0,1 M), enjuagados con PBS 0,1 M que contenía glicocola 0,1 M durante 15 minutos y equilibrados en formamida al 50%, SSC 2x, durante 1 hora (temperatura ambiental).

Los cortes fueron hibridados con sondas de RNA antisentido marcadas con digoxigenina, transcritas a partir de pPC12-1 o pNach2 [Cooperman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8721 (1987)] de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la marcación de RNA con digoxigenina-UTP (BOEHRINGER MANNHEIM). Se sintetizaron sondas no marcadas al sustituir la digoxigenina-UTP por rUTP. Cada corte fue cubierto con \approx 100 \mul de disolución de hibridación que contenía TRIS-HCl 20 mM (pH 8,0), EDTA 2,5 mM, formamida al 50%, NaCl 0,3 M, disolución de Denhardt 1x, sulfato de dextrano al 10%, 1 mg/ml de tRNA, y sonda en una concentración de 0,7 \mug/ml. Los cortes fueron luego cubiertos con cubreobjetos PARAFILM y fueron incubados en una cámara húmeda durante la noche a 45ºC. Después de la hibridación, los cortes fueron lavados en formamida al 50%, SSC 2x, a 45ºC durante 1 hora, lo que fue seguido de digestión con RNasa en NaCl 0,5 M, TRIS-HCl 10 mM (pH de 8,0) y 20 \mug/ml de RNasa A (BOEHRINGER MANNHEIM). Los cortes fueron posteriormente lavados a 45ºC en formamida al 50%, SSC 2x, durante 1 hora, y formamida al 50%, SSC 1x, durante 1 hora.

La detección inmunológica se llevó a cabo utilizando un kit (kit GENIUS 3, BOEHRINGER MANNHEIM) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En la mayoría de los experimentos, los cortes fueron incubados en la disolución de color durante 3-5 horas a temperatura ambiental. Los cortes fueron luego cubiertos con cubreobjetos AQUA-MOUNT (Lerner Laboratories) y fueron almacenados en oscuridad.

Densitometría

Se determinaron los niveles de mRNA de canal de sodio por análisis densitométrico de los autorradiogramas usando el software Bio Image (Millipore Corp., Ann Arbor, Michigan, EE.UU.). Los niveles de RNA fueron normalizados con respecto a los niveles cuantificados de mRNA de ciclofilina.

Resultados Aislamiento de un cDNA expresado preferentemente en nervio periférico

D'Arcangelo et al., J. Cell Biol. 122: 915-921 (1993) habían mostrado previamente que el tratamiento de células PC12 con NGF aumenta el nivel de un transcrito de gen de canal de sodio, de \approx 11 kb, que no se hibridaba con sondas específicas para cualquiera de los genes de canal de sodio conocidos. También se detectó un transcrito de idéntico tamaño en mRNA de ganglios simpáticos y sensoriales de rata adulta, pero no en mRNA de cerebro. Estos resultados sugerían que el transcrito codificaba un nuevo miembro de la familia de genes de canal de sodio [denominado tipo 1 de nervio periférico (PN1)].

Para confirmar la identidad del gen PN1, cDNAs de un subclón de PC12 tratado con NGF que expresa preferentemente mRNA de PN1 (células PKI-4; D'Arcangelo et al.) fueron multiplicados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un par de cebadores oligonucleotídicos degenerados que especifican una región de 400 pares de bases (bp) del gen de la subunidad \alpha del canal de sodio (véase Métodos, Figura 1). Ambos cebadores especificaban supuestas regiones que atraviesan la membrana dentro del dominio III de repetición, que están muy conservadas entre los canales de sodio sensibles al voltaje. Las regiones multiplicadas entre los cebadores incluyen los restos exactamente conservados que revisten los poros, así como restos que son divergentes entre las diferentes subunidades \alpha de mamífero. El análisis de las secuencias de los productos de PCR reveló un cDNA, pPC12-1, que codificaba una porción de una supuestamente nueva subunidad \alpha de canal de sodio (Figura 1). Además, se aislaron cDNAs adicionales que encapsulaban la región codificadora completa de PN1.

Para determinar si pPC12-1 codifica parte del gen PN1, se usó el cDNA para generar sondas de RNA antisentido para el análisis, por transferencia Northern, de mRNA procedente de células PC12 tratadas con testigo y tratadas con NGF (Figura 2B). Para comparación, se hibridó una transferencia duplicada (Figura 2A) con una sonda antisentido pRB211, que codifica una región muy conservada de la subunidad \alpha del canal de sodio [Cooperman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8721 (1987)] y que se hibrida cruzadamente con el transcrito PN1; como muestran D'Arcangelo et al., J. Cell Biol. 122: 915-921 (1993), los niveles del transcrito detectado deberían aumentar rápida y transitoriamente después del tratamiento con NGF (máximo \approx 5 horas). La comparación de las Figuras 2A y 2B muestra que pPC12-1 satisfacía ambos criterios. Además, consistentemente con D'Arcangelo et al., J. Cell Biol. 122: 915-921 (1993), se halló ahora que la inducción, por NGF, del transcrito detectado por pPC12-1 es independiente de la actividad proteína cinasa dependiente de cAMP.

Para aislar cDNAs adicionales que codifican PN1, se preparó un banco de cDNA en Lambda ZAP II, aleatoriamente cebado con oligo(dT) (STRATAGENE, 5,6 x 10^{6} clones independientes), a partir de mRNA poli(A)+ aislado del mismo subclon de PC12 del que se había aislado pPC12-1. La exploración de 4 x 10^{4} recombinantes con una sonda generada a partir de pPC12-1 dio lugar al aislamiento de 2 cDNAs solapantes adicionales que se unen para proporcionar un cDNA de 3033 bp (Figura 7). Además, se aislaron cDNAs adicionales que encapsulaban la región codificadora completa de PN1.

Análisis de la deducida estructura primaria de PN1

Como se muestra en la Figura 8, la deducida estructura primaria de PN1 codifica el dominio II de repetición del gen de la subunidad \alpha del canal de sodio. La comparación con el canal de sodio de tipo II muestra que la secuencia de PN1 contiene todos los motivos estructurales característicos de los canales de sodio sensibles al voltaje, incluyendo seis supuestos dominios transmembranales (IIIS1-IIIS6). El dominio S4, del que se piensa que sirve como sensor del voltaje, presenta un patrón muy conservado de un resto positivamente cargado (lisina o arginina) en cada tercera posición. Además, los supuestos segmentos de revestimiento de poro (IIISS1-IIISS2) contienen restos de los que se ha mostrado que están implicados en una permeación selectiva para el sodio [Heinemann et al., Nature 356: 441-443 (1992)] así como en afinidad por TTX [Terlau et al., FEBS Lett. 293: 93-96 (1991)].

Además de dichas características estructurales muy conservadas, la subunidad \alpha del canal de sodio experimenta varias modificaciones postraduccionales características. Todos los canales de sodio secuenciados hasta la fecha presentan un patrón distintivo de sitios de glicosilación enlazados a asparagina (enlazados a N), que se encuentran casi exclusivamente en los bucles extracelulares que unen las hélices transmembranales S5 y S6. Los sitios de glicosilación de PN1 enlazados a N se corresponden bien con este patrón; tres posibles sitios de glicosilación extracelulares están situados entre IIIS5 y IIIS6. Dos de los sitios también se encuentran en los canales de sodio de tipos I, II y III.

La subunidad \alpha es fosforilada por la proteína cinasa C (PKC), y la deducida secuencia de PN1 contiene el sitio de fosforilación de consenso por PKC muy conservado en la serina^{1506} (Figura 1). Este resto está situado en el bucle citoplásmico que une los dominios III y IV, que ha sido implicado en la inactivación del canal, y un análisis mutacional ha mostrado que esta serina es necesaria para la modulación de la inactivación del canal por PKC (West et al., 1991).

Se determinaron las secuencias completas de DNA (Figura 9A-D) y de aminoácidos (Figura 10). La secuencia de aminoácidos de PN1 de rata fue comparada con las nuevas secuencias humanas (Figura 11A-E) presentadas en el Ejemplo 2.

En suma, la deducida estructura primaria de PN1 contiene todas las características distintivas de los dominios estructurales y funcionales de una subunidad \alpha del canal de sodio sensible al voltaje.

El gen PN1 se expresa preferentemente en el PNS

Para determinar si el gen PN1 se expresaba preferentemente en el PNS, se aisló el RNA total del cerebro, médula espinal, SCG, DRG, músculo esquelético y músculo cardíaco de rata adulta y se sometió a un análisis por transferencia Northern. Las transferencias fueron hibridadas con la sonda antisentido específica de PN1, generada a partir de pPC12-1. Como se muestra en la Figura 3A, se hallaron niveles elevados de hibridación con un transcrito de \approx 11 kb tanto en SCG como en DRG. Tanto en la médula espinal como en el cerebro se vieron niveles de hibridación mucho menores, aunque detectables, con los transcritos. No se observó hibridación detectable alguna con mRNA de músculo esquelético, músculo cardíaco e hígado.

También se prepararon análisis para protección frente a ribonucleasa (RNasa). Se aisló el RNA total de los mismos tejidos que en el análisis por transferencia Northern, así como de la glándula suprarrenal, y se hibridó con una sonda antisentido específica de PN1 (pPC12-1). El mRNA de SCG, DRG, cerebro, médula espinal y glándula suprarrenal protegía un fragmento de 343 bp de la sonda de PN1 (Figura 4B). Las bases no protegidas representan secuencias de plásmidos y cebadores oligonucleotídicos. La sonda de PN1 no resultó protegida por el mRNA del músculo esquelético ni por el del músculo cardíaco.

Para determinar las cantidades relativas de mRNA de PN1 en los diversos tejidos, se analizaron las autorradiografías de tres experimentos de protección frente a RNasa diferentes por densitometría. Para controlar las pequeñas diferencias en la cantidad de RNA total entre las muestras, se incluyó una sonda para \beta-actina. Los niveles de mRNA de PN1 tanto en SCG como en DRG eran aproximadamente 40 veces mayores que en la médula espinal, la glándula suprarrenal y el cerebro.

El gen PN1 se expresa en neuronas simpáticas y sensoriales

Para determinar si el gen PN1 se expresa en neuronas de ganglios periféricos, se utilizó la hibridación in situ para examinar la distribución celular de mRNA de PN1 en SCG y DRG de rata adulta. Se hibridaron cortes de criotomo con una sonda de RNA específica de PN1, marcada con digoxigenina (pPC12-1), que se visualizó utilizando un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina. Como se muestra en la Figura 4A,B, la sonda antisentido de PN1 marcaba la mayoría de los cuerpos celulares neuronales tanto en el SCG como en el DRG. Para confirmar que la señal de hibridación se debía a la unión específica de la sonda con mRNA de PN, se llevaron a cabo dos controles negativos diferentes: (1) se hibridaron los cortes con la sonda marcada con digoxigenina, en presencia de un exceso 100x de sonda antisentido de PN1 no marcada; (2) experimentos previos habían mostrado que SCG y DRG contienen niveles sumamente bajos de mRNA de canal de sodio de tipo II [S. Beckh, FEBS Lett. 262: 317-322 (1990)]. Por lo tanto, también se hibridaron los cortes con una sonda antisentido específica del tipo II. Como se muestra en la Figura 4C-F, en estos dos experimentos de control se reducía mucho la señal de hibridación. Además, coherentemente con los resultados de los análisis por transferencia Northern y de protección frente a RNasa, se halló que la hibridación de la sonda marcada de PN1 con cortes del córtex cerebral de rata adulta no producía tinción detectable alguna.

Aunque la sonda de PN1 teñía la mayoría de los cuerpos celulares neuronales tanto en SCG como en DRG, se halla ahora que la variabilidad de célula a célula en los niveles de mRNA de PN1 difería entre los dos ganglios. Las neuronas del SCG eran bastante homogéneas, ya que la intensidad del producto de reacción era relativamente constante entre las diferentes células. Sin embargo, las neuronas del DRG eran bastante heterogéneas ya que la intensidad de tinción variaba considerablemente de célula a célula. Por ejemplo, en la Figura 4B, las flechas indican dos neuronas del DRG, de aproximadamente el mismo diámetro, que difieren acusadamente en la intensidad de tinción.

Finalmente, se halló que la sonda de PN2 no teñía células no neuronales tales como células satélite y células de Schwann. Sin embargo, es posible que estas células contengan niveles bajísimos de mRNA de PN1 que no son detectables por este método.

Las neuronas del SCG también expresan el gen del canal de sodio de tipo I

Un análisis previo por transferencia Northern ha mostrado que el mRNA del SCG contiene dos transcritos distintos del gen del canal de sodio. Como hemos demostrado, el transcrito mayor, de 11 kb, codifica el canal de sodio de PN1. Sin embargo, el transcrito menor no ha sido aún identificado. Formulamos la hipótesis de que este transcrito más pequeño codificaba el canal de sodio de tipo I puesto que se han hallado niveles moderados de mRNA de tipo I en otros tejidos del PNS [S. Beckh, FEBS Lett. 262: 317-322 (1990)]. Para probar esta hipótesis, transferencias Northern de mRNA de SCG aislado de ratas adultas fueron hibridadas con una sonda antisentido específica para el gen del canal de sodio de tipo I (pNach1; véase Métodos más atrás). Como se muestra en la Figura 5, la sonda específica del tipo 1 se hibridaba específicamente con el transcrito más pequeño. Además, hemos hallado que el mRNA de SCG protege a la sonda de tipo I en un ensayo de protección frente a RNasa.

Los supuestos genes de la subunidad PN1\alpha y la subunidad de tipo I\alpha son diferencialmente regulados durante el desarrollo

Diversos estudios han mostrado que los genes del canal de sodio de los tipos I, II y III son diferencialmente regulados durante el desarrollo en los sistemas nerviosos tanto central como periférico. Para determinar si los genes de PN1 y de tipo I son también independientemente regulados durante el desarrollo, se midieron sus niveles relativos de mRNA en SCG aislado de ratas con diferentes edades posnatales. Para visualizar ambos transcritos simultáneamente, las transferencias Northern se hibridaron con la sonda conservada pRH221 del gen del canal de sodio. Como se muestra en la Figura 6A, en SCG extirpado el día posnatal 7 (P7), los niveles de los mRNAs de PN1 y de tipo I eran aproximadamente iguales. Sin embargo, el día P14, su abundancia relativa había cambiado de modo que el nivel de mRNA de PN1 excedía al del tipo I en \approx * veces. Este aumento en la relación de los niveles de mRNA de PN1 con los de mRNA de tipo I continúa durante al menos las cuatro semanas posnatales siguientes. El día P42, PN1 es el transcrito predominante del gen del canal de sodio, con niveles de mRNA de PN1 varias veces mayores que los del mRNA de tipo I.

Para cuantificar los cambios en los niveles de mRNA durante el desarrollo, se analizaron por densitometría las autorradiografías de tres experimentos separados. Para controlar las diferencias en la cantidad de RNA total entre los carriles, las transferencias fueron posteriormente hibridadas con una sonda para el testigo interno, la ciclofilina. Como se muestra en la Figura 6B, en la que se traza gráficamente el porcentaje del mRNA máximo frente a la edad posnatal, el cambio en la abundancia relativa de los dos transcritos se debe en gran medida a una disminución del nivel de mRNA del canal de sodio de tipo I durante el desarrollo. Desde P7 hasta P42, el nivel del mRNA de tipo I disminuye aproximadamente un 80%.

Ejemplo 2 Exploración farmacológica de antagonistas de PN-1

La capacidad de un ligando (por ejemplo, antagonistas y agonistas) de SCP de PNS para inhibir o potenciar la actividad de una SCP de PNS es evaluada con células que expresan al menos una SCP de PNS. Se utiliza un ensayo para actividad SCP de PNS en dichas células, para determinar la funcionalidad de la proteína SCP de PNS en presencia de al menos un agente que puede actuar como antagonista o agonista, y, de este modo, se identifican agentes que interfieren en la actividad de SCP de PNS o la potencian. Se utilizan dos o más líneas celulares (cada una de las cuales expresa una SCP de PNS diferente), usando también opcionalmente una o más líneas celulares que expresan un canal de sodio específico del CNS como testigo.

Estos agentes son seleccionados y explorados (1) al azar, (2) mediante una selección racional y/o (3) mediante diseño usando, por ejemplo, técnicas de modelado por ordenador.

Hay numerosas variaciones de ensayos que pueden ser usadas por un técnico experto, sin necesidad de una experimentación excesiva, para aislar agentes o ligandos moduladores de una SCP de PNS. Los métodos para determinación de agentes incluyen el diseño molecular asistido por ordenador (CAMD; del inglés, computer assisted molecular design), unión de SCP de PNS-agentes, síntesis y ensayo químicos sofisticados, exploración específica, tecnología de bancos peptídicos combinatorios, tecnología antisentido y/o ensayos biológicos, de acuerdo con métodos conocidos. Véanse, por ejemplo, Rapaka et al., redactores, "Medications Development: Drug Discovery, Databases, and Computer-Aided Drug Design", NIDA Research Monograph 134, Publicación 93-3638 del NIH, U.S. Dept. of Health and Human Services, Rockville, Maryland, EE.UU. (1993); Langone, "Methods in Enzymology", volumen 203, "Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications", parte B, "Antibodies and Antigens, Nucleic Acids, Polysaccharides and Drugs", sección III, páginas 587-702, Academic Press, New York, EE.UU. (1991).

Alternativamente, se utilizan bancos de expresión celular u otras células. En dichos métodos, se prefieren las células que han sido seleccionadas o genéticamente construidas para que expresen y presenten una SCP de PNS a través del uso de los ácidos nucleicos de SCP de PNS del invento, ya que se pueden escoger líneas celulares huésped que estén desprovistas de receptores relacionados. Rapaka, infra, página 58-65.

En el contexto del presente invento, un agente de SCP de PNS se refiere a cualquier molécula química o biológica que se asocia con una SCP de PNS in vitro, in situ o in vivo, agentes que pueden ser, pero no se limitan a, composiciones y compuestos químicos sintéticos, recombinantes u obtenidos de la naturaleza, tales como, por ejemplo, compuestos orgánicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, derivados de vitaminas, hormonas, neurotransmisores, virus o dominios de los mismos que se unen a receptores, opsinas, rodopsinas, nucleósidos, nucleótidos, factores de la cascada de coagulación, sustancias odorantes o feromonas, toxinas, factores de crecimiento, factores activadores de plaquetas, péptidos neuroactivos, neurohormonas y cualesquier compuestos biológicamente activos, tales como fármacos o compuestos presentes en la naturaleza.

Los agentes son seleccionados y explorados al azar o son seleccionados o diseñados racionalmente usando técnicas de modelado por ordenador. Para la exploración aleatoria, se seleccionan agentes potenciales y se analizan en cuanto a su capacidad para unirse a la SCP de PNS o a un fragmento de la misma. Alternativamente, los agentes pueden ser racionalmente seleccionados o diseñados. Como se utiliza aquí, se dice que un agente es "racionalmente seleccionado o diseñado" cuando el agente es elegido basándose en la configuración de al menos una SCP de PNS específica (por ejemplo, como se presenta en la Figura 11). Por ejemplo, un experto en la técnica puede adaptar fácilmente los procedimientos actualmente asequibles para generar agentes capaces de unirse a una secuencia peptídica específica con objeto de generar compuestos racionalmente diseñados, tales como compuestos químicos, ácidos nucleicos o péptidos. Véanse, por ejemplo, Rapaka, infra (1983); Hurby et al., "Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides" en "Synthetic Peptides, A User's Guide", W. H. Freeman, New York, EE.UU. (1992), páginas 289-307; y Kaspczak et al., Biochemistry 28: 9230-9238 (1989).

Un método de exploración para un agente que modula la actividad de al menos una SCP de PNS comprende:

(a)

incubar al menos una línea celular que expresa al menos una SCP de PNS, con el agente que se va a ensayar; y

(b)

analizar la al menos una célula en cuanto a la actividad de al menos una proteína SCP de PNS midiendo el efecto del agente sobre la unión de SCP de PNS o la actividad SCP de PNS; preferiblemente, el ensayo permite distinguir el efecto del agente sobre una SCP de PNS alternativa y determinar que el agente ejerce poco o ningún efecto sobre canales de sodio del CNS, o ejerce un efecto relativamente menor sobre canales de sodio del CNS.

\vskip1.000000\baselineskip

En el ensayo anterior se puede utilizar cualquier célula con tal de que exprese una forma funcional de proteína SCP de PNS y se pueda medir la actividad SCP de PNS. Las células de expresión preferidas son células u organismos eucarióticos. Dichas células pueden ser modificadas para que contengan secuencias de DNA que codifican la proteína SCP de PNS, utilizando procedimientos rutinarios conocidos en la técnica. Alternativamente, un experto en la técnica puede introducir directamente en la célula un mRNA que codifique la proteína SCP de PNS.

En una realización alternativa, se pueden construir genéticamente poblaciones de células madre para células neuronales o gliales, para que expresen un canal iónico funcional de SCP de PNS. Dichas células que expresan el canal iónico de SCP de PNS pueden ser trasplantadas a la región enferma o dañada del sistema neurológico del mamífero ["Neural Transplantation: A Practical Approach", redactado por Donnet y Djorklund, Oxford University Press, New York, EE.UU. (1992)]. En otra realización, se pueden construir genéticamente neuronas de tejido embrionario o fetales para que expresen un canal iónico funcional de SCP de PNS, y se pueden transplantar a la región enferma o dañada del sistema límbico del mamífero. Se ha demostrado la viabilidad del trasplante de neuronas dopamínicas fetales a pacientes con enfermedad de Parkinson [Lindvall et al., Archives of Neurology 46: 615-631 (1989)].

Actualmente se utilizan al menos dos tipos de planteamientos para expresar clones de canales de sodio dependientes del voltaje con objeto de generar proteínas de canal funcionales. En un planteamiento, se hace que el mRNA que codifica el cDNA se exprese en ovocitos de Xenopus. El cDNA del canal de sodio es clonado en un vector de expresión bacteriano tal como el plásmido recombinante pGEM (Melton et al., 1984). La transcripción del cDNA clonado se lleva a cabo utilizando una RNA polimerasa tal como polimerasa de SP6 o polimerasa de T7 con un compuesto análogo de remate tal como M^{7}G(5')ppp(5')G. Se inyecta el RNA resultante (por ejemplo, aproximadamente 50 nl, que corresponden a 2-5 ng) a ovocitos en fase V y fase VI aislados de Xenopus, y se realiza una incubación durante 3-5 días a 19ºC. Los ovocitos son ensayados en cuanto a la expresión del canal de sodio con una fijación del voltaje de dos microelectrodos [Trimmer et al., Neuron 3: 33-49 (1989)].

En un planteamiento alternativo, cDNAs que codifican un canal de sodio dependiente del voltaje son clonados en cualquiera de diversos vectores de expresión de mamífero, y se transfectan células de mamífero que no expresan canales de sodio endógenos dependientes del voltaje (tales como líneas de fibroblastos) con dichos cDNAs. Se seleccionan los clones transfectados que expresan el cDNA clonado y transfectado. Se mide la expresión de canales de sodio con una técnica de fijación del voltaje para células completas utilizando un electrodo de membrana [D'Arcangelo et al., J. Cell Biol. 122: 915-921 (1993)].

Fuentes de SCPs de PNS y líneas celulares útiles para la exploración de fármacos

Para la exploración de fármacos, se puede utilizar cualquier línea celular que exprese (naturalmente, por inducción o a causa de la expresión recombinante de una SCP de PNS). Como un ejemplo no restrictivo, las células PC12 expresan canales de sodio tanto de PN1 como de tipo II. Las células A126-1B2 son mutantes deficientes en actividad proteína cinasa A (PKA) que expresan PN1, pero se ha descubierto ahora que no expresan canales de sodio de tipo II. PKI-4 es una línea celular PC12 transfectada con un cDNA que codifica un inhibidor peptídico de PKA. Cada una de estas líneas celulares puede ser utilizada como una fuente de SCP de PNS del presente invento o como una línea celular para uso en la exploración de fármacos. El tratamiento de las células PC12 con NGF reduce los canales de sodio tanto de SCP de PNS (PN1) como de tipo II, mientras que el NGF sólo induce PN1 en células A126-1B2. Las células PKI-4 expresan una SCP de PNS (PN1) sin tratamiento con NGF [D'Arcangelo et al., J. Cell Biol. 122: 915-921 (1993)].

Adicional o alternativamente, se pueden utilizar también sistemas de expresión heterólogos mediante los cuales se transfectan establemente líneas celulares [tales como células de ovario de hámster chino (CHO; del inglés, chinese hamster ovary)] con un cDNA que codifica PN-1. Las operaciones metódicas para transfectar y hacer que se exprese establemente cDNA para formar líneas celulares heterólogas son bien conocidas en la técnica. Una ventaja de utilizar células transfectadas es que se obtienen clones que expresan niveles muy elevados de una SCP de PNS, tal como PN-1.

Para explorar moduladores de SCP de PNS, como antagonistas o agonistas, se examinan fármacos en cuanto a su capacidad para:

(a)

inhibir o potenciar la unión de radioligandos a una SCP de PNS (reacción de unión a ligandos marcados), y/o

(b)

inhibir o potenciar el flujo iónico a través del canal de la SCP de PNS en una línea celular que expresa una SCP de PNS.

\vskip1.000000\baselineskip

Para caracterizar canales de sodio del PNS, se pueden utilizar neurotoxinas que se unen a ligandos marcados. Por ejemplo, estudios previos han permitido identificar al menos seis sitios distintos de unión a neurotoxinas en canales de sodio previamente caracterizados que no son del PNS [revisión de Lombert et al., FEBS Lett. 219 (2): 355-359 (1987)]. Se piensa que muchos de estos sitios están alostéricamente copulados entre sí [para una revisión, véanse Strichartz et al., Ann. Rev. Neurosci. 10: 237-268 (1987), y las referencias ahí citadas]. En otras palabras, la unión de un fármaco o una toxina a una neurotoxina particular puede ser sensible a la unión del fármaco no sólo en ese sitio sino también en otros sitios del canal. Esto es ventajoso para un programa de exploración de fármacos ya que, para un ligando marcado dado, aumenta la probabilidad de identificar agentes que se unan preferentemente a una SCP de PNS.

Las técnicas aquí descritas para medir la unión de ligandos marcados a una SCP de PNS del invento en células intactas (por ejemplo, PC12, PKI o líneas celulares heterólogas que expresan SCP de PNS) en suspensión son similares a las descritas previamente para la unión de radioligandos a otros canales de sodio en preparaciones sinaptosómicas de cerebro [véase, por ejemplo, Catterall et al., J. Biol. Chem. 256 (17): 8922-8927 (1981)]. Sin embargo, es bien reconocido por los expertos en este campo que estas técnicas son rutinariamente modificadas para el uso de células fijadas a sustratos o preparaciones de células rotas, basándose en las enseñanzas y la orientación aquí presentadas.

Células A126-1B2, PC12 o PKI-4, u otras células que expresen una SCP de PNS, son cultivadas utilizando técnicas estándares y son opcionalmente tratadas con NGF durante 1-2 días para inducir la expresión de PN-1. Las células son recogidas y son ensayadas en cuanto a actividad de flujo iónico con agentes potenciales alternativos.

Para ambos radioligandos, se llevan a cabo las reacciones de unión a, por ejemplo, 37ºC y luego se detienen. Se filtran rápidamente las muestras, con lavado en vacío con tampón enfriado con hielo, y se determina la radiactividad unida mediante la cuenta del centelleo.

El flujo iónico prueba directamente la capacidad de un posible agente de SCP de PNS para inhibir o potenciar la actividad de una función de SCP de PNS, por su capacidad para inhibir o potenciar la entrada de trazadores iónicos a través de una SCP de PNS.

En la mayoría de los estudios previos sobre canales de sodio se ha empleado ^{22}Na como trazador [véase, por ejemplo, Catterall et al., J. Biol. Chem. 256 (17): 8922-8927 (1981)]. Sin embargo, la elevada toxicidad del ^{22}Na puede ser una desventaja para su uso en la exploración de fármacos con alto rendimiento. Una alternativa menos tóxica es el ion (^{14}C)-guanidinio, habiéndose mostrado que su entrada es un indicador fiable de la apertura del canal de sodio [Reith, Europ. J. Pharmacol. 188: 33-41 (1990)]. En consecuencia, se pueden utilizar métodos rutinarios para explorar compuestos en cuanto a la modulación de la actividad del canal iónico de SCP de PNS, tal como, por ejemplo, mediante el flujo iónico de (^{14}C)-guanidinio usando células intactas que expresan al menos una SCP de PNS. Además, estos métodos son bien conocidos por ser fácilmente modificados para uso con ^{22}Na. Similarmente, estas operaciones metódicas conocidas podrían ser modificadas para uso con vesículas o células fijadas a sustratos y preparadas a partir de células rotas, de acuerdo con operaciones metódicas conocidas.

Para el ensayo de flujo de guanidinio, se modifican los métodos para ^{22}Na a partir de los Reith [Europ. J. Pharmacol. 188: 33-41 (1990), para sinaptosomas de cerebro] como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 2 más adelante. Se incuban partes alícuotas de una suspensión celular que contiene células heterólogas que expresan al menos una SCP de PNS, durante 10 minutos a 37ºC, en presencia de agentes abridores de canales (típicamente, veratridina 100 \muM) y fármacos de ensayo en un volumen total de 100 \mul (0,20-0,25 mg de proteína). Se inicia el flujo iónico mediante la adición de una disolución de HEPES/TRIS que contiene además guanidina-HCl 4 mM (final) y 1000 dpm/nanomol de (^{14}C)-guanidina. Se continúa la reacción durante 30 segundos y se detiene mediante la adición de tampón de incubación enfriado con hielo, lo que va seguido de una rápida filtración bajo vacío con un filtro Whatman GF/C. Se lavan rápidamente los filtros con tampón de incubación enfriado con hielo y se determina la radiactividad por cuenta de centelleo. La incorporación inespecífica se determina en paralelo mediante la inclusión de tetrodoxina 1 mM tanto durante la preincubación como durante la incorporación.

Utilizando el ensayo del flujo de guanidinio, se ensayaron varios compuestos sustituidos con metilo/halofenilo, tal como lidoflazina (véanse, por ejemplo, Merck Index Monograph 5311 y la Patente de EE.UU. nº 3.267.104, ambas incorporadas aquí por referencia en su totalidad), y se halló que inhibían la actividad canal de sodio de al menos una SCP de PNS del presente invento en células que expresan al menos una SCP de PNS, con una pIC50 de 6,51 para la lidoflazina en células PKI-4. En consecuencia, el presente invento proporciona agentes moduladores de SCP de PNS, tales como piperizinas sustituidas con metilo/halofenilo.

Ejemplo 3 Identificación de una secuencia de SCP de PNS humana a partir de un banco de cDNA del sistema nervioso periférico humano

Similarmente a los procedimientos proporcionados en el Ejemplo 1, se utilizó un banco de cDNA del sistema nervioso periférico humano (como un banco de DRG humano) para multiplicación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la PCR se utilizó un cebador 5' que correspondía al DNA que codifica los aminoácidos 604-611 de la ID. SEC. nº 2, y un correspondiente cebador 3' que codificaba los aminoácidos 723-731 de la ID. SEC. nº 2.

La mezcla de la reacción PCR consistía en 5% del cDNA, MgCI_{2} 1 mM, dNTPSs 0,2 mM, cada cebador 0,5 M y Taq polimerasa (Perkin-Elmer) en un tampón que consistía en KCl 0,1 M, TRIS-HCl 0,1 M (pH de 8,3) y gelatina (1 mg/ml). La reacción se llevó a cabo en un termociclador Perkin-Elmer del modo siguiente: cinco ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 min), hibridación (37ºC, 1 min) y extensión (72ºC, 1 min), seguidos de 25 ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 min), hibridación (50ºC, 1 min) y extensión (72ºC, 1 min).

Los productos de PCR resultantes proporcionaron un cDNA humano multiplicado que codificaba los aminoácidos 646-658 de la ID. SEC. nº 2, como se presenta en la Figura 11A-E.

Ejemplo 4 Clonación y secuenciación de la secuencia de PN-1 humana a partir de un banco de cDNA humano del ganglio de la raíz dorsal

Como en los Ejemplos 1 y 3 anteriores, se utilizan cebadores de PCR adicionales que corresponden a la ID. SEC. nº 1 para aislar clones del banco de cDNA de DRG humano que abarcan la región de codificación completa de una o más SCPs de PNS humanas del presente invento. Un cebador 5' incluye la secuencia 5'TTTGTGCCCCACAGACCC
CAG3' (ID. SEC. nº 17) y un cebador 3' incluye la secuencia 5'ACACAAATTCTTGATCTGGAATTGCT3' (ID. SEC. nº 18) o 5'CAACCTCAGACAGAGAGCAATGA3' (ID. SEC. nº 19), que se usan para una PCR anidada. De acuerdo con los Ejemplos 1 y 3 anteriores, se lleva a cabo la PCR para obtener cDNAs que codifican una SCP de PNS humana.

Se lleva a cabo una PCR adicional por "tránsito (walking)" 5' o 3' de la secuencia que corresponde al producto de PCR anterior. De este modo, se obtienen cDNAs que abarcan la región de codificación completa de una o más SCPs de PNS humanas.

Los productos de PCR o clones de cDNA adicionales resultantes que codifican la SCP de PNS humana completa son subclonados en un vector plasmídico previamente restringido con sitios de restricción adecuados. Los clones son explorados en cuanto a insertos de cDNA mediante un kit miniprep (Sambrook et al., infra) y son secuenciados en ambas direcciones mediante el método didesoxi de terminación de cadena (kit Sequenase 2.0, United States Biochemical). Los datos de secuencias son compilados y analizados utilizando el software GenWorks (IntelliGenetics, Inc., Mountain View, California, EE.UU.). Las esperadas secuencias de aminoácidos alternativas para una secuencia de PN1 humana
se presentan en la Figura 11A-D y como ID. SEC. n^{os} 7, 11 y 12, donde Xaa representa 0, 1, 2 ó 3 aminoácidos.

Luego se confirma que los transcritos con el tamaño de la SCP de PNS humana resultante están presentes en mRNA o cDNA de PNS humano (que codifica una secuencia de 1970-1990 aminoácidos de la Figura 11A-E). Sin embargo, como en el Ejemplo 1, no se espera que dichos transcritos se detecten en mRNA de cerebro. Este resultado esperado confirma los nuevos miembros humanos de la familia génica del canal de sodio [denominados tipo 1 de nervio periférico humano (HUMPN1A y HUMPN1B de la Figura 11A-E, donde X es 0, 1, 2 ó 3 de los mismos o diferentes aminoácidos).

Luego se confirman las secuencias de aminoácidos y de DNA completas de los nuevos PN1s humanos y se espera de ellas que contengan todas las características estructurales y funcionales de los dominios de una subunidad \alpha de un canal de sodio sensible al voltaje, de mamífero.

Claims (18)

1. Un polipéptido aislado de un canal de sodio específico del sistema nervioso periférico (PNS), polipéptido:

(i)

que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con respecto a la Figura 7 (secuencia de aminoácidos); y

(ii)

que forma un canal de sodio de tipo I del PNS, sensible al voltaje, capaz de transportar iones de sodio cuando el polipéptido se expresa en ovocitos de Xenopus.

2. El polipéptido de la Reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con respecto a la Figura 7 (secuencia de aminoácidos).

3. El polipéptido de la Reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos de la Figura 7 (secuencia de aminoácidos).

4. Un anticuerpo que se une a un epítopo específico para un péptido de acuerdo con la Reivindicación 2.

5. El anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 4, en que dicho anticuerpo es un anticuerpo detectable que está detectablemente marcado o que se une a un marcador detectable.

6. Una célula huésped que produce un anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 4.

7. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende:

(A)

una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos, que tiene al menos un 90% de identidad con respecto a la Figura 7 y forma un canal de sodio de tipo I del sistema nervioso periférico (PNS), sensible al voltaje, capaz de transportar iones de sodio cuando el polinucleótido se expresa en ovocitos de Xenopus; o

(B)

una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido del canal de sodio del sistema nervioso periférico de la Figura 7 (secuencia de aminoácidos).

8. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia complementaria de la secuencia polinucleotídica de longitud completa expuesta en la Reivindicación 7(B).

9. Una molécula de ácido nucleico aislada, de acuerdo con la Reivindicación 7, que comprende la secuencia polinucleotídica de la Figura 7 (secuencia de ácido nucleico).

10. Un método para preparar un vector recombinante, que comprende insertar el ácido nucleico de la Reivindicación 7 en un vector.

11. Un vector recombinante que comprende el ácido nucleico de la Reivindicación 7.

12. Un método para preparar una célula huésped recombinante en cultivo, que comprende introducir el vector recombinante de la Reivindicación 11 en una célula huésped en cultivo.

13. Una célula huésped en cultivo, que comprende el vector de la Reivindicación 11.

14. Un virión recombinante que comprende el ácido nucleico de la Reivindicación 7.

15. Un método para producir recombinantemente un polipéptido, que comprende las operaciones de:

(i)

introducir el vector de la Reivindicación 11 en una célula huésped;

(ii)

cultivar la célula huésped bajo unas condiciones que permitan la expresión del polipéptido a partir del vector; y

(iii)

aislar el polipéptido.

16. Un bioensayo para evaluar un candidato a agente modulador de un polipéptido del canal de sodio (SCP) del sistema nervioso periférico, que comprende:

(A)

poner un agente candidato en contacto con una línea celular que expresa, en la membrana celular de dicha célula, una SCP del sistema nervioso periférico, en que dicha SCP comprende una secuencia de aminoácidos de la Figura 7 (secuencia de aminoácidos); y

(B)

evaluar la modulación de la actividad biológica SC de dicha célula, mediada por dicha puesta en contacto de dicho agente candidato.

17. El bioensayo de acuerdo con la Reivindicación 16, en que dicha línea celular es seleccionada entre células de feocromocitoma (PC12) y una forma recombinante de las mismas que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la Reivindicación 7.

18. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo con la Reivindicación 7, o un ácido nucleico antisentido complementario del mismo de longitud completa, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.