PT1414960E - Doença óssea de paget - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DOENÇA ÓSSEA DE PAGET ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto processos e materiais para detectar um gene humano localizado no lócus (posição no cromossoma ocupada por determinado gene ou alelo) PDB3 no cromossoma 5q35: a proteína atípica p62/sequestosoma 1 (p62/SQSTMl) que interage com a proteí-.na-cinase C, da qual alguns mutantes causam a doença óssea de Paget. A presente invenção também tem por objecto processos terapêuticos para o tratamento da doença óssea de Paget.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A doença óssea de Paget (Mendelian inheritance in Man, MIM 167250) é um distúrbio metabólico progressivo dos ossos, com uma localização monostótica (apenas um sítio afectado) ou poliostótica (são afectados vários sítios). A doença é caracterizada por um processo crescente de remodelação em que a reabsorção óssea anormal está associada à formação de novos ossos osteoblásticos. O processo inicia-se por aumentos da reabsorção óssea mediada por osteoclastos, com subsequentes aumentos compensatórios na nova formação de ossos, o que resulta num mosaico desorganizado de ossos e ossos em fibras ou lamelares nos sítios afectados. Esta alteração estrutural produz ossos com uma dimensão maior, menos compactos, mais vascularizados e mais susceptíveis a deformações ou fracturas do que os ossos normais (Siris e Canfield 1990). 1

Os sinais e sintomas clínicos variam de um paciente para outro consoante o número e a localização dos sítios do esqueleto afectados, assim como da rapidez da modificação anormal dos ossos. Crê-se que a maioria dos pacientes são assintomáticos, mas cerca de 5% dos pacientes com doença de Paget apresentam sintomas que requerem tratamento (Kanis 1998). As queixas mais frequentes são dores nos ossos, hipertrofia e deformações (Kanis 1998). Outras manifestações desta doença incluem uma maior susceptibilidade a fracturas, calor excessivo nos ossos provocado por hiper-vascularízação, surdez e complicações neurológicas causadas, na maior parte dos casos, por compressão dos tecidos neurais adjacentes aos ossos com doença de Paget, assim como uma maior susceptibilidade a osteossarcomas (Hamdy 1995) . A doença óssea de Paget aparece normalmente após os 40 anos de idade (Klein e Norman 1995) e afecta principalmente o esqueleto axial. Nos países ocidentais, a doença óssea de Paget é o segundo distúrbio ósseo metabólico mais comum depois da osteoporose. Nos Estados Unidos, o distúrbio tem uma frequência estimada de 1-3% na população com mais de 40 anos de idade e de 8-10% para os que têm mais de 80 anos (Siris e Oanfield 1990). A etiologia da doença óssea de Paget continua desconhecida. Contudo, há uma evidência convincente de que factores genéticos desempenham um papel determinante na etiologia do distúrbio. A doença é mais comum na Europa Ocidental (Detheridge et al. 1983), América do Norte (Rosenbaum e Hanson 1969; Guyer e Chamberlain 1980), Austrália (Barker 1984) e Nova Zelândia (Reasbeck et al. 1983) com a prevalência mais elevada no Reino Unido, particularmente no Lancashire (prevalência > 6,3 %) (Barker et 2 al. 1980). O risco familiar da doença óssea de Paget já foi avaliado por vários autores. Sofaer et al. observaram um aumento da prevalência dez vezes superior entre os pais e irmãos de pacientes, em comparação com as respectivas mulheres (Sofaer et al. 1983). Nos Estados Unidos, Siris et al. relataram ainda 12 % de parentes do primeiro grau de pacientes com doença óssea de Paget afectados numa percentagem de 12% e calcularam um aumento do risco, de sete vezes, de desenvolvimento da doença em parentes do primeiro grau (Siris et al. 1991). Em Espanha, Mirales-Piga et al. observaram que 40% dos casos indexados tinham pelo menos um parente do primeiro grau afectado com a doença óssea de Paget (Morales-Piga et al. 1995). O agrupamento familiar da doença óssea de Paget foi documentado frequentemente (Sofaer et al. 1983; Siris et al. 1991; Morales-Piga et al. 1995; Haslam et al. 1998; Hocking et al. 2000). Nos parentes investigados até a esta data, a doença óssea de Paget parece ser transmitida de um modo autossóraico dominante de hereditariedade com uma penetrância (grau do efeito produzido na população por um gene) incompleto.

Relatou-se, pela primeira vez uma evidência sugestiva da ligação entre a doença óssea de Paget e o lócus de AHL (antigénio humano dos leucócitos, HLA na terminologia inglesa) em 6p (Fotine et al. 1977; Tilyard et al. 1982). Este lócus potencial foi designado por PDBl (MIM 167250). Contudo, outros estudos não confirmam a ligação neste sitio (Breanndan Moore e Hoffman 1988; Nance et al. 2000; Good et al. 2001), sugerindo que o papel do lócus de AHL pode ter uma importância menor na etiologia da doença óssea de Paget.

Mapeou-se um distúrbio raro dos ossos, a osteólise expansível familiar (OEF, FEO na terminologia inglesa) (MIM 3 #174810), no cromossoma 18g21-q22 (Hughes et al. 1994}. Utilizando uma abordagem enfocada num lócus candidato e uma grande família com doença óssea de Paget, Cody et al. relataram a evidência da ligação entre a doença óssea de Paget e a mesma região 18q com uma pontuação de LDD (limite de detecção) de 3,40 em D18S42 (Cody et al. 1997). Este lócus foi designado por PDB2 (MIM 602080). Estes autores propuseram que os gene(s) responsáveis pela OEF e pela doença óssea de Paget ou estavam fortemente ligados ou eram variants alélicas do mesmo gene mutante. Subsequentemente, Haslam et al. confirmaram a ligação a 18q em cinco famílias com doença óssea de Paget e observaram a heterogeneidade genética em três outros parentes (Haslam e tal. 1998). Estudos mais recentes confirmaram a heterogeneidade genética do distúrbio e sugeriram que a ligação da doença óssea de Paget em 18q21-q22 era relativamente rara (Hocking et al. 2000; Nance et al. 2000; Good et al. 2001).

Recentemente, o gene da doença de OEF foi identificado como o gene TNFRSF11A (MIM 603499) que codifica RANK, o activador do receptor do factor nuclear kB (Hughes et al. 2000) . Detectou-se a mesma inserção heterozigótica (84dupl8) no exão 1 de TNFRSF11A em três famílias com OEF ou casos relacionados com OEF. Uma linhagem de origem japonesa com doença óssea de Paget atípica também comportava uma inserção de 27 pb (75dup27) no gene TNFRSF11A. Os seus sintomas raros incluíam um início precoce e problemas dentários, sugerindo que estes pacientes podiam sofrer de uma forma mais suave de OEF ou uma forma com um início particularmente precoce da doença óssea de Paget (Leach et al. 2001) . Não foram ainda relatadas mutações de RANK em pacientes que manifestam casos típicos de doença óssea de Paget (Hughes et al. 2000; Sparks et al. 2001). Estas observações mostram que os gene (s) que causam a forma 4 típica da doença óssea de Paget ainda não estão caracterizados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto processos e materiais para isolar e detector um gene humano localizado no lócus PDB3 que causa a doença óssea de Paget. 0 gene codifica a proteína p62 que interage com a proteína-cinase C atípica, que também é designada por sequestosoma 1 (SQSTM1), da qual alguns alelos causam a doença óssea de Paget. Mais especificamente, a presente invenção tem por objecto mutações de germlina na proteína/ sequestosoma 1 (p62/SQSTMl) que interage com a proteína-cinase C atípica e a sua utilização nó diagnóstico e na predisposição para a doença óssea de Paget. Δ presente invenção também tem'por objecto a terapia pré-sintomática de indivíduos que comportam alelos prejudiciais do gene p62/SQSTMl. A presente invenção também tem por objecto a terapia da doença óssea de Paget de indivíduos que têm mutações no gene p62/SQSTMI (incluindo a terapia de gene, terapia de substituição de proteínas, inibidores e produtos que simulam proteínas, interferência de ARN e anti-paralelo)·. A presente invenção também tem por objecto a terapia pré-sintomática de indivíduos que comportam alelos prejudiciais do gene p62/SQSTMl. A presente invenção tem ainda por objecto a pesquisa de fármacos para a' doença óssea de Paget. Finalmente, a presente invenção tem ainda por objecto a pesquisa do gene p62/SQSTMl quanto a possíveis mutações, que são úteis para o diagnóstico da doença óssea de Paget.

De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto uma molécula de ácido nucleico que compreende uma 5 sequência que codifica uma proteína atípica que interage com a proteína-cinase C, com um peso molecular de aproximadamente 62 kD (uma forma com mutações de p62/SQ5TMl) que serve para o diagnóstico de uma doença óssea. A molécula de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácidos que se mostra na SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento, em que o fragmento contém o aminoácido da posição 392. Num enquadramento preferido, a molécula de ácido nucleico isolada codifica uma proteína mutada p62/SQSTMl· que serve para ó diagnóstico de uma doença óssea de Paget.

Noutro enquadramento, a . presente invenção tem por objecto uma proteína atípica que interage com a proteina-cinase C com um peso . molecular de aproximadamente 62 kD (uma forma com mutações de p62/SQ5TMl} que serve para o diagnóstico de uma doença óssea. A proteína a sequência de aminoácidos que se mostra na SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmènto, em que o fragmento contém o aminoácido da posição 392. Num enquadramento preferido, a molécula de ácido nucleico isolada codifica uma proteína mutada p62/SQSTMl que serve para o diagnóstico de uma doença óssea de Paget.

Ainda noutro enquadramento, a presente invenção tem por objecto um processo de identificação de substâncias que se podem ligar a uma p62/SQSTMI mutada, que compreende as etapas de: (a) incubação de uma proteína mutada p62/SQSTMl com a sequência de aminoácidos que se mostra na SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento e um substrato de ensaio, em condições que permitam a formação de um complexo entre a proteína p62/SQSTMl e a substância de ensaio e 6 (b) ensaio dos complexos da proteína p62/SQSTMl mutada com uma substância de ensaio, para detectar substâncias livres ou proteína p62/SQSTMl complexada não mutada, em que a presença de complexos indica que a substância de ensaio é capaz de se ligar à proteína p62/SQSTMl mutada. A presente invenção também tem por objecto processos para identificar um composto que afecta a actividade ou a expressão da proteína mutada p62/SQSTMl, compreendendo: (a) a incubação de um composto de ensaio com uma proteína p62/SQSTMl mutada comportando a sequência ilustrada na SEQ ID NO: 4 ou um fragmento da proteína ou um ácido nucleico que codifica o ácido nucleico da proteína p62/SQSTMl mutada comportando a sequência ilustrada na SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento; e (b) a determinação de uma quantidade da actividade ou da expressão da proteína mutada p62/SQSTMl e comparação com um controlo, em que uma alteração na actividade ou na expressão da proteína mutada p62/SQSTMl quando comparadas com as do controlo, indica que o composto do ensaio tem um efeito na actividade ou na expressão da proteína mutada p62/SQSTMl.

Noutro enquadramento, a presente invenção tem por objecto um processo de detecção de uma condição associada a uma proteína pê2/SQSTMl mutada que compreende o ensaio de uma amostra para detectar (a) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína, mutada p62/SQSTMl comportando a sequência ilustrada na SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento ou (b) uma proteína mutada p62/SQSTMl comportando a sequência ilustrada na SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento. 7

Também tem por objecto um processo de tratamento de uma doença óssea que compreende a administração a uma célula ou a um animal que dele necessite, uma quantidade efectiva de um agente que regula a expressão e/ou a actividade de p62/SQSTMl. A presente invenção também tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva de um agente que regula a expressão e/ou a actividade de p62/SQSTMl para a produção de um medicamento para tratar uma doença óssea. Num enquadramento preferido, a doença óssea é a doença óssea de Paget.

Ainda num outro enquadramento, a presente invenção por objecto um animal não humano que é portador de uma mutação no gene que codifica a proteína p62/SQSTMl comportando a sequência ilustrada na SEQ ID NO: 4 correspondendo a um resíduo humano P392L em que o animal é um modelo para a doença óssea.

Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue. Deve entender-se, contudo, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando enquadramentos preferidos da presente invenção são dados apenas a título ilustrativo, dado que alterações e modificações dentro do espirito e do âmbito da presente invenção serão evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição detalhada,

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Descrevem-se vários enquadramentos da presente invenção, fazendo-se referência aos desenhos que a acompanham, em que: 8 A figura 1 representa um diagrama que mostra a ordem dos marcadores genéticos do lócus PDB3 na vizinhança do gene de p62/SQSTMl, um mapa esquemático dos CBAs (cromossomas bacterianos artificiais; BAC na terminologia inglesa) que atravessam o lócus PDB3, e também mostra a localização do gene de p62/SQSTMl dentro de um intervalo definido sob o ponto de vista genético. A figura 1 também mostra a unidade de transcrição de p62/SQSTMl que mostra a 1 CBA contíguo que foi construído em sílica. Os exões individuais estão numerados e estes números correspondem, às sequências indicadas na figura 4. A figura 2 representa um diagrama que mostra a segregação dos aminoácidos que alteram a mutação Pro a Leu na posição de aminoácido 392 na proteína p62/SQSTMl que codifica a sequência dentro de uma grande família afectada pela doença óssea de Paget. A figura 3 representa um diagrama que mostra a sequência do ADNc de p62/SQSTMl mutada. A figura descreve a posição da mutação que causa a doença óssea de Paget. A figura 4 representa um diagrama que mostra parte da sequência genómica do gene de p62/SQSTMl incluindo a sequência completa de oito exões assim como as sequências das fronteiras de intrões/exões. As sequências dos iniciadores utilizados para a sequenciação dos exões estão indicadas nos quadros 1 e 2. 0 quadro 1 mostra as sequências dos iniciadores dos marcadores de micro-satélites utilizados para o genótipo no intervalo se localização de p62/SQSTMl. 0 quadro 2 mostra as sequências dos iniciadores desenhados nos genes de p62/SQSTMI dos intrões com a sequência do gene de p62/SQSTMl. 9

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os requerentes realizaram análises de ligação genética em 24 grandes famílias franco-canadianas (479 indivíduos) em que a doença óssea de Paget foi segregada como um traço autosómico dominante. Depois de se excluir PDB2, realizou-se uma vasta digitalização do genoma nos três núcleos de famílias mais informativos que incluíam 44 indivíduos. Observaram-se pontuações de LDD maiores do que 1,0 em sete localizações do genoma humano. Utilizaram-se então 24 famílias para detector uma forte evidência da ligação no cromossoma 5q35-qter. Em relação à heterogeneidade, obteve-se um valor de pontuação máxima de 8,58 em D5S2073 com Θ = 0,1. 0 mesmo haplotipo característico estava em todos os pacientes nas oito famílias sugerindo um efeito iniciador. Um evento de recombinação numa família chave confinou a região da doença dentro de um intervalo de 6 cM entre D5S469- e o telómero. As outras 16 famílias, com uma probabilidade condicional muito baixa de ligação em 5q35-qter, foram ainda utilizadas para mapear um segundo lócus em 5q31. Quanto à heterogeneidade, detectou-se um valor de pontuação máxima do LDD de 3,70 em D5S500 com Θ = 0.00. Eventos de recombinação refinaram a região 5q31 dentro de 11,7 cM entre D5S642 e D5S1972. Estas observações demonstraram assim o mapeamento de dois novos loci para a doença óssea de Paget e dão maior evidência à sua heterogeneidade genética. Os loci 5q35-qter e 5g31 loci foram designados por PDB3 e PDB4, respectivamente.

Os requerentes ainda rastrearam muitos genes no lócus PDB3 lócus quanto ao seu envolvimento na doença óssea de Paget. Entre os muitos genes que foram rastreados para avaliar a mutação, um destes genes foi a proteína p62 que interage . com a proteína-cinase C atípica (p62também 10 conhecida como sequestosoma 1 (SQSTM1). Uma variação nucleotídica na posição 1215 do gene de p62/SQSTMl, alterando os aminoácídos Pro a Leu na posição do aminoácido 392 (Pro392Leu), foi detectada em 11 parentes das famílias de recurso. Esta alteração não conservadora flanqueia- o domínio associado à ubiquitina (AUB) (posição 394-440) da proteína. Verificou-se que esta variação estava diferenciada com o distúrbio nestas famílias. A sequenciação de 112 casos esporádicos revelou que 18 pacientes também eram portadores da variação. A sequenciação de 86 esposas não afectadas e de 250 da população geral não revelaram qualquer alteração na sequência natural p62/SQSTMl. Estes dados demonstram assim que a variação C a T na posição 1215 do gene de p62/SQSTMl é, de facto, uma mutação que causa a doença óssea de Paget.

Identificou-se o gene de p62/SQSTMl em 1995 (PNAS 92: 12338 (1995)). A p62/SQSTMl foi originalmente descrita como uma fosfoproteína de 62 kilodalton (kD) que interagia com p56ick. A proteína mostrou estar localizada no citosol e que se ligava à ubiquitina. A p62/SQSTMl interage com várias moléculas de transdução do sinal incluindo a tirosina-cinase p561ck e a proteína-cinase C-zeta atípica. Experiências recentes mostraram que p62/SQSTMl actua como um ponto de convergência das vias de sinalização de IL-1 e FNT-alfa. A interacção entre p62/SQSTMl com RIP liga a proteína-cinase C atípica à activação de NF-kapa B (NFkB) por meio da via de sinalização de FNT-alfa. Na verdade, evidências recentes sugerem que p62/SQSTMl interage selectivamente com TRAF6 e RIP e é um intermediário importante na sinalização de na interleucina-1 (IL-1) e o factor de necrose de tumor a. (FNT a) em relação à activação de NFkB (Sanz et al. 1999; Sanz et al 2000). A importância funcional de p62/SQSTMl na activação de NFkB tem sido sublinhada por meio da observação de que o seu esgotamento 11 anula severamente a activação de NFkB tanto por meio do FNT-α como por meio de 1L-1 (Sanz et al. 2000). A sequência de p62/SQSTMl foi depositada no GenBank em 1 de Novembro de 2000 com o número de acesso GI 4505570. Esta sequência foi substituída em 4 de Abril de 2002 com o número de acesso GI 19923742. As diferenças nas duas sequências verificaram-se nas regiões não traduzidas 5' e 3' e na sequência da proteína de p62/SQSTMl verifica-se o mesmo. No presente pedido de patente de invenção a sequência de p62/SQSTMl de tipo natural tem o número de acesso GI 19923742 enquanto no pedido de prioridade (pedido provisional de patente de invenção norte-americana com o número de série U.S. 60/308.135, registado em 30 de Julho de 2001), a sequência 62 de tipo natural tinha o número de acesso GI 4505570. Como resultado da sequência corrigida no presente pedido de patente de invenção, a posição do nucleótido da mutação associada com a doença de Paget foi alterada do nt 1227 para o nt 1215. A posição da alteração do aminoácido (posição 392) permaneceu inalterada. A sequência da mutação tanto na sequência de nucleótidos (C -► T) como na sequência de aminoãcidos (Pro - Leu) permanece a mesma. I. Moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção

Descreve-se aqui uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica uma proteína de interacção com a proteína-cinase C atípica, com um molecular de aproximadamente 62kD. Esta proteína é normalmente referida aqui como "p62/SQSTMl". Os termos T'p62/SQSTM1", "p62" e "sequestosoma 1" (ou SQSTM1) são sinónimos e podem ser utilizados de uma forma permutável no presente pedido de patente de invenção (número de acesso do 12

GenBank GI 19923742; número MIM: 601530; e ID PubMed: 8650207). A presente invenção inclui formas mutadas . de p62/SQSTMl associadas à doença de Paget ou a qualquer doença óssea, em que a forma mutada tem uma sequência de ácidos nucleicos ilustrada na SEQ. ID. NO.: 3. A sequência ilustrada na SEQ. ID. NO.: 3 difere da SEQ. ID. NO.: 1 (a sequência de p62/SQSTMl de tipo natural) em que há um T em vez de um C na posição 1215. 0 termo "isolado" refere-se a um ácido nucleico praticamente isento de material celular ou meio de cultura quando produzido por técnicas de ADN recombinante ou precursores químicos, ou outros produtos químicos quando sintetizados por via química. A expressão "ácido nucleico" pretende incluir AND e ARN e pode ser de estrutura helicoidal simples ou dupla.·

Num enquadramento da presente invenção, providencia-se uma molécula de ácido nucleico isolada com uma sequência que codifica que codifica p62/SQSTMl com uma sequência de aminoácidos conforme ilustrado na SEQ. ID. NO.: 4.

Num enquadramento preferido, a presente invenção providencia uma sequência isolada de ácidos nucleicos que compreende: (a) uma sequência de ácidos nucleicos conforme ilustrado na SEQ. ID. NO. : 3 em que T também pode ser U; (b) uma sequência de ácidos nucleicos que é complementar de uma sequência de ácidos nucleicos de (a); 13 (c) uma sequência de ácidos nucleicos que é praticamente homóloga de uma sequência de ácidos nucleicos de (a) ou (b); (d) uma sequência de ácidos nucleicos que é análoga de uma sequência de ácidos nucleicos de (a) , (b) ou (c) ; ou (e) uma sequência de ácidos nucleicos que hibrida com uma sequência de ácidos nucleicos de (a), (b) , (c) ou (d), em condições severas de hibridação. A expressão "sequência que é praticamente homóloga da sequência" significa as sequências de ácidos nucleicos que têm variações ligeiras ou inconsequentes em relação às sequências de (a) ou (b) , isto é, a sequência funciona praticamente da mesma maneira e pode ser utilizada para detectar, estudar ou tratar a doença óssea de Paget. As variações podem ser atribuídas a mutações locais ou modificações estruturais. As sequências de ácidos nucleicos que têm uma homologia significativa incluem as sequências de ácidos nucleicos que têm pelo menos 65%, mais preferencialmente pelo menos 85%, e o mais preferencial 90-95 % de identidade com as sequências de ácidos nucleicos que se mostram nas SEQ. ID. NO.: 1 ou SEQ. ID. NO.: 3. A expressão "sequência que hibrida" significa uma sequência de ácidos nucleicos que pode hibridar com uma sequência de {a), (b), (c) ou (d), em condições de hibridação severas. "Condições de hibridação severas" apropriadas que promovem a hibridação do AND são conhecidas dos especialistas nesta técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, pode-se utilizar o seguinte: 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, seguido de uma lavagem com 2,0 x SSG a 50 14 °C; 0,2 x SSC a 50 °C a 65 °C; ou 2,0 x SSC a 44 °C a 50 °C. Pode-se seleccionar o grau de severidade com base nas condições utilizadas na etapa de lavagem. Por exemplo, a concentração do sal na etapa de lavagem pode ser seleccio-nada a partir de uma alta severidade de cerca de 0,2 x SSC a 50 °C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser em condições de alta severidade, a cerca de 65 °C. A expressão "uma sequência de ácidos nucleicos que é análoga" significa uma sequência de ácidos nucleicos que foi modificada quando se compara com a sequência de (a), (b) ou (c)· em que a modificação não altera a utilidade da sequência, conforme se descreve aqui. A sequência ou a sequência análoga modificadas podem ter melhores propriedades em relação às sequências ilustradas em (a), (b) ou (c). Um exemplo de uma modificação para preparar uma sequência análoga consiste em substituir uma das bases de ocorrência natural (isto é, adenina, guanina, citosina ou timidina) da sequência ilustrada na SEQ. ID. NO. : 1 ou 3, com uma base modificada tal como uma xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo, 2-propilo e outras adeninas dè alquilo, 5-halogeno-uracilo, 5-halogeno-citosina, 6-aza-uracilo, 6-aza-citosina e β-azatimina, pseudo-uracilo, 4-tiouracilo, 8-halogeno-adenina, 8-aminoadenina, 8-tiol-ade-nina, 8-tiolalquil-adeninas, 8-hidroxil-adenina e outras adeninas substituídas na posição 8, 8-halogeno-guaninas, 8 amino-guanina, 8-tiol-guanina, 8-tiolalquil-guaninas, 8-hidroxil-guanina e outras guaninas substituídas na posição 8, outros aza- e desaza-uracilos, timidinas, citosinas, adeninas, ou guaninas, 5-trifluorometil-uracilo e 5-tri-fluoro-citosina.

Um outro exemplo de uma modificação consiste em incluir heteroátomos fosforosos ou de oxigénio, modifica is dos, na estrutura de fosfato, ligações curtas de inter-açúcares de cadeias de alquilo ou de cicloalquilo na molécula de ácido nucleico ilustrada nas SEQ. ID. NO.: 1 ou SEQ. ID. NO.: 3. Por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos podem conter fosforotioatos, fosfotriésteres, fosfonatos de metilo, e fosforoditioato de metilo.

Um outro exemplo de um análogo de uma molécula de ácido nucleico da presente invenção é um ácido nucleico de um péptido (ANP) em que a estrutura de fosfato de desoxiribose (ou de ribose) noi ADN (ou no ARN) , está substituída com uma estrutura de poliamida semelhante à encontrada nos péptidos (PE. Nielsen, et al Science 1991, 254, 1497). Os análogos de ANP mostraram ser resistentes à degradação pelas enzimas e terem uma vida mais prolongada in vivo e in vítro. Os ANPs também se ligam mais fortemente a uma sequência complementar de ADN devido à falta de carga de repulsão entre o hélice de ANP e o· hélice· de ADN. Outros análogos de ácidos nucleicos podem conter nucleótidos que contêm estruturas de polímeros, estruturas cíclicas ou estruturas acíclícas. Por exemplo, os nucleótidos podem ter estruturas básicas de morfolino (patente norte-americana U.S. No. 5.034.506). Os análogos podem também conter grupos relatores, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas ou farmacodinâmicas da sequência de ácidos nucleicos.

Será evidente que a presente invenção inclui moléculas de ácidos nucleicos que codificam as truncagens de proteínas da .presente invenção e análogos e homólogos de proteínas da presente invenção e das suas truncagens, tal como se descreve a seguir. Ainda será também evidente que as formas variantes das moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção que aparecem por combinação alternativa 16 de um ARNm correspondente a um ADNc da presente invenção, estão englobados pela presente invenção. . As moléculas de ácidos nucleicos isoladas e purificadas que diferem da sequência de ácidos nucleicos da presente invenção devido à degenerescência no código genético estão também dentro do âmbito da presente invenção. Esses ácidos nucleicos codificam proteínas que são equivalentes sob o ponto de vista funcional mas diferem na sequência das sequências mencionadas antes devido à degenerescência no código genético.

Pode-se isolar uma molécula de ácido nucleico isolado da presente invenção que compreende o ADN por meio da preparação de uma sonda marcada de ácido nucleico com base em todas ou partes das sequências de ácidos nucleicos da presente invenção e utilizando esta sonda marcada de ácido nucleico para rastrear uma biblioteca apropriada de ADN (por exemplo, uma biblioteca de ADNc ou de ADN genómico) . Por exemplo, pode-se utilizar uma biblioteca genómica para isolar um ADN que codifica uma nova proteína da presente invenção por meio do rastreio da biblioteca com a sonda marcada utilizando técnicas normalizadas. Os ácidos nucleicos isolados por rastreio de uma biblioteca de ADNc ou de ADN genómico por meio de técnicas normalizadas.

Uma molécula de ácido nucleico isolada, da presente-invenção, que é ADN, pode ser isolada por meio da ampliação selectiva de um ácido nucleico que codifica uma proteína nova da presente invenção utilizando processos de. reacção em cadeia de polimerase (RCP) e ADNc ou ADN genómico. É possível preparar iniciadores sintéticos de oligonucleó-tidos a partir da sequência de ácidos nucleicos da presente invenção para serem utilizados na RCP. Um ácido nucleico 17 pode ser ampliado a partir de ADNc ou de ADN genómico utilizando estes iniciadores de oligonucleotideos e técnicas normalizadas de ampliação por RCP. O ácido nucleico assim ampliado pode ser clonado num vector apropriado e caracterizado por análise da sequência de ADN. Será evidente que o ADNc pode ser preparado a partir ARNm, por meio do isolamento do ARNm celular total por meio. de uma variedade de técnicas,. por exemplo, utilizando o processo de extracção de tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al., Biochemistri, 18, 5294-5299 (1979).

Sintetiza-se então o ADNc a partir do ARNm utilizando transcriptase inversa (por exemplo, transcriptase inversa Moloney MLV da Invitrogen, Carlsbad, CA, ou transcriptase inversa AMV disponível na Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL).

Pode-se isolar uma molécula de ácido nucleico da presente invenção que representa o ARN, por meio da clonagem de um ADNc que codifica uma proteína nova da presente invenção num vector apropriado que permite a transcrição do ADNc para produzir uma molécula de ARN que codifica uma proteína da presente invenção. Por exemplo, pode-se clonar um ADNc a jusante de um promotor bacteriófago, (por exemplo, um promotor de T7) num vector, o ADNc pode ser transcrito, in vitro com polimerase T7 e pode-se isolar o ARN resultante por técnicas normalizadas.

Pode-se também sintetizar quimicamente uma molécula de ácido nucleico da presente invenção utilizando técnicas normalizadas. Conhecem-se vários processos de síntese química de polidesoxinucleótidos, incluindo a síntese em fase sólida a qual, tal como a síntese de péptidos, já foi completamente automatizada em sintetizadores de ADN disponíveis comercialmente (ver, por exemplo, Itakura et 18 al. patente de invenção norte-americana U.S. No. 4.598.049; Caruters et al. patente de invenção norte-americana U.S. No. 4.458.066; e Itakura patentes de invenção norte-americanas U.S. Nos. 4.401.796 e 4.373.071). A determinação se uma molécula de ácido nucleico particular codifica uma proteina nova da presente invenção, pode ser conseguida por meio da expressão do ADNc numa célula hospedeira apropriada por meio de técnicas normalizadas, é análise da actividade da proteina utilizando os processos aqui descritos. Um ADNC que tem a actividade de uma proteina nova da presente invenção assim isolado pode ser sequenciado por técnicas normalizadas, tal como a terminação de cadeia de didesoxinucleótido ou a sequenciação química de Maxam-Gilbert, para determinar a sequência de ácido nucleico e prever a sequência de aminoácidos da proteína codificada. O codão de iniciação e as sequências não traduzidas das moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção podem ser determinados utilizando software de computador disponível comercialmente desenhado para este fim, tal como. o PC/Gene (IntelliGenetics Inc., Calif.). Podem identificar-se elementos reguladores utilizando técnicas convencionais. A função dos elementos pode ser confirmada utilizando estes elementos para expressar um gene relator que está operacionalmente ligado aos elementos. Estas estruturas podem ser introduzidas em células de cultura utilizando processos normalizados. Para além da identificação dos elementos reguladores no ADN, essas estruturas podem também ser utilizadas para identificar proteínas que interagem com os elementos, utilizando técnicas conhecidas. 19 A sequência de uma molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser invertida relativamente à sua apresentação normal para a transcrição, para produzir uma molécula de ácido nucleico anti-paralela que se descrevem completamente aqui. Preferencialmente, constrói-se uma sequência anti-paralela invertendo uma região que precede o codão de iniciação ou uma região não conservada. Em particular, as sequências de ácidos nucleicos contidas nas moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção ou os seus fragmentos podem ser invertidas relativamente à sua apresentação normal para a transcrição para produzir moléculas de ácidos nucleicos anti-paralelas. Ά presente invenção também tem por objecto ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão que compreendem uma proteína nova da presente invenção e uma proteína seleccionada ou uma proteína de um marcador seleccionável (ver a seguir).

Também tem por objecto porções da sequência de ácidos nucleicos que codifica fragmentos, dominios funcionais ou determinantes antigénicos de p62/SQSTMl ou proteína de p62/SQSTMl mutada. A presente invenção também tem por objecto a utilização de porções da sequência como sondas e iniciadores de RCP para p62/SQSTMl e proteínas relacionadas, assim como para a determinação de aspectos funcionais da sequência.

Um especialista na material está agora habilitado a identificar e isolar os genes ou os ADNcs de p62/SQSTMl que são variantes alélicas da sequência de p62/SQSTMl descrita, utilizando o rastreio de hibridação padrão ou técnicas de RCP normalizadas. 20 II. Proteínas novas da presente invenção A presente invenção contempla ainda, de um modo geral, uma proteína atípica isolada que interage com a proteína cinase C com um peso molecular de aproximadamente .62 kD. A proteína tem a sequência de aminoácidos que se mostra na SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento contendo a posição 392 dos aminoácidos. Também tem por objecto uma p62/SQSTMl isolada que comporta uma sequência de aminoácidos conforme se mostra na figura 3 '{SEQ. ID. NO.: 2). A presente invenção inclui, assim, formas mutadas de p62/SQSTMl que constituem um diagnóstico da doença óssea de Paget ou de outras doenças dos ossos. Num enquadramento, a p62/SQSTMl mutada comporta uma sequência de aminoácidos conforme se mostra na figura 3 ou na SEQ. ID. NO.: 4. A sequência ilustrada na. SEQ. ID. NO.: 4 difere da sequência de origem natural ilustrada na SEQ. ID. NO. : 2 na posição 392 dos aminoácidos em que a prolina na sequência de origem natural está alterada para leucina na forma mutada.

No contexto da presente invenção, uma proteína da presente invenção pode incluir várias formas estruturais da proteína primária que retêm a actividade biológica. Por exemplo, uma proteína da presente invenção pode estar sob a forma de sais ácidos ou básicos ou numa forma neutra. Além disso, os resíduos individuais de aminoácidos podem ser modificados por oxidação ou redução.

Para além da sequência de aminoácidos de comprimento complete, a proteína da presente invenção pode também incluir fragmentos ou truncagens da proteína, tal como descrito aqui, desde que incluam- a posição 392 dos aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4. As proteínas trun- 21 cadas ou os seus fragmentos podem compreender péptidos de pelo menos 5, pref erencialmen.te 10 e mais preferencialmente 15 resíduos de aminoácidos da sequência ilustrada na SEQ. ID. NO.: 4. A presente invenção tem ainda por objecto polipéptidos que compreendem pelo menos um domínio funcional ou pelo menos um determinante antigénico de uma proteína p62/SQSTMl ou de uma-proteína p62/SQUMl mutada.

Estes fragmentos. contêm a mutação de prolina em leucina na posição 392. O fragmento da proteína p62/SQSTMl pode também incluir o domínio associado à ubiquitina nas posições 394-440 dos aminoácidos.

Também se descrevem aqui análogos da proteína e/ou as suas truncagens que podem incluir, mas não se .limitam a uma sequência de aminoácidos contendo uma ou mais substituições, inserções, eliminações e/ou mutações de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser de uma. natureza conservada ou não conservada. As substituições de aminoácidos conservadas envolvem a substituição de u ou mais aminoácidos das proteínas da presente invenção com aminoácidos com uma carga, dimensão e/ou características de hidrofobicidade. semelhantes. Quando se fazem apenas substituições conservadas, o análogo resultante deve ser funcionalmente equivalente. As substituições não conservadas envolvem a substituição de um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos com um ou mais aminoácidos que têm carga, dimensão e/ou características de hidrofobicidade diferentes.

Descrevem-se inserções de um ou mais aminoácidos nas sequências de aminoácidos da proteína. As inserções de 22 aminoácidos podem consistir em resíduos simples de aminoácidos ou aminoácidos sequenciais variando de 2 a 15 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, as inserções de aminoácidos podem ser utilizadas para destruir sequências-alvo de modo a que a proteínas deixe de estar activa. Este processo pode ser utilizado in vivo para inibir a actividade de uma proteína.

As eliminações podem consistir na eliminação de um ou mais aminoácidos ou porções discretas da sequência de aminoácidos da proteína p62/SQSTMl. Os aminoácidos eliminados podem ou não ser contíguos. 0 limite inferior, comprimento do análogo resultante com a mutação de eliminação é de cerca de 10 aminoácidos, preferencialmente 100 aminoácidos.

Os análogos de uma proteína aqui descritos podem ser preparados por introdução de mutações na sequência de nucleótidos que codifica a proteína.

As mutações podem ser introduzidas em loci particulares por meio da síntese de oligonucleotídeos que contêm uma sequência mutante, flanqueada por sítios de restrição que permitem a ligação a fragmentos da sequência natural. No seguimento da ligação, a sequência reconstruída resultante codifica um análogo com a desejada inserção, substituição ou eliminação de aminoácidos.

Alternativamente, podem utilizar-se processos de muta-génese específicos dos sítios dirigidos aos oligonucleó-tidos para providenciar um gene inalterado comportando codões particulares alterados de acordo com a substituição, eliminação ou inserção necessárias. A eliminação ou truncagem de uma proteína da presente invenção podem também 23 ser construídas por meio da utilização de sítios de endonucleases de restrição convenientes, adjacentes à eliminação desejada. No seguimento da restrição, as saliências podem ser preenchidas e o ADN religado. Sambrook et al {Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) descreve exemplos de processos que produzem as alterações indicadas antes.

Também se descrevem aqui homólogos das sequências de aminoácidos da proteína p62/SQSTMl, proteína p62/SQSTMl mutada e/ou os seus fragmentos. Esses homólogos são proteínas cujas sequências de aminoácidos são constituídas por sequências de aminoácidos que hibridam em condições de hibridação severas (ver aqui a discussão de condições de hibridação severas) com uma. sonda utilizada para se obter uma proteína- da presente invenção. Os homólogos dessa proteína têm as mesmas regiões que são características da proteína.

Uma proteína homóloga inclui uma proteína com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70 %, preferencialmente 80-95 % de identidade com a sequência de aminoácidos da proteína p62/SQSTMl ou da proteína p62/SQSTMl mutada. A presente invenção também contempla as isoformas das proteínas da presente invenção. Uma isoforma contém o mesmo número e tipos de aminoácidos que uma proteína da presente invenção, mas a isoforma tem uma. estrutura molecular diferente. As isoformas contempladas na presente invenção são as que têm as mesmas propriedades que a proteína da presente invenção, tal como se descreve aqui. 24 A presente invenção também, inclui uma proteína da presente invenção conjugada com uma proteína seleccionada, ou uma proteína de um marcador seleccionado, para produzir proteínas de fusão. Por exemplo, a sequência do ADNc de p62/SQSTMl está inserida num vector que contém uma sequência de nucleótidos que codifica outro péptido (por exemplo, GST -glutationossuccinil-transferase). A proteína de fusão é expressa e recuperada a partir de células procarióticas (por exemplo, bacterianas ou de .baculovírus) ou eucarióticas. A proteína de fusão pode então ser purificada por cromatografia de afinidade com base na sequência do vector de fusão e a proteína p62/SQSTMl obtida por clivagem enzimátíca da proteína de fusão.

As proteínas da presente invenção (incluindo fragmentos, etc.), podem ser preparadas utilizando processos de ADN recombinante. De acordo com isto, as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção que comportam uma sequência que codifica uma proteína da presente invenção podem ser incorporadas de acordo com processos conhecidos na técnica, num vector de expressão apropriado que assegura uma boa expressão da proteína. Os vectores de expressão possíveis incluem, mas não se limitam a cosmidos, plas-midos, ou vírus modificados (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosos, adenovírus e vírus adeno-associados), desde que o vector seja compatível com a célula hospedeira utilizada. A expressão "vectores apropriados para a transformação de uma célula hospedeira ", significa que os vectores de expressão contêm uma molécula de ácido nucleico da presente invenção e sequências reguladoras, seleccionadas com base nas células hospedeiras que se utilizam para a expressão, que estão operacionalmente ligadas à molécula de ácido nucleico. "Operacionalmente ligadas" pretende significar que o ácido 25 nucleico está ligado a sequências reguladoras de uma maneira que permite a expressão do ácido nucleico. A presente invenção tem por isso por objecto um vector de expressão recombinante contendo uma molécula de ácido nucleico da presente invenção ou um seu fragmento, e as sequências reguladoras necessárias para a transcrição e tradução da sequência de proteínas inserida. As sequências reguladoras apropriadas podem derivar de uma variedade de fontes, incluindo genes bacterianos, fúngicos ou virais (por exemplo, ver as sequências reguladoras descritas em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). A selecção das sequências reguladoras apropriadas está dependente da células . hospedeira escolhida e pode ser facilmente realizada por um especialista na técnica. Exemplos dessas sequências reguladoras incluem: um promotor e um melhorador transcricionais ou sequências de ligação de polimerase de ARN, uma sequência de ligação ribosómica, incluindo um sinal de iniciação da tradução. Adicionalmente, consoante a células hospedeira escolhida e o vector utilizado, outras sequências, tal como uma origem de replicação, sítios de restrição adicionais de ADN, melhoradores, e sequências que conferem inductibilidade de transcrição podem ser incorporadas no vector de expressão. Também se entenderá que as sequências reguladoras podem ser fornecidas pela proteína natural e/ou as regiões que a flanqueiam. A presente invenção tem ainda por objecto um vector de expressão recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico de ADN da presente invenção no vector de expressão com uma orientação anti-paralela. Isto é, a molécula de AND está ligada operacionalmente a uma sequência reguladora de uma maneira que permite a expressão, por meio da trans- 26 crição da molécula de ADN, de uma molécula de ARN que é anti-paralela em relação a.uma sequência de nucelótidos da presente invenção. As sequências reguladoras ligadas operacionalmente ao ácido nucleico anti-paralelo podem ser escolhidas de modo a dirigirem a expressão continua da molécula de ARN anti-paralela.

Os vectores de expressão recombinante da presente invenção podem também conter um gene de marcador seleccionável que facilitam a selecção de células hospedeiras transformadas ou transfectadas com uma molécula recombinante da presente invenção. Exemplos de genes de marcadores seleccionáveis são genes que codificam uma proteína tal como G418 e higromicina que conferem resistência a certos fármacos, 13-galactosidase, cloran-fenicol-acetiltransferase, ou firefli-luciferase. A transcrição do gene de marcador seleccionável é monitorizada pelas alterações, na concentração da proteína do marcador seleccionável tal como iS-galactosidase, cloranfenicol-acetiltransferase, ou firefli-luciferase. Se o gene de marcador seleccionável codifica uma proteína que confere resistência a antibióticos tal como células transformantes da resistência à neomicina, podem ser seleccionados com G418 (também conhecido como geneticina) . As células que tenham incorporado o gene de marcador seleccionável irão sobreviver, enquanto as outras células morrem. Isto torna possível visualizar e ensaiar quanto à expressão dos vectores de expressão.recombinante da presente invenção e, em particular, para determinar o efeito de uma mutação na expressão e no fenótipo. Tornar-se-á evidente que os marcadores seleccionáveis podem ser introduzidos num vector separado a partir do ácido nucleico de interesse. 27

Os vectores de expressão recombinante podem também conter genes que codificam uma parte de fusão que providencia uma maior expressão da proteína recombinante; uma maior solubilidade da proteína recombinante; e ajuda na purificação de uma proteína-alvo recombinante por meio da actuação como um ligando numa purificação por afinidade. Por exemplo, pode-se adicionar um sítio de clivagem proteolítica à proteína-alvo recombinante para permitir a separação da proteína recombinante a partir da parte de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão.

Os vectores de expressão recombinante podem ser introduzido em células hospedeiras para produzir uma célula hospedeira transformada. De acordo com isto, a presente invenção inclui uma célula hospedeira que compreende um vector de expressão recombinante da presente invenção. A expressão "célula hospedeira transformada" significa' que inclui células procarióticas e eucarióticas que tenham sido transformadas ou transfectadas com um vector de expressão recombinante da. presente invenção. As expressões "transformado com", "transfectado com", "transformação" e "transfecção" significam que englobam a introdução de ácido nucleico (por exemplo um vector) numa célula por meio de uma ou mais técnicas possíveis conhecidas na técnica. As células procarióticas podem ser transformadas com ácido nucleico, por exemplo, por meio de electroporação ou transformação regulada por cloreto de cálcio. 0 ácido nucleico pode ser introduzido em células de mamíferos por via de técnicas convencionais tal como a co-precipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio,· transfecção. regulada por DEAE-dextrano, lipofectina, electroporação ou micro-injecção. Os processos apropriados para a transformação e transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A 28

Laboratory Manual, 2 a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), e outros livros de texto laboratoriais.

As células hospedeiras apropriadas incluem uma ampla variedade de células hospedeiras procarióticas e euca-rióticas. Por exemplo, as proteínas da presente invenção podem ser expressas em células bacterianas tal como células bacterianas tais como E. coli, Pseudomonas, Bacíllus subtillus, células de insectos (utilizando baculovírus), células de leveduras ou células de mamíferos. Outras células hospedeiras apropriadas podem ser encontradas em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991).

Como exemplo, para produzir, de forma recombinante, proteínas p62/SQSTMl, pode-se utilizar, for exemplo, E. coli, utilizando o sistema promotor de 17 ARN polímera-se/promotor utilizando dois plasmidos ou por meio da marcação das proteínas codificadas por plasmidos ou por expressão, por infecção com os vectores M13 Fago mGPI-2. Os vectores de E. coli podem também ser utilizados com as sequências reguladoras de Fago lambda, por meio de vectores de proteínas de fusão (por exemplo, lacZ e trpE) , por meio de fusões de proteínas que se ligam a maltose e por meio das proteínas de fusão de glutationa-S-transferase.

Alternativamente, a proteína p62/SQSTMl pode ser expressa em células de insectos utilizando vectores de baculovírus, ou em células de mamíferos utilizando vírus vaccínia. Para a expressão em células de mamíferos, a sequência de ADN pode estar ligada a promotores heteró-logos, tal como um promotor de vírus de símios (SV40) no vector pSV2 vector e é introduzida em células, tal como células COS para se realizar a expressão temporária ou de 29 longo prazo. Ά integração estável da estrutura de gene quimérico pode ser mantida em células de mamíferos por meio de uma selecção bioquímica, tal como neomicina e ácido micofenólico. A sequência de ADN de p62/SQSTMI ADN pode ser alterada utilizando processos tal como a digestão de enzimas de restrição, o preenchimento de ADN-polimerase, a eliminação por meio de xonuclease, a extensão por desoxinucleótido-transferase terminal, a ligação de sequências de ADN sintéticas ou clonadas, a alteração de sequências dirigida ao sítio com a utilização de oligonucleotideos específicos em conjunto com RCP. A sequência de ADNc ou as suas porções ou um mini gene que consiste num ADNc com um intrão e o seu próprio promotor é introduzida nos vectores de expressão eucariótica por técnicas convencionais. Estes vectores permitem a transcrição do . ADNc em células eucaríóticas por meio de sequências reguladoras que iniciam e aumentam a transcrição do ADNc e asseguram a sua própria combinação e polia-denilação. Também se pode utilizar o promotor .do gene endógeno de p62/SQSTMl. Os diferentes promotores dentro dos vectores têm' diferentes actividades que alteram o nível de expressão do ADNc. Alem disso, certos promotores podem também regular a função tal como o promotor responsável pelos glicocorticoides do vírus de tumor mamário de ratos.

Alguns dos vectores listados antes contêm marcadores seleccionáveis ou novos genes bacterianos que permitem o isolamento de células por selecção química. Podem manter-se vectores estáveis a longo prazo em células como as episomais, facilitando uma replicação livre por meio da utilização de elementos reguladores dos vírus. Podem também 30 produzir-se linhas de células que têm integrado o vector no ADN genómico. Desta maneira, o. produto do gene é produzido numa base continua.

Introduzem-se os vectores em células receptoras por vários processos incluindo fosfato de cálcio, fosfato de estrôncio, electroporação, lipofecção, DEAE-dextrano, microinjecção, ou por fusão do protoplasto. Alternativamente, o ADNc pode ser introduzido por infecção utilizando vectores virais.

As proteínas p62/SQSTMl podem também ser isoladas das células- ou dos tecidos, incluindo células ou tecidos de mamíferos,, em que a proteína é expressa normalmente. A proteína pode ser purificada por processos convencionais de purificação, conhecidos pelos especialistas da técnica, tal como processos de cromatografia, processos de cromatografia em liquido de elevada resolução ou precipitação.

Por exemplo, os anticorpos anti-p62/SQSTMl (tal como se descreve a seguir) podem ser utilizados para isolar uma proteína p62/SQSTMl, que é então purificada por processos normalizados.

As proteínas da presente invenção podem também ser preparadas por síntese química utilizando técnicas bem conhecidas na química das proteínas tal como as sínteses em fase sólida (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoe. 85: 2149-2154) ou síntese em solução homogénea (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 1 e II, Thieme, Estugarda). 31 III. Utilizações A presente invenção inclui todas as utilizações da molécula de ácido nucleico e as proteínas p62/SQSTMl da presente invenção incluindo, mas não se limitando à preparação de anticorpos e de oligonucleotídeos para estudar p62/SQSTMl e as suas formas mutadas, o isolamento de substâncias que regulam a expressão e/ou a actividade de p62/SQSTMl assim como a utilização de sequências de ácidos nucleicos de p62lSQSTMl e as suas proteínas e reguladores, em aplicações de diagnóstico e terapêuticas. A seguir descrevem-se mais utilizações. (a) Anticorpos 0 isolamento da proteína p62/SQSTMl e da proteína p62/SQSTMl mutada p62/SQSTMl protein permite a preparação de anticorpos específicos para p62/SQSTMl e/ou p62/SQSTMl mutada. De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto um anticorpo que se liga a uma proteína p62/SQSTMl mutada com a sequência de aminoácidos que se mostra na SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento que contêm a posição 392 dos aminoácidos, na posição 392 dos aminoácidos. Os anticorpos que reagem apenas com p62/SQSTMl mutada podem ser utilizados com vantagem para diagnosticar a doença óssea de Paget ou outras doenças ósseas. Os anticorpos podem ser preparados de modo a ligarem-se a epítopos distintos na região mutada da proteína.

Podem utilizar-se processos convencionais para preparar os anticorpos. Por exemplo, utilizando um péptido de p62/SQSTMl, podem preparar-se anti-soros policlonais ou anticorpos monoclonais, utilizando processos normalizados. Um mamífero (por exemplo, um rato, um hamster, ou um 32 coelho) pode ser imunizado com uma forma imunogénica do péptido que provoca uma resposta do anticorpo no mamífero. As técnicas que conferem a imunogeneicidade num péptido incluem a conjugação com veículos ou outras técnicas bem, conhecidas na técnica. Por exemplo, a proteína ou o péptido podem ser administrados na presença de adjuvante. 0 progresso da imunização pode ser monitorizado por detecção de títulos de anticorpos, no plasma ou no soro. 0 processo normalizado de ELISA ou outros imuno-ensaios podem ser utilizados com o imunogénio como antigénio para avaliar os níveis de anticorpos. No seguimento da imunização, podem obter^se anti^soros e, se desejado, anticorpos pòliclonais isolados do soro.

Para produzir anticorpos monoclonais, podem colher-se células que produzem anticorpos (linfócitos) do animal imunizado e depois fundem-se, com células de mieloma por meio de processos normalizados de fusão de células somáticas, imortalizando assim essas células e obtendo-se células de hibridoma. Essas técnicas são bem conhecidas neste domínio, (por exemplo, a técnica de hibridoma originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein (Nature 256, 495-497 (1975)) assim como por outras técnicas tal como a técnica do hibridoma da célula B humana (Kozbor et al., Immunol. Today 4,. 72 (1983) ) , a técnica de VEB (vírus de Epstein-Barr)-hibridoma para produzir anticorpos monoclonais humanas (Cole et al. Monoclonal Antibodies in Câncer Therapy (1985) Allen R. Bliss, Inc., páginas 77-96), e rastrear bibliotecas combinatórias de anticorpos (Huse et al., Science 246, 1275 (1989)). As células de hibridoma podem ser rastreadas imuno-quimicamente para a produção de anticorpos especificamente reactivos com o péptido e podem isolar-se os anticorpos monoclonais. Por isso, a presente invenção também tem por objecto células de hibridoma que 33 segregam anticorpos monoclonais com especificidade para p62/SQSTMl e/ou p62/SQSTMl mutada, conforme se descreve aqui. 0 termo "anticorpo", tal como se utiliza aqui, supõe a inclusão dos seus fragmentos que também reagem especi-ficamente com p62/SQSTMl mutadas. Os anticorpos podem ser fragmentados utilizando técnicas convencionais e os fragmentos são rastreados quanto à sua utilidade, da mesma maneira que se descreveu antes. Por exemplo, os fragmentos F(ab'}2 podem ser gerados tratando o anticorpos com pepsina. O fragmento de F(abT)2 resultante pode ainda ser tratado para produzir os fragmentos Fab'.

Os derivados de anticorpos quiméricos, isto é, as moléculas de anticorpos que combinam uma região variável de animal não humano e uma região constante humana estão também contempladas no âmbito da presente invenção. As moléculas de anticorpos quiméricos podem incluir, por exemplo, o domínio de ligação dò antigénio de um anticorpo de um murganho, rato, ou. de outras espécies, com regiões constantes humanas.. Podem utilizar-se processos convencionais para produzir anticorpos quiméricos contendo a região variável de imunoglobulina que reconhece o produto do gene dos antigénios de p62/SQSTM da presente invenção (ver, por exemplo, Morrison et al., Free. Natl Acad. Sei. E.U.A. 81, 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al., patente de invenção norte-americana U.S. No. 4.816.567; Boss et alpatente de invenção norte-americana U.S. No. 4.816.397; Tanaguchi et al., publicação da patente de invenção europeia EP171496; publicação da patente de invenção europeia 0173494, patente de invenção britânica GB 21770966). Espera-se que os anticorpos 34 quiméricos sejam menos imunogénicos num indivíduo humano do que os correspondentes anticorpos não quiméricos.

Os anticorpos monoclonais ou quiméricos que reagem especificamente com uma proteína da presente invenção, tal como descrito aqui, podem ainda ser humanizados por meio da produção de substitutos de regiões constantes humanas, em que partes das regiões variáveis, particularmente as regiões com uma estrutura conservada do domínio de ligação do antigénio, são de origem humana e apenas as regiões hipervariáveis não são de origem humana. Essas moléculas de imunoglobulina podem ser produzidas por técnicas conhecidas neste domínio, (por exemplo, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor at al.,

Immunology Today, 4, 7 27 9 (1983); Olsson et al., Meth.

Enzymol., 92, 3-16 (1982)), e a publicação da patente. PCT W092/06193;ou EP 0239400). Os anticorpos humanizados podem também ser. produzidos comercialmente (Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Grã-Bretanha.)

Os anticorpos específicos ou os fragmentos de anticorpos, que reagem contra as proteínas p62/SQSTMl podem também ser gerados por rastreamento de bibliotecas de expressão que codificam os genes de imunoglobulina, ou as suas porções, expressos em bactérias com péptidos produzidos a partir de moléculas de ácidos nucleicos de p62/SQSTMl.' Por exemplo, os fragmentos completos de Fab,· as regiões VH e as regiões FV podem ser expressas em bactérias . utilizando bibliotecas de expressão de fagos (ver, por exemplo Ward et al., Nature 341, 544-546: (1989); Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989); e McCafferty et al.

Nature 348, 552-554 (1990)). Alternativamente, pode-se utilizar um rato SCID-hu, por exemplo o modelo desenvolvido 35 por Genfarm, para produzir anticorpos ou os seus fragmentos . (b) Oligonucleotideoes anti-paralelos 0 isolamento de uma molécula de ácido nucleico que codifica p62/SQSTMl e p62/SQSTMl mutada permite a produção de oligonucleotldeos anti-paralelos que regulam a expressão e/ou a actividade de p62/SQSTMl e p62/SQSTMl mutada.

De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto um oligonucleotídeo antí-paralelo que é complementar de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica p62/SQSTMl mutada. Pelo contrário, um exemplo de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica p62/SQSTMl normal. está ilustrado na. SEQ. ID. NO.: 1 e está ilustrada no GenBank com os nos. de acesso NM0039Q0, XM035281 ou GI 19923742.

Noutro enquadramento, a sequência de ácidos nucleicos codifica uma p62/SQSTMl mutada que está associada com a doença óssea de Paget ou com outras doenças ósseas. Preferencialmente, a sequência de ácidos nucleicos é como a ilustrada na SEQ. ID. NO.: 3. A expressão " oligonucleotídeo anti-paralelo" tal como se utiliza aqui, significa uma sequência de ácidos nucleicos que é complementar do seu alvo. 0 termo "oligonucleotídeo" refere-se a um oligómero ou a um polímero de monómeros de nucleótidos ou de nucleósidos que consiste em bases, açúcares e ligações inter-açúcares (estruturas) de ocorrência natural. 0 termo também inclui oligómeros modificados ou substituídos que compreendem monómeros ou porções de monómeros de ocorrência natural, que funcionam de uma forma similar. Esses oligonucleotideos modificados ou substituídos podem ser preferidos em relação às formas de ocorrência natural por causa das propriedades tais como aumento da absorção celular ou aumento de estabilidade na presença de nucleases. 0 termo também inclui oligonucleotideos quiméricos que contêm duas ou mais regiões distintas sob o ponto de vista químico. Por exemplo, os oligonucleotideos quiméricos podem conter pelo menos uma região de nculeótidos modificados que conferem propriedades benéficas (por exemplo, aumento de resistência às nucleases, aumento de fixação nas células), ou dois ou mais oligonucleotideos da presente invenção podem juntar-se para formar um olígonucleotídeo quimérico.

Os oligonucleotideos anti-paralelos da presente invenção podem ser os ácidos ribonucleico ou desoxiribonucleico e podem conter bases de ocorrência natural incluindo adenina, guanina, citosina, timidina e uracilo. Os oligonucleotideos podem também conter bases modificadas tais como xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil-, 2-propil- e outras alquil-adeninas, 5-halogeno- uracilo, 5-halogeno-citosina, 6-aza-uracilo, 6-aza- citosina a 6-aza-timina, pseudo-uracilo, 4-tiouracilo, 8-halogeno-adenina, 8-aminoadenina, 8-tiol-adenina, 8-tiolalquil-adeninas, 8-hidroxil-adenina e outras adeninas substituídas na posição 8,. 8-halogeno-guaninas, 8-amino-guanina, 8-tiol-guanina, 8-tiolalquil-guaninas, 8-hidroxi-l guanina e outras guaninas substi-tuídas na posição 8, outros aza- e desaza-uracilos, timidi-nas, citosinas, adeninas, ou guaninas, 5-trifluorometil-uracilo e 5-trifluoro-citosina.

Outros oligonucleotideos anti-paralelos da presente in-venção podem conter heteroátomos de fósforo e oxigénio 37 modificados na estrutura de fosfato, cadeias curtas de alquilo ou ligações de cicloalquilo entre os açúcares ou cadeias curtas, heteroatómicas ou ligações heterociclicas entre os açúcares. Por exemplo, os oligonucleotideos anti-paralelos podem conter tioatos de fósforo, fosfotriésteres, fosfonatos de metilo, e ditioatos de fósforo. Num enquadramento da presente invenção, há ligações de tioato de fósforo entre as quatro a seis bases de terminação 3' . Noutro enquadramento, as ligações de tioato de fósforo ligam todos os nucleótidos.

Os oligonucleotideos anti-paralelos da presente invenção podem também compreendem análogos de nucleótidos que podem estar melhor adaptados como reagentes terapêuticos ou experimentais. Um exemplo de um análogo de oligonucleotídeo é um ácido nucleico de péptido (ANP) em q estrutura de fosfato de desoxiribose (ou ribose) no ADN (ou no ARN) , está substituída por uma estrutura de poliamida que é semelhante à encontrada nos' péptidos (P.E. Nielsen, et al Science 1991, 254, 1497). Os análogos de ANP têm mostrado ser resistentes à degradação provocada por enzimas e ter vidas mais prolongadas in vivo e in vitro. Os ANPs também se ligam de forma mais forte a uma sequência complementar de ADN devido à perda de repulsão de carga entre a estrutura helicoidal do ANP e a estrutura helicoidal do ADN. Outros oligonucleotideos podem conter nucleótidos contendo estruturas de polímero, estruturas cíclicas, ou estruturas acíclicas. Por exemplo, os nucleótido podem ter estrutras de morfolino (patente de invenção norte-americana U.S. No. 5.034.506). Os oligonucleotideos podem também conter grupos tal como grupos relatores, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um oligonucle-ótido ou um grupo para melhorar as propriedades fármaco-cinéticas de um oligonucleotídeo anti-paralelo. Os oligonu- 38 cleótidos anti-paralelos poderá ter estruturas que simulam açúcares.

As moléculas de ácidos nucleicos anti-paralelos podem ser construídas utilizando sínteses químicas e reacções de ligação enzimática utilizando processos conhecidos nesta técnica. As moléculas de ácidos nucleicos anti-paralelos da presente invenção ou um seu fragmento podem ser sintetizadas quimicamente utilizando nucleótidos de ocorrência natural ou nucleótidos modificados de várias maneiras, preparados para aumentar, a estabilidade biológica das moléculas, ou para aumentar a estabilidade física do duplex formado com ARNm ou o gene natural, por exemplo, derivados de. tioato de fósforo e nucleótidos substituídas com acridina. As sequências anti-paralelas podem ser produzidas biologicamente utilizando um vector de expressão introduzido nas células sob a forma de um plasmido, fagemido recombinante ou virus atenuado em que as sequências anti-paralelas são produzidas sob o controlo de uma região reguladora altamente eficiente, cuja actividade pode ser determinada pelo tipo de célula em que se introduz o vector.

Os oligonucleotídeos anti-paralelos podem ser oligonu-cleótidos introduzidos em tecidos ou .células utilizando técnicas conhecidas neste dominio incluindo técnicas de vectores (vectores retrovirais, vectores adenovirais e vectores de vírus de ADN) ou técnicas físicas tais como micro-injecção. Os oligonucleotídeos anti-paralelos podem ser administrados directamente in vivo ou podem ser utilizados para transfectar células in vitro que são então administradas in vivo. Num enquadramento, o oligonucleo-tídeo anti-paralelo pode ser libertado nos macrófagos e/ou nas células endoteliais numa formulação de liposoma. 39 (c) Ensaios de diagnóstico A verificação, pelos requerentes, de que p62/SQSTMl mutada está envolvida na doença óssea de Paget permite o desenvolvimento de ensaios de diagnóstico para a detecçâo da doença óssea de Paget ou de outras doenças dos ossos.

De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto um processo para a detecçâo de uma condição associada com uma proteína p62/SQSTMl mutada compreendendo o ensaio de uma amostra para avaliar (a) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína p62/SQSTMl mutada ou que comporta a sequência ilustrada na SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento ou (b) uma proteína p62/SQSTMl mutada ou comportando a sequência ilustrada na SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento. Num enquadramento, a condição associada à proteína p62/SQSTMl mutada é a doença óssea de Paget. (I) Moléculas de ácidos nucleicos

As moléculas de ácidos nucleicos que codificam p62/SQSTMl, tal como descrita aqui, ou um seu fragmento, permitem aos especialistas na matéris construir sondas de nucelótido para serem utilizadas na detecçâo de sequências de nucleótidos que codificam p62/SQSTMl mutada ou os seus fragmentos em amostras, preferencialmente amostras biológicas tal como células, tecidos e fluidos do corpo. As sondas podem ser úteis na detecçâo da presença de uma condição associada com p62/SQSTMl ou na monitorização do progresso dessa condição. Essas condições incluem a doença óssea de Paget.

Também se descreve aqui um processo para a detecçâo de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma p62/SQSTMl 40 mutada numa amostra, que consiste no contacto da amostra com uma sonda de nucleótido capaz de hibridar com a molécula de ácido nucleico . para formar o produto de hibridação, em condições que permitem a formação do produto de hibridação e fazendo o ensaio para detectar o produto de hibridação. A sonda de nucleótido utilizada no ensaio de diagnóstico irá hibridar com a p62/SQSTMl mutada (contendo a mutação de prolina em leucina na posição 392) mas não com a p62/SQSTMl de tipo selvagem. Exemplos de sondas que podem ser utilizadas no processo anterior incluem fragmentos das sequências de ácidos nucleicos ilustradas na figura 3 ou na SEQ. ID. NO.: 3. Uma sonda de nucleótido pode ser marcada com uma substância detectável tal como um marcador radioactivo que fornece um sinal adequado e tenha um semi-período de vida suficiente tal como 32P, 3H, 14C ou similares. Outras substâncias detectáveis que podem ser utilizadas incluem ántigénios que são reconhecidos. por um anticorpo especifico marcado, compostos fluorescentes, enzimas, anticorpos específicos para um antigénio marcada© e quimioluminescência. Um marcador apropriado pode ser seleccionado tendo em vista a taxa de hibridação e de ligação da sonda ao ácido nucleico a ser detectado e a quantidade de ácido nucleico disponível para a hibridação. As sondas marcadas podem ser hibridadas com ácidos nucleicos em suportes sólidos tal como filtros de nitrocelulose ou membranas de nylon, tal - como . está descrito, genericamente, em Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a ed.). As sondas de nucleótidos podem ser utilizadas para detector genes, preferencialmente em células humanas, que hibridam com a molécula de ácido nucleico da presente invenção, preferencialmente as moléculas de ácidos nucleicos que 41 hibridam com a molécula de ácido nucleico da presente invenção em condições de hibridação severas, tal como descrito aqui.

Num enquadramento, o ensaio de hibridação pode ser uma análise de Southern em que a amostra do paciente é analisada quanto à sequência de ADN que híbrida com uma sonda especifica de p62/SQSTMl mutada. Noutro enquadramento, o ensaio de hibridação pode ser uma análise de Northern em que a amostra do paciente é analisada quanto à sequência de ARN que hibrida com uma sonda específica de p62/SQSTMl mutada. As análises de Southern e de Northern podem ser realizadas utilizando técnicas conhecidas neste domínio (ver, for exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons).

As moléculas de ácidos nucleicos que. codificam uma proteína p62/SQSTMl mutada podem ser ampliadas selecti-vamente numa amostra utilizando processos de reacção em cadeia de polimerase (RCP) e ADNc ou ADM genómico. É possível preparar iniciadores sintéticos de oligonucleóti-dos a partir da sequência de nucleótidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 3 para ser utilizada na RCP. Um ácido nucleico pode ser ampliado a partir de ADNc e ADN genómico utilizando iniciadores de oligonUcleotídeos e técnicas normalizadas de ampliação por RCP. 0 ácido nucleico ampliado pode ser clonado num vector apropriado e caracterizado por análise de sequências de ADN. 0 ADNc pode ser preparado a partir de ARNm, isolando o ARNm celular total por meio de uma variedade de técnicas, por exemplo, utilizando o processo de extracçâo com tiocianato de guanidínio de Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294-5299 (197 9) . 0 ADNc é então sintetizado a partir do ARNm utilizando transcriptase inversa (por exemplo, trans- 42 criptase inversa Moloney MLV disponível na Gibco/BRL, Betesda, MD, ou transcriptase inversa AMV disponível na Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL).

Os pacientes podem ser rastreados por rotina utilizando sondas para detectar a presença de um gene mutante de p62/SQSTMa por meio de uma variedade de técnicas. 0 ADN genómico utilizado para o diagnóstico pode ser obtido a partir de células do corpo, tal como as que estão presentes no sangue, em biopsias de tecidos, espécies cirúrgicas ou material de autópsia. 0 ADN pode ser isolado e utilizado directamente para a detecção de uma sequência especifica ou pode ser ampliado por RCP antes da análise. Também se pode utilizar ARN ou ADNc. Para detectar uma hibridação específica de uma sequência de ADN utilizando oligonu-cleotídeos específicos, podem utilizar-se processos como sequenciação directa de ADN, digestão da enzima de restrição, protecção de RNase, clivagem química e detecção mediada por ligase. Os oligonucleotídeos específicos para as sequências mutantes podem ser sintetizados quimicamente e marcados radioactivamente com isótopos ou marcadores de biotina utilizados de. forma não radioactiva e hibridados com amostras individuais de ADN imobilizadas em membranas ou outros suportes sólidos por meio de transferência de manchas (dot-blot) ou transferência a partir de géis após a electroforese. A presença ou a ausência destas sequências mutantes é então visualizada utilizando processos tais como autoradíografia, fluorometria, ou reacções colorimétricas. Os iniciadores apropriados da RCP podem ser gerados de tal modo que sejam úteis, por exemplo, na ampliação de porções da sequência em questão, contendo mutações identificadas. A sequenciação directa do ADN revela diferenças na sequência entre o ADN de p62/SQSTMl normal e mutante. Os 43 segmentos de ADN clonado podem ser utilizados como sondas para detectar segmentos específicos de ADN. Pode-se utilizar a RCP para aumentar a sensibilidade deste processo. A RCP é uma ampliação enzimática dirigida pelos iniciadores específicos da sequência e envolve ciclos repetidos de desnaturação pelo calor do ADN, enrolamento dos iniciadores complementares e extensão do iniciador enrolado com uma polimerase de ADN. Isto resulta num aumento exponencial do ADN alvo.

Podem utilizar-se outras técnicas de ampliação das sequências de nucleótidos, tal como RCP mediada pela ligação, TCP ancorada e ampliação enzimática como será entendido pelos especialistas na matéria.

As alterações da sequência podem também gerar sítios fortuitos de reconhecimento da enzima de restrição que são revelados pela utilização da digestão apropriada da enzima seguida de hibridação de gel-mancha. Os fragmentos que comportam o sítio (normais ou mutantes) são detectados pelo aumento ou redução da sua dimensão ou pelo aumento ou diminuição do número de fragmentos de restrição resultantes. As amostras de ADN genómico podem também ser ampliadas por RCP antes do tratamento com a enzima de restrição apropriada e visuzalizam-se fragmentos de diferentes dimensões, com luz UV, na presença de brometo de etidio, depois da electroforese em gel.

Os ensaios genéticos com base nas diferenças das sequências de AND podem ser feitos por meio da detecção da alteração na mobilidade electroforètica dos fragmentos de ADN nos géis. As eliminações e inserções pequenas podem ser visualizadas por electroforese em gel de alta resolução. As eliminações pequenas podem também ser detectadas como 44 alterações no modelo de migração dos heteroduplexes de ADN por meio de electroforese em gel não desnaturante. Alternativamente, pode-se detector uma única mutação de substituição da base no comprimento diferencial do iniciador na RCP. Os produtos da ECP do gene normal e mutante podem ser detectados diferencialmente em géis de acrilamida gels.

Os ensaios de protecção da nuclease (Sl ou mediados por ligase) também revelam alterações da sequência em localizações específicas. Alternativamente, pode-se utilizar ASO, REF-PCHS (polimorfismo com uma conformação em hélice simples, SSCP na terminologia inglesa) e PCHS para confirmar ou detectar alterações no mapeamento de restrição de polimorfismos ligados A RCP. Tanto REF-PCHS como PCHS são ensaios de alteração da mobilidade que se baseiam na alteração na conformação devida a mutações.

Os.fragmentos de ADN podem também ser visualizados por processos em que as amostras individuais, de ADN não estão imobilizadas· em membranas. A sonda e as sequências alvo podem estar em solução ou a sequência da sonda pode estar imobilizada. A autoradiografia, a diminuição da radio-actividade, a espectrofotometría, e a fluorometria também podem ser utilizadas para identificar genotipos individuais específicos.

De acordo com um enquadramento da presente invenção, a porção do segmento de ADN que é informativa quanto à mutação pode ser. ampliada utilizando RCP. Por exemplo, para detector a mutação de prolina em leucina na posição 392 do aminoácido, pode-se ampliar o nucleótido à volta do.ADN na posição 1215. 0 segmento de ADN que envolve a proximidade de uma mutação específica adquirida de amostras de sangue 45 periférico ou de outros tecidos, de um indivíduo, pode ser rastreado utilizando iniciadores preparados de oligonucleo-tídeos. Esta região será então ampliada por RCP, os produtos separados e transferidos para a membrana. As sondas marcadas são então hibridadas com os fragmentos de ADN e realiza-se a autoradiografia. (ii) Proteínas A proteína p62/SQSTMl mutada pode ser- detectada numa amostra utilizando anticorpos que se ligam à proteína conforme descrito em detalhe antes. De acordo com isto, num enquadramento, o processo para a detecção de uma proteína p62/SQSTMl mutada compreende o contacto da amostra com um anticorpo que se liga a p62/SQSTMl que é capaz de ser detectada depois de se ligar a p62/SQSTMl mutada mutada na amostra.

Os anticorpos que reagem especificamente com p62/SQSTMl mutada, ou os seus derivados, tal como conjugados de enzima ou os derivados marcados, podem ser utilizados para detectar proteína p62/SQSTMl mutada em vários materiais biológicos, por exemplo, podem ser utilizados em quaisquer imuno-ensaios conhecidos que se baseiam na interacção de ligação entre . um determinante antigénico de p62/SQSTMl mutada e os anticorpos. Exemplos desses ensaios são os rádio-imunoensaios, imuno-ensaios com enzima (por exemplo, ELISA), ensaios de imunofluorescência, de imunoprecipitação, de aglutinação de latex, de hema-glutinação e histoquímicos. Assim, podem utilizar-se os anticorpos para detectar e quantificas p62/SQSTMl mutada numa amostra, de modo a determinar o seu papel em eventos celulares particulares ou estados patológicos e para diagnosticar e tratar esses estados patológicos, preferencialmente a doença óssea de Paget.

Em particular, os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados em análises imuno-histoquimicas, por exemplo, ao nivel celular e sub-celular, para detectar p62/SQSTMl mutada, para localizá-la em células e tecidos particulares e para localizações sub-celulares especificas, e para quantificar o nivel de expressão.

Podem-se utilizar técnicas citoquímicas conhecidas neste dominio para localizar antigénios utilizando luz e microscópio electrónico para detectar p62/SQSTMl mutada. Geralmente, pode-se marcar um anticorpo da presente invenção com uma substância detectável e .a p62/SQSTMl mutada pode ser localizada no tecido com base na presença da substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioactivos. Exemplos de enzimas apropriadas incluem peroxidase de rábano, biotina, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinaesterase; exemplos de materiais fluorescentes apropriados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotio-cianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de materiais radioactivos apropriados incluem iodo radioactivo 1-125, 1-131 ou 3-H. Os anticorpos podem estar acoplados a substâncias com densidade electrónica, tal como ferritina ou ouro coloidal, que são facilmente visualizadas por microscopia electrónica.

Também se podem utilizar processos indirectos em que a reacção de antigénio primário - anticorpo é ampliada pela 47 introdução de um segundo anticorpo, com especificidade para o anticorpo reactivo face a p62/SQSTMl mutada. A título de exemplo, se o anticorpo tiver especificidade face a p62/SQSTMl mutada, é um anticorpo de IgG de anticorpo, o segundo anticorpo pode ser gama-globulina de cabra anti-coelho marcada com uma substância detectável, tal como se descreve aqui.

Quando se utiliza um marcador râdioactivo como substância detectável, a p62/SQSTMl mutada pode ser localizada por autoradiografia. Os resultados da auto.radiografía podem ser quantificados por meio da determinação da densidade de partículas nas autoradiografias por . meio· de vários processos ópticos, ou contando os grãos: (d) Sistemas experimentais

Podem-se utilizar sistemas de expressão eucarióticos para muitos estudos do gene de p62/SQSTMl e os produtos do gene incluindo a produção de grandes quantidades da proteína normal e mutante para o isolamento e purificação, para utilizar células que expressam a p62/SQSTMl ou proteína p62/SQSTMl mutada como um. sistema de ensaio funcional para os anticorpos gerados em função da proteína ou para analisar a eficácia de agentes farmacológicos, para estudar a função da proteína normal completa, porções específicas da proteína, ou de proteínas mutantes de ocorrência natural e artificial.

Utilizando as técnicas mencionadas, os vectores de expressão com a sequência de ADNc de p62/SQSTMl ou de p62/SQSTMl mutada ou as suas porções, podem ser introduzidos numa variedade de células de mamíferos a partir de outras espécies ou em células não pertencentes a mamíferos. 48 0 vector de clonagem recombinante, de acordo com a presente invenção, compreende o ADN seleccionado das sequências de ADN da presente invenção para a expressão num hospedeiro apropriado. 0 ADN está operacionalmente ligado ao vector numa sequência de controlo de expressão na molécula recombinante de ADN, de modo a que a proteína p62/SQSTMl possa ser expressada. A sequência de controlo de expressão pode ser seleccionada no grupo que consiste em sequências que controlam.a expressão de genes das células procarióticas ou eucarióticas e os seus vírus e as suas combinações. A sequência de controlo de expressão pode ser seleccionada no grupo que consiste- no sistema de lac, no sistema de trp, no sistema de tac, no sistema de trc, operador principal e regiões do promotor do fago lambda, região do controlo da proteína do revestimento de fd, promotores precoces e tardios de SV40, promotores derivados de polioma, adenovírus, retrovírus, baçulovírus, vírus de macaco, promotor, de 3-fosfoglicerato-cinase, promotores de fosfatase ácida de leveduras, factores alfa de empa-relhamento de leveduras e as suas combinações. A expressão do gene' de p62/SQSTMl em sistemas de células heterólogas pode também ser utilizada para demonstrar as relações de estrutura - função assim como para providenciar as linhas de células com a finalidade de detectar o fármaco. A sequência do ADN de p62/SQSTMl num vector de expressão de plasmido para transfectar células, é um processo útil para ensaiar a influência das proteínas nos vários parâmetros bioquímicos celulares incluindo a identificação de substratos assim como de activadores e inibidores do gene. Os vectores de expressão do plasmido contendo quer uma sequência de codificação inteira para p62/SQSTMl, ou para as suas porções, pode ser utilizada em 49 experiências de mutagénese in vitro que irão identificar porções da proteína cruciais para a função. A sequência de ADN pode ser manipulada em estudos para se compreender a expressão do gene e o seu produto. As alterações na sequência podem ou não alterar o modelo de expressão em termos de quantidades relativas, especificidade do tecido e propriedades funcionais.

Também se descrevem aqui processos para examinar a função da proteína p62/SQSTMl mutada codificada pelas moléculas de ácido nucleico da presente invenção. As células, tecidos, e os animais não humanos a que falta a expressão ou a que falta parcialmente a expressão da proteína, podem ser desenvolvidos utilizando moléculas recombinantes da presente invenção com mutações específicas de eliminação ou de inserção na molécula de ácido nucleico da presente invenção. Pode-se utilizar uma molécula recombinante para inactivar ou alterar o gene endógeno por recombinação homóloga, e criando assim uma célula, um tecido ou um animal deficientes. Essa célula mutante, tecido ou animal podem ser utilizados para . definir populações específicas de células, modelos de desenvolvimento e processos in vivo, normalmente dependentes da proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da presente invenção.

Para confirmar a importância da proteína p62/SQSTMl na doença óssea de Paget, pode-se preparar uma mutação de p62/SQSTMl de rato. A título de exemplo, pode-se utilizar uma estratégia de recombinação dirigida ao alvo para inactivar o gene endógeno de p62/SQSTMl. Um gene que introduz codões de paragem em todos os quadros de leitura e vai abolir a actividade biológica da proteína pode ser 50 inserido numa cópia genómica da proteina. 0 fragmento mutado pode ser introduzido em células tronco embriónicas e podem seleccionar-se colónias para recombinação homóloga com genes com resistência positiva (neomicina)/negativa (ganciclovir, timidina-cinase). Para estabelecer a linha inicial de transmissão, podem injectar-se dois clones que comportam o gene de delecção num alelo, em blastócitos de ratos C57BI/6· e transferem-se depois para mães adoptivas. As quimeras podem ser emparelhadas com os ratos C57BI/6 e pode-se fazer uma análise dos descendentes para detectar animais homozigóticos para a mutação (p62/SQSTMl -/-). Os efeitos da mutação na doença óssea de Paget ou noutras situações dos ossos, podem ser determinados, em comparação com os controlos não mutados e pode-se analisar a sobrevivência e o perfil histológico da doença. 0 domínio AUB (associado à ubiquitina, UBA na terminologia inglesa) está conservado em outras espécies (murganho e rato)), incluindo o resíduo P392. De acordo com isto, a presente invenção também tem por objecto a produção de um animal não humano que seja portador da mutação pontual que codifica para a proteina p62/SQSTMl mutada por P392L em que a referida mutação corresponde à proteína humana p62/SQSTMl ilustrada na SEQ ID NO: 4. Essa célula mutante, tecido ou animal pode ser utilizada como um modelo para a doença óssea, preferencialmente a doença óssea de Paget. (e) Moduladores de p62/SQSTMl

Para além dos anticorpos e dos oligonucleotídeos anti-paralelos aqui descritos, também se podem identificar outras substâncias que regulam a expressão ou a actividade p62/SQSTMl, assim como substâncias que regulam as formas mutadas de p62/SQSTMl. 51 (i) Substâncias que se ligam a p62/SQSTMl

As substâncias que afectam a actividade de p62/SQSTMl podem ser identificadas com base na sua capacidade para se ligarem a p62/SQSTMl e/ou a p62/SQSTMl mutada.

As substâncias que de podem ligar a p62/SQSTMl podem ser identificadas por meio da reacçâo de p62/SQSTMl com uma substância que se liga potencialmente a p62/SQSTMl, e avaliam-se quanto a complexos, quanto a substâncias livres ou quanto a p62/SQSTMl não complexada, ou quanto à activação de p62/SQSTMl. Em particular, pode-se utilizar um sistema de ensaio de dois híbridos de levedura para identificar proteínas que interagem com p62/SQSTMl (Fields, S. e Song, 0.,.1989, Nature, 340: 245-247). Os sistemas de análises que podem ser utilizados incluem o ensaio ELISA.

De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto um processo de identificação de substâncias que se podem ligar a uma p62/SQSTMl mutada, que compreende as etapas de: (a) a reacção de uma proteína p62/SQSTMl mutada comportando a sequência da SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento e uma substância de ensaio, em condições que permitem a formação de um complexo entre a p62/SQSTMl e a substância analisada e (b) a análise dos complexos da p62/SQSTMl mutada e da substância de ensaio, para avaliar a substância livre ou a p62/SQSTMl mutada, complexada, em que a presença de complexos indica que a substância do ensaio é capaz de se ligar a p62/SQSTMl mutada. 52

As condições que permitem a formação da substância e dos complexos de p62/SQSTMl podem ser seleccionadas tendo em conta factores tais como a natureza e as quantidades da substância e da proteína. 0 complexo de substância-proteína, a substância livre ou as proteínas não complexadas podem ser isoladas por técnicas de isolamento convencionais, for exemplo, adição de sal, cromatografia, electroforese, filtração em gel, fraccionamento, absorção, electroforese em gel de poli-acrilamida, aglutinação ou as suas combinações. Para facilitar- o ensaio dos componentes, pode-se utilizar o anticorpo contra p62/SQSTMl ou a substância ou p62/SQSTMl marcado, ou uma substância marcada. Os anticorpos, proteínas ou substâncias podem ser marcados com uma substância detectável tal como se descreveu antes. p62/SQSTMl, ou a substância utilizada no processo da presente invenção podem ser insolubilizadas. Por exemplo, p62/SQSTMl ou a substância podem ligar-se a um veículo apropriado. Exemplos de veículos apropriados são agarose, celulose, dextrano, Sefadex, Sefarose, poliestireno de celulose carboximetilada, papel de filtro, resina permuta-dora de iões, película de plástico, tubo de plástico, pérolas de vidro, copolímeros de poliamína-éter metil-vinílico - ácido maleico, copolímero . de aminoácidos, copolímero de etileno - ácido maleico, nylon, seda, etc. 0 veículo pode estar sob a forma de, for exemplo, um tubo, placa de ensaio, pérolas, disco, esfera etc. A proteína ou a substância insolubilizadas podem ser preparadas por meio da reacção do material com um veículo insolúvel apropriado utilizando processos químicos e físicos conhecidos, por exemplo, acoplamento de brometo de cianogénio. 53

As proteínas ou a substância podem também ser expressas na superfície de uma célula utilizando os processos aqui descritos. A presente invenção também contempla o ensaio para um antagonista ou um agonista da acção de p62/SQSTMl.

Deve entender-se que os agonistas e . os antagonistas que podem ser analisados utilizando os processos da presente invenção podem actuar em um ou mais dos sítios de ligação na proteína ou na substância incluindo sítios de ligação de agonistas, sítios de ligação de antagonistas competitivos, sítios de ligação de antagonistas não competitivos, ou sítios alostéricos. A presente invenção também torna possível rastrear antagonistas que inibem os efeitos de um agonista p62/SQSTMl. Assim, a presente invenção pode ser utilizada para analisar uma substância que concorre para os mesmos sítios de ligação de p62/SQSTMl. (ii) Produtos miméticos de péptidos

Também se descrevem aqui produtos miméticos de péptidos da p62/SQSTMl e proteínas de p62/SQSTMl mutadas da presente invenção. Por exemplo, um derivado de péptido de um domínio mutado de p62/SQSTMl irão interagir directamente ou indirectamente com uma molécula associada de tal maneira que simule a ligação natural da proteína mutada. 0.produto mimético do péptido pode ser derivado do domínio AUB de p62/SQSTMl., Esses péptidos podem incluir inibidores concorrentes, melhoradores, produtos miméticos de péptidos, e similares. Todos estes péptidos assim como as moléculas praticamente homólogas, complementares <?u de algum modo 54 equivalente sob o ponto de vista funcional ou estrutural, em relação a estes péptidos, podem ser utilizados para os fins da presente invenção. "Produtos miméticos de péptidos" são estruturas que servem como substitutos dos péptidos ' em interseções entre moléculas (ver Morgan et al (1989), Ann. Reports Med. Chem. 24: 243-252 para uma revisão). Produtos miméticos de péptidos incluem estruturas sintéticas que podem ou não conter ligações de aminoácidos e/ou péptidos mas retêm as caracteristicas estruturais e funcionais de um péptido ou melhorador ou inibidor da presente invenção. Os produtos miméticos de péptidos também incluem peptóides, oligopé-ptoides (Simon et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sei EIA 89: 9367); e bibliotecas de péptidos contendo péptidos com um determinado comprimento que representam todas as sequências possíveis de aminoácidos que correspondem a um péptido da presente invenção.

Os produtos miméticos de péptidos podem ser preparados, com base na informação obtida por substituição sistemática de L-aminoácidos por meio de D-amínoácidos, substituição das cadeias .laterais com grupos que têm propriedades electrónicas diferentes e por substituição sistemática de ligações peptídicas com substituições das ligações de ami-da. As restrições locais da conformação podem também ser introduzidas para determinar os requisitos de conformação para a actividade de um candidato a mimético de péptido. Os produtos miméticos podem incluir ligações isoestéricas de amída, ou D-aminoácídos para estabilizar ou promover conformações com folha inversa e para ajudar a estabilizar a molécula. Os análogos cíclicos de aminoácidos podem ser utilizados para obrigar os resíduos de aminoácidos estados conformacionais particulares. Os produtos miméticos podem 55 também incluir simulações de estruturas secundárias dos péptidos inibidores. Estas estruturas podem modelar a orientação tri-dimensional dos resíduos de aminoácidos nas conformações secundárias conhecidas das proteínas. Também se podem utilizar, peptóides que são oligómeros de aminoácidos substituídos em N e podem ser utilizados como elementos para o geração de bibliotecas quimicamente diversificadas de novas moléculas.

Os péptidos da presente invenção podem também ser utilizados para identificar compostos de chumbo para o desenvolvimento de fármacos. A estrutura dos péptidos aqui descritos pode ser facilmente determinada por meio de um certo número de processos tais como RMN e cristalografia por raios X.-Uma comparação das estruturas de péptidos semelhantes na sequência, mas que diferem nas actividades biológicas que provocam nas. moléculas-alvo podem dar informação acerca da relação estrutura-actividade do alvo. A informação obtida pelo exame das relações estrutura-actividade podem ser utilizadas, para preparar quer péptidos modificados, quer outras moléculas pequenas ou' compostos de chumbo que podem ser ensaiados para prever propriedades conforme relatado em relação à molécula-alvo. A actividade dos compostos de chumbo pode ser avaliada utilizando ensaios semelhantes aos descritos aqui. A informação acerca das relações estrutura-actividade pode também ser obtida a partir de estudos de co-cristalização. Nestes estudos, um péptido com uma actividade desejada cristaliza em associação com uma molécula-alvo e determina-se a estrutura do complexo por raios X. Pode-se então comparar a estrutura com a estrutura da molécula alvo no seu estado original e pode-se utilizar a 56 informação dessa comparação para preparar compostos que se espera que a possuam. (iii) Processos para rastrear fármacos

De acordo com um enquadramento, a presente invenção tem por objecto um processo para rastrear compostos candidatos quanto â sua . capacidade para aumentar ou diminuir a actividade da proteina dê p62/SQSTMl mutada. O processo compreende providenciar um sistema de análise para analisar a actividade de p62/SQSTMl, analisar a actividade na presença ou na ausência- do composto candidato õu composto de ensaio e a determinação se o composto aumentou ou diminuiu a actividade de p62/SQSTMl. Esses compostos podem ser úteis no tratamento da doença óssea de Paget.

De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto um processo para identificar um composto que afecta a actividade ou a expressão de p62/SQSTMl mutada, que compreende: (a) a incubação de um composto de ensaio com uma proteina mutada p62/SQSTMl com a sequência que se mostra na SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento ou um ácido nucleico que tem a sequência.ilustrada na SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento; e (b) a determinação de uma quantidade da actividade ou expressão da proteina p62/SQSTMl mutada com um controlo (isto é, na ausência da substância de ensaio), em que uma alteração na actividade ou expressão da proteina p62/SQSTMl mutada comparada com um controlo indica que o composto do ensaio tem um efeito na actividade ou na expressão da proteina p62/SQSTMl mutada. 57

De acordo com outro enquadramento, a presente invenção tem por objecto um processo para rastrear compostos candidatos quanto à sua capacidade para aumentar ou diminuir a expressão de uma proteína p62/SQSTMl. 0 processo compreende juntar uma célula com um composto candidato, em que a célula inclui uma região reguladora de um gene de p62/SQSTMl ligado operacionalmente a uma região que codifica um gene relator e a detecção de uma alteração na expressão do gene relator.

Num enquadramento, a presente invenção tem por objecto sistemas de cultura em linhas de células que expressam o gene de p62/SQSTMl mutada e que são incubadas com compostos candidatos para ensaiai os seus efeitos na expressão de p62/SQSTMl mutada. Esses sistemas de cultura podem ser identificados compostos que aumentam ou diminuem a regulação da expressão de p62/SQSTMl ou a sua função, através da interacção com outras proteínas.

Esses compostos podem ser seleccionados a partir dos compostos de proteína, produtos químicos e vários fármacos que se adicionam ao meio de cultura. Depois de um período de incubação na presença de um composto de ensaio seleccionado, pode-se examinar a expressão de p62/SQSTMl mutada por meio da quantificação dos níveis de ARNm de p62/SQSTMl utilizando o processo normalizado de transferência de ADN/ARNm de Northern, tal como descrito nos exemplos aqui incluídos, para determinar quaisquer alterações na expressão como um resultado do composto do ensaio. As linhas de células transfectadas com estruturas que expressam p62/SQSTMl podem também ser utilizadas para analisar a função de compostos desenvolvidos para modificar a expressão das proteínas. (f) Utilizações terapêuticas 58

Tal como discutido previamente, a p62/SQSTMl da presente invenção está provavelmente'envolvida na doença óssea de Paget e outras doenças ósseas relacionadas incluindo a osteoporose. De acordo com isto, descreve-se aqui um processo de tratamento de uma doença dos ossos que compreende a administração a uma célula ou a um animal que disso necessite, de uma quantidade efectiva de um agente que modula a expressão e/ou a actividade de p62/SQSTMl. A presente invenção tem por objecto a utilização de um agente que regula a expressão e/ou a actividade de p62/SQSTMl para o fabrico de um medicamento para tratar uma doença dos ossos. A expressão "agente que regula a expressão e/ou a actividade de p62/SQSTMl" significa qualquer substância que pode alterar a expressão e/ou a actividade de p62/SQSTMl mutada encontrada no paciente para ser consistente com p62/SQSTMl de tipo natural. Exemplos de agentes que podem ser utilizados, para fazer essa administração incluem: uma molécula de ácido nucleico que codifica uma ' proteína p62/SQSTMl do tipo natural assim como os seus fragmentos, análogos, os seus derivados ou os seus homólogos; anticorpos; ácidos nucleicos anti-paralelos; produtos miméticos de péptidos; e substâncias isoladas utilizando os processos de rastreio aqui descritos que podem corrigir a mutação para resultar em níveis de p62/SQSTMl e/ou uma função consistente com uma pessoa sem a doença. A expressão "quantidade efectiva", tal como se utiliza aqui, significa uma quantidade efectiva, em doses e durante períodos de tempo necessários para se conseguir os resultados desejados. 59 0 termo "animal" tal como se utiliza aqui inclui todos os elementos do reino animal, incluindo os seres humanos.

Também se discute aqui um processo para o tratamento da doença óssea de Paget por meio da administração a uma célula ou a um animal de uma quantidade efectiva de um agente que regula a expressão ou a actividade biológica da proteína p62/SQSTMl mutada. Num enquadramento da presente invenção providencia-se a utilização de uma quantidade efectiva de um agente que regula a expressão ou a actividade biológica da proteína p62/SQSTMl mutada para a produção de um medicamento para tratar a doença óssea de Paget. As substâncias que inibem a actividade de p62/SQSTMl mutada incluindo produtos que mimetizam péptidos, antagonistas de p62/SQSTMl e alguns anticorpos de p62/SQSTM1. As substâncias que inibem a expressão do gene de p62/SQSTMl mutada incluem oligonucleotídeos anti-paralelos com uma sequência de ácido nucleico de p62/SQSTMÍ mutada.

Todas,as doenças dos ossos ocorrem em consequência dos efeitos do processo de doença em eventos celulares no ciclo normal de remodelação dos ossos. Q esqueleto de um adulto está num estado dinâmico, estando continuamente a ser diminuído e remodelado por’ meio de acções coordenadas dos osteoclastos e dos osteoblastos nas superfícies, trabecula-res e em sistemas haversianos (descobertos por Clopton Havers) (osso cortical} . Os conceitos correntes da remodelação ou da modificação dos ossos têm por base as observações morfológicas de Frost e colegas (Hattner R. , Etker B. N., Frost Η. M. Suggested sequential mode of control of changes in cell behaviour in adult bone remodeling. Nature 1965; 206 (983): 489-490.), que observaram que a formação dos ossos em adultos humanos ocorria quase exclusivamente em sítios que tinham sofrido 60 recentemente reabsorção osteoclástica. Esta modificação ou remodelação dos ossos ocorre em zonas focais e discretas ao longo do esqueleto. Reconhece-se agora que a remodelação de cada zona dura um período de tempo finito (estimado como sendo de cerca de 3-4 meses) . A remodelação que ocorre em cada zona (designada por Frost por unidade de remodelação do osso) está geograficamente e cronologicamente separada de outras zonas de remodelação. Isto sugere que a activação da frequência (também chamada frequência de activação) de eventos celulares responsáveis pela remodelação está controlada localmente, possivelmente, por meio de um mecanismo de autbregulação, talvez por factores auto-crínicos ou paracrínicos gerados no micro-ambiente do ossso. A sequência é sempre a mesma - . reabsorção osteoclática do osso (10 dias) seguida da formação osteoblástica dos ossos (3 meses) para reparar o defeito. O novo osso que se forma é designado por unidade estrutural do osso (UEO) (Frost Η. M. Dynamics of te bone remodelling. In: Bone Biódynamics. Boston: Little & Brown, 1964: 315.).. A activação dos osteoclastos é a etapa inicial na sequência de remodelação. Os osteoclastos são activados em sitios focais específicos por meio de mecanismos que ainda não são compreendidos. Este período é seguido pela reparação do defeito de re-absorção por meio de um conjunto de osteoblastos, que são atraídos para o sítio do defeito de re-absorção e depois continua a produção do novo osso. A sequência completa dos eventos celulares que ocorrem na superfície dos ossos durante o processo de remodelação j+a foi descrita em detalhe por Baron et al (Baron R, Vignery A., Horowitz M. Lymphocytes, macrophages and the regulation of bone remodeling. Em: Bone and Mineral Research, Peck WA ed. Amsterdam, Elsevier, 1984: 175-243.) a partir de estudos sobre o osso alveolar de osso de rato, e por Boyce 61 et al (Boyce B. F., Yates AJP, Mundy G. R. Bolus injectíons of recombinant human interleukin-1 cause transient hypocalcemia in normal mice. Endocrinology 1989; 125:2780-3.) a partir de estudos do osso do calvário de rato. Os eventos celulares que ocorrem nestes modelos são similares aos dos ossos de adultos humanos. Em condições normais, a reabsorção dos ossos e a formação do osso estão acopladas e em equilíbrio. É útil estabelecer uma distinção entre o equilíbrio do esqueleto e o acoplamento da formação dos ossos e da reabsorção dos ossos. 0 desacoplamento implica a dissociação destes dois processos; quer a criação das cavidades de reabsorção sem a subsequente atracção de osteoblastos, como se vê algumas vezes em neoplasia tal como no mieloma múltiplo, ou inversamente, a deposição de osso novo em sítios diferentes dos sítios da reabsorção anterior. Esta última ocorre conspicuamente em vários tumores tal como em doenças ósseas metastásicas devidas ao carcinoma da mama ou da próstata. A extensão a que ocorre o não acoplamento da reabsorção ou da formação em adultos saudáveis não é conhecida, mas é provável que seja uma componente muito pequena da modificação (Jaworski ZFG, Meunier PJ e Frost HM. Observations on two types of resorptíon cavities in human lamellar cortical bone. Glin Ortop 1972; 83: 279-285.), talvez e principalmente na reparação de micro-fracturas.

No caso da doença óssea de Paget, há poucas evidências de uma formação não acoplada dos ossos mesmo na presença de osteoesclerose densa. Quando os novos ossos formados estão torcidos, como na doença óssea de Paget, pode aparecer osteosclerose trabecular sem, necessariamente, um aumento na quantidade de colagénio (ou de cálcio) devido ao colagénio armazenado em perda (osso torcido em vez de osso lamelar normal bem organizado). Quando o equilíbrio entre a 62 formação do osso e a reabsorção está perturbado, cada sequência de remodelação resulta num ganho finito (ou equilíbrio positivo, como na doença óssea de Paget, e no hiperparatiroidismo primário e secundário} ou na perda óssea (equilíbrio negativo, como na osteoporose post-menopausa, osteoporose masculina, osteoporosis induzida por glicocorticoides, e algodistrofia). A taxa de ganho ou de perda será ampliada na proporção da frequência de activação de novas unidades de remodelação. A frequência de activação está dramaticamente aumentada mas apenas nos ossos afectados com a doença óssea de Paget enquanto parece normal nos sítios de ossos não,afectados. Noutras doenças ósseas a frequência de activação está aumentada em relação a todo o esqueleto. Uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no aumento focal na frequência de activação e o equilíbrio positivo na doença óssea de Paget levando por isso à verificação de terapias inovadoras dirigidas a modulações dos processos de remodelação dos ossos noutras doenças ósseas metabólicas associadas a um aumento universal da frequência de activação em relação a todo o esqueleto: hiperparatiroidismo primário e secundário, osteoporose post-menopausa, osteoporose induzida por glicocorticoides, e algodistrofia. Dado que p62/SQSTMl está ligada à doença óssea de Paget, será um alvo potencial para intervenções terapêuticas noutras doenças metabólicas dos ossos.

Por isso, os requerentes reivindicam que as mutações no gene de p62/SQSTMl podem também ser associadas com outros distúrbios dos ossos, incluindo osteoporose. De acordo com isto, os processos terapêuticos aqui descritos podem ser utilizados para tratar qualquer doença óssea (incluindo a doença óssea de Paget e a osteoporose). 63

Também se descreve aqui o facto de que a presente invenção permite a terapia de genes como uma abordagem terapêutica potencial para as doenças dos ossos, em que as cópias dos genes normais de p62/SQSTMl são introduzidas em pacientes para codificar com sucesso para a proteina p62/SQSTMl normal em vários tipos de células diferentes afectadas.

Podem utilizar-se vectores retrovirais para a terapia de genes das células somáticas especialmente por causa da sua elevada eficiência de infecção e integração e expressão estáveis. Contudo, as células-alvo devem ser capazes de se dividir e expressar os níveis de proteína normal devem ser elevados. 0 gene normal de p62/SQSTMl de comprimento complete' pode ser clonado num vector retroviral e transferido do seu promotor endógeno ou da repetição retroviral de terminal longo ou de um promotor específico para o tipo de célula-alvo que interessa (tal como as células linfóides). Outros vectores virais que podem ser utilizados incluem vírus adeno-associados, vírus vacínia, vírus do papiloma bovino ou um vírus de herpes tal como vírus de Epstein-Barr·. A transferência de genes pode ser conseguida utilizando meios não virais que requerem a infecção in vitro. Isto inclui fosfato de cálcio, DEAE dextrano,· electroporaçâo, formulações catiónicas ou anióni-cas de lípidos (liposomas) e fusão de protoplastos. Embora estes processos estejam disponíveis, muitos deles são pouco eficientes.

As estratégias à base de anti-paralelos podem ser utilizadas para inibir a função do gene de p62/SQSTMl mutada e são a base para a produção do fármaco terapêutico. 0 princípio baseia-se na hipótese de que a supressão do gene específica da sequência da expressão do gene pode ser 64 conseguida por hibridação intracelular entre o ARNm e espécies complementares anti-paralelas. É possível sintetizar nucleótidos, com estrutura helicoidal anti-paralela, que ligam a estrutura helicoidal paralela de ARN ou de ADN com um elevado grau de especificidade. A formação de um duplex híbrido de ARN interfere com o processamen-to/transporte/tradução e/ou estabilidade de um ARNm-alvo. A hibridação é necessária para que ocorra um efeito anti-paralelo. Os efeitos anti-paralelos já foram descritos numa variedade de abordagens incluindo a utilização de oligonucleotídeos anti-paralelos, injecção de ARN anti-paralelo, ADN e transfecção de vectores de expressão de ARN anti-paralelos.

Os nucleótidos terapêuticos anti-paralelos podem ser preparados comooligonucleotídeos ou nucleótidos expressos. Os oligonucleotídeos são estruturas helicoidais simples e curtas de AND que normalmente têm 15 a 20 bases de ácidos nucleicos de comprimento. Os nucleótidos expressos sã'o produzidos por meio de um vector de expressão tal como um vector adenoviral, retroviral ou de plasmido. O vector é administrado às células em cultura, ou a um paciente, cujas células produzem então o nucleótido anti-paralelo. Os vectores de expressão podem ser preparados para produzir ARN anti-paralelo, que podem variar no seu comprimento desde algumas dúzias de bases até várias centenas.

Os efeitos anti-paralelos podem ser induzidos por se-· quências de controlo (paralelas). A extensão das alterações fenotípicas é altamente variável. Os efeitos fenotípicos induzidos pelos anti-paralelos baseiam-se nas alterações em critérios tais como pontos extremos biológicos, níveis de 65 proteína, medição da activação da proteína e níveis do ARNm-alvo. (g) Composições farmacêuticas

As substâncias descritas antes incluindo os ácidos nucleicos que codificam p62/SQSTMl e p62/SQSTMI mutada, proteínas de p62/SQSTMl e. proteínas de p62/SQSTMI mutadas, anticorpos, e oligonucleotídeos anti-paralelos assim com outros agentes que regulam p62/SQSTMl e/ou p62/SQSTMl mutada podem ser formuladas em composições farmacêuticas para administração a indivíduos, numa forma compatível apropriada para administração ín vivo. Por "forma compatível sob o ponto de vista biológico, apropriada para administração in vivo " entende-se uma forma da substância a ser administrada em que os efeitos tóxicos são excedidos pelos efeitos terapêuticos. As substâncias podem ser administradas a organismos vivos incluindo seres humanos e animais. A administração de uma quantidade activa sob o ponto de vista terapêutico da presente invenção é definida como uma quantidade efectiva, em doses e durante períodos de tempo necessários para se conseguir o resultado desejado. Por exemplo, uma quantidade activa sob o ponto de vista terapêutico de uma substância pode variar de acordo com factores tais como o estado de doença, a idade, o sexo, e o peso do indivíduo e a capacidade da substância para provocar uma resposta desejada no indivíduo. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para providenciar a. resposta terapêutica óptima. For exemplo, pode-se administrar várias doses divididas ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida tal como indicado pelas exigências da situação terapêutica. 66

Pode-se administrar uma substância activa de uma forma conveniente tal como por injecção (subcutânea, intravenosa, etc.), administração oral, inalação, aplicação transdérmica ou administração rectal. Consoante a via de administração, a substância activa pode ser revestida com um material para proteger o composto da acção de enzimas, ácidos e outras condições naturais que podem inactivar o composto. Se a substância activa é um ácido nucleico que codifica, for exemplo, uma p62/SQSTMl modificada, pode ser libertada utilizando técnicas conhecidas neste domínio.

As composições aqui descritas podem ser preparadas per se por meio de processos conhecidos para a preparação de composições farmacêuticas aceitáveis que podem ser administradas a indivíduos, tal como uma quantidade efectiva da substância activa que se combina numa mistura com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Veículos apropriados estão descritos, for exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., EUA 1985) ou Handbook of Pharmaceutical Additives (compilado por Michael e Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, Inglaterra (1995)).

Com base nisto, as composições incluem, embora não exclusi-vamente, soluções das substâncias em associação com um ou mais veículos ou diluentes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, e podem estar contidos em soluções tamponadas com um pH apropriado e/ou ser iso-osmóticos com fluidos fisiológicos. A este respeito, pode-se fazer referência à patente de invenção norte-americana U.S. No. 5.843.456. Tal como será entendido pelos especialistas na matéria, a administração das substâncias descrita aqui pode ser feita por meio de um veículo virai inactivo. 67 (h) Kits

Os reagentes apropriados para a realização dos processos da presente invenção podem ser embalados em kits convenientes que fornecem os materiais necessários, embalados em embalagens apropriadas. Esses kits podem incluir todos os reagentes necessários para detectar uma molécula de ácido nucleico ou uma proteína da presente invenção numa amostra por meio dos processos aqui descritos e, eventualmente, suportes apropriados úteis para a realização dos processos da presente invenção. Os kits podem ser úteis na detecção da doença óssea de Paget ou de outras doenças dos ossos.

Descreve-se um kit que inclui iniciadores que são Capazes de ampliar a molécula de ácido nucleico da presente invenção ou um seu fragmento de oligonucleotídeo pré-determinado, todos os reagentes necessários para produzir a molécula de ácido nucleico ampliada ou um seu fragmento pré-determinado na reacção em cadeia de polimerase e tem significado para analisar as sequências ampliadas.

Num kit os iniciadores podem ampliar um ácido nucleico que codifica uma proteína p62/SQSTMl mutada, preferencialmente a proteína da SEQ. ID. NO.: 4. Nesse, caso, o iniciador vai ampliar a região que circunda o nucleico 1215. na sequência ilustrada na SEQ ID. NO.: 3. 0 kit pode também incluir enzimas de restrição para digerir os produtos da RCP. Um outro kit contém uma sonda de nucleótido que híbrida com uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, reagentes necessários para a hibridação da sonda de nucleótido com a molécula de ácido nucleico e as indicações para a sua utilização. Um outro kit inclui anticorpos da presente invenção e os reagentes 68 necessários para a ligação do anticorpo a uma proteína p62/SQSTMl mutada da presente invenção numa amostra.

Os processos e kíts podem ser utilizados para detector a doença óssea de Paget. As amostras que podem ser analisadas incluem materiais do corpo tal como sangue, urina, soro, lágrimas, saliva, fezes, tecidos, células e similares. Para além das amostras humanas, as amostras podem ser recolhidas de mamíferos tal como primatas não humanos, etc.

Antes de analisar uma amostra de acordo com os processos aqui descritos, a amostra pode ser concentrada utilizando técnicas conhecidas neste domínio, tal como centrifugação e filtração. Para os processos de hibridação e/ou processos à base de RCP aqui descritos, os ácidos nucleicos podem ser extraídos de extractos de células da amostra de ensaio utilizando técnicas conhecidas neste domínio. A descrição anterior descreve, de uma forma geral, a presente invenção. Pode-se ter . uma compreensão mais alargada por meio das referências e exemplos específicos que se seguem. Estes exemplos são descritos apenas a título de ilustração e não pretendem limitar o âmbito da presente invenção. Alterações na forma e substituição de equivalentes estão contempladas como circunstâncias que podem sugerir ou tornar eficiente. Embora se tenham utilizado aqui termos específicos, esses termos são entendidos num sentido descritivo e não com fins limitativos.

Os exemplos não limitativos que se seguem são ilustrativos da presente invenção: 69

EXEMPLOS

Exemplo 1

Os requerentes identificaram a proteina p62/seques-tosoma I (p62/SQSTMl) mutada, atípica, que interage com a proteina-cinase C, como sendo o gene que causa a doença óssea de Paget.

Estratégia geral

Uma região na banda do cromossoma 5q35, com o telómero do genoma humano que contém o lócus genético PDB3, que causa a doença óssea de Paget, tem estado confinada num intervalo de 6 cM. Este. lócus PDB3 que contém o gene de p62/SQSTMl foi identificado utilizando uma variedade de técnicas genéticas, incluindo o mapeamento genético, tal como se definiu antes. Gora base nos estudos de grandes famílias alargadas ("parentes ou linhagem") com múltiplos casos de doença óssea de Paget assim como aproximadamente 100 pacientes esporádicos afectados pelo distúrbio, refinou-se a região cromossómica contendo o gene da doença com aproximadamente 2 milhões de nucleótidos no cromossoma 5q35. A região que contém p62/SQSTMl estava fisicamente ligada por CA5-5 e CA5-26. (Os requerentes desenvolveram os seus próprios marcadores de dinucleótido partindo de sequências publicamente disponíveis).

Recursos de população

Para identificar a base molecular da doença óssea de Paget, os requerentes realizaram estudos de ligações genéticas e de haplotipos em famílias Franco-Canadianas. Os parentes com origem nesta população estão particularmente bem ajustados para estes estudos (Morissette et al. 1995; 70

Morissette et al. 1998). Na verdade, por razões sociais e linguísticas, esta população manteve, durante os últimos três séculos, um crescimento demográfico sem imigração e até à pouco tempo, uma elevada taxa de natalidade com grandes laços familiares, contendo 10 a 15 parentes por geração (Bouchard e Braekeleer 1991). A reconstrução da árvore genealógica foi também facilitada pela conservação dos registos genealógicos, incluindo certidões . de nascimentos, casamentos e óbitos que recuam até aos primeiros imigrantes. Para contrariar a heterogeneidade genética da doença óssea de Paget, os requerentes exploraram estes atributos e fizeram um rastreio sistemático das grandes famílias Franco-Canadianas afectadas por este. distúrbio.

Os requerentes recrutaram 24 famílias Franço-Canadia-nas com pelo menos dois parentes do primeiro grau afecta-dos, num total de 554 indivíduos, incluindo 56 esposas. Estes parentescos eram de diferentes graus e complexidades. Oito deles eram constituídos por entre 30 e 71 indivíduos e 14 eram. portadores da doença óssea de Paget ao longo de duas gerações. Doze pessoas da linhagem vinham . da mesma área geográfica.

Destes 554 indivíduos, diagnosticou-se, em 105, a doença óssea de Paget. A idade na altura do diagnóstico variava entre 29 e 89 anos, com uma média, de idades de 58 anos. Na maioria destes pacientes foram diagnosticados aos 60 anos de idade ou mais velhos (63/105; 60 %) enquanto apenas um pequeno número teve um diagnóstico antes dos 40 anos de idade (3/105; 2,9 %) . A doença óssea de Paget foi segregada como um traço autossómico dominante com uma penetração incompleta dependente da idade dentro das linhagens. 71

Para identificar p62/SQSTMl como o gene mutado que causa a doença óssea de Paget, os requerentes também estudaram 112 pacientes afectados pelo distúrbio. Estes pacientes foram recrutados como casos esporádicos.

Mapeamento genético e confinamento da doença óssea de Paget no lócus PDB3 no cromossoma 5q35-qter

Os marcadores genéticos úteis na pesquisa de um lócus genético associado com uma doença podem ser seleccionados numa base ad hoc cobrindo densamente um cromossoma especifico, ou uma análise detalhada de uma região específica de um cromossoma. Os requerentes realizaram análises de ligação genética em 24 parentes Franco-Canadianos em que o distúrbio foi segregado com um traço autossómico dominante. Mapearam-se dois novos loci para a doença óssea de Paget no cromossoma 5q35-qter e no cromossoma 5q31. Estes dois loci foram designados por PDB3 e PDB4, respectivamente.

Uma vez estabelecida, a ligação, é necessário identificar os marcadores que flanqueiam o lócus da doença, isto é, um ou mais marcadores proximais para o lócus da doença e um ou mais marcadores distais para o lócus da doença. Definiu-se o lócus de PDB3 por meio do marcador AFM 137xf6 no lócus D5S469 e o telómero. Para refinar mais o intervalo genético, prepararam-se 11 marcadores polimórficos de dinucleó-tido dentro do intervalo genético. Estes marcadores foram desenhados pesquisando em silício um esboço do Projecto do Genoma Humano, disponível electronicamente em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ para as repetições de dinucle-ótidos. As sínteses dos iniciadores apropriados à volta destas repetições foram realizadas para ampliar os dinucleótidos. Os iniciadores utilizados para fazer o 72 genótipo dos marcadores polimórficos de dinucleótidos preparados para confinar o intervalo de PDB3 estão indicados no quadro 1 (SEQ. ID. NOS.: 5-20). Fez-se o genótipo de 112 pacientes esporádicos para encontrar pacientes que eram portadores dos mesmos alelos que os identificados nas famílias ligadas ao lócus PDB3 (haplotipos: PDB3H1 e PDB3H2). Estes alelos dos marcadores testados definiram uma assinatura genética que foi utilizada para refinar mais o intervalo genético de PDB3 dentro dos marcadores CA5-5 e CA5-26.

Construção de um mapa físico integrado do lócus PAB3

Dado um . intervalo definido geneticamente pelos recombinantes, genético e meiótico, é preciso gerar um contigo de clones genómicos que extravase o intervalo. Os recursos disponíveis publicamente, tal como o National Center for Bioinforraatics, e o Laurence Livermore

Laboratory (mapa do cromossoma 5 de Março de 2001), fornecem mapas de cromossomas alinhados de marcadores genéticos, sítios de sequências marcadas (SSMs), dados, híbridos de mapas de radiação, clones CEPH.de cromossomas artificiais de leveduras (CALs), cromossomas artificiais de (CABs) e cromossomas artificiais de PI (CAPs). Os requerentes utilizaram alguns destes recursos que estão todos disponíveis electronicamente, para construir em sílica um contigo de CAB cobrindo o lócus PDB3. Qs pares de iniciadores de oligonucleotídeos para os marcadores localizados no intervalo foram sintetizados para validar alguns dos CABs que extravasam o intervalo geneticamente definido.

Sequenciação genómica de genes candidatos para a doença óssea de Paget dentro do intervalo mínimo 73

I

Utilizaram-se recursos do Human Gonome Project para identificar genes em silica localizados dentro do intervalo. Estes genes representam candidatos potenciais para causar a doença óssea de Paget. Estes genes foram mapeados em silica no contigo de CAB na via de ladrilhos. Alguns marcadores da sequência expressa (MSEs), foram também mapeados em silica no contigo de CAB. Vários genes destes genes candidatos foram sequenciados mas não se encontraram mutações neles.

Rastreio de mutações do gene p62/SQSTMl e identificação de uma mutação que causa a doença óssea de Paget

Entre os muitos genes que foram rastreados quanto à mutação, um . destes genes foi o p62/sequestosoma 1 (p62/SQSTMl) da proteína atípica que interage com a proteina-cinase C. 0 quadro 2 mostra a sequência dos iniciadores utilizada para sequenciar o gene p62/SQSTMl (SEQ. ID. NOS.: 21-36). Uma variação do nucleótido na posição 1215 do nucleótido do gene p62/SQSTMl, alterando o aminoácido Pro para Leu na posição 392 do aminoácido (Pro392Leu),. foi detectada em 11 parentes da família de recurso. Verificou-se que esta variação estava associada ao distúrbio nestas famílias. A sequenciação de 112 casos esporádicos revelou que 18 pacientes também eram portadores desta variação. A sequenciação de 86 esposas não afectadas e 205 indivíduos da população geral não revelaram qualquer alteração na sequência de p62/SQSTMl de tipo selvagem. Estes dados demonstram assim que as variações C a T na posição 1215 do gene p62/SQSTMl são, de facto, uma mutação que causa a doença óssea de Paget.

Não se encontraram mais mutações que causassem a doença. Contudo, identificaram-se cinco SNPs: 380C-VT 74 (A117V) , no exão 3; 862G -* C (Q274E), no exão 6; 916C -» T (D292D) , no exão 6; 976G -» A (R312R), no exão 6; e 994C -> A (S318S) , no exão 6. As frequências destas cinco SNPs eram semelhantes entre os indivíduos afectados e não afectados. Nenhuma destas SNPs tinha alelos associados com a mutação. Contudo, duas destas SNPs,· 916C -* T e 97 6G -> A exibiram alelos distintos co-segregando com os haplotipos da doença. Por exemplo, p haplotipo PDB3H1 exibiu um T e um A nas posições 916 e 976, respectivamente, enquanto a assinatura de PDB3H2 exibiu um C e um G nestas duas posições. QUADRO 1

Iniciadoras Para a fraxita Ganètipo CA5-3 ggaçcagçattcâçfgâaçrgt [SEQ.ID.NO. :5) GA5-5 gtgtcatcattcccaggctt [SEQ.ID.NO.:1) CA5-6 ctatctagcctgggcgacag {SEQ.ID.NO.i9) CA5-7 aaggctcctccattccttgt [SEQ.ID.NO..:11) CA5-9 gcctcaatggacataaacca [SEQ.ID.NO.:13) CA5-11 actcacacacccaggcctac (SEQ.ID.NO.:15) CA5-25 gggggtgtagagaggaaacc (SEQ.ID.NO.:17) CA5-27 acgaccacgaaagtgacaca (SEQ.ID.NO.:19)

Inversa taccaagttctttcctgccc (SEQ.ID.NO.:6) agcattggcttagetcagga (SEQ.ID.NO.:8) ttcctgtgatcttaacaccttcc (SEQ.ID.NO.:10] ccaccttccccgtctttaat (SEQ.ID.NO.:12) ggtgtcctatttcttcctgtatcaa (SEQ.ID.NO.:14) caccatcagccagagactgt (SEQ.ID.NO.:16) aattggaatgccactcccta (SEQ.ID.NO.:18} cgcccggctaaaastacat (SEQ.ID.NO.:20)

Anti-paralelo

Iniciadores QUADRO 2 Paralelo

Sequenciação p02/SQSTM1-1 ' p62/SQSTM1-2 p63/SQSTM1-3 p62/SQSTM1-4 PS2/SQSTM1-5 P62/SQSTMI-6 P62/SQSTMI-7 PG2/SOSTM1-8 ggcecattttccgccagc (SEQ.id.NO.:21) agggggtagtcttgccícte (SEaiD.NO.S3) agfttcctggfggacccatt (SEQ.ID.NO.:2S) ctgaattcttgccttgcaca (SEQID.NO.:27) ccogtggíooagcaclaota (SEQ.ID.I\10.:29) cttagctgcítgtggggact (SEQ.ID.N0.:31) agaccccigcagccttaact (SEQ.ID.NO.:33) caoigtggcotgtgaggac (SEQ.I D.NO.:35) cttgglcaccaciceagtca (SEaiD.NO.:22) acagcocteaaattgctgac (SEQ.ID.NO.:24) gtgacagccccacagtgac (SEQ.ID.N0.:26) gcacctgtctgaggtgagc (SEQ.ID.NO.:28) agagtgggaggaaggagagg (SEQ.ID.NO.:30) ctecctcgggttigíaagtg (SEQ.1D.N0.:32) ccaactcctaacctcccaca (SEQ.)D.NO.:34) cagtgagccttgggtotcg (SEQ.lD.NO.:36)

CITAÇÕES COMPLETAS DAS REFERÊNCIAS ASSINALADAS NA MEMÓRIA DESCRITIVA

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<211> 2870 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1 ggcctgggtg gcgaattcgg ggcctacctt ctgggcaagg cagccccgag cctgaggcgg gctgagccgg gtggccgccc ccgcgatgag gacggggact gtcctacgtg aaggatgaca ggacoaccgc ocaccgtgtg ctgcgatggc tgcaatgggc ctacgacttg tgtagcgtct attccccagc cccttcgggc ggtgaaacac ggacacttcg cccacgtcct cctcgtgcag tccatcggag gatccgagtg ccttagccct ctgggcattg cacgaggctc gccgctcgct aggacgcggc gcgcgagatt aagccgaggc tgcggcgggt tgttccccgc gctgcggcct tggttgcctt tttcagtgac tcttccgaat ctacattaaa ctcaggaggc gccccgcaac ctgtggtagg aacccgctac gcgagggaaa gggcttgcac acctgtctga gggcttctcg ggtggccagg atgggaaatg gggaggcçcg ccctggcccc tgaatttcct gaagaacgtt aagttgatat cgatgtggag atggcgtcgc tcaccgtgaa 50 cgccgcttca gcttctgctg 120 ccgggaccct gcgagcggct 180 ggcggcttcc aggcgcacta 240 gaggaattga caatggccat 300 gagaaaaaag agtgccggcg 360 atggtgcacc ccaatgtgat 420 aagtgcagcg tctgcccaga 480 cgggggcaca ccaagctcgc 540 cacagccgct ggctccggaa 600 ggtccaccag gaaactggag 660 acggcagaat cagcttctgg 720 ggggagagtg tggcagctgc 780 cacggaggga aaagaagccg 840 80 cctgaccccc gfcctctccag agagbtccag cacagaggag aagsgcagct cacagccaag 900 cagctgctgc tctgabecca gcaagccggg tgggaabgbb gagggcgcca cgcagtctct 960 ggcggagcag atgagaaaga tcgcctbgga gtccgagggg cgcgctgagg aacagatgga 1020 gtcggataac tgttcaggag gagatgatga ctggacccat ctgtcttcaa aagaagtgga 1030 cccgtctaca ggbgaacbcc agfcccctaca gatgccagaa tccgaagggc caagctctcb 1140 ggaeccctcc caggagggae ccacagggcfc gaaggaagcb gccttgtacc cacatctccc 1200 gccagaggct gacccgcggc tgattgagtc cctctcccag atgcbgtcca tgggcttctc 1260 tgatgaaggc ggctggctca ccaggctccb gcagaccaag aacbabgaca tcggagcggc 1320 tctggacaçc atccagtatt caaagcatcc cccgccgttg tgacc&cttt bgcccacctc 1380 bbctgcgbgc cccfcctbcfcg tctcabagtt gtgfcfcaagct tgcgtagaab bgcaggbcbc 1440 bgbacaggcc aghtbcbctg ccttctfccca ggatcagggg btagggtgca agaagccabb 1500 tagggcagca aaacaagtga cabgaaggga gggfcccctgt gtgtgbgtgt gtgctgatgt 1560 . btcctgggbg ccctggctcc ttgcagcagg gctgggcctg cgagacccaa ggctcactgc 1620 agcgcgcbcc tgacccctcc ctgcaggggc tacgttagca gcccagcaca bagcttgcci: 1680 aatggcbbbc acbttctcbb ttgttttaaa tgactcatag gtecctgaca tbfeaghbgat 1740 battttctgc fcacagacctg gtacacfccbg abtbbagaba aagtaagcct aggtgfctgtc 1800 agcaggcagg ctggggaggc eagtgttgbg ggctbccbge tgggactgag aaggctcacg 1860 aagggaatcc gcaatgttgg ttbcactgag agcfcgccbee fcggtcbcttc accacfcgtag 1920 ttctctcabb tccaaaccat cagctgcbtt taaaataaga tctctfctgta gccatcctgb 1980 taaatttgta aacaatctaa ttaaabggca tcagcactfct aaccaatgac gtttgcabag 2040 agagaaatga ttgacagtaa gbttattgtt aatggttctt acagagtatc fcttaaaagtg 2100 cefctagggga accctgbccc tcotaacaag bgtatctcga bbaataacct gccagbccca 2160 gatcacacat catcatcgaa gtcbtcccca gttabaaaga ggtcacatag fccgtgtgggt 2220 cgaggafctct gtgcctccag gaccaggggc ccacccbctg cccagggagt ccttgcgtcc 2280 catgaggtct fccccgcaagg cctcbcagac ccagabgbga cggggfcgtgt ggcccgagga 2340 agcbggacag cggcagtggg cctgctgagg ccttcbcbbg aggcctgtgc tctgggggtc 2400 ccttgctbag cctgtgcbgg accagcbggc ctggggbccc tctgaagaga ccttggcbgc 2460 tcactgtcca cabgtgaiact bbbtcbaggb ggcaggacaa atcgçgccca ttbagaggat 2520 gtggctgtaa cctgctggat gggacbccat agctccbbcc caggacccct cagctocccg 2580 gcactgcagt ctgcagagtt ctccbggagg caggggctgc bgcçtfcgbtt caccttccat 2640 gtcaggccag ccbgtcccbg aaagagaaga bggceatgcc ctccatttgb aagaacaatg 2700 ccagggccca ggaggaccgc cbgccatgcc bgggcctbgg ctgggccbcb ggtfccbgaca 2760 ctbbcfcgcbg gaagctgtca ggctgggaca ggcbttgatb btgagggbta gcaagacaaa 2B20 gcaaataaat gccttecacc tcacegcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2870 <210> 2 <211> 440 81

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Ala Ser Leu Tre Vai Lis Ala Tir Leu Leu Gli Lis Glu Asp Ala 1 5 10 15 Ala Arg Glu Ile Arg Arg Tre Ser Tre Cis Cis Ser Pro Glu Pro Glu 20 25 30 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Gli Pro Gli Pro Cis Glu Arg Leu Leu 35 40 45 Ser Arg Vai Ala Ala Leu Tre Pro Ala Leu Arg Pro Gli Gli Tre Gin 50 55 60 Ala His Tir Arg Asp Glu Asp Gli Asp Leu Vai Ala Tre Ser Ser Asp 65 70 75 80 Glu Glu Leu Tre Met Ala Met Ser Tir Vai Lis Asp Asp Ile Tre Arg 85 90 95 Ile Tir Ile Lis Glu Lis Lis Glu Cis Arg Arg Asp His Arg Pro Pro 100 105 110 Cis Ala Gin Glu Ala Pro Arg Asn Met Vai His Pro Asn Vai Ile Cis 115 120 125 Asp Gli Cis Asn Gli Pro Vai Vai Gli Tre Arg Tir Lis Cis Ser Vai 130 135 140 Cis Pro Asp Tir Asp Leu cis Ser Vai Cis Glu Gli Lis Gli Leu His 145 150 155 160 Arg Gli His Tre Lis Leu Ala Tre Pro Ser Pro Tre Gli His Leu Ser 165 170 175 Glu Gli Tre Ser His Ser Arg Trp Leu Arg Lis Vai Lis His Gli His 180 185 190 82

Tre Gli Trp Pro Gli Trp Glu Met Gli Pro Fro Gli Asn Trp Ser Pro 195 200 205

Arg Pro Pro Arg Ala Gli Glu Ala Arg Pro Gli Pro Tre Ala Glu Ser 210 215 220

Ala Ser Gli Pro Ser Glu Asp Pro 225 . 230 Gli Glu Ser Vai Ala Ala Ala Leu 245 Ile Asp Vai Glu His Gli Gli Lis 260 Pro Glu Ser Ser Ser Tre Glu Glu 275 280

Ser Vai Asn Tre Leu Lis Asn Vai 235 240 Ser Pro Leu Gli Ile Glu Vai Asp 250 255 Arg Ser Arg Leu Tre Pro Vai Ser 265 270 Lis Ser Ser Ser Gin Pro Ser Ser 285

Cis Cis Ser Asp Pro Ser Lis Pro Gli Gli Asn Vai Glu Gli Ala Tre 290 295 300

Gin Ser Leu Ala Glu Gin Met Arg Lis Ile Ala Leu Glu Ser Glu Gli 305 310 315 320

Arg Pro Glu Glu Gin Met Glu Ser Asp Asn Cis Ser Gli Gli Asp Asp 325 330 335

Asp Trp Tre His Leu Ser Ser Lis Glu Vai Asp Pro Ser Tre Gli Glu 340 345 350

Leu Gin Ser Leu Gin Met Pro Glu Ser Glu Gli Pro Ser Ser Leu Asp 355 360 365

Pro Ser Gin Glu Gli Pro Tre Gli Leu Lis Glu Ala Ala Leu Tir Pro 370 375 380

His Leu Pro Pro Glu Ala Asp Pro Arg Leu Ile Glu Ser Leu Ser Gin 385 390 395 400 83

Met Leu Ser Met Gli Tre Ser Asp Glu Gli Gli Trp Leu Tre Arg Leu 405 410 415

Leu Gin Tre Lis Asn Tir Asp Ile Gli Ala Ala Leu Asp Tre Ile Gin 420 425 430

Tir Ser Lis His Pro Pro Pro Leu 435 440

<210> 3 <211> 2870 <212> ADN <213> Homo sapiens <400 3 ggcctgggtg gcgaattcgg cacgaggctc gccgctcgct atggcgtcgc tcaccgtgaa 60 ggcctacctt ctgggcaagg aggacgcggc gcgcgagatt cgccgcttca gcttctgctg 120 cagccccgag cctgaggcgg aagccgaggc tgcggcgggt ccgggaccct gcgagcggct 180 gctgagccgg gtggccgccc tgttccccgc gctgcggcct ggcggcttcc aggcgcacta 240 ccgcgatgag gacggggact tggttgcctt ttccagtgac gaggaattga caatggccat 300 gtcctacgtg aaggatgaca tcttccgaat ctacattaaa gagaaaaaag agtgccggcg 360 ggaccaccgc ccaccgtgtg ctcaggaggc gccccgcaac atggtgcacc ccaatgtgat 420 ctgcgatggc tgcaatgggc ctgtggtagg aacccgctac aagtgcagcg tctgcccaga 480 ctacgacttg tgtagcgtdt gcgagggaaa gggcttgcac cgggggcaca ccaagctcgc 540 attccccagc cccttcgggc acctgictga gggcttctcg cacagccgct ggctccggaa G00 ggtgaaacac ggacacttcg ggtggccagg atgggaaatg ggtccaccag gaaactggag 660 cccacgtcot cctcgtgcag gggaggcccg ccctggcccc acggcagaat cagcttctgg 720 tccatcggag gatccgagtg tgaatttcct gaagaacgtt ggggagagtg tggcagctgc 780 ccttagccct ctgggcattg aagttgatat cgatgtggag cacggaggga aaagaagccg 840 cctgaccccc gtctctcoag agagttccag cacagaggag aagagcagct cacagccaag 900 cagctgctgc tctgatccca gcaagecggg tgggaatgtt gagggcgcca cgcagtctct 960 ggcggagcag atgagaaaga tcgccttgga gtccgagggg cgccctgagg aacagatgga 1020 gtcggataac tgttcaggag gagatgatga ctggacccat ctgtcttcaa aagaagtgga 1080 cccgtctaca ggtgaactco agtccctaca gatgccagaa tccgaagggc caagctctct 1140 ggacccctcc caggagggac ccacagggct gaaggaagct gccttgtacc cacatctcCc 1200 gccagaggct gacctgeggc tgattgagtc cctctcccag atgctgtcca tgggcttctC 1260 tgatgaaggc ggctggctca ccaggctcct gcagaccaag aactatgaca tcggagcggc 1320 tctggacacc atccagtatt caaagcatcc cccgccgttg tgaccacttt tgcccacetc 1380 ttctgcgtgc ccctcttctg tctcatagtt gtgttaagct tgcgtagaat tgcaggtctc 1440 tgtacaggcc agtttctctg ccttcttcca ggatcagggg ttagggtgca agaagccatt 1500 84 tagggcagca aaacaagtga catgaaggga gggtccctgt gtgtgtgtgt gtgctgatgt 1560 ttcctgggtg ccctggctcc ttgcagcagg gctgggcctg cgagacccaa ggctcactgc 1620 agcgcgetcc tgacccctcc ctgcaggggc tacgttagca gcccagcaca tagcttgcct 1680 aatggctttc actttctctt ttgttttaaa tgactcatag gtccctgaca tttagttgat 1740 tattttctgc tacagacctg gtacactctg attttagata aagtaagcct aggtgttgtc 1800 agcaggcagg ctggggaggc cagtgttgtg ggcttcctgc tgggactgag aaggctcacg 1860 aagggcatcc gcaatgttgg tttcactgag agctgcctcc tggtctcttc accactgtag 1920 ttctctcatt tccaaaccat cagctgcttt taaaataaga tctctttgta gccatcctgt 1980 taaatttgta aacaatctaa ttaaatggca tcagcacttt aaccaatgac gtttgcatag 2040 agagaaatga ttgacagtaa gtttattgtt aatggttctt acagagtatc tttaaaagtg 2100 ccttagggga accctgCccc tcctaacaag tgtatctcga ttaataacct gccagtccca 2160 gatcacacat catcatcgaa gtcttcccca gttataaaga ggtcacatag tcgtgtgggt 2220 cgaggattct gtgcctcCag gaccaggggc ccaccctctg cccagggagt ccttgcgtcc 2280 catgaggtct tcccgcaagg cctctcagac ccagatgtga cggggtgtgt ggcccgagga 2340 agctggacag cggcagtggg cctgctgagg ccttctcttg aggcctgtgc tctgggggtc 2400 ccttgcettag cçtgtgctgg accagctggc ctggggtccc tctgaagaga ccttggctgc 2460 tcactgtcca catgtgaact t.tttctaggt ggcaggacaa atcgcgccca tttagaggat 2520 gtggctgtáa cctgctggat gggactccat agctccttcc caggacccct cagctccccg 2580 gcáctgcagt ctgcagagtt ctcctggagg caggggctgc tgccttgttt caccttccat 2640 gtcaggccag ectgtccctg aaagagaaga tggccatgcc ctccatttgt aagaacaatg 2700 ccagggccca ggaggaccgc ctgccctgcc tgggcettgg ctgggcctct ggttctgaca 2760 ctttctgctg gaagctgtca ggctgggaca ggctttgatt ttgagggtta gcaagacaaa 2820 gcaaataaat gccttccacc tcaccgcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2870

<210> 4 <211> 440 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met Ala Ser Leu Tre Vai Lis Ala Tir Leu Leu Gli Lis Glu Asp Ala 15 10 15

Ala Arg Glu Ile Arg Arg Fen Ser Fen Cis Cis Ser Pro Glu Pro Glu 20 25 30

Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Gli Pro Gli Pro Cis Glu Arg Leu Leu 35 40 45

Ser Arg vai Ala Ala Leu Fen Pro Ala Leu Arg Pro Gli Gli Fen Gin 50 55 60 85

Ala His Tir Arg Asp Glu Asp Gli Asp Leu Vai Ala Fen Ser Ser A$p 65 70 75 80

Glu Glu Leu Tre Met Ala Met Ser Tir Vai Lis Asp Asp Ile Fen Arg 85 90 ·95

Ile Tir Ile Lis Glu Lis Lis Glu Cis Arg Arg Asp Ris Arg Pro Pro 100 105 110

Cis Ala Gin Glu Ala Pro Arg Asn Met Vai His Pro Asn Vai Ile Cis 115 120 125

Asp Gli Cis Asn Gli Pro Vai Vai Gli Tre Arg Tir Lis Cis Ser Vai 130 135 140

Cis Pro Asp Tir Asp Leu Cis Ser Vai Cis Glu Gli Lis Gli Leu His 145 150 155 160

Arg Gli His Tre Lis Leu Ala Fen Pro Ser Pra Fen Gli His Leu Ser 165 .170 175

Glu Gli Fen Ser His Ser Arg Trp .Leu Arg Lis Vai. .Lis His Gli His 180 185 190

Fen Gli Trp Pro Gli Trp Glu Met Gli Pro Pro Gli Asn Trp Ser Pro 195 200 205

Arg Pro Pro Arg Ala Gli Glu Ala Arg Pro Gli Pro Tre Ala Glu Ser 210 215 220

Ala Ser Gli Pro Ser Glu Asp Pro Ser Vai Asn Fen Leu Lis Asn Vai 225 230 235 240

Gli Glu Ser Vai Ala Ala Ala Leu Ser Pro Leu Gli Ile Glu Vai Asp 245 250 255

Ile Asp Vai Glu His Gli Gli Lis Arg Ser Arg Leu Tre Pro Vai Ser 260 265 270 86

Pro Glu Ser Ser Ser Tre Glu Glu Lis Ser Ser Ser Gin Pro Ser Ser 275 280 285

Cis Cis Ser Asp Pro Ser Lis Pro Gli Gli Asn Vai Glu Gli Ala Tre 290 295 300

Gin Ser Leu Ala Glu Gin Met Arg Lis Ile Ala Leu Glu Ser Glu Gli 305 310 315 320

Arg Pro Glu Glu Gin Net Glu Ser Asp Asn Cis Ser Gli Gli Asp Asp 325 330 . 335

Asp Trp Tre His Leu Ser Ser Lis Glu Vai Asp Pro Ser Tre Gli Glu 340 345 350

Leu Gin Ser Leu Gin Met Pro Glu Ser Glu Gli Pro Ser Ser Leu Asp 355 360 365

Pro Ser Gin Glu Gli Pro Tre Gli Leu Lis Glu Ala Ala Leu Tir Pro 370 375 380

His Leu Pro Pro Glu Ala Asp Leu Arg Leu Ile Glu Ser Leu Ser Gin 385 390 395 400

Met Leu Ser Met Gli Fen Ser Asp Glu Gli Gli Trp Leu Tre Arg Leu 405 410 415

Leu Gin Tre Lis Asn Tir Asp Ile Gli Ala Ala Leu Asp Tre Ile Gin 420 425 430

Tir Ser Lis His Pro Pro Pro Leu . 435 440

<210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial 87 <220> <223> iniciador directo CA5-3 <400> 5 ggagcaggat tcaggaaggt 20

<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador inverso CA5-3 <400> 6 taccaagttc tttcctgccc 20 <210> 7 .

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador directo CA5-5 <400> 7 20 gtgtcatcattcccaggctt

<210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador inverso CA5-5 <400> 8. agcattggct tagctcagga 20

<210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador directo CA5-6 <400> 9 ctatctagcc tgggcgacag 20 <210> 10

<211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador inverso CA5-6-<4 00> 10 ttcctgtgat cttaacacct tcc

<210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador directo CA5-7 <400>11 aaggctcctc cattccttgt 20

<210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador inverso CA5-7 <400> 12 ccacctt.ccc cgtctttaat 20 <210> 13.

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial. <220> <223> iniciador directo CA5-9 <400> 13 gcctcaatgg acataaacca 20

<210> 14 ·<211 > 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador inverso CA5-9 <400> 14 ggtgtcctat ttcttcctgt atcaa 25

<210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador directo CA5-11 <400> 15 actcacacac ccaggcctac 20

<210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador inverso CA5-11 <400> 16 caccatcagc cagagactgt 20

<210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador directo CA5-25 91 <400> 17 gggggtgtag agaggaaacc 20

<210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador inverso CA5-25 <400> 18 aattggaatg ccactcccta 20

<210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial. <230> <223> iniciador directo CA5-27 <400> 19 acgaccacga aagtgacaca 20

<210> 20 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador inverso CA5-27 <400> 20 92 cgcccggcta aaaatacat 19

<210> 21 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador paralelo p62-l <400> 21 ggcccatttt ccgccagc 18

<210> 22 <2.11> 20 <212> ADN <213>Sequência artificial <220> <223> iniciador anti-paralelo p62-l <400> 22 cttggtcacc actccagtca 20

<210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial. <220> <223> iniciador' paralelo p62-2 <400> 23 agggggtagt cttgcctctc 20 <210> 24

<211> 20 <312> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador anti-paralelo ρβ2-2 <400> 24 acagccctca aattgctgac 20

<210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador paralelo p62-3 <400> 25 ' agtttcctgg tggacccatt 20

<210> 26 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <223> iniciador anti-paralelo p62-3 <4C0> 26 gtgacagccc cacagtgac 19 <210> 27 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador paralelo p62-4 <400> 27 ctgaattctt gccttgcaca 20

<210> 28 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador anti-paralelo p62-4 <400> 28 gcacctgtct gaggtgagc .19

<210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador paralelo p62-5 <400> 29 cccgtggtcc agcactacta

<210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial 20 <220> <223> iniciador anti-paralelo ρβ2-5 <400> 30 agagtgggag gaaggagagg 20

<210> 31 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador paralelo p62-6 <4 00 31 ' cttagctgct tgtggggact 20

<210> 32 <211> 20 < 212 > ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador anti-paralelo p62-6 <400> 32 ctccctcggg tttgtaagtg 20 <210> 33 <211> 20 .

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador paralelo p62-7 <400> 33 agacccctgc agccttaact 20

<210 34 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador anti-paralelo p62-7 <400> 34 ccaactccta acctcccaca 20

<210> 35 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220 <223> iniciador paralelo p62-8 <400 35 cactgtggcc tgtgaggac 19

<210> 36 <211> 19 <312> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador anti-paralelo p62-8 97 <400> 36 cagtgagcct tgggtctcg

Lisboa, 16 de Abril de 2008

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a detecção de uma condição associada com uma proteína p62/SQSTMl mutada, caracterizado pelo facto de compreender a análise de um amostra para detectar {a) uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína p62/SQSTMl mutada comportando a sequência ilustrada na SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento; ou (b) uma proteína comportando a sequência ilustrada na SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de a condição ser a doença óssea de Paget.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracteri zado pelo facto de o processo compreender o contacto da amostra com uma sonda de nu.cleótido capaz de hibridar com a molécula de ácido nucleico para formar um produto de hibridação, em condições que permitem a formação do produto de hibridação e a análise desse produto de hibridação.
4. 4. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 3, caracterizado pelo facto de o processo compreender o contacto da amostra com um anticorpo que se liga a p62/SQSTMl mutada e que é capaz de ser detectado depois de se ligar a p62/SQSTMl mutada na amostra.
5. 5. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica a proteína p62/SQSTMl caracterizada pelo facto de ter a sequência de amínoácidos ilustrada na SEQ. ID NO. 4 ou 1 ura seu fragmento, em que o referido fragmento inclui a posição 392 dos aminoácidos ilustrados na SEQ. XD NO.4.
6. 6. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo facto de o referido fragmento incluir um domínio associado à ubiquitina.
7. 7. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo facto de compreender: (a) uma sequência de ácidos nucleicos conforme ilustrado na SEQ. ID. NO.: 3 em que T também pode ser U; (b) uma sequência de ácidos nucleicos que é complementar de uma sequência de ácidos nucleicos de (a); (c) uma sequência de ácidos nucleicos que é praticamente homóloga de uma sequência de ácidos nucleicos de (a) ou (b); (d) uma sequência de ácidos nucleicos que é análoga de uma sequência de ácidos nucleicos de (a), (b) ou (c); ou (e) uma sequência de ácidos nucleicos que híbrida com uma sequência de ácidos nucleicos de (a) , (b) , (c) ou (d), em condições severas de hibridação. em que a referida sequência de ácidos nucleicos codifica um aminoácido na posição 392 como ilustrado na SEQ. ID NO. 4.
8. 8. Proteína isolada caracterizada pelo facto de comportar a sequência de aminoácidos tal como se ilustra na SEQ. ID NO. 4 ou um seu fragmento, em que o referido fragmento compreende a posição 392 dos aminoácidos como ilustrado na SEQ. ID NO. 4. 2
9. 9. Proteína de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo facto de o referido fragmento incluir um domínio associado à ubiquitina.
10. 10. Molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 a 7 ou uma proteína de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo facto de se destinar a detectar uma doença dos ossos.
11. 11. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 10 caracterizada pelo facto de se destinar a detectar a doença óssea de Paget.
12. 12. Oligonucleótido anti-paralelo caracterizado pelo facto de ser complementar de uma sequência de ácidos nuclei-cos de comprimento completo, de acordo com umá:qualquer das reivindicações 5 a 7.
13. 13. Vector de expressão caracterizado pelo facto de compreender uma molécula de ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 a 7.
14. 14. Célula hospedeira transformada com um vector de expressão de acordo com a reivindicação 13.
15. 15. Anticorpo caracterizado pelo facto de se poder ligar a uma proteína de acordo com a reivindicação 8 ou 9 na posição 392 dos aminoácidos.
16. 16. Processo de identificação de uma substância que se pode ligar a uma proteína de p62/SQSTMI mutada, caracterizada pelo facto de compreender as etapas de: 3 (a) incubação de uma proteína p62/SQSTMl mutada comportando a sequência que se mostra na SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento e uma substância de ensaio, em condições que permitam a formação de um complexo entre a proteína p62/SQSTMl e a substância de ensaio, e (b) a análise dos complexos da proteína p62/SQSTMl mutada e a substância de ensaio, da substância livre ou da proteína p62/SQSTMl mutada· complexada, em que a presença de complexos . indica que a substância de ensaio é capaz de se ligar à proteína p62/SQSTMl mutada.
17. 17. Processo de identificação de um composto que afecta a. actividade ou a expressão da proteína p62/SQSTMl mutada, caracterizado pelo facto de compreender: (a) incubação de . um composto de ensaio com uma proteína p62/SQSTMl mutada, comportando a sequência de aminoácidos que se mostra na SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento ou um ácido nucleico que codifica uma proteína p62/SQSTMl mutada cujos ácidos nucleicos são capazes de se ligar à proteína p62/SQSTMl mutada. (b) determinação do valor da actividade ou da expressão da proteína p62/SQSTMl mutada e comparação com um controlo, em que uma alteração na actividade ou na expressão da proteína p62/SQSTMl mutada, quando comparada com o controlo, indica que o composto de ensaio tem um efeito na actividade ou na expressão da proteína p62/SQSTMl mutada. 4
18. 18. Animal não humano caracterizado pelo facto de ser portador de uma mutação num gene que codifica uma proteína p62/SQSTMl, em que a referida mutação corresponde à proteina humana p62/SQSTMl mostrada na SEQ. ID NO. 4. Lisboa, 16 de Abril de 2008