JP2001502170A

JP2001502170A - カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来の熱安定ｄｎａポリメラーゼ

Info

Publication number: JP2001502170A
Application number: JP10516242A
Authority: JP
Inventors: アンケンバウアー，ワルトラウド; マルカウ，ウルスーラ; スヴェトリヒニー，ヴィタリー; シュミッツ―アゲグイアン，ガドラム; ライセル，アストリッド; アンジェリア，ベルンハード; エベンビシュラー，クリスティン; ロウェ，フランク; ボンク―オスモロヴスカヤ，エリザヴェータ
Original assignee: ロシュダイアグノスティックスゲーエムベーハー
Priority date: 1996-10-03
Filing date: 1997-10-01
Publication date: 2001-02-20
Anticipated expiration: 2017-10-01
Also published as: ATE357527T1; IL129085A0; AU5049598A; US6468775B1; CA2268014C; JP4005637B2; EP0929680B1; DE69737502T2; RU2197524C2; NZ334652A; NO991568D0; DE69737502D1; EP0929680A1; EP0834569A1; AU717009B2; CA2268014A1; NO991568L; NO323846B1; IL129085A; WO1998014589A1

Abstract

(57)【要約】好熱性真正細菌由来のＤＮＡポリメラーゼが提供される。このＤＮＡポリメラーゼは、マグネシウムイオン依存性逆転写酵素活性および3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示す。また、本発明は、この酵素を産生することが可能な組換えプラスミドおよび形質転換宿主細胞も含む。この酵素は、クラスEC2.7.7.7.、ＤＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼＤＮＡ誘導型に分類される。

Description

【発明の詳細な説明】カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来の熱安定ＤＮＡポリメラーゼ本発明は、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス(Carboxydothermus h ydrogenoformans)から取得可能なＤＮＡポリメラーゼである熱安定酵素に関する。さらに、本発明は、分子生物の分野に関し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）配列の複製および増幅のための改良方法を提供する。好ましい実施態様においては、本発明は、熱反応性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する方法を提供する。別の態様においては、本発明は、熱安定ＤＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型からＤＮＡセグメントを増幅する方法（ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ）を提供する。熱安定ＤＮＡポリメラーゼ（EC2.7.7.7.ＤＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ特異的）は、多数の好熱性生物から単離されている（例えば、Kale dinら(1980)Biokimiya 45，644-651;Kaledinら(1981)Biokimiya 46，1247-1254; Kaledinら(1982)Biokimiya 47，1515-1521;Ruttimannら(1985)Eur．J．Biochem ．149，41-46;Neunerら(1990)Arch．Microbiol．153，205-207）。いくつかの生物に関しては、そのポリメラーゼ遺伝子がクローニングされており、発現されている（Lawyerら(1989)J．Biol．Chem．264，6427-6437;Engelkeら(1990)Anal．B iochem．191，396-400;Lundbergら(1991)Gene 108，l-6;Perlerら(1992)Proc．N atl．Acad．Sci．USA 89，5577）。好熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ますます分子生物学における使用のための重要なツールになってきており、ＲＮＡおよびＤＮＡの診断的検出、遺伝子クローニングならびにＤＮＡ配列決定における使用により適した特性および活性を有する新規ポリメラーゼの発見に関心が高まりつつある。現在のところ、これらの目的のために主として用いられている好熱性ＤＮＡポリメラーゼは、T.アクアティカス(T.aquaticus)由来のTaqポリメラーゼのようなテルムス(Thermus)種由来のものである（Brockら(1969)J．Bacteriol．98，289-297）。逆転写は、通常、鳥類骨髄芽球細胞症ウイルスまたはモロニーマウス白血病ウイルスから単離された酵素のようなウイルス逆転写酵素を用いて行なわれる。これらの酵素は、マグネシウムイオンの存在下で活性であるが、ＲＮアーゼＨ−活性を有するという欠点を有する。この活性は、逆転写反応中に鋳型ＲＮＡを破壊し、それぞれ42℃または37℃に最適な温度を有する。高温で活性な好熱性生物のＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性を用いる代替の方法が記載されている。高温での逆転写は、産物の早期終結が生じ得るＲＮＡ鋳型の二次構造に打ち勝つという利点を有する。逆転写酵素活性を有する熱安定ＤＮＡポリメラーゼは、通常、テルムス種から単離される。しかしながら、これらのＤＮＡポリメラーゼは、マンガンイオンの存在下においてのみ逆転写酵素活性を示す。マンガンイオンの存在下ではポリメラーゼは低い忠実度で鋳型ＲＮＡをコピーするので、これらの反応条件は最適状態に及ばない。通常用いられている逆転写酵素の別の特性は、それらが3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を含まないということである。したがって、誤って取り込まれたヌクレオチドを除去することができず、よって鋳型ＲＮＡ由来のｃＤＮＡコピーは有意な程度の突然変異を含み得る。したがって、・高温で作用して鋳型の二次構造に打ち勝ち、反応の早期終結を回避し、欠失なしにｃＤＮＡを産生させ、・高い忠実度でＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを調製するためにマグネシウムイオンの存在下で活性であり、そして・誤って取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ合成の継続前に除去し、突然変異の頻度の低い産物を産生するために3'-5'エキソヌクレアーゼを有する逆転写酵素を開発することが望まれている。本発明はこれらの要求に取り組むものであり、マグネシウムイオンの存在下で逆転写酵素活性を有し、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する高温で活性な熱安定ＤＮＡポリメラーゼを提供する。本発明の目的は、マグネシウムイオンの存在下、ならびにマンガンイオンの存在下で逆転写酵素活性を有することを特徴とする、ポリメラーゼ酵素（EC2.7.7. 7.）を提供することである。別の態様においては、本発明は、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell kulturen GmbH，Mascheroder Weg lb，D-38124 Braunschweig，DSM No.8979)から単離されたＤＮＡポリメラーゼを含む。さらなる態様においては、本発明は、マグネシウムイオンの存在下および実質的にマンガンイオンの不存在下で逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む。さらなる態様においては、本発明は、in situ ＰＡＧＥ分析によって測定された場合、約100〜105kDaの分子量を有するＤＮＡポリメラーゼを含む。さらなる態様においては、本発明は、熱安定性の逆転写酵素を含む。さらなる態様においては、本発明は、3'-5'-エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む。さらなる態様においては、本発明は、微生物カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスのＤＮＡポリメラーゼ活性をコードする組換えＤＮＡ配列を含む。関連した態様においては、ＤＮＡ配列は、配列番号７に示される。第２の関連した態様においては、本発明は、本質的にアミノ酸残基１〜831をコードする組換えＤＮＡ配列を含む。さらなる態様においては、本発明は、プラスミドベクターに挿入された本発明のＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡプラスミドを含み、その組換えＤＮＡプラスミドを用いることによってそのプラスミドで形質転換された宿主細胞中にカルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスの熱安定ＤＮＡポリメラーゼの発現を誘導することができる。さらなる態様においては、本発明は、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するpAR4と呼ばれるベクターpDS56 を含む組換え株を含む。プラスミドpAR4を有するE.coli株（BL21(DE3)pUBS520）はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascherod er Weg lb，D-38124 Braunschweig DSM No.11179)に寄託され、AR96と呼ばれている。その中に選択肢を提供しないリストにしたがって「実質的にまたは実際上」一連のアミノ酸から構成されるようなペプチド鎖に言及する場合、その参照の中に、本発明者らは、そのペプチド鎖からなるタンパク質の全体的な構造および全体的な機能が、非置換バージョンのものと実質的に同じか、または検出不能なくらいの違いであるような様式で１以上のアミノ酸に対してなされる置換を有するペプチド鎖のあらゆるバージョンを含むものである。例えば、一般的に、特に、変更される部位が折りたたまれたタンパク質の形態学に重要でない位置である場合、タンパク質の特性を大きく変更することなくアラニンとバリンを交換することが可能である。ＤＮＡポリメラーゼが「熱安定な」とは、熱に対して安定であり、高温、特にＤＮＡ鎖の変性に用いられる高温で選択的に活性であることを意昧する。より詳しくは、熱安定ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられる高温で実質的に不活性化されない。「逆転写酵素」という用語は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと特性付けられるポリメラーゼのクラスを意味する。公知の逆転写酵素はすべて、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡ転写物の合成にプライマーを必要とする。歴史的に、逆転写酵素は、主にｍＲＮＡを、その後さらなる操作のためのベクターにクローニングされ得るｃＤＮＡに転写することに用いられている。その他の定義付けは、当技術分野と一致した様式で用いられる。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスは、V.Svetlichnyによってカムチャッカの温泉から単離された。C.ヒドロゲノホルマンスの試料は、ブダペスト条約の約定の下にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen G mbH(DSM)に寄託しており、受託番号DSM 8979を得ている。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスから単離された熱安定ポリメラーゼは、100〜105KDaの分子量を有し、95℃で30分間加熱した後、その初期活性の60％以上を保持する。熱安定酵素は、5'-3'ポリメラーゼ活性、3'-5'-エキソヌクレアーゼ活性、5'-3'- エキソヌクレアーゼ活性およびMg⁺⁺依存性の逆転写酵素活性を有する。本発明のポリメラーゼは、マグネシウムイオンの存在下およびマンガンイオンの実質的に不存在下で逆転写酵素活性を有する。熱安定酵素は、天然でも組換え型のものでもよく、ｃＤＮＡクローニング、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ標識およびＤＮＡ増幅における第１および第２鎖ｃＤＮＡ合成に用いられる得る。天然タンパク質を回収するために、Svetlichnyら（1991）System．Appl．Micr obiol.，14，205-208に記載された技術などの適当な技術を用いてC.ヒドロゲノホルマンスを増殖させるとこができる。細胞増殖後の酵素の単離および精製のための一つの好ましい方法は、下記の多段プロセスを用いて行われる：細胞を解凍し、緩衝液Ａ（40mMのトリス−HCl、pH7.5、0.1mMのEDTA、７mMの2 -メルカプトエタノール、0.4ＭのNaCl、10mMのPefabloc）に懸濁し、Gaulinホモジナイザーを二重通過させることによって溶解する。未処理の抽出物を遠心分離によって透明にし、上清を緩衝液Ｂ（40mMのトリス−HCl、pH7.5、0.1mMのEDTA 、７mMの2-メルカプトエタノール、10％のグリセロール）に対して透析し、ヘパリン−セファロース(Pharmacia)を詰め込んだカラム上にのせる。各場合において、カラムは出発溶媒で平衡化し、試料を加えた後、その３倍の容量のかかる溶媒を用いて洗浄する。第１のカラムの溶出は、緩衝液Ｂ中、０〜0.5ＭのNaClの直線グラジエントを用いて行う。ポリメラーゼ活性を示す画分をプールし、硫酸アンモニウムを最終濃度が20％になるまで加える。この溶液をブチル−ＴＳＫ− トーヨーパール(TosoHass)を含む疎水性カラムに加える。この時、カラムを20％から０％の硫酸アンモニウムの下降グラジエントで溶出する。活性を含むプールを透析し、再びＤＥＡＥ−セファロース(Pharmacia)を含むカラムに移し、緩衝液Ｂ中、０〜0.5ＭのNaClの直線グラジエントで溶出する。第４のカラムにはトリス−アクリル−ブルー(Biosepra)が含まれており、前出の場合と同様に溶出する。最後に、活性画分を緩衝液Ｃ（20mMのトリス−HCl、pH7.5、0.1mMのEDTA、7 .0mMの2-メルカプトエタノール、100mMのNaCl、50％グリセロール）に対して透析する。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスからの組換えＤＮＡポリメラーゼの単離は、同じプロトコルまたはその他の通常用いられている手順で行われ得る。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、本質的に、Holtke，H.-J.，Sanger，G.，Kessler ，C.およびSchmitz，G.(1992)Biotechniques 12，104-113に記載された方法にしたがって、合成されたＤＮＡへのジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰの取込み、取り込まれたジゴキシゲニンの検出および定量によって測定した。逆転写酵素活性の測定は、反応混合物が実施例３に記載されたような成分からなること以外は、本質的に、ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定について記載されたようにして行われる。ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性のin situ ＰＡＧＥ分析は、本質的に、Spanos A.およびHubscher U.((1983)Methods in Enzymology 91，263-277)によって記載された方法にしたがって行った。オリジナルの方法に対するいくつかのマイナーではあるが本質的な変更は、ＳＤＳ−変性ポリペプチドの再生をマグネシウムイオン（３mM）およびｄＡＴＰ（0.5〜１μＭ）の存在下で行うことにより再折りたたみを助けることである。 3'-5'エキソヌクレアーゼ活性は、通常、ＤＮＡポリメラーゼの「プルーフリーディング」または「編集」活性と呼ばれている。この活性は、Ａ型ポリメラーゼの大断片の小ドメインに位置する。この活性は、ヌクレオシド三リン酸の不存在下でＤＮＡのプライマー末端の3'末端から不適性対合したヌクレオチドを除去するものである（Kornberg A.およびBaker T.A.（1992）DNA Replication W.H.F reemann & Company，ニューヨーク）。このヌクレアーゼ作用は、デオキシヌクレオシド三リン酸が鋳型に適合し、ポリマーに取り込まれ得る場合、そのデオキシヌクレオシド三リン酸によって抑制される。請求の範囲に記載したＤＮＡポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の不存在下もしくは存在下における鋳型ＤＮＡ、またはデオキシリボヌクレオシド三リン酸の不存在下もしくは存在下におけるＤＮＡ断片上にアニールした5'-ジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドの分解または短縮化として測定され得る。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスＤＮＡポリメラーゼは、図１に示されているようにマンガンイオン存在下よりもマグネシウムイオン存在下において高い活性を有する、好熱性真正細菌から単離された最初のＤＮＡポリメラーゼである。ＤＮＡポリメラーゼ活性と比較して、マグネシウムの存在下における逆転写酵素活性は相対的に高い。これは、図６において、T.フィリホルミス(T.f iliformis)、A.サーモフィラム(A.thermophilum)および逆転写に最も一般的に用いられているT.サーモフィラス(T.thermophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼとの比較において示されている。ＤＮＡポリメラーゼはマンガンの存在下よりもマグネシウムの存在下において高い忠実度でＤＮＡを合成する（Beckmann R.A.ら（1 985）Biochemistry 24，5810-5817;Ricchetti M.およびBuc H.（1993）EMBO J. 12，387-396）ので、マグネシウムに依存する逆転写酵素活性は都合がよい。低忠実度ＤＮＡ合成は、原鋳型の突然変異コピーを生じさせる可能性が高い。さらに、Mn²⁺イオンは、特に高温におけるＲＮＡ分解の速度増大に関係しており、このことによって逆転写反応において短い産物の合成が引き起こされ得る。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスポリメラーゼのＤＮＡ配列（配列番号７）および該酵素の誘導アミノ酸配列を図５に示す。配列から推定される分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動においては94348Daであるが、図２に示されているように、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスポリメラーゼはE.coli pol I（109kDa）よりも高く、Taqポリメラーゼ（94kDa）およびクレノウフラグメント（76kDa）よりも低い電気泳動移動度を有する。TaqおよびE.coli ＤＮＡポリメラーゼの移動特性とカルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスポリメラーゼの移動特性を比較することにより、分子量100〜105kDa が推定され得る。天然株から単離されたカルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスポリメラーゼは組換え酵素と同じ移動特性を有するので、ＳＤＳゲル電気泳動中の「より遅い」移動はクローニング人工産物というよりも酵素の特性であるに違いない。この現象についての可能な説明は、好熱性生物から誘導されるこの酵素は、用いられる標準変性条件下で完全に折りたたまれている非常に安定な構造を有するということである。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスＤＮＡポリメラーゼの組換え体の産生には、一般的に、下記の工程が含まれる：カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来の染色体ＤＮＡを、細胞を界面活性剤、例えばＳＤＳ、およびプロテイナーゼ、例えばプロテイナーゼＫで処理することによって単離する。溶液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノールによる沈殿によって精製する。ＤＮＡをトリス／ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をＰＣＲ技術によって２つの混合オリゴヌクレオチド（プライマー１および２）を用いて特異的に増幅する。配列番号１および配列番号２に記載されたこれらのオリゴヌクレオチドは、Braithwaite D.K.およびItoJ. ，1993，Nucl．Acids Res．Vol．21，p.787-802に記載されたファミリーＡＤＮＡポリメラーゼの保存領域に基づいて設計した。特異的に増幅された断片をベクター、好ましくはpCR^TMIIベクター(Invitorogen)にライゲートし、サイクル− 配列決定法(cycle-sequencing)によって配列を決定する。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコード領域および隣接配列の完全な単離は、スクリーニングの第１ラウンドのものとは別の制限酵素によるカルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスＤＮＡの制限断片化およびインバース(inverse)ＰＣＲによって行われ得る（Inn isら，（1990）PCR Protocls:Academic Press．Inc.，p.219-227）。これは、遺伝子部分の外側のＤＮＡ配列に、逆方向に結合する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われ得る。配列番号３および４に記載されたこれらのオリゴヌクレオチドは、上記の第１のＰＣＲ産物の配列決定によって決定される配列に基づいて設計した。鋳型としては、制限消化によって切断され、T4 ＤＮＡリガーゼと接触することによって環化するカルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスＤＮＡが用いられる。全ポリメラーゼ遺伝子のコード領域を単離するために、配列番号５および６に示されたようなプライマーを用いて別のＰＣＲを行って、ゲノムＤＮＡおよび線状化発現ベクターと適合する導入末端から完全ＤＮＡポリメラーゼを直接増幅する。配列番号１：プライマー１：5'-CCN AAY YTN CAR AAY ATH-3' 配列番号２：プライマー２：5'-YTC RTC RTG NAC YTG-3' 配列番号３：プライマー３：5'-GGG CGA AGA CGC TAT ATT CCT GAG C-3' 配列番号４：プライマー４：5'-GAA GCC TTA ATT CAA TCT GGG AAT AAT C-3' 配列番号５：プライマー５：5'-CGA ATT CAA TCC ATG GGA AAA GTA GTC CTG GTG GAT-3' 配列番号６：プライマー６：5'-CGA ATT CAA GGA TCC TTA CTT CGC TTC ATA CCA GTT-3' 遺伝子は、原核または真核宿主／ベクター系における発現に適した制御配列に作動可能なように(operably)連結される。ベクターは、好ましくは、適当な宿主における形質転換および維持に必要な全ての機能をコードするものであり、ポリメラーゼ発現に対する選択可能なマーカーおよび／または制御配列をコードし得るものである。活性な組換え熱安定ポリメラーゼは、連続的に、または発現誘導後に形質転換宿主の培養によって産生することができる。活性熱安定ポリメラーゼは、宿主細胞から、またはそのタンパク質が細胞膜を通過して分泌される場合には培養培地から回収することができる。また、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス熱安定ポリメラーゼ発現は、E.coliにおいて、クローニングおよび発現中に厳しく制御されることも好ましい。本発明の実施に有用なベクターは、下記の制御上の特徴：（１）ポリメラーゼ遺伝子の出発点のすぐ隣にあるか、融合タンパク質としての転写開始のプロモーターまたは部位、（２）遺伝子発現をオンにしたリオフにしたりするのに用いることができるオペレーター、（３）翻訳増進のためのリボソーム結合部位、ならびに（４）安定性増進のための転写または翻訳終結部位のいくつかまたは全てを付与することによってカルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスポリメラーゼの制御発現の程度を変化させるべきである。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスポリメラーゼのクローニングおよび発現に使用するのに適当なベクターとしては、例えば、ファージおよびプラスミドが挙げられる。ファージとしては、例えば、ラムダgtII(Promega)、ラムダDash(Stratagene)、ラムダZap II(Stratagene)が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、pBR322、pBTac2(B oehringer Mannheim)、pBluescript(Stratagene)、pSP73(Promega)、pET3A(Rose nberg，上記同様，（1987）Gene 56：125-135)、pASK75(Biometra)、pDS56(Stub er，D.，Matile，H．およびGarotta G．(1990)Immunologlcal Methods，Letkovc s，I.およびPernis，B.編)およびpETllC(Studier，F.W．(1990)Methods in Enzy mology，185:60-89)。本発明によれば、プラスミド、特にpDS56の使用が都合がよいことがわかった。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するプラスミドpDS56は、pAR4と呼ばれる。形質転換、ファージ感染および細胞培養には標準プロトコルがある(Maniatis ら（1982）Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Lab oratory Press)。プラスミド形質転換に用いることができる多数のE.coli株の中で好ましい株としては、JM110(ATCC47013)、LE392pUBS520(Maniatisら，上記同様;Brinkmannら，（1989）Gene 85:109-114)、JM101(ATCC No.33876)、XL1(St ratagene)、およびRR1(ATCC No.31343)、BL21(DE3)pUBS520(Brinkmann，U.ら（1 989）Gene 85，109-114)およびBL21(DE3)plysS(Studier，F.W.ら，（1990）Meth ods in Enzymology，上記同様)が挙げられる。本発明によれば、E.coli株BL21(D E3)pUBS520の使用が都合がよいことがわかった。プラスミドpAR4で形質転換されたE.coli株BL21(DE3)pUBS520は、AR96(DSM No.11179)と呼ばれる。E.coli株XL1- Blue(Stratagene)およびER1458(Raleigh，E.A.ら，（1988）Nucleic Acids Rese arch 16:1563-1575)は、ラムダファージに対して使用され得る株に含まれ、Y108 9はラムダgt11溶原性に対して使用され得る。形質転換細胞は、好ましくは37℃ で増殖させ、クローニングされた遺伝子の発現はＩＰＴＧで誘導される。組換えＤＮＡポリメラーゼの単離は、標準技術によって行うことができる。E. coli抽出物からのＤＮＡポリメラーゼの分離および精製は、標準的な方法によって行うことができる。これらの方法としては、例えば、塩沈降および溶媒沈降のような溶解性を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の相違を利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷の相違を利用する方法、アフィニティクロマトグラフィーのような特異的相互作用を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーのような疎水性の相違を利用する方法、ならびに等電点電気泳動のような等電点の相違を利用する方法が挙げられる。本発明は、効率的にＲＮＡを転写し、ＲＮＡまたはＤＮＡを増幅するための改良方法を提供する。これらの改良は、熱活性ＤＮＡポリメラーゼについての従来知られていない特性の発見および応用によって達成される。本発明の熱安定酵素は、かかる酵素活性が必要であるか、望まれているあらゆる目的に対して使用され得る。特に好ましい実施態様においては、酵素は、ＰＣＲとして公知の核酸増幅反応を触媒する。核酸配列を増幅するためのこの方法は、米国特許第4,683,202号に開示されており、特許請求されている。ＰＣＲ核酸増幅法は、核酸または核酸の混合物に含まれる少なくとも１つの特異的核酸配列を増幅することを含み、２本鎖ＤＮＡを産生するものである。精製された状態または未精製の状態のあらゆる核酸配列は、その核酸配列が所望の特異的核酸配列を含むか、または含むと推測される場合、出発核酸として利用することができる。増幅される核酸はあらゆる起源から取得することができ、例えば、pBR322などのプラスミド、クローニングされたＤＮＡまたはＲＮＡ、細菌、酵母、ウイルス、オルガネラ、ならびに植物および動物などの高等動物を含むあらゆる起源由来の天然ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはin vitroで作られた核酸の調製物などから取得することができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、血液、絨毛膜絨毛などの組織材料、または羊膜細胞から種々の技術によって抽出され得る。例えば、Maniatisら，1982，molecular Cl oning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Har bor，ニューヨーク)pp.280-281を参照されたい。したがって、この方法は、例えば、ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡなどのＲＮＡを用い得るものであり、このＤＮＡまたはＲＮＡは、１本鎖または２本鎖であり得る。さらに、それぞれの１本の鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが利用され得る。ＤＮＡ内、またはＲＮＡからのターゲット配列の増幅を行うことによって、分析される核酸の試料中の特定の配列の存在を試験したり、特異的遺伝子をクローニングしたりすることができる。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来のＤＮＡポリメラーゼは、これらの方法に非常に有用である。その3'-5'エキソヌクレアーゼ活性のために、当技術分野における逆転写酵素としてより高い精度で産物を合成することができる。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来のＤＮＡポリメラーゼを用いることによって、試料中のＲＮＡターゲット分子の検出のための方法を簡略化および改良することもできる。これらの方法において、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来のＤＮＡポリメラーゼは、（ａ）逆転写、（ｂ）第２のｃＤＮＡ鎖合成、および所望により（ｃ）ＰＣＲによる増幅を触媒し得る。記載された方法におけるカルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来のＤＮＡポリメラーゼの使用により、以前、各ステップに対して異なる酵素を使用するために必要であった２組のインキュベーション条件の必要性が排除される。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来のＤＮＡポリメラーゼを用いることによって、ＲＮＡ逆転写および得られる相補的ＤＮＡの増幅を、高い特異性で、そして従来のＲＮＡクローニングおよび診断法よりも少ない工程で行うことができる。図面の簡単な説明図１は、マグネシウム塩およびマンガン塩の存在下におけるカルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来のＤＮＡポリメラーゼの相対的な逆転写酵素活性を示すものである。図２は、in situで行ったＤＮＡポリメラーゼアッセイの写真を示すものである。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来のＤＮＡポリメラーゼと参照ポリメラーゼの活性はin situで検出される。C.ヒドロゲノホルマンス由来のＤＮＡポリメラーゼの画分と参照酵素を活性化子ウシ胸腺ＤＮＡを含むＳＤＳ −ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動にかけた。電気泳動後、ＳＤＳを除去し、タンパク質を再生し、65℃で、マグネシウム塩、ｄＮＴＰおよびジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰの存在下にてインキュベートすることによってＤＮＡを合成した。核酸をナイロン膜にブロットし、新たに合成されたＤＮＡを化学発光反応によって検出した。図３は、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来のＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を示すものである。ＤＮＡポリメラーゼのアリコートを図に示した温度で30分間インキュベートし、次いで残存酵素活性を測定した。図４は、テルムスアクアティカス(Thermus aquaticus)およびピロコッカスウーゼイ(Pyrococcus woeseii)由来のＤＮＡポリメラーゼと比較したカルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来のＤＮＡポリメラーゼの3'-5-エキソヌクレアーゼ活性の分析を示すものである。この分析は、ｄＮＴＰの存在下または不存在下で行う。5'末端をジゴキシゲニンで標識した22merプライマーを、鋳型ＤＮＡの12bp5'突出部(overhang)を残したままの34mer鋳型ＤＮＡにアニールした。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス、テルムスアクアティカスおよびピロコッカスウーゼイ由来のＤＮＡポリメラーゼを、マグネシウムの存在下、ｄＮＴＰとともにまたはｄＮＴＰなしにこの基質とインキュベートした。産物を配列決定ゲル上で分離し、ナイロン膜にブロットして化学発光反応によって検出した。図５は、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスのポリメラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号７に示し、誘導されたＤＮＡポリメラーゼタンパク質のペプチド配列を配列番号８に示すものである。図６は、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス、アナエロセラムサーモフィラム(Anaerocelum thermophillum)、テルムスフィリホルミス(Thermus f iliformis)(Pacific Enzymes)およびテルムスサーモフィラス(Thermus the rmo philus)の熱安定ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性の比較を示すものである。同様の量（単位）のＤＮＡポリメラーゼを分析した。各酵素を、個々の酵素に対して最適な反応条件下で、ＤＮＡポリメラーゼ活性、Mg⁺⁺（５mM）の存在下での逆転写酵素活性、およびMn⁺⁺（１mM）の存在下での逆転写酵素活性について試験した。ＤＮＡ合成は、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチドの取込みによって測定した。逆転写活性に対するＤＮＡポリメラーゼの割合を比較するために、ＤＮＡポリメラーゼアッセイにおいて測定した相対光単位(relative light units，RLU )を100にセットした。逆転写酵素活性試験において測定されたＲＬＵは、ポリメラーゼ活性のパーセントで表される。実施例１エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ活性の検出エンドヌクレアーゼ活性の欠如：１μｇのプラスミドＤＮＡを、パラフィン油で上を被った50μｌの試験緩衝液中で、過剰の精製ＤＮＡポリメラーゼとともに 72℃にて４時間インキュベートする。非特異的エキソヌクレアーゼ活性の欠如：ラムダＤＮＡのEcoRI/HindIII-断片１μｇを、100μｌの試験緩衝液中、ｄＮＴＰの不存在下および存在下で（１mM の最終濃度）、過剰の精製ＤＮＡポリメラーゼとともに72℃で４時間インキュベートする。リボヌクレアーゼ活性の欠如：３μｇのＭＳ２ＲＮＡを、20μｌの試験緩衝液中で、過剰のＤＮＡポリメラーゼとともに72℃で４時間インキュベートする。続いて、ＭＯＰＳゲルにおける電気泳動によってＲＮＡを分析する（Maniatisら（1982）Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，ニューヨーク）。実施例２ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定ＤＮＡポリメラーゼ活性を、本質的にHoltke，H．J.，Sagner，G.，Kessler， C.およびSchmitz，G.（1992）Biotechniques 12，104-113に記載された方法にしたがって、合成ＤＮＡへのジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰの取込み、取り込まれたジゴキシゲニンの検出および定量によって測定した。反応は、１または２μｌの希釈（0.05Ｕ〜0.01Ｕ）ＤＮＡポリメラーゼならびに50mMのトリス−HCl、pH8.5 ；12.5mMの(NH₄)₂SO₄；10mMのKCl；5mMのMgCl₂；10mMの2-メルカプトエタノール；33μＭのｄＮＴＰ；200μｇ/mlのＢＳＡ；12μｇの子ウシ胸腺由来のＤＮＡアーゼＩ活性化ＤＮＡおよび0.036μＭのジゴキシゲニン−ｄＮＴＰを含む、50μ ｌの反応容積で行う。試料を72℃で30分間インキュベートし、反応を２μｌの0.5ＭＥＤＴＡを加えることによって停止させ、チューブを氷上に置く。８μｌの５Ｍ NaClおよび150 μｌのエタノール（予め-20℃に冷却したもの）を加えた後、氷上で15分間インキュベートすることによってＤＮＡを沈殿させ、13000×rpm、４℃で10分間遠心分離することによってペレットにする。ペレットを100μｌの70％エタノール（予め-20℃に冷却したもの）および0.2Ｍ NaClで洗浄し、再び遠心分離して減圧乾燥する。ペレットを50μｌのトリス−ＥＤＴＡ（10mM／0.1mM；pH7.5）に溶解する。５ μｌの試料を、白色マイクロウェルプレート（Pall Filtrationstechnik GmbH， Dreieich，FRG，製品番号SMO45BWP）の底に付けたナイロン膜のウェルにスポットする。70℃で10分間ベーキングすることによってＤＮＡを膜に固定する。ＤＮＡ添加ウエルを、100μｌの0.45μｍ−濾過１％ブロッキング溶液（100mMのマレイン酸、150mMのNaCl、１％（w/v）カゼイン、pH7.5）で満たす。下記のインキュベーション工程はすべて室温で行う。２分間インキュベートした後、適当な減圧連結管を用いて-0.4バールで溶液を膜に吸収させる。洗浄工程を繰り返した後、ウェルを、抗ジゴキシゲニン−ＡＰ,Fabフラグメント（Boehringer Mannheim ，FRG，No.1093274）を上記のブロッキング溶液で１：10000に希釈した希釈液100μｌで満たす。２分間インキュベートし、吸収させ、この工程を再度繰り返す。ウェルを、減圧下で２回、それぞれ200μｌの洗浄緩衝液１（100mMのマレイン酸、150mMのNaCl、0.3％(v/v)Tween^TM20（ポリ（オキシエチレン）_n− ソルビタン−モノラウレート）、pH7.5）で洗浄する。さらに２回減圧下で、それぞれ200μｌの洗浄緩衝液２（10mMのトリス−HCl、100mMのNoCl、50mMのMgCl₂ 、pH9.5）で洗浄した後、ウェルを洗浄緩衝液２で１：100に希釈した50μｌのCS PD^TM(Boehringer Mannheim．no:1655884)とともに５分間インキュベートする。このCSPD^TMは、アルカリホスファターゼに対する化学発光基質として作用するものである。溶液を膜に吸収させ、10分間インキュベートした後、ＲＬＵ／ｓ（相対光単位／秒）をルミノメーター(luminometer)、例えばMicroLumat LB96P（EG& G Berthold．Wiltbad，FRG）で検出する。 Taq ＤＮＡポリメラーゼの段階希釈を用いて、直線範囲が分析されるＤＮＡポリメラーゼの活性測定に対する標準として役立つ参照曲線を作製する。実施例３逆転写酵素活性の測定本質的に、反応混合物が下記の成分：１μｇのポリｄＡ−（ｄＴ）₁₅、33μＭのｄＴＴＰ、0.36μＭのジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、200mg／mlのBＳＡ、10mMのトリス−HCl、pH8.5、20mMのKCl、５mMのMgCl₂、10mMのＤＴＥおよび種々の量のＤＮＡポリメラーゼからなる以外はＤＮＡポリメラーゼ活性の測定について記載したようにしてアッセイを行う。用いられるインキュベーション温度は５０℃である。実施例４ in situＤＮＡポリメラーゼ活性の測定ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性についてのin situ ＰＡＧＥ分析を、本質的に、Spanos A.およびHubscher U.(1983)Methods in Enzymology 91，263- 277によって記載された方法にしたがって行った。オリジナルの方法に対するいくつかのマイナーであるが本質的な変更は、ＳＤＳ−変性ポリペプチドの再生をマグネシウムイオン（３mM）およびｄＡＴＰ（0.5〜１μＭ）の存在下で行って再折りたたみを助けることである。簡単に言えば、この方法は下記のとおりである：粗細胞抽出物またはゲル１ml当たり150μｇの活性化子ウシ胸腺ＤＮＡを含む変性８％ポリアクリルアミドゲル（積層ゲル５％アクリルアミド）上の精製試料からポリペプチドを分離した後、ゲルを、４回、それぞれ室温で30分間、適度に振盪しながら過剰の再生緩衝液（50mMのトリス−HCl、pH8.3、1mMのＥＤＴＡ、３mMの2-メルカプトエタノール、50mMのKCl、５〜10％グリセロール）中で洗浄してＳＤＳを除去する。次いで、ゲルを３mMのMgCl₂および0.5〜１μＭのｄＡＴＰを含む同緩衝液中で４℃で攪拌せずに一晩インキュベートする。翌日、最初の４回の洗浄を再生緩衝液を用いて繰り返す。ＳＤＳを除去し、タンパク質を再生した後、ゲルを、50mMのトリス−HCl、pH8.3、50mMのKCl、３mMのDTT、７mMのMg Cl₂、それぞれ12μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、８μＭのｄＴＴＰおよび４μＭのDig-ｄＵＴＰ、10％(vol/vol)グリセロールからなる反応混合物に移す。まず、ゲルを室温で１時間振盪しながらインキュベートし、次いで37℃、45 ℃、55℃、65℃、および72℃に段階的に加温する。各インキュベーション温度でＤＮＡ合成を60分間進行させた。ＤＮＡ合成後、ＤＮＡを接触ブロッティングまたはキャピラリーブロッティング（15×ＳＳＣ、Maniatisら，上記同様）によってナイロン膜（Boehringer Man nheim GmbH）に移し、架橋する。新たに合成されたジゴキシゲニン−標識ＤＮＡの検出は、前の項（ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定）に記載した手順にしたがった。分子量測定のために、公知の分子量のマーカーポリメラーゼ（例えば、クレノウ−ポリメラーゼ、Pol I、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、HIV RT、M-MuL V RT）を同ゲルの異なるレーンに加える。請求の範囲に記載されたＤＮＡポリメラーゼの本方法による分子量は100〜105 kDaである。実施例５ 3'-5'エキソヌクレアーゼ活性の検出 3'-5'エキソヌクレアーゼ活性は、通常、ＤＮＡポリメラーゼの「プルーフリーディング」または「編集」活性と呼ばれている。この活性は、Ａ型ポリメラーゼの大断片の小ドメインに位置する。この活性は、ヌクレオシド三リン酸の不存在下でＤＮＡのプライマー末端の3'末端からヌクレオチドを除去するものである（Kornberg A.およびBaker T.A.（1992）DNA Replication W.H.Freemann & Co mpany，ニューヨーク）。このヌクレアーゼ作用は、デオキシヌクレオシド三リン酸が鋳型に適合し、ポリマーに取り込まれ得る場合、そのデオキシヌクレオシド三リン酸によって抑制される。請求の範囲に記載したＤＮＡポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の不存在下もしくは存在下における鋳型ＤＮＡ、またはデオキシリボヌクレオシド三リン酸の不存在下もしくは存在下におけるＤＮＡ断片上にアニールされた5'-ジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドの分解または短縮化として測定され得る。ジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドの分解：この反応混合物は、ｄＮＴＰ濃度が12.5μＭまで低減されており、活性化子ウシ胸腺ＤＮＡが500fMolプライマーまたは鋳型／プライマー混合物に置換されている以外は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定についてのもの（50mMのトリス−HCl、pH8.4；12.5mMの(NH₄)₂SO₄ ；10mMのKCl；５mMのMgCl₂；10mMの2-メルカプトエタノール）と本質的に同じである。プライマー配列は、配列番号８：Dig-GCATGGATCCCACTGCCCAGGG(5'-3') である。このプライマーは、種々の12bp５プライムオーバーハングの鋳型分子とアニールされる。典型的に0.1単位のＤＮＡポリメラーゼ試料を、Perkin Elmer サーマルサイクラー(thermal cycler)中、合計反応容量10μｌで72℃にて30分間インキュベートする。反応を等容量のホルムアミド−緩衝液（98％ホルムアミド；10mMのＥＤＴＡ；ブロムフェノールブルーおよびキシレンシアノール）を加えることによって停止させ、95℃にて10分間加熱することによって変性させる。試料を、氷上ですばやく冷却して、20％変性ポリアクリルアミド／尿素配列決定ゲルにのせる。電気泳動を60℃、2000Ｖで2.5時間行う。分離後、ＤＮＡを、30分間の接触ブロッティングによって正荷電ナイロン膜（ Boehringer Mannheim）上に移す。ＤＮＡを120mジュールのＵＶ照射(Strat alinker，Stratagene)によって膜に架橋する。膜を、ブロッキング溶液（100mM のマレイン酸、150mMのNaCl、1％(w/v)のカゼイン、pHは1ＭのNaOHを用いて7.5 に調節）で室温にて少なくとも30分間ブロックし、ジゴキシゲニン−標識プライマーＤＮＡをブロッキング溶液で１：10000に希釈した抗ジゴキシゲニン−AP.Fa b−フラグメント(Boehringer Mannheim，FRG，No.1093274)で検出する（室温で3 0分間）。洗浄緩衝液（100mMのマレイン酸、150mMのNaCl、0.3％(v/v)のTween（商品名）20（ポリ（オキシエチレン）_n−ソルビタン−モノラウレート）、pH7.5 ）で３〜４回（それぞれ10〜15分間）洗浄することによって過剰の非結合抗体を除去する。膜を、10mMのトリス−HCl、100mMのNaCl（pH9.5）を含む緩衝液に移し、さらに室温で10〜15分間の洗浄を２回行う。最後に、膜を、CDP-Star（商品名）(Boehringer Mannheim)の１：10000希釈溶液で浸漬する。CDP-Star（商品名）は、アルカリホスファターゼに対する化学発光基質として作用する。次いで、膜を濾紙（Whatman 3MM）に移して過剰の液を除去し、２枚の透明なオーバーヘッドホイルの間に入れて、Ｘ線フィルム（化学発光検出フィルム、Boeh ringer Mannheim）に５〜10分間曝す。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を、対照（ポリメラーゼを添加しないもの）と比べたプライマーの分解または短縮化によって検出する。陰性および陽性対照として、テルムス・アクアティカス（3'−5'エキソヌクレアーゼ活性無し）およびピロコッカス・ウーゼイ（3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を示す）由来のＤＮＡポリメラーゼが含まれている。デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下または不存在下でのＤＮＡ断片の分解：Chyポリメラーゼの段階希釈液を、１μｇのＤＮＡ分子量マーカーIII(Boehrin ger Mannheim)とともに、それぞれ１mMのｄＮＴＰの存在下または不存在下で、パラフィンで上を被った50μｌの下記のインキュベーション緩衝液：50mMのトリス−HCl、pH7.8；10mMのMgCl₂；7mMの2-メルカプトエタノール中、70℃で２時間インキュベートした。ＤＮＡ断片を臭化エチジウムを含む１％アガロースゲル上で分離した。ｄＮＴＰの不存在下では、ＤＮＡ断片のスメアが検出されるか、またはＤＮＡは検出することができず、ｄＮＴＰの存在下ではＤＮＡ断片は分解されないままであった。実施例６カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニングカルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスからの染色体ＤＮＡの調製カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスのバイオマス0.8ｇを、20mlの１Ｍ KClに懸濁し、遠心分離した。次いで、ペレットを4.8mlのSET-緩衝液（150mM のNaCl、15mMのEDTA、pH8.0、60mMのトリス−HCl、pH8.0、50μｇ/μｌのＲＮアーゼＡ）に再懸濁し、その後１mlの20％ＳＤＳおよび50μｌのプロテイナーゼＫ（10mg／ml）を加えた。混合物を37℃で45分間維持した。フェノールおよびクロロホルムによる抽出後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、H₂Oに溶解した。このようにして、約4.1mgのＤＮＡが得られた。ＰＣＲによる特異的ＤＮＡの増幅ＰＣＲ技術によるカルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスのＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の増幅のために、２つの混合オリゴヌクレオチド（プライマー１および２）を、Braithwaite D.K.およびIto J.（1993）Nucl.Acids Res.21，787-802に記載されたようにして、ファミリーＡＤＮＡポリメラーゼの保存領域に基づいて設計した。配列番号１プライマー１：5'-CCN AAY YTN CAR AAY ATH-3' 配列番号２：プライマー２：5'-YTC RTC RTG NAC YTG-3' ＰＣＲ増幅を、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来の750ngのゲノムＤＮＡ、10mMのトリス−HCl、pH8.8、2.5mMのMgCl₂、50mMのKCl、200μＭのｄＮＴＰ、100pmolの各プライマーおよび2.5単位のTaqポリメラーゼ（Boehringe r Mannheim GmbH，FRG）を含む100μｌの緩衝液中で行った。ターゲット配列を、まず、95℃で２分間変性させ、次いで95℃で0.5分間、47℃で１分間および72 ℃で２分間のサイクルを30サイクル行うことにより増幅させた。熱サイクル反応は、Perkin Elmer GenAmp9600サーマルサイクラーで行った。アガロースゲル電気泳動により、約600塩基対の断片が特異的に増幅されていることが示された。この断片をpCR^TMIIベクター(Invitrogen)中にライゲートし、サイクル配列決定によって配列を決定した。このヌクレオチド配列から推定したアミノ酸配列は、他の公知のＤＮＡポリメラーゼのものと非常に類似しており、プライマー３および４をインバース(inverse)ＰＣＲ用に設計することができた。配列番号３プライマー３：5'-GGG CGA AGA CGC TAT ATT CCT GAG C-3' 配列番号４：プライマー４：5'-GAA GCC TTA ATT CAA TCT GGG AAT AAT C-3' インバースＰＣＲは、本質的に、Triglia T.ら(1988)Nucleic Acids Res．16, 8186に記載されたようにして行った。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来の５μｇのゲノムＤＮＡを、製造業者の仕様書（Boehringer Mannheim GmbH）にしたがってEcoRIで切断し、等容量のフェノール／クロロホルム混合物で処理した。水相を除去し、エタノールで沈殿させたＤＮＡを遠心分離によって回収した。環化のために、消化ＤＮＡをライゲーション緩衝液（Boehringer Mannheim Gm bH，FRG）で50ng／μｌの濃度まで希釈した。ライゲーション反応を、T4 ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim GmbH，FRG）を0.2単位／μｌの濃度まで加えることによって開始させ、反応を15℃で15時間進行させた。次いで、ライゲートされたＤＮＡをエタノールで沈殿させ、遠心分離によって回収した。ＰＣＲを、50mMのトリス−HCl、pH9.2、16mMの(NH₄)₂SO₄、2.25mMのMgCl₂、２％(v/v)ＤＭＳＯ、0.1％(v/v)のTween（商品名）20、上記のようにして得られた 700ngの環化ＤＮＡ、50pmolの各プライマー、500μＭのｄＮＴＰおよび0.75μｌの酵素混合物(Expand Long Template PCR System，Boehringer Mannheim GmbH) を含む50μｌの緩衝液中で行った。サイクル条件は下記のとおりである：１× 92℃、２分間の鋳型の変性アガロースゲル電気泳動によって、7000塩基対長のＤＮＡ断片が特異的に増幅されていることがわかった。このＤＮＡ断片をpCR(商品名)IIベクター(Invitrog en)にライゲートし、配列決定した。この配列から推定して、ポリメラーゼ領域の、5'末端および3'末端それぞれをコードするプライマ−５および６を設計することができた。プライマー５はNcoI部位を含んでおり、プライマー６はBamHI部位を含んでいた。ＰＣＲを、鋳型としてカルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来の750 ngのゲノムＤＮＡを用いて、上記（インバースＰＣＲ）と同じ条件下で行った。配列番号５：プライマー５：5'-CGA ATT CAA TCC ATG GGA AAA GTA GTC CTG GTG GAT-3' 配列番号６：プライマー６：5'-CGA ATT CAA GGA TCC TTA CTT CGC TTC ATA CCA GTT-3' クローニングおよび発現ＰＣＲ産物を、0.8％アガロースゲルにおける20μｌのＰＣＲ混合物の電気泳動によって精製した。2.496kbのポリメラーゼコード領域のバンドを、フェノール抽出によってアガロースから精製した。次いで、ＤＮＡをクロロホルムで処理して、エタノールで沈殿させた。ペレットを再懸濁し、製造業者の仕様書（Boeh ringer Mannheim GmbH）にしたがってNcoIおよびBamHIで消化して、方向性のある(directional)クローニングのための付着末端を得た。ＤＮＡを、NcoIおよびB amHIで消化した発現ベクターpDS56（Stuber D.，Matile H.およびGarotta G.（1 990）Immunological Methods，Letkovcs，IおよびPernis，B.編）にライゲートした。ライゲートした産物を形質転換によってE.coli株BL21(DE3)pUBS520(Brink mann U.ら（1989）Gene 85，109-114)に導入した。形質転換体を、100μｇ/mlのアンピシリンおよび50μｇ/mlのカナマイシンを含むL-寒天上で増殖させて組換え体を選択した。コロニーを拾って、100μｇ/mlのアンピシリンおよび50μｇ/ml のカナマイシンを含むL-ブロス中で増殖させ、プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解によって調製した。プラスミドをBamHIによる消化によって、挿入についてスクリーニングした。挿入物を含むそれらの組換え体を、アンピシリンおよびカナマイシンを含むL-ブロス中で増殖させ、１mMのＩＰＴＧによる指数関数的に増殖する培養の誘導によって好熱性ＤＮＡポリメラーゼの発現について試験し、上記（ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定）のようにしてＤＮＡポリメラーゼ活性について熱処理抽出物をアッセイした。カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンス由来のＤＮＡポリメラーゼを発現する組換え体が得られた。この株は、E.coli AR9 6(DSM No.11179)およびプラスミドpAR4と命名した。

【手続補正書】【提出日】平成１１年５月２５日（１９９９．５．２５）【補正内容】請求の範囲１．ＤＮＡの鋳型誘導重合を触媒し、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、マグネシウムイオンの存在下およびマンガンイオンの不存在下で逆転写酵素活性を有する、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスから取得可能な精製された熱安定ＤＮＡポリメラーゼであって、前記ポリメラーゼのマグネシウムイオン依存性逆転写酵素活性が、前記ポリメラーゼのマンガン依存性逆転写酵素活性の少なくとも100％である、前記ポリメラーゼ。２．前記ポリメラーゼがMn²⁺依存性である逆転写酵素活性を示す、請求項１に記載のポリメラーゼ。３．前記ポリメラーゼのマグネシウムイオン依存性逆転写酵素活性が、前記ポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性の少なくとも100％である、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリメラーゼ。４．前記ポリメラーゼが、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によって測定した場合、約100〜105kDaの見掛けの分子量を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリメラーゼ。５．前記ポリメラーゼが、E.コリBL21(DE3)pUBS520pAR4、DSM No.11179から取得可能である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリメラーゼ。６．カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスから取得可能な請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリメラーゼをコードする、単離されたＤＮＡ配列。７．微生物カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスのポリメラーゼ活性をコードすることが可能な組換えＤＮＡ配列。８．配列番号７に示された式によって表される単離されたＤＮＡ配列。９．請求項６〜８のいずれか１項に記載された単離されたＤＮＡ配列を含むベクター。１０．前記ベクターが、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するプラスミドpDS56である、請求項９に記載のベクター。１１．下記の特徴：（１）転写開始のプロモーターまたは部位（２）遺伝子発現をオンにしたリオフにしたりするのに用いることができるオペレーター（３）翻訳増進のためのリボソーム結合部位（４）転写または翻訳終結部位のいくつかまたは全てを付与するものである、請求項９または１０に記載のベクター。１２．請求項９〜１１のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された微生物宿主。１３．前記形質転換体が、E.コリBL21(DE3)pUBS520pAR4、DSM No.11179である、請求項１２に記載の微生物宿主。１４．（ａ）天然株カルボギシドテルムスヒドロゲノホルマンスを培養する工程、（ｂ）天然株の細胞を緩衝液に懸濁する工程、（ｃ）細胞を破壊する工程、（ｄ）１以上のセファロースカラムの使用を含むクロマトグラフィー工程によってＤＮＡポリメラーゼを精製する工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼの調製方法。１５．請求項９〜１１のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された組換え体E.コリ株を増殖させ、ＤＮＡポリメラーゼを精製し、単離する工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼの調製方法。１６．請求項１〜５のいずれか１項に記載の熱安定ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、ＤＮＡの増幅方法。１７．請求項１〜５のいずれか１項に記載の熱安定ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、第２のｃＤＮＡクローニングおよびＤＮＡ配列決定方法。１８．請求項１〜５のいずれか１項に記載の熱安定ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、ＤＮＡ標識方法。１９．請求項１〜５のいずれか１項に記載の熱安定ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、逆転写方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/12 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＺＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (72)発明者スヴェトリヒニー，ヴィタリードイツ連邦共和国ディー―95448 ベイレウス，ウォーメンステイナヒャーシュトラーセ 91ジー (72)発明者シュミッツ―アゲグイアン，ガドラムドイツ連邦共和国ディー―82347 ベルンリエド，ウェテルステインシュトラーセ３ (72)発明者ライセル，アストリッドドイツ連邦共和国ディー―82387 アントドルフ，シュライエル―ヴェグ 20 (72)発明者アンジェリア，ベルンハードドイツ連邦共和国ディー―83024 ローゼンハイム，シューツェンシュトラーセ 20 (72)発明者エベンビシュラー，クリスティンドイツ連邦共和国ディー―82387 アンドルフ，ドルフシュトラーセ５ (72)発明者ロウェ，フランクドイツ連邦共和国ディー―82396 フェアル，シーシュトラーセ 16 (72)発明者ボンク―オスモロヴスカヤ，エリザヴェータロシア連邦国 117192 モスクワ，33―２ ―60，ロモノソブスキーアベニュー

Claims

【特許請求の範囲】１．ＤＮＡの鋳型誘導重合を触媒し、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、マグネシウムイオンの存在下および実質的にマンガンイオンの不存在下で逆転写酵素活性を有する、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスから取得可能な精製された熱安定ＤＮＡポリメラーゼ。２．前記ポリメラーゼがMn²⁺依存性である逆転写酵素活性を示す、請求項１に記載のポリメラーゼ。３．前記ポリメラーゼのマグネシウムイオン依存性逆転写酵素活性が、該ポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性よりも高い、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリメラーゼ。４．前記ポリメラーゼのマグネシウムイオン依存性逆転写酵素活性が、該ポリメラーゼのマンガン依存性逆転写酵素活性よりも高い、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリメラーゼ。５．前記ポリメラーゼが、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によって測定した場合、約100〜105kDaの見掛けの分子量を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリメラーゼ。６．前記ポリメラーゼが、AR96と称する株、E.coli BL21(DE3)pUBS520から取得可能である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリメラーゼ。７．カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスから取得可能な請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリメラーゼをコードする、単離されたＤＮＡ配列。８．微生物カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスのポリメラーゼ活性をコードすることが可能な組換えＤＮＡ配列。９．配列番号７に示された式によって表される単離されたＤＮＡ配列。１０．請求項７〜９のいずれか１項に記載された単離されたＤＮＡ配列を含むベクター。１１．前記ベクターが、カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するプラスミドpDS56であり、pAR4と称するものである、請求項１０に記載のベクター。１２．下記の特徴：（１）転写開始のプロモーターまたは部位（２）遺伝子発現をオンにしたリオフにしたりするのに用いることができるオペレーター（３）翻訳増進のためのリボソーム結合部位（４）転写または翻訳終結部位のいくつかまたは全てを付与するものである、請求項１０または１１に記載のベクター。１３．請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された宿主微生物。１４．前記形質転換体が、AR96と称する株、E.coli BL21(DE3)pUBS520由来のものである、請求項１３に記載の宿主微生物。１５．（ａ）天然株カルボキシドテルムスヒドロゲノホルマンスを培養する工程、（ｂ）天然株の細胞を緩衝液に懸濁する工程、（ｃ）細胞を破壊する工程、（ｄ）１以上のセファロースカラムの使用を含むクロマトグラフィー工程によってＤＮＡポリメラーゼを精製する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼの調製方法。１６．請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された組換え体E.coli株を増殖させ、ＤＮＡポリメラーゼを精製し、単離する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼの調製方法。１７．請求項１〜６のいずれか１項に記載の熱安定ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、ＤＮＡの増幅方法。１８．請求項１〜６のいずれか１項に記載の熱安定ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、第２のｃＤＮＡクローニングおよびＤＮＡ配列決定方法。１９．請求項１〜６のいずれか１項に記載の熱安定ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、ＤＮＡ標識方法。２０．請求項１〜６のいずれか１項に記載の熱安定ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、逆転写方法。