NO323846B1 - Renset termostabil DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans, isolert DNA-sekvens som koder for denne, vektor inneholdende sekvensen, mikrobiell vert som omfatter vektoren, fremgangsmate for fremstilling av DNA-polymerasen, fremgangsmate for amplifisering av DNA, DNA-kloning og DNA-sekvensering, DNA-merking og reverstranskripsjon ved anvendelse av polymerasen. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et termostabilt enzym som er en DNA-polymerase frembrakt fra Carboxydothermus hydrogenoformans. Videre angår oppfinnelsen området molekylærbiologi og frembringer forbedrede fremgangsmåter for replika-sjon og amplifikasjon av deoksyribonuklein {DNA) og ribo-nukleinsyre {RNA)-sekvenser. I en foretrukken utførelsesform frembringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å syntetisere en komplementær DNA-kopi fra et RNA-templat med en termoreaktiv DNA-polymerase. I et annet aspekt frembringer oppfinnelsen fremgangsmåter for amplifisering av DNA-segment fra et RNA-eller DNA-templat ved anvendelse av en termostabil DNA-polymerase (RT-PCR eller PCR).

Varmestabile DNA-polymeraser (EC 2.7.7.7. DNA-nukleotidyltransferase, DNA-styrt) er blitt isolert fra et antall termofile organismer (f.eks.: Kaledin et al. (1980). Biokimiya 45, 644-651; Kaledin et al. (1981} Biokimiya 46, 1247-1254; Kaledin et al. (1982) Biokimiya 47, 1515-1521; Ruttimann et al. (1985) Eur. J. Biochem. 149, 41-46; Neuner et al. (1990) Arch. Microbiol. 153, 205-207), WO9203556 og WO9610640.

For noen organismer er polymerasegenet blitt klonet og uttrykt (Lawyer et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 6427-6437; Engelke et al. (1990) Anal. Biocehm. 191, 396-400; Lundberg et al. (1991) Gene 108, 1-6; Perler et al. (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89, 5577).

Termofile DNA-polymeraser blir et stadig mer viktig verktøy ved anvendelse innen molekylærbiologi og det er en økende interesse for å finne nye polymeraser som har mer egnede egenskaper og aktiviteter for anvendelse ved diag-nostisk påvisning av RNA og DNA, genkloning og DNA-sekvensering. For tiden er de mest anvendte termofile DNA-polymeraser for disse hensikter fra Thermus-arter som Taq-polymerase fra T. aquaticus (Brock et al. (1969) J. Bacteriol. 98, 289-297).

Revers transkripsjon utføres vanligvis med virale revers transskriptaser som enzymet isolert fra Avian myeloblastosevirus eller Moloney murin leukemivirus, som er aktive i nærvær av magnesiumioner men har de ulemper at de har RNase H-aktivitet, som ødelegger templat-RNA under revers transkripsjonsreaksjonen og har et temperaturoptimum ved henholdsvis 42 °C eller 37 °C.

Alternative fremgangsmåter er beskrevet som anvender revers transkriptaseaktiviteten til DNA-polymeraser fra termofile organismer som er aktive ved høyere temperaturer. Revers transkripsjon ved høyere temperaturer er en fordel for å overkomme sekundærstrukturer av RNA-templatet som kan resultere i prematur terminering av produktet. Termostabile DNA-polymeraser med revers transkriptaseaktivitet isoleres vanligvis fra termusarter. Disse DNA-polymeraser viser imidlertid revers transkriptaseaktivitet bare i nærvær av manganioner. Disse reaksjonsbetingelser er suboptimale fordi polymerasen kopierer templat-RNA med lav nøyaktighet ved nærvær av manganioner.

Et annet trekk ved de vanlig anvendte revers transskriptaser er at de ikke inneholder 3<*->5<*> -eksonukleaseaktivitet. Derfor kan ikke feilinkorporerte nukleotider bli fjernet og dermed kan cDNA-kopiene fra templat-RNA'et inneholde en betydelig grad av mutasjoner.

Det er derfor ønskelig på utvikle en revers transkriptase

• som virker ved høyere temperaturer for å overkomme sekundærstrukturer i templatet for å unngå prematur terminering av reaksjonen og å sikre fremstilling av

cDNA uten utelatelser

•som er aktiv i nærvær av manganioner for å fremstille cDNA fra RNA-templater med høyere nøyaktighet og • som har 3'-5<*->eksonukleaseaktivitet for å fjerne feilinkorporerte nukleotider før fortsettelsen av DNA-syntesen og for å fremstille et produkt med en lav mutasjonsfrekvens.

Foreliggende oppfinnelse adresserer behovet og frembringer en varmestabil DNA-polymerase som er aktiv ved høye temperaturer og som har revers transkriptaseaktivitet i nærvær av magnesiumioner og som har 3'-5'-

eksonukleaseaktivitet.

Det er et formål med denne oppfinnelse å frembringe et polymeraseenzym (EC 2.7.7.7.)/ kjennetegnet ved at det har revers transkriptaseaktivitet i nærvær av magnesiumioner så vel som i nærvær av manganioner. Et annet aspekt av oppfinnelsen omfatter en DNA-polymerase isolert Carboxydothermus hydrogenoformans (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, DSM; nr. 8979). Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen frembringer en DNA-polymerase som har revers transkriptaseaktivitet i nærvær av magnesiumioner og i vesentlig fravær av manganioner. Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen omfatter en DNA-polymerase som har en molekylvekt på ca. 100 til 105 kDa bestemt ved in situ PAGE-analyse. Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen omfatter en revers transkriptase som er termostabil. Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen omfatter en DNA-polymerase som har 3<*->5<*->eksonukleaseaktivitet. Et ytterligere aspekt-av oppfinnelsen omfatter en rekombinant DNA-sekvens som koder for DNA-polymeraseaktiviteten fra mikroorganismen Carboxydothermus hydrogenoformans. I et beslektet aspekt fremstilles DNA-sekvensen som SEQ ID NO: 7. Et annet beslektet aspekt av oppfinnelsen omfatter en rekombinant DNA-sekvens som i alt vesentlig koder for aminosyrerestene 1 til 831. Ytterligere et aspekt av oppfinnelsen omfatter et rekombinant DNA-plasmid som omfatter DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen innføyd i plasmid-vektorer og som kan anvendes for å drive ekspresjonen av den termostabile DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans i en vertscelle transformert med plasmidet. Ytterligere et aspekt av oppfinnelsen omfatter en rekombinant stamme som omfatter vektoren pDS56 som bærer Carboxydothermus hydrogenoformans DNA-polymerasegenet og betegnes pAR 4. E. coli-stammen (BL21)(DE3)pUBS520) som bærer plasmidet pAR4 ble deponert ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig DSM nr. 11179) og er betegnet AR96.

Med henvisning til en peptidkjede som omfattes av en serie aminosyrer "vesentlige eller effektive" i henhold til en liste som ikke gir noen alternativer innenfor seg selv, inkluderer vi i den referanse en hvilken som helst versjon av peptidkjeden som bærer substitusjoner med en eller flere aminosyrer på en slik måte at den totale struktur og den totale funksjon av det konstruerte protein av den peptidkjede i hovedsak er den samme som - eller ikke påviselig forskjellig fra - den usubstituerte versjonen. F.eks. er det vanligvis mulig å bytte alanin og valin uten store endringer av proteinegenskaper, spesielt dersom det forandrede stedet eller stedene er ved posisjoner som ikke er kritiske for morfologien av det foldede protein.

DNA-polymerasen er "termostabil" betyr at den er stabil overfor varme og fortrinnsvis aktiv ved høyere temperaturer, spesielt i høye temperaturer som anvendes for denaturering av DNA-tråder. Mer spesielt er de termostabile DNA-polymeraser ikke vesentlig inaktive ved de høye temperaturer som anvendes ved polymerasekjedereaksjoner.

Betegnelsen "revers transskriptase" beskriver en klasse polymeraser karakterisert som RNA-avhengig DNA-polymeraser. Alle kjente revers transskriptaser krever en primer for å syntetisere et DNA-transkript fra en RNA-templat. Revers transkriptase er historisk blitt anvendt først og fremst for å transkribere mRNA til cDNA som deretter kan klones inn i en vektor for videre manipulering.

Andre definisjoner er anvendt på en måte som er konsistent innen teknikken.

CarJboxydotnerjnus hydrogenoformans ble isolert fra en varm kilde i Kamchata ved V. Svetlichny. En prøve av Carboxydothermus hydrogenoformans ble deponert ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) under betegnelser ifølge budapesttraktaten og fikk aksesjonsnr.DSM 8979. Den termostabile polymerase isolert fra Carjboxydothermus hydrogenoformans har en molekylvekt på 100 til 105 kDa og bibeholder mer enn 60 % av sin initielle aktivitet etter oppvarming til 95 °C i 30 minutter. Det termostabile enzym har en 5'-3'-polymeraseaktivitet, en 3<*->5'-eksonukleaseaktivitet, en 5'-3<*->eksonukleaseaktivitet og en revers transkriptaseaktivitet som er Mg<++->avhengig. Polymerasen ifølge oppfinnelsen har revers transkriptaseaktivitet i nærvær av magnesiumioner og i vesentlig fravær av manganioner. Det termostabile enzym kan være nativt eller rekombinant og kan anvendes ved første eller andre cDNA-trådsyntese, ved cDNA-kloning, DNA-sekvensering, DNA-merking og DNA-amplifisering.

For gjenvinning av det native protein kan Carboxydothermus hydrogenoformans dyrkes ved hjelp av en hvilken som helst egnet teknikk, slik som teknikken beskrevet av Svetlichny et al. (1991) System. Appl. Microbiol., 14, 205-208. Etter cellevekst er en foretrukken fremgangsmåte for isolering og rensing av enzymet oppnådd ved hjelp av følgende flertrinnsfremgangsmåte: Cellene tines, suspenderes i buffer A(40 mM Tris-HCl,pH 7,5. 0,1 mM EDTA, 7 mM 2-merkaptoetanol, 0,4 M NaCl, 10 mM Pefabloc) og lyseres ved to gangers passasje gjennom en Gaulin-homogenisator. Råekstraktet klares ved sentrifugering, supernatanten dialyseres mot buffer B (40 mM Tris-HCl, pH 7,5. 0,1 mM EDTA, 7 raM 2-merkaptoetanol. 10 % glyserol) og anbringes på en kolonne fylt med Heparin-Sepharosé (Pharmacia). I hvert tilfelle er kolonnene ekvilibrert med utgangsløsningsmiddelet og etter applisering av prøven vasket med tre ganger sitt volum med dette løsningsmiddel. Eluering av den første kolonne utføres med en lineær gradient fra 0 til 0,5 M NaCl i buffer B. Fraksjonene som viser polymeraseaktivitet samles og ammoniumsulfat tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 20 %. Denne løsningen appliseres på en hydrofob kolonne inneholdende Butyl-TSK-Toyopearl (TosoHaas). Denne gang elueres kolonnen med en fallende gradient fra 20 til 0 % ammoniumsulfat. Oppsamlingen inneholdende aktiviteten dialyseres og overføres igjen til en kolonne denne gang med DEAE-Sepharose (Pharmacia), og elueres med en lineærgradient fra 0-0,5 M NaCl i buffer B. Den fjerde kolonne inneholder Tris-Acryl-Blue (Biosepra) og elueres som i det foregående tilfelle. Til slutt dialyseres de aktive fraksjoner mot buffer C 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA. 7,0 mM 2-merkaptoetanol, 100 mM NaCl. 50 % glyserol.

Isolering av rekombinant DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans kan utføres etter den samme protokoll eller med andre alminnelige anvendte prosedyrer.

DNA-polymeraseaktivitet ble målt ved inkorporering av digoxigenin-merket dUTP i det syntetiserte DNA og påvisning og kvantifisering av det inkorporerte digoxigenin ble i hovedsak utført ifølge fremgangsmåten beskrevet i H5ltke, H.-J.; Sagner, G; Kessler, C, og Schmitz, G. (1992) Biotechniques 12, 104-113.

Bestemmelse av revers transkriptaseaktivitet utføres i hovedsak som beskrevet for bestemmelse av DNA-polymeraseaktivitet, med unntak av at reaksjonsblandingen består av bestanddelene beskrevet ved eksempel 3. In situ PAGE-analyse av polymeraseaktivitet og revers transkriptaseaktivitet ble i hovedsak utført ifølge fremgangsmåten beskrevet av Spanos A. og Hilbscher U. ((1983) Methods in Enzymology 91, 263-277). Noen små, men viktige endringer til den originale fremgangsmåten er at renatureringen av SDS-denaturerte polypeptider utføres i nærvær av magnesiumioner (3 mM) og dATP (0,5-1 uM) for å avhjelpe refolding. 3 '-5'-eksonukleaseaktivitet refereres vanligvis til som "korrekturlesende" ellér"editerende"-aktivitet av DNA-polymeraser. Den er plassert i det lille domene av det store fragmentet av type A-polymeraser. Denne aktivitet fjerner feilparede nukleotider fra den 3'-enden av primer terminus av DNA i fravær av nukleosidtrifosfater (Kornberg A. og Baker T.A. (1992) DNA Replication W.H. Freemann & Company, New York). Denne nukleasevirkning undertrykkes av deoksynukleotidtrifosfater hvis de passer til templatet og kan inkorporeres i polymeren.

Den 3'-5'-eksonukleaseaktivitet til DNA-polymerasen ifølge oppfinnelsen kan måles som degradering eller forkorting av et 5'-digoxygenin-merket oligonukleotid annealert til templat-DNA i fravær eller nærvær av doksyribonukleosidtri-fosfater eller på DNA-fragmenter i fravær eller nærvær av deoksyribonukleotidtrifosfater.

CarJboxydotherraus hydrogenoformans DNA-polymerase er den første DNA-polymerase isolert fra termofile eubakterier med en høyere aktivitet i nærvær av magnesiumioner enn i nærvær av manganioner som vist i fig. 1. Sammenlignet med DNA-polymeraseaktiviteten er revers transkriptaseaktiviteten i nærvær av magnesium relativt høy. Dette er vist, i sammenligning med DNA-polymeraser fra T. filiformis, A. thermophilum og den mest vanlige anvendte DNA-polymerase for revers transkripsjon T. thermophilus i fig. 6. Revers transkriptaseaktiviteten avhengig av magnesium er fordelaktig fordi DNA-polymeraser syntetiserer DNA med høyere nøyaktighet i nærvær av magnesium enn i nærvær av mangan (Beckmann R.A. et al. (1985) Biochemistry 24, 5810-5817; Ricchetti M. og Bue. H.

(EMBO J. 12, 387-396). DNA-syntese med lav nøyaktighet medfører sannsynligvis muterte kopier av originaltemplatet. Mn<2+->ioner er i tillegg blitt innblandet i en økt grad av RNA-degradering, spesielt ved høyere temperaturer og dette kan medføre syntese av kortere produkter ved den reverse tran-skripsjonsreaksjon.

DNA-sekvensen (SEQ ID NO: 7) til Carboxydothermus hydrogenoformans- polymerase og den utledete aminosyresekvens til dette enzym er vist i fig. 5. Molekylvekten utledet fra sekvensen er 94348 Da, imidlertid har Carboxydothermus hydrogenoformans- polymerase en elektroforetisk mobilitet ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese høyere enn E. coli pol 1(109 kDa) og en lavere mobilitet enn Taq-polymerase (94 kDa) og Klenow-fragment (76 kDa) som vist i fig. 2. Ved sammenligning av migreringsegenskapene til Taq- og E. coli DNA-polymerase med polymeraser fra Carboxydothermus hydrogenoformans-polymerase kan en molekylvekt på 100 til 105 kDa utledes. Siden CarJboxydothermus hydrogenoformans-polymerase isolert fra den native stammen har de samme migreringsegenskaper som det rekombinante enzym må den "langsommere" migrering under SDS-gelelektroforese heller være en egenskap av enzymet enn et kloningsartefakt. En mulig forklaring på dette fenomen kan være at dette enzym som er avledet fra en termofil organisme har en svært stabil struktur som ikke er fullstendig utfoldet under de anvendte standard denatureringsbetingelser.

Fremstillingen av en rekombinant form av CarJboxydothermus hydrogenoformans DNA-polymerase inkluderer vanligvis de følgende trinn: kromosomalt DNA fra Carboxydothermus hydrogenoformans isoleres ved å behandle cellene med detergent f.eks. SDS og en proteinase f.eks. Proteinase K. Løsningen ekstraheres med fenol og kloroform og DNA<*>et renses ved felling med etanol. DNA'et løses i Tris/EDTA-buffer og genet som koder for DNA-polymerasen amplifiseres særskilt ved PCR-teknikken ved hjelp av to blandede oligonukleotider (primer 1 og 2). Disse oligonukleotider, beskrevet ved SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2, ble konstruert på bakgrunn av konserverte regioner i familie A DNA-polymeraser som publisert av Braithwaite D. K. og Ito J., 1993, Nucl. Acids Res. vol. 21, s' •787-802. Det særskilt amplifiserte fragment ligeres i en vektor, fortrinnsvis "pCR II"-vektor (Invitrogen) og sekvensen bestemmes ved syklisk sekvensering. Fullstendig isolering av koderegionen og flankesekvensene til DNA-polymerasegenet kan utføres ved restrisjonsfragmentering av Carboxydothermus hydrogenoformans- DHh med et annet restriksjonsenzym enn i den første runden av screeningen og ved invers PCR (Innis et al,

(1990) PCR Protocols: Academic Press. Inc., s 219-227). Dette kan oppnås med syntetiserte oligonukleotidprimere som binder til de ytre DNA-sekvenser av genpartiet men i motsatt orientering. Disse oligonukleotider, beskrevet ved SEQ ID NO: 3 og 4, ble konstruert på bakgrunn av sekvensene som ble bestemt ved sekvensering av det første PCR-produkt beskrevet ovenfor. Som templat anvendes Cari?oxydothemjus hydrogenoformans- DYlk som er spaltet ved restriksjonsspalting og sirkularisert ved kontakt med T4 DNA-ligase. For å isolere koderegionen til hele polymerasegenet utføres en annen PCR ved anvendelse av primere som vist i SEQ ID NO: 5 og 6 for å amplifisere det fullstendige DNA-polymerasegenet direkte fra genomt DNA og å introdusere ender kompatible med den line-ariserte ekspresjonsvektor.

SEQ ID NO: 1:

Primer 1: 5'-CCN AAY YTN CAR AAY ATH-3'

SEQ ID NO: 2:

Primer 2: 5<*->YTC RTC RTG NAC YTG-3'

SEQ ID NO: 3:

Primer 3: 5'-GGG CGA AGA CGC TAT ATT CCT GAG C-3'

SEQ ID NO: 4:

Primer 4: 5'-GAA GCC TTA ATT CAA TCT GGG AAT AAT C-3'

SEQ ID NO: 5:

Primer 5: 5'-CGA ATT CAA TCC ATG GGA AAA GTA GTC CTG GTG GAT-3»

SEQ ID NO: 6:

Primer 6: 5'-CGA ATT CAA GGA TCC TTA CTT CGC TTC ATA CCA GTT-3<*>

Genet er operasjonelt bundet til hensiktsmessige kontrollsekvenser for ekspresjon i enten prokaryote eller eukaryote verts-/vektorsystemer. Vektoren koder fortrinnsvis for alle funksjoner nødvendig for transformering og opprett-holdelse i en egnet vert, og kan kode for selekterbare markører og/eller kontrollsekvenser for polymeraseekspresjon. Aktiv rekombinant termostabil polymerase kan fremstilles ved transformerte vertskulturer enten kontinuerlig eller etter induksjon av ekspresjon. Aktiv termostabil polymerase kan gjenvinnes enten fra vertsceller eller fra kulturmedium dersom proteinet sekreres gjennom cellemembranen.

Det er også foretrukket at Carboxydothermus hydro-genoforjnans-termostabil polymeraseekspresjon er nøye kontrollert i E. coli under kloning og ekspresjon. Vektorer nyttige i utøvelsen av foreliggende oppfinnelse bør frembringe ulike nivåer av kontrollert ekspresjon av CarJboxydothermus hydrogenoformans-polymerase ved å frembringe noen eller alle de følgende kontrolltrekk: (1) promoterer eller steder for initiering av transkripsjon, enten i direkte tilknytning til starten av polymerasegenet eller som fusjonsproteiner, (2) operatorer som kan anvendes for å skru genekspresjonen på eller av, (3) ribosombindingssteder for forbedret translasjon, og (4) transkripsjons- eller translasjonstermineringssteder for forbedret stabilitet. Hensiktsmessige vektorer anvendt ved kloning og ekspresjon av Carjboxydothermus hydrogenoformans-polymerase omfatter, f.eks. fag og plasmider. Eksempler på fag omfatter lambda gtll (Promega), lambda Dash (Stratagene) lambda ZapII (Stratagene). Eksempler på plasmider omfatter pBR322.pBTac2 (Boehringer Mannheim), pBluescript (Stratagene), pSP73 (Promega), pET3A (Rosenberg, supra, (1987) Gene 56:125-135), pASK75 (Biometra), pDS56 (Stiiber,D., Matile, H. og Garotta G. (1990) Immunological Methods, Letkovcs. I. og Pernis, B., red.) og pETHC (Studier, F.W. (1990) Methods in Enzymology, 185:60-89). Ifølge foreliggende oppfinnelse har anvendelsen av et plasmid vist seg å være fordelaktig, spesielt pDS56. Plasmidet pDS56 som bærer Carjboxydothermus hydrogenoformans-DNA-polymerasegenet er følgelig betegnet pAR4.

Standard protokoller finnes, for transformering, faginfeksjon og celledyrkning (Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press). Av de mange E. coli-stammene som kan anvendes for plasmidtransformering, omfatter de foretrukne stammer JM110 (ATCC 47013), LE392 pUBS 520 (Maniatis et al. supra; Brinkmann et al., (1989) Gene 85:109-114;), JM101 (ATCC nr. 33876), XLI (Stratagene), og RR1 (ATCC nr. 31343), BL21 (DE3) pUBS 520 (Brinkmann, U. et al. (1989) Gene 85, 109-114) og BL21 (DE3) plysS (Studier, F. W. et al., (1990) Methods in Enzymology, supra). Ifølge foreliggende oppfinnelse har anvendelsen av E. coli-stammen BL21 (DE3) pUBS520 vist seg å være fordelaktig. E. coli-stammen BL21 (DE3) pOBS520 transformert med plasmidet pAR4 betegnes følgelig AR96(DSM nr. 11179). E.coli-stammene XLl-Blue (Stratagene) og ER1458 (Raleigh, E. A. et al., (1988) Nucleic Acids Research 16:1563-1575) er blant de stammene som kan anvendes ved lambdas-fag og Y1089 kan anvendes for lambda gtll-lysogeni. De transformerte celler dyrkes fortrinnsvis ved 37 °c og ekspresjonen av det

klonede gen induseres med IPTG.

Isolering av den rekombinante DNA-polymerase kan utføres etter standard teknikker. Separering og rensing av DNA-polymerase fra E.coli-ekstrakt kan utføres etter standard fremgangsmåter. Disse fremgangsmåter omfatter, f.eks. fremgangsmåter som benytter løselighet som saltfelling og løsningsmiddelfelling, fremgangsmåter som benytter forskjeller i molekylvekt som dialyse, ultrafiltrering, gelfiltrering og SDS-polyakrylamidgelelektroforese, fremgangsmåter som benytter en forskjell i isoelektrisk ladning som ionebytterkolonne-kromatografi, fremgangsmåter som benytter spesifikke inter-aksjoner som affinitetskromatografi, fremgangsmåter som benytter en forskjell i hydrofobisitet som revers fase høyutnyttelsesvæskekromatografi og fremgangsmåter som benytter en forskjell i isoelektrisk punkt som isoelektrisk fokuse-ringselektroforese.

Foreliggende oppfinnelse frembringer forbedrede fremgangsmåter for effektivt å transkribere RNA og amplifisere RNA eller DNA. Disse forbedringer oppnås ved oppfinnelsen av og søknaden av tidligere ukjente egenskaper til termoaktive DNA-polymeraser.

Det termostabile enzym ifølge oppfinnelsen kan anvendes for en hvilken som helst hensikt der slik enzymaktivitet er nødvendig eller ønskelig. I en spesielt foretrukken utførelsesform katalyserer enzymet nukleinsyre-amplifiseringsreaksjonen kjent som PCR. Denne fremgangsmåte for amplifisering av nukleinsyresekvenser er beskrevet og patentert i US patent nr. 4 683 202. PCR-nukleinsyreampli-fiseringsmetoden omfatter amplifisering av minst en spesiell nukleinsyresekvens inneholdt i en nukleinsyre eller en blanding av nukleinsyrer og fremstiller dobbelttrådet DNA. En hvilken som helst nukleinsyresekvens i renset eller urenset form kan benyttes som startnukleinsyrer(r), forutsatt at den inneholder eller antas å inneholde den ønskede spesifikke nukleinsyresekvens. Nukleinsyren som skal amplifiseres kan frembringes fra en hvilken som helst kilde, f.eks. fra plasmider som pBR322, fra klonet DNA eller RNA, fra naturlig DNA eller RNA fra en hvilken som helst kilde, inkludert bakterier, gjær, viruser, organeller og høyere organismer som planter og dyr, eller fra preparasjoner av nukleinsyrer utført in vitro.

DNA eller RNA kan ekstraheres fra blod, vevsmateriale som chorion villi eller amnionceller ved et uttall av teknikker. Se f.eks. Maniatis et al., 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) s 280-281. Følgelig kan fremgangsmåten anvende f.eks. DNA eller RNA, inkludert budbringer RNA,

) der DNA eller RNA kan være enkelttrådet eller dobbelttrådet. I

tillegg kan en DNA- RNA-hybrid som inneholder en tråd av hver benyttes.

Amplifiseringen av målsekvenser i DNA eller fra RNA kan utføres for å bevise tilstedeværelsen av en spesiell

i sekvens i prøven av nukleinsyrer som skal analyseres eller for å klone et spesifikt gen. DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans er svært nyttig ved disse fremgangsmåter. På grunn av dens 3'-5<1->eksonukleaseaktivitet er den i stand til å

syntetisere produkter med høyere nøyaktighet enn den reverse transkriptasen ifølge teknikkens stand.

DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans kan også utnyttes for å forenkle og forbedre fremgangsmåten for påvisning av RNA-målmolekyler i en prøve. I disse

fremgangsmåter kan DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans katalyserer: (a) revers transkripsjon, (b)

syntese av den andre tråden i cDNA, og, dersom ønskelig, (c) amplifisering ved hjelp av PCR. Anvendelsen av DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans i de beskrevne

fremgangsmåter ville eliminere de tidligere behov for to sett av inkububeringsbetingelser som er nødvendig på grunn av anvendelsen av ulike enzym for hvert trinn. Anvendelsen av DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans kan anvendes for å utføre RNA-revers transkripsjon og amplifisering av den dannede komplementære DNA med forhøyet spesifisitet og med færre trinn enn tidligere RNA-kloning og diagnostiske metoder.

Oppfinnelsen gjelder således en renset termostabil' DNA-polymerase frembrakt fra Carboxydothermus hydrogenoformans med deponeringsnummer DSM nr. 8979, kjennetegnet ved at den katalyserer den templatstyrte polymeriseringen av DNA, har 3'-5<*->eksonukleaseaktivitet og har reverstranskriptaseaktiyitet i nærvær av magnesiumioner og i fravær av manganioner, der den magnesiumionavhengige reverstranskriptaseaktiviteten til nevnte polymerase er høyere enn den manganavhengige reverstranskriptaseaktivitet til nevnte polymerase, testet ved reaksjonsbetingelser som er optimale for de individuelle enzymene.

Den gjelder også en solert DNA-sekvens, kjennetegnet ved at den koder for polymerasen ifølge oppfinnelsen, frembrakt fra Carboxydothermus hydrogenoformans, en vektor, kjennetegnet ved at den inneholder den isolerte DNA-sekvens ifølge foreliggende oppfinnelse og en mikrobiell vert, kjennetegnet ved at den er transformert med vektoren ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen gjelder også en fremgangsmåte for fremstilling av DNA-polymerase. ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved de følgende trinn: (a) dyrking av den naturlige stammen Carboxydothermus

hydrogenoformans

(b) suspendering av cellene fra den naturlige stammen i buffer (c) ødeleggelse av cellene (d) rensing av DNA-polymerasen ved kromatografiske trinn omfattende anvendelsen av en eller flere sepharosekolonner, en fremgangsmåte for fremstilling av DNA-polymerase ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved dyrking av en rekombinant E. coli-stamme transformert med en vektor ifølge foreliggende oppfinnelse og rensing og isolering av DNA-polymerasen, en fremgangsmåte for amplifisering av DNA, kjennetegnet ved at en termostabil DNA-polymerase ifølge oppfinnelsen anvendes, en fremgangsmåte for andre cDNA-kloning og DNA-sekvensering, kjennetegnet ved at en termostabil DNA-polymerase ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes, en fremgangsmåte for DNA-merking, kjennetegnet ved at en termostabil DNA-polymerase ifølge oppfinnelsen anvendes og en fremgangsmåte for reverstranskripsjon, kjennetegnet ved at en termostabil DNA-polymerase ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes. Fig. 1 viser den relative revers transkriptaseaktivitet til DNA-polymerase f ra'' Ca rjboxydotherjn us hydrogenoformans ved avhengighet av magnesium- og mangansalt. Fig. 2 viser et bilde av en DNA-polymeraseanalyse utført in situ. Aktiviteten av DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans og referansepolymeraser er påvist in situ. En del av DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans og referanseenzyra ble utsatt for elektroforese -på en SDS-polyakrylamidgel inneholdende kalvethymus-DNA. Etter elektroforese ble SDS fjernet, proteinene ble renaturert og inkubert ved 65 °C i nærvær av magnesiumsalt, dNTP og digoxigeninmerket dOTP for å tillate DNA-syntese. Nukleinsyren bie blottet på en nylonmembran og den nylig syntetiserte DNA påvist ved en kjemiluminescensreaksjon. Fig. 3 viser termostabiliteten av DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans. Aliquoter av DNA-polymerasen ble inkubert i 30 minutter ved temperaturer anført i figuren, og deretter ble den gjenværende enzymaktivitet bestemt. Fig. 4 viser analysen av 3<1->5<1->eksonukleaseaktivitet til DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans sammenlignet med DNA-polymerase fra Thermus aquaticus og Pyrococcus woeseii. Analysen utføres i nærvær eller fravær av dNTP. En 22mer primer merket med digoxigenin på 5'-ende ble annealet til en 34mer templat-DNA som gjør at det blir igjen et 12 bp 5<*> overheng av templat-DNA. DNA-polymeraser fra Carboxydothermus hydrogenoformans, Thermus aquaticus og Purococcus woeseii ble inkubert med dette substrat i nærvær av magnesium med eller uten dNTP. Produktene ble separert på en sekvenseringsgel, blottet på en nylonmembran og påvist ved en kjemiluminescensreaksjon. Fig. 5 viser DNA-sekvensen til polymerasegenet til Carboxydothermus hydrogenoformans med SEQ ID NO: 7 og den utledede peptidsekvens av DNA-polymeraseproteinet med SEQ ID NO: 8. Fig. 6 viser en sammenligning av revers transkriptaseaktiviteten til den termostabile DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans, Anaerocellum thermophilus,

Thermus filliformis (Pacific Enzymes) og Thermus thermophilus. Tilsvarende mengder (enheter) av DNA-polymerasene ble analysert. Hvert enzym ble undersøkt for DNA-polymeraseaktivitet, revers transkriptaseaktivitet i nærvær av Mg<++> (5 mM) og revers transkriptaseaktivitet i nærvær av Mn<++> (1 mM) under reaksjonsbetingelser optimale for hvert enkelt enzym. DNA-syntese ble målt ved inkorporering av digoxigenin-merkede nukleotider. For å sammenligne forholdet mellom DNA-polymerase og revers transkriptaseaktivitet, ble den relative lysenhet (RLU) målt i DNA-polymeraseanalysen satt til 100. RLU målt i revers transkriptaseaktivitetstester ble uttrykt som prosent av polymeraseaktiviteten.

Eksempel 1

Påvisning av endonuklease-, eksonuklease- og ribonuklease-aktiviteter: Fravær av endonukleaseaktivitet: 1 ug plasmid-DNA inkuberes i 4 timer med et overskudd av renset DNA-polymerase i 50 pl testbuffer med et parafinoljetopplag ved 72 °C.

Fravær av ikke-spesifikk eksonukleaseaktivitet: 1 pg EcoRI/HindIII-fragmenter av lambda DNA inkuberes i 100 pl testbuffer i fravær og nærvær av dNTP (lmM sluttkonsentrasjon av hver) med et overskudd av renset DNA-polymerase i 4 timer ved 72 °C.

Fravær av ribonukleaseaktivitet: 3 pg MS2 RNA inkuberes med et overskudd av DNA-polymerase i 20 pl testbuffer i 4 timer ved 72 °C. RNA1 et analyseres deretter ved elektroforese i en MOPS-gel (Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York).

Eksempel 2

Bestemmelse av DNA-polymeraseaktivitet

DNA-polymeraseaktivitet ble målt ved inkorporering av digoxigeninmerket dUTP i syntetisert DNA og påvisning og kvantifisering av det inkorporerte digoxigenin i hovedsak ifølge fremgangsmåten beskrevet av Holtke, H.-J.; Sagner, G; Kessler, C. og Schmitz, G. (1992) Biotechniques 12, 104-113. Reaksjonen utføres i et reaksjonsvolum på 50 pl inneholdende 1 eller 2 pl fortynnet {0,05 U - 0,01 U) DNA-polymerase og 50 mM Tris-HCl, pH 8,5; 12,5 mM (NH4)2S04; 10 mM KC1; 5 mM MgCl2;

10 mM 2-merkaptoetanol; 33 uM dNTPs; 200 ug/ml BSA; 12 pg av

DNAse I-aktivert DNA fra kalvethymus og 0,036 pM digoxigenin-dUTP.

Prøvene inkuberes i 30 minutter ved 72 °C, reaksjonen stoppes ved tilsetting av 2 pl 0,5 M EDTA, og reagensrørene

. plasseres på is. Etter tilsetning av 8 pl.5 M NaCl og 150 pl etanol (forkjølt til -20 °C) presipiteres DNA ved inkubering i 15 minutter på is og sentrifugering i 10 min ved 13000 x

omdreininger per minutt og 4 °C. Pelleten vaskes med 100 pl 70 etanol (forkjølt til -20 °C) og 0,2 M NaCl, sentrifugert om igjen og tørket under vakuum.

Pelleten oppløses i 50 pl Tris-EDTA (10 mM/0,1 mM; pH 7,5) 5 pl prøve fordeles på en brønn av en hvit mikrobrønns-plate med nylonmembranbunn (Pall Filtrationstechnik GmbH, Dreieich, FRG, produkt nr. SM045BWP). DNA<*>et fikseres til membranen ved baking i 10 minutter ved 70 °C. De DNA-påførte brønner fylles med 100 pl 0,45 pm-filtirert 1 % blokkerings-løsning {100 mM maleinsyre, 150 mM NaCl og 1 % (vekt/volum) kasein, pH 7,5). Alle følgende inkuberingstrinn ble utført ved romtemperatur. Etter inkubering i 2 minutter ble løsningen sugd gjennom membranen med et egnet vakuum på -0,4 bar. Etter gjentagelse av vasketrinnet, ble brønnene fylt med 100 pl av en 1:10000-fortynning av Anti-digoxigenin-AP, Fab-fragmenter (Boehringer Mannheim, FRG, nr.: 1093274) fortynnet i den ovenfor nevnte blokkeringsløsning. Etter inkubering i 2 minutter og gjennomsuging repeteres dette trinn en gang til. Brønnene vaskes to ganger under vakuum med 200 pl vaskebuffer 1 (100 mM maleinsyre, 150 mM NaCl, 0,3 vekt% "Tween 20"

(poly(oksyetylen)„-Sorbitan-monolaurat), pH 7,5) hver gang. Etter enda to vaskinger under vakuum med 200 pl vaskebuffer 2 (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH, 9,5) hver gang ble brønnene inkubert i 5 minutter med 50 pl "CSPD"

(Boehringer Mannheim, nr.: 1655884), fortynnet 1 : 100 i vaskebuffer 2, som fungerte som et kjemiluminescenssubstrat for alkalisk fosfatase. Løsningen suges gjennom membranen og etter inkubering i 10 minutter påvises RLU/s (relativ lysenhet

per sekund) i et luminometer f.eks. MicroLumat LB 96 P (EG&G Berthold. Wilbad, FRG).

Med en seriefortynning av Taq-DNA-polymerase lages en referansekurve der det lineære område fungerer som en standard for bestemmelse av aktivitet til DNA-polymerasene som analyseres .

Eksempel 3

Bestemmelse av revers transkriptaseaktivitet

Analysen utføres i hovedsak som beskrevet for bestemmelse av DNA-polymeraseaktivitet, med unntak av at reaksjonsblandingen består av de følgende komponenter 1 pg polyA-(dT) is, 33 pM dTTP, 0,36 pM digoxigenin-dUTP, 200 mg/ml BSA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 20 mM KC1, 5 mM MgCl2, 10 mM DTE og ulike mengder av DNA-polymerase. Inkuberingstemperaturen er 50 °C.

Eksempel 4 Påvisning av DNA-polymeraseaktivitet in situ

In situ PAGE-analyse av polymeraseaktivitet og revers transkriptaseaktivitet ble utført" i hovedsak ifølge fremgangsmåten beskrevet av Spanos A. og HUbscher U. {1983} Methods in Enzymology 91, 263-277. Noen små, men viktige endringer i forhold til opprinnelig fremgangsmåte er at renatureringen av SDS-denaturerte polypeptider utføres i nærvær av magnesiumioner (3 mM) og dATP (0,5-1 pM) for å avhjelpe refolding.

Kortfattet er fremgangsmåten som følger:

Etter separering av polypeptider fra enten råcelleekstrakter eller rensede prøver på denaturerende 8 % polyakrylamidgeler (stablegel 5 % akrylamid) som inneholder 150 pg aktivert kalvethymus-DNA per ml gelvolum, vaskes gelen fire ganger i 30 minutter ved romtemperatur med moderat risting i overskudd av renatureringsbuffer (Tris-HCl, 50 mM, pH 8,3; EDTA, 1 mM; 2-merkaptoetanol, 3 mM; KC1, 50 mM; glyserol, 5-10 %) for å fjerne SDS. Deretter inkuberes gelene over natten i den samme buffer, inkludert 3 mM MgCl2 og 0,5-1 pM dATP ved 4 °C uten agitering. De første fire vaskene repeteres den neste dag uten renatureringsbuffer. Etter fjerning av SDS og renaturering av proteinene overføres gelen til reaksjonsblandingen bestående av Tris-HCl, 50 mM, pH 8,3; KC1, 50 mM; DTT, 3 mM; MgCl2, 7 mM; 12 uM av hver dATP, dCTP, dGTP, 8 pM dTTP og 4 pM Dig-dO*TP; 10 % (volum/volum) glyserol. Geler ble først inkubert med risting ved romtemperatur i 1 time og deretter oppvarmet trinnvis til 37, 45, 55, 65 og 72 °C. Ved hver inkuberingstemperatur fikk DNA-syntesén pågå i 60 minutter.

Etter DNA-syntese overføres DNA<1>et enten ved kontaktblotting eller ved kapillærblotting (15 x SSC, Maniatis et al., supra) til nylonmembraner (Boehringer Mannheim, GmbH) og kryssbindes.

Påvisningen av nylig syntetisert, digoxigeninmerket DNA fulgte fremgangsmåten gitt i det tidligere avsnitt (bestemmelse av DNA-polymeraseaktivitet).

For molekylvektsbestemmelse påføres markørpolymeraser av kjent molekylvekt (f.eks. Klenow-polymerase, Pol I, Taq-polymerase, Tth-polymerase, HIV RT, M-MuLV RT) på den samme genen, men i ulike felter.

Molekylvekten til DNA-polymerasen ifølge oppfinnelsen bestemt etter denne metode er 100 til 105 kDa.

Eksempel 5

Påvisning av 3'-5'-eksonukleaseaktivitet

3'-5'-eksonukleaseaktivitet omtales vanligvis som "korrekturlesende" eller "editerende" aktivitet av DNA-polymeraser. Den er lokalisert i det lille domene av det store fragment av type A polymeraser. Denne aktivitet fjerner

nukleotider fra den 3'-enden av primerterminus av DNA i fravær av nukleosidtrifosfater (Kornberg A. og Baker T.A. (1992) DNA Replication W.H. Freeman & Company, New York). Denne nukleasevirkning undertrykkes ved deoksynukleotidtrifosfater dersom de passer til templatet og kan inkorporeres i polymeren.

3<*->5'-eksonukleaseaktivitet til DNA-polymerasen ifølge oppfinnelsen kan måles som degradering eller forkorting av et 5'-digoxigeninmerket oligonukleotid annealert til

templat-DNA i fravær eller nærvær av deoksyribonukleosidtrifosfater eller på DNA-fragmenter i fravær eller nærvær av deoksyribonukleosidtrifosfater.

Degradering av digoxigeninmerket oligonukleotid: Reaksjonsblandingen er i hovedsak den samme som ved bestemmelse av DNA-polymeraseaktivitet (50 mM Tris-HCl, pH 8,4, 12,5 mM (NH^SCv 10 mM KC1; 5 mM MgCl2 10 mM 2-merkaptoetanol) med unntak av at dNTP-konsentrasjonen ble redusert til 12,5 uM og aktivert kalvethymus-DNA ble erstattet med 500 fMol primer eller templat/primerblanding.

Primersekvensen er:

Dig-GCATGGATCCCACTGCCCAGGG(5' til 3'). Denne primer anneales med templatmolekyler av ulike 12 bp 5 primeroverheng. DNA-polymeraseprøver av typisk 0,1 enheter inkuberes i et totalt reaksjonsvolum på 10 pl i 30 minutter ved 72 °C i en Perkin Eimer termisk sykluser. Reaksjonen stoppes ved å tilsette et likt volum av formamidbuffer (98 % formamid: 10 mM EDTA; bromfenolblått og xylencyanol) og denaturert ved oppvarming i 10 minutter ved 95 °C. Prøvene fryses raskt på is og påføres en 20 % denatureringspolyakrylamid/ureasekvenseringsgel. Elektroforesen utføres ved 60 °C og 2000 V i 2,5 timer.

Etter separasjon overføres DNA til en positivt ladet nylonmembran (Boehringer Mannheim) ved kontaktblotting i 30 minutter. DNA'et kryssbindes til membranen ved UV-bestråling ved 120 mJoul (Stratalinker. Stratagene). Membranen blokkeres med blokkeringsløsning (100 mM maleinsyre 150 mM NaCl, 1 % vekt/volum) kasein, pH justeres til 7,5 med 1 M NaOH) ved romtemperatur i minst 30 minutter. Digoxigeninmerket primer-DNA påvises med anti-digoxigenin-AP, Fab-fragmenter (Boehringer Mannheim, FRG, nr. 1093274) fortynnet 1:10000 i blokkeringsløsning (30 minutter ved romtemperatur). Overskudd av ubundet antistoff fjernes ved vasking 3-4 ganger (10-15 minutter for hvert trinn) med vaskebuffer (100 mM maleinsyre 150 mM NaCl, 0,3 % (vekt/vekt) "Tween 20" (poly(oksyetylen)n-sorbitan-monolaurat), pH 7,5). Membranen overføres til en buffer inneholdende 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5} og vaskes to ganger i ytterligere 10-15 minutter ved romtemperatur. Til slutt nedsenkes membranen i en løsning av "CDP-Star"

(Boehringer Mannheim) fortynnet 1:1000. "CDP-Star" fungerer som et kjemilumininescenssubstrat for alkalisk fosfatase. Membranen overføres deretter til et filterpapir (Whatman 3MM) for å fjerne overskudd av væske, plassert mellom to lag av gjennomsiktig "overhead-folie" og eksponeres for røntgenfilm (Chemiluminescent Detection Film, Boehringer Mannheim) i 5-10 minutter. 3'-5'-eksonukleaseaktivitet påvises ved degradering eller forkorting av primeren sammenlignet med en kontroll (ingen polymerase tilsatt). Som negative og positive kon-troller ble DNA-polymerase fra Thermus aquaticus (ingen 3'-5<* >eksonukleaseaktivitet) og fra Pyrococcus woeseii (har 3'-5' eksonukleaseaktivitet) inkludert.

Degradering av DNA-fragmenter i nærvær eller fravær av deoksynukleotidtrifosfater: En seriefortynning av Chy-polymerase ble inkubert i 2 timer ved 70 °C ned 1 ug DNA-molekylvektmarkør III (Boehringer Mannheim) i nærvær og fravær av dNTP, 1 mM av hver, i 50 ul av følgende inkuberingsbuffer: 50 mM Tris-HCl,pH 7,8; 10 mM MgCl2; 7 mM 2-merkaptoetanol med parafintopplag. DNA-fragmentene ble separert på en 1 % agarosegel inneholdende etidiumbromid. I fravær av dNTP kunne et utstryk av DNA-fragmenter og ingen DNA påvises mens i nærvær av dNTP forble DNA-fragmentene udegraderte.

Eksempel 6

Kloning av Carboxydothermus hydrogenoformans DNA-polymerasegenet .

Fremstilling av kromosomalt DNA fra Carboxydothermus hydrogenoformans. 0,8 g biomasse Carboxydothermus hydrogenoformans ble suspendert i 20 ml 1 M KC1 og sentrifugert. Pelleten ble deretter resuspendert i 4,8 ml SET-buffer (150 mM NaCl, 15 mM EDTA, pH 8,0, 60 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 ug/ul RNaseA). Deretter ble 1 ml 20 % SDS og 50 ul proteinase K (10 mg/ml) tilsatt. Blandingen ble oppbevart ved 37 °C i 45 minutter. Etter ekstraksjon med fenol og kloroform ble DNA'et presipitert med etanol og løst i H20. Følgelig ble ca. 4,1 mg DNA frembrakt.

Amplifisering av spesifikt DNA ved PCR.

For amplifisering av genet som koder for DNA-polymerasen til Carboxydothermus hydrogenoformans ved hjelp av PCR-teknikken ble to blandede oligonukleotider {primer 1 og 2) konstruert på grunnlag av konserverte regioner i familie A DNA-polymeraser som publisert av Braithwaite D.K. og Ito J.

{1993) Nucl. Acids Res. 21, 787-802.

SEQ ID NO: 1

Primer 1: 5'-CCN AAY YTN CAR AAY ATH-3'

SEQ ID NO: 2

Primer 2: 5<*->YTC RTC RTG NAC YTG-3'

PCR-amplifiseringen ble utført i 100 buffer inneholdende 750 ng genomt DNA fra Carboxydothermus hydrogenoformans, 10 mM Tris-HCl, pH 8,8, 2,5 mM MgCl2/ 50 mM KC1, 200 uM dNTP, 100 pmol av hver primer og 2,5 enheter Taq-polymerase (Boehringer Mannheim GmbH, FRG). Målsekvensen ble amplifisert ved først å denaturere ved 95 °C i 2 minutter etterfulgt av 30 sykluser ved 95 °C i 0,5 minutter, 47 °C i 1 minutt og 72 °C i 2 minutter. Termisk sykling ble utført i en Perkin Eimer GenAmp 9600 termal sykluser. Agarosegelelektroforese viste at et fragment på ca. 600 basepar i særdeleshet ble amplifisert. Fragmentet ble ligert til "pCR II"-vektor (Invitrogen) og sekvensen ble bestemt ved syklisk sekvensering. Aminosyre-sekvensen utøvet fra denne nukleotidsekvens var svært lik den til andre kjente DNA-polymeraser, slik at primer 3 og 4 kunne konstrueres for invers PCR.

SEQ ID NO: 3

Primer 3: 5'-GGG CGA AGA CTC TAT ATT CCT GAG C-3'

SEQ ID NO: 4

Primer 4: 5<*->GAA GCC TTA ATT CAA TCT GGG AAT AAT C-3'

Invers PCR ble utført i hovedsak som beskrevet av Triglia T. et al (1988) Nucleic Acids Res. 16, 8186. 5 ug genomt DNA fra Carboxydothermus hydrogenoformans ble spaltet ved EcoRI ifølge leverandørens spesifikasjoner (Boehringer Mannheim GmbH) og behandlet med et likt volum fenol/kloro-formblanding. Den vandige fase ble fjernet, DNA-presipitert med etanol og oppsamlet ved sentrifugering.

For sirkularisering ble det spaltede DNA fortynnet til en konsentrasjon på 50 pl i ligeringsbuffer (Boehringer Mannheim GmbH, FRG). Ligeringsreaksjonen ble initiert ved tilsetting av T4 DNA-Ligase (Boehringer Mannheim GmbH, FRG) til en konsentrasjon på 0,2 enheter/pl og reaksjonen fikk pågå i 15 timer ved 15 °C. Det ligerte DNA ble deretter presipitert med etanol og oppsamlet ved sentrifugering.

PCR ble utført i 50 pl buffer inneholdende 50 mM Tris-Cl, pH 9,2, 16 mM (NH^zSO*, 2,25 mM MgCl2, 2 vekt% DMSO, 0,1 vekt% "Tween 20", 700 ng sirkularisert DNA frembrakt som beskrevet ovenfor, 50 pmol av hver primer, 500 pM dNTP og 0,75 pl enzymblanding (Expand Long Template PCR System, Boehringer Mannheim GmbH).

Syklusbetingelsene var som følger:

Agarosegelelektroforese viste et særskilt amplifisert DNA-fragment, 7000 basepar langt. DNA-fragmentet ble ligert i "pCR II"-vektoren (Invitrogen) og sekvensert. Utledet fra denne sekvens kunne primer 5 og 6 som koder for henholdsvis den 5<*-> og 3'-enden av polymeraseregionen konstrueres. Primer 5 inneholdt Ncol-sete og primer 6 inneholdt et BamHI-sete. PCR ble utført under de samme betingelser som beskrevet ovenfor {invers PCR) ved anvendelse av 750 ng genomt DNA fra Carboxydothermus hydrogenoformans som templat.

SEQ ID NO: 5

Primer 5: 5'-CGA ATT CAA TCC ATG GGA AAA GTA GTC CTG GTG GAT-3'

SEQ ID NO: 6

Primer 6: 5<»->CGA ATT CAA GGA TCC TTA CTT CGC TTC ATA CCA GTT-3<«>

Kloning og ekspresjon.

PCR-produktet ble renset ved elektroforese av 20 pl av PCR-blandingen på en 0,8 % agarosegel. 2496 kb-båndet av den polymerasekodende region ble renset fra agarosen ved fenolekstraksjon. DNA'et ble deretter behandlet med kloroform og presipitert med etanol. Pelleten ble resuspendert og spaltet med Ncol og BamHI ifølge leverandørens spesifikasjoner (Boehringer Mannheim GmbH) for å danne kohesive ender for retningsbestemt kloning. DNA<*>et ble ligert i ekspresjons-vektoren pDS56 (Staber D., Matile H. og Garotta G. (1990) Immunological Methods. Letkovcs, I og Pernis, B., red.) som også var blitt spaltet med Ncol og BamHI. De ligerte produkter ble introdusert i E. coli-stammen BL21(DE3)pUBS520 (Birnkmann U. et al. (1989 Gene 85, 109-114) ved transformering. Trans-formantene ble dyrket på L-agar inneholdende 100 pg/ml ampicillin og 50 pg/ml kanamycin for å tillate seleksjon av rekombinanter. Koloniene ble plukket og dyrket i L-buljong inneholdende 100 pg/ml ampicillin og 50 pg/ml kanamycin, og plasmid-DNA ble fremstilt ved alkalinert lyse. Plasmidene ble screenet for innføyelser ved spalting med BamHI. De rekombinanter som inneholdt innføyelser ble dyrket i L-buljong inneholdende ampicillin og kanamycin og undersøkt for ekspresjon av termofil DNA-polymerase ved induksjon av eksponentiell vekstkultur med 1 mM IPTG og undersøkelsé av de varmebehandlede ekstrakter for DNA-polymeraseaktivitet som beskrevet ovenfor (bestemmelse av DNA-polymeraseaktivitet). En rekombinant uttrykkende DNA-polymerase fra Carboxydothermus hydrogenoformans ble frembragt. Stammen ble betegnet E. coli AR96 (DSM nr. 11179) og plasmidet pAR4.

Claims (18)

1. Renset termostabil DNA-polymerase frembrakt fra Carjboxydotnermus hydrogenoformans med deponeringsnummer DSM nr. 8979, karakterisert ved- at den katalyserer den templatstyrte polymeriseringen av DNA, har 3<*->5'-eksonukleaseaktivitet og har reverstranskriptaseaktivitet i nærvær av magnesiumioner og i fravær av manganioner, der den magnesiumionavhengige reverstranskriptaseaktiviteten til nevnte polymerase er høyere enn den manganavhengige reverstranskriptaseaktivitet til nevnte polymerase, testet ved reaksjonsbetingelser som er optimale for de individuelle enzymene.

2. Polymerase ifølge krav 1, karakterisert ved at polymerasen har en reverstranskriptaseaktivitet som er Mn<2+->avhengig.

3. Polymerase ifølge et hvilket som helst av krav 1-2, karakterisert ved at den magnesiumionavhengige reverstranskriptaseaktiviteten til nevnte polymerase er høyere enn DNA-polymeraseaktiviteten til nevnte polymerase, testet ved reaksjonsbetingelser som er optimale for de individuelle enzymene.

4. Polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at polymerasen har en tilsynelatende molekylvekt mellom ca. 100 til 105 kDa bestemt ved SDS-polyakrylamidelektroforese.

5. Polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at polymerasen er frembrakt fra E. coli BL21 (DE3)pUBS520, pAR4, DSM 11179.

6. Isolert DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for polymerasen ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 frembrakt fra CarJboxydothermus hydrogenoformans.

7. Isolert DNA-sekvens, karakterisert ved at den har formelen vist i SEQ ID NO: 7.

8. Vektor, karakterisert ved at den inneholder den isolerte DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst av kravene 6-7.

9. Vektor ifølge krav 8, karakterisert ved at vektoren er plasmid pDS56 som bærer Carboxydothermus hydrogenoformans DNA-polymerasegenet.

10. Vektor ifølge kravene 8 og 9,. karakterisert ved at den har noen eller alle de følgende trekk:

(1) promoterer eller steder for initiering av transkripsjon

(2) operatorer som kan anvendes for å skru genekspresjonen på eller av

(3) ribosombindingssteder for forbedret translasjon

(4) transkripsjons- eller translasjonstermineringssteder

11. Mikrobiell vert, karakterisert ved at den er transformert med vektoren ifølge kravene 8-10.

12. Mikrobiell vert ifølge krav 11, karakterisert ved at transformanten er fra E. coli BL21(DE3)pOBS520, pAR4, DSM nr. 11179.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved de følgende trinn: (a) dyrking av den naturlige stammen Carboxydothermus hydro genoformans (b) suspendering av cellene fra den naturlige stammen i buffer (c) ødeleggelse av cellene (d) rensing av DNA-polymerasen ved kromatografiske trinn omfattende anvendelsen av en eller flere Sepharosekolonner.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved dyrking av en rekombinant £.coli-stamme transformert med en vektor ifølge kravene 9-11 og rensing og isolering av DNA-polymerasen.

15. Fremgangsmåte for amplifisering av DNA, karakterisert ved at en termostabil DNA-polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 anvendes.

16. Fremgangsmåte for andre cDNA-kloning og DNA-sekvensering, karakterisert ved at en termostabil DNA-polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 anvendes.

17. Fremgangsmåte for DNA-merking, karakterisert ved at en termostabil DNA-polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 anvendes.

18. Fremgangsmåte for reverstranskripsjon, karakterisert ved at en termostabil DNA-polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 anvendes.