JPWO2015019951A1 - 核酸増幅法 - Google Patents

Abstract

塩基類似体を含むＰＣＲにおいて、標的核酸の効率的な増幅法を提供することを目的とする。塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させる方法であって、前記反応組成に、（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体、および（ｂ）増幅増強活性を示すＰＣＮＡを含む、前記核酸増幅方法。

Description

本発明は、ＰＣＲによる核酸増幅法に関する。本発明は、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。

ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）とは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
数コピーといった微量サンプルからでも標的核酸を何十万倍に増幅することができ、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられるようになってきている。

一方、ＰＣＲは非常に高感度な検出方法であるため、以前に行ったＰＣＲ増幅産物のキャリーオーバーによる偽陽性が問題となる。そこで、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰなどの塩基類似体を含む基質を用いてＰＣＲを行い、増幅産物にウラシル塩基を取り込ませ、次のＰＣＲを行う際にＵｒａｃｉｌ−Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）処理することで、コンタミネーション（キャリーオーバー）した増幅産物を分解する手法（ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法）がとられている（非特許文献１）。

しかしながら、ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法において、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを基質としてＰＣＲを行うと、反応効率が低下し、増幅産物の量が減少することが問題となっていた。また、ウラシルを含んだ鋳型ＤＮＡを増幅する際にも、反応効率が低下し、増幅産物の量が減少することが知られている。
そこで、ｄＵＴＰが存在していても、また鋳型ＤＮＡにウラシルが含まれていても、通常のｄＴＴＰを用いたときや通常のアデニン、シトシン、グアニン、チミンからなる鋳型を増幅するときのように十分な増幅量を示す核酸増幅法が求められていた。

特許４３９５３７７ 特表２００６−５０７０１２

Ｇｅｎｅ， Ｖｏｌ．９３（１）， １２５-１２８ （１９９０）

そこで、本発明は塩基類似体を含む核酸増幅の反応組成において、標的核酸の効率的な増幅法を提供することを目的とする。さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本発明の目的は、塩基類似体存在下の遺伝子の増幅に適したＰＣＲ改良法およびＰＣＲ反応試薬を提供することにある。

前記目的を達成するための本発明の核酸増幅方法は、塩基類似体を含む核酸増幅の反応組成において、ウラシルなどの塩基類似体に対して減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼと、ＰＣＮＡと、を用いることを特徴とする。

すなわち、本発明者は塩基類似体を含む核酸増幅の反応組成において、減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼと、ＰＣＮＡとを用いることで、塩基類似体が存在しても、通常の塩基存在下と同様以上の増幅量を示すＰＣＲが可能になることを見いだし、本発明を成すに至った。

代表的な本願発明は以下の通りである。
［１］
塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させる方法であって、前記反応組成に、
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体、および
（ｂ）ＰＣＮＡ
を含む、前記核酸増幅方法。
［２］
減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体が、以下の（ａ１）から（ａ３）のいずれかで示されるものである、［１］に記載の核酸増幅方法。
（ａ１）配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ａ２）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目以外の部位において少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号１との同一性が８０％以上またはそのアミノ酸配列と配列番号２との同一性が８０％以上であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
（ａ３）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
［３］
減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［２］に記載の核酸増幅法。
［４］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがさらに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する変異体である、［１］〜［３］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［５］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列のＤ１４１、Ｉ１４２、Ｅ１４３、Ｈ１４７、Ｎ２１０及びＹ３１１に相当するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変である、［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［６］
ＰＣＮＡが、以下の（ｂ１）から（ｂ３）のいずれかで示されるものである、［１］〜［５］のいずれかに記載の核酸増幅方法。
（ｂ１）配列番号１１または配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、下記（ｘ）および（ｙ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくともひとつの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチド。
（ｘ）８２、８４、１０９番目のアミノ酸残基群
（ｙ）１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸残基群
（ｂ２）（ｂ１）で示されるＰＣＮＡにおいて、さらに、（ｘ）および（ｙ）で示される群以外の部位において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
（ｂ３）配列番号１１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、または、配列番号１２で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
［７］
ＰＣＮＡが配列番号１１または配列番号１２の、１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、または、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、［１］〜［６］のいずれかに記載の核酸増幅方法。
［８］
精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する［１］〜［７］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［９］
生体試料が、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルスのいずれかである［１］〜［８］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［１０］
以下の（ａ）から（ｅ）を含む、核酸増幅反応を行うための試薬。
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体
（ｂ）ＰＣＮＡ
（ｃ）プライマー対
（ｄ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））
（ｅ）Ｍｇイオンを含むバッファー溶液
［１１］
［１０］に記載の試薬を含むキット。

本発明によって、ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法によるコンタミネーションを防げるため、研究分野だけでなく、同じサンプルを何度も増幅する遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等においても広く利用することができる

ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよびその種々の改変体のウラシルの検出活性の評価 ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよびその種々の改変体のウラシルの検出活性の評価 ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよびその種々の改変体のウラシルの検出活性の評価 ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよびその種々の改変体のウラシルの検出活性の評価 ＰＣＮＡの増幅増強活性の評価 ＰＣＮＡ添加による長鎖ターゲットの増幅比較 ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅評価 ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅評価 ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅評価 ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅 ＰＣＮＡ添加による爪、髪、口腔粘膜からの増幅 ＰＣＮＡ添加によるバイサルファイト処理後のＤＮＡからの増幅 ＰＣＮＡの多量体形成に関するアミノ酸領域を示す図 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼを用いた糞便存在下からの増幅評価

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。たとえば「Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第１４７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。三重変異体以上の多重変異体については、さらに「／」の記号のあとに「Ｐ３６Ｈ」などの変異箇所についての情報を追記する。
また、本明細書において「変異型ＰＣＮＡ」などという場合の「変異型」とは、従来知られたＰＣＮＡとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。

（１）核酸増幅方法
本発明の実施形態の一つは、塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させる方法であって、前記反応組成に、
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体、および
（ｂ）ＰＣＮＡ
を含む、前記核酸増幅方法である。

本発明の方法において、核酸の増幅方法はＤＮＡポリメラーゼで増幅可能な方法であれば特に限定されない。典型的にはＰＣＲであるが、本発明はＰＣＲのみならず、ＤＮＡを鋳型とし、１種のプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法にも使用される。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法を含む。

本発明における塩基類似体とは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）以外の塩基を示し、例えば、ウラシル（Ｕ）やイノシン（Ｉ）などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明における塩基類似体を含む反応組成とは、核酸増幅する組成に、塩基類似体を含むものであって、塩基類似体は、ＤＮＡ合成用基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））として反応組成に含まれてもよく、また核酸増幅に用いられるプライマーに含まれていてもよく、また増幅対象ＤＮＡに含まれていてもよい。

本発明の核酸増幅法に適用される核酸は、ＤＮＡポリメラーゼで増幅可能なものであればその長さや配列、ＧＣ含量の違いなどに制約を受けず、特に限定されない。
前記核酸は、典型的には、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）で構成されるＤＮＡであるが、本発明の核酸増幅方法ではＤＮＡポリメラーゼとして「減少した塩基類似体（本明細書では、アデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を塩基類似体と称する。）検出活性」を有する変異体を用いるので、アデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基、例えばウラシルやイノシンなどを含むものであってもよい。
以下、本明細書では特に断りのない限り、ＤＮＡを構成する塩基には、上記のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔおよび塩基類似体のいずれを含んでも良いものとする。

本発明の核酸増幅法に適用される核酸は、ｄＵＴＰを取り込ませる場合は、核酸にＴが含まれることが必要であり、Ｔが１０個以上含まれていることが好ましい。

［生体試料］
本発明の核酸増幅法に適用する生体試料は、生体から採取された試料であれば特に限定されない。例えば、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。前記生体試料には、食品などの加工製品、土壌などの自然環境や、事業所、住居などの生活環境の中に存在するものであって、生体に由来するものも含まれる。

本発明の核酸増幅法に適用する生体試料は、精製工程を経ていないものであってもよい。すなわち、本発明における核酸増幅法は、精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であってもよい。

精製とは、生体試料の組織、細胞壁などの夾雑物質と生体試料中のＤＮＡを分離する方法であり、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、ＤＮＡを分離する方法や、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬によってＤＮＡを分離する方法がある。本発明における核酸増幅法は、生体試料をこれらの精製法をとることなく、核酸増幅反応液に添加し増幅してもよい。

「精製工程を経ていない生体試料」とは、生体試料そのもの、あるいは液体の生体試料を水などの溶媒を用いて希釈したもの、固体の生体試料を水などの溶媒に添加し熱をかけて破砕させたものなどが挙げられる。
臓器や細胞など、増幅対象となる核酸が試料の組織内に存在する場合、前記核酸を抽出するために組織を破壊する行為（物理的な処理による破壊、界面活性剤などを使用した破壊など）は、本発明で言う精製に該当しない。また、前記方法で得られた試料、または、生体試料を、緩衝液などにより希釈する行為も本発明で言う精製に該当しない。

本発明の核酸増幅法に適用する生体試料は、バイサルファイト処理を経たものであってもよい。すなわち、本発明における核酸増幅法は、バイサルファイト処理後のＤＮＡを増幅する方法であってもよい。
ＤＮＡのメチル化を解析する手法として、バイサルファイト処理後のＤＮＡをシークエンスする方法が取られている。バイサルファイト処理は非メチル化シトシンをウラシルに変換し、一方、メチル化シトシンは変換されないことから、シークエンスを確認することでメチル化シトシン、非メチル化シトシンを区別することができる。

本発明の方法において、ＰＣＲの場合の代表的な条件を以下に示すが、これに限定されるものではない。
増幅対象ＤＮＡに、
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体
（ｂ）ＰＣＮＡ
のほか、
（ｃ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｄ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、および、
（ｅ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含むバッファー溶液を、混合し、
サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を上下させることにより、（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のＤＮＡ断片を増幅させる。
上記ＰＣＲ方法においては、必要に応じて、さらに、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤を用いてもよい。

上記ＰＣＲ方法においては、必要に応じて、さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。

（１．１）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体
本発明の方法に用いるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体は、「減少した塩基類似体検出活性」を有する。
（１．１．１）塩基類似体検出活性
塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。（塩基類似体検出活性の評価方法については、後述する。）
通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ポリメラーゼ機能がほぼ完全に阻害されるが、本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの塩基類似体検出活性を減少させるよう、野生型のアミノ酸配列に改変を施した変異体である。したがって、ウラシルやイノシンなどの塩基類似体が存在していても、ポリメラーゼ機能が完全に阻害されることなくＤＮＡ合成（ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応）が進む。

＜塩基類似体検出活性の測定方法＞
塩基類似体検出活性はＰＣＲによって評価できる。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、および評価対象のＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、ｄＵＴＰ溶液を、終濃度０．５μＭ〜２００μＭで添加し、熱サイクルを行う。反応後にエチジウムブロマイド染色アガロース電気泳動でＰＣＲ産物の有無を確認し、許容できたｄＵＴＰ濃度によって、ウラシルの検出活性を評価することが出来る。ウラシル検出活性の高いＤＮＡポリメラーゼは少しのｄＵＴＰの添加で伸長反応が阻害され、ＰＣＲ産物が確認できない。またウラシルの検出活性の低いＤＮＡポリメラーゼは高濃度のｄＵＴＰを添加しても問題なくＰＣＲによる遺伝子増幅が確認できる。

本明細書において塩基類似体検出活性の測定は、以下の方法に従う。
（反応液の調製）
活性測定対象のＤＮＡポリメラーゼ １Ｕ（ＤＮＡポリメラーゼの活性測定法については、（１．１．３）で後述。）と、ベースとなる緩衝液（活性測定対象がＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号１）またはその変異体の場合、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを、活性測定対象がＰｒｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号２）またはその変異体の場合、Ｐｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを用いる。その他のＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体の場合は至適の反応ＢｕｆｆｅｒもしくはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを代用して用いる。ここで１０×とは反応に用いる濃度の１０倍に濃縮されていることを示す。
ＰＣＲの反応には１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒに１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４と、
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）と、
約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１３及び１４に記載のプライマー対と、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）と、
を含む５０μｌの反応液を調製する。
（ＰＣＲ）
前記反応液中に、ｄＵＴＰ(Ｒｏｃｈｅ製)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるよう添加する。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。
（増幅産物の検出）
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認する。

（１．１．２）塩基類似体検出活性が「減少した」かどうかの判断
変異型ＤＮＡポリメラーゼの塩基類似体検出活性が「減少した」とは、変異型ＤＮＡポリメラーゼの塩基類似体検出活性が野生型のそれと比較して減少していることを言う。
本明細書では、（１．１．１）に記載の＜塩基類似体検出活性の測定方法＞により変異型と変異がない野生型との塩基類似体検出活性を比較し、変異型の方が野生型より多くのＰＣＲ産物を得たことが確認できれば、その変異型ＤＮＡポリメラーゼは「減少した塩基類似体検出活性」を有すると判断する。
ただし、前記方法によっても野生型との比較が困難な場合は、ｄＵＴＰを０．５μＭの濃度で添加してもＰＣＲの増幅ができるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体については、当該変異体が野生型と比較して減少した塩基類似体検出活性を有すると推定する。

（１．１．３）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼは以下のように活性を測定する。
酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，５０％ グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。
（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。
（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。
（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ 塩化マグネシウム１５ｍＭ ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍＬ 仔牛胸腺ＤＮＡ

（１．２）ＤＮＡポリメラーゼの改変箇所
（１．２．１）
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼに、塩基類似体検出活性を減少させるよう改変を施した変異体である。

ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号２）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号１）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ Ｎｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＳ−１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などがある。
なかでもＰＣＲ効率の観点から、伸長性や熱安定性の優れたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。

このようなファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ変異体としては、具体的には、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の１〜４０番目、および７８〜１３０番目によって形成されるウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）の少なくとも１か所に改変を加え、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較してウラシルやイノシンへの結合能力を低下させたＤＮＡポリメラーゼ変異体が例示される。

ウラシルの結合に関するアミノ酸配列はパイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）においては、上述の通り、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号２）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号３）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号４）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄ（配列番号５）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３（配列番号６）のおいては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７（配列番号７）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ−１（配列番号８）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号９）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号１０）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。

（１．２．２）
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体として、より好ましいのは、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目のうち少なくとも１つに改変を加えたファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体、すなわち、
（ａ１）配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
である。

上記のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体は、以下の（ａ２）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ａ２）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目以外の部位において少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号１との同一性またはそのアミノ酸配列と配列番号２との同一性が８０％以上（好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。

アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。

上記のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体は、以下の（ａ３）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ａ３）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。

ここで「数個」とは、「減少した塩基類似体検出活性」が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２〜１６０個、好ましくは２〜１２０個、より好ましくは２〜８０個、更に好ましくは２〜４０個であり、より更に好ましくは２〜５個である。

なお、「配列番号１に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に対応する、ウラシルの結合に関すると想定されているアミノ酸を含む表現である。

本願明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列における、配列番号１上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。

配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。

なお、特許文献１または２には、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目のアミノ酸のいずれかに改変を加えたファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体がいくつか例示されているが、その全ての改変体が本願の課題にかなう良好な特性を有しているわけではなく、中には活性を失っているものも見られる。

（１．２．３）
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体は、より好ましくは、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、または９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。

前記ポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変が１か所である場合、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換が例示される。別の例としては、３６番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、またはＰ３６Ｒのアミノ酸置換が例示される。別の例としては、９３番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）が正電荷をもつ極性アミン酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＶ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、またはＶ９３Ｒのアミノ酸置換が例示される。

より好ましくは、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９３Ｒからなる群より選ばれるいずれかである。

前記ポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変が２か所である場合、好ましい変異体として、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＱまたはＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられる。好ましくは、Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨまたはＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

（１．２．４）３’−５’エキソヌクレアーゼ領域の改変
本発明の核酸増幅法に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼは、さらに３’−５’エキソヌクレアーゼ領域の改変を含んでいてもよい。
３’−５’エキソアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を指し、上記の３’−５’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）、パイロコッカス・フリオサスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２）、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３）、サーモコッカス・リトラリスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）、パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号５）、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号７）、サーモコッカス・エスピーＫＳ−１に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号８）、サーモコッカス・セラーに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）、又はサーモコッカス・シクリに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１０）においては、１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目のアミノ酸である。本発明は具体的に配列を提示したＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにも適用される。また、配列番号１〜１０に示されるＤＮＡポリメラーゼ以外のファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼにおいては、配列番号１の１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目のアミノ酸からなる３’−５’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。

なお、「配列番号１に示される１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。

上記の３’−５’エキソヌクレアーゼ領域への改変とは、置換、欠失、または付加からなり得る。配列番号１における１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸への改変を示す。より好ましくは、配列番号１における１４１、１４２、１４３、１４７、２１０、３１１番目に対応するアミノ酸の少なくとも一つを改変したものが挙げられる。

前記改変の具体例としては、アミノ酸の改変がＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｎ２１０Ｄ、またはＹ３１１Ｆから選択されるいずれか一つが挙げられる。これらの改変体は、前記改変により３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損している。
なお、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（−））ＤＮＡポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して５０％（好ましくは２０％、さらに好ましくは１０％、さらに好ましくは５％、さらに好ましくは１％、さらに好ましくは０．１％、さらに好ましくは０．０５％、さらに好ましくは０．０３％）以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する、改変されたＤＮＡポリメラーゼを指す。

前記改変の別の具体例としては、アミノ酸の改変がＨ１４７Ｅ、またはＨ１４７Ｄから選択されるいずれか一つが挙げられる。これらの改変体は、前記改変によりエキソヌクレアーゼ活性を維持したまま、ＰＣＲ効率を向上させたＤＮＡポリメラーゼである。

３’−５’エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼを生成する方法や、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を解析する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。
例えば、米国特許第６９４６２７３号に開示されている。ＰＣＲ効率を向上させたＤＮＡポリメラーゼとは、ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加している改変されたＤＮＡポリメラーゼを示す。ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加しているかどうかを解析するための方法は、特許第３８９１３３０号等に記載されている。

（１．３）ＰＣＮＡ
本発明の核酸増幅方法には、ＰＣＮＡを用いる。
ＰＣＮＡとは、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ（増殖核抗原）の略称であり、由来は特に限定されないが、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されたＰＣＮＡが挙げられる。
パイロコッカス属由来のＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するＰＣＮＡとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ Ｎｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＳ−１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｃｕｌｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。
アミノ酸配列が知られているものとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のもの（配列番号１２）（以下、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡとも表記する）、および、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ−１株由来のもの（配列番号１１）（以下、ＫＯＤ−ＰＣＮＡとも表記する）などがある。

ＤＮＡ複製は、ＤＮＡヘリカーゼで複製起点の二本鎖構造が解かれることにより開始される。解かれたＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が結合して一本鎖が安定化され、さらに、それぞれの鎖上にプライマーを合成するためのプライマーゼが働く。次に複製因子Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｃ（ＲＦＣと略称される。）がプライマーを認識して結合し、ＰＣＮＡをＤＮＡ鎖上に誘導する。ＰＣＮＡはＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ鎖上に留めておくためのクランプの役目をし、ＰＣＮＡと複合したＤＮＡポリメラーゼが新生鎖を合成する。

本発明で用いるＰＣＮＡは増幅増強活性を示すことが好ましい。ＰＣＮＡは通常、多量体を形成し輪のような構造をとる。ＰＣＮＡ多量体の輪の構造内部にＤＮＡを通すことを「ＤＮＡにロードする」と言い、通常はＲＦＣと共同して初めてＰＣＮＡはＤＮＡにロードすることができる。増幅増強活性を示す変異体とは単独でＤＮＡにロードする変異体を示し、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる部位を改変し、多量体形成を不安定化することで、ＲＦＣなしでもＤＮＡをＰＣＮＡ多量体内部に通しやすくした変異体を示す。

ＰＣＮＡが多量体形成に関する部位は、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＰＣＮＡ（配列番号１１）、パイロコッカス・フリオサスのＰＣＮＡ（配列番号１２）においては、８２、８４、１０９番目のアミノ酸からなるＮ末端領域と１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなるＣ末端領域があげられる。Ｎ末端領域はプラスに帯電し、Ｃ末端領域はマイナスに帯電し、相互作用することで多量体形成を行う。

（１．３．１）増幅増強活性
増幅増強活性はＰＣＲによって評価できる。鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、およびファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、評価するＰＣＮＡを添加し、ＰＣＮＡ添加なしのものと増幅量を比較することで、増幅増強活性を確認することができる。これにより、ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードできるかどうかを確認することができる。

本明細書においては、増幅増強活性はｄＵＴＰを含んだ反応系で、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体を用いて評価する。
具体的には以下の方法である。
（ｉ）ＰＣＲ
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ添付を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含んだ０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー（１．３ｋｂの増幅には配列番号１３及び１４、２．８ｋｂの増幅には配列番号１５及び１６、３．６ｋｂの増幅には配列番号１７及び１８）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、０．８μｇのＫＯＤ抗体を混合した１Ｕ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ Ｖ９３Ｋ変異体（減少した塩基類似体検出活性を持つ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体）を含む５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１ｍｉｎ／ｋｂ（１．３ｋｂの増幅には１分３０秒、２．８ｋｂの増幅には３分、３．６ｋｂの増幅には４分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。
（ｉｉ）ＰＣＲ産物の分析
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片を、ＰＣＮＡを添加していないものと比較することで増幅増強活性を評価することができる。増幅増強活性の高いＰＣＮＡは添加によって増幅量が増加する。

野生型のＰＣＮＡをはじめ、単独でＤＮＡにロードできないＰＣＮＡは添加しても、ＰＣＲの増幅量は変化せず、むしろ増幅量を減らす傾向がある。一方、単独でＤＮＡにロードできる変異体は、ＰＣＮＡ添加なしのもの、また野生型ＰＣＮＡ添加のものと比べて優れた増幅量を得ることができる。

（１．４）ＰＣＮＡの変異箇所
（１．４．１）
本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは、増幅増強活性を示す変異体であってもよい。そのような変異体として、以下の（ｂ１）から（ｂ３）のいずれかで示される変異型が例示できる。
（ｂ１）配列番号１１または配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、下記（ｘ）および（ｙ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくともひとつの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチド。
（ｘ）８２、８４、１０９番目のアミノ酸残基群
（ｙ）１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸残基群
（ｂ２）（ｂ１）で示されるＰＣＮＡにおいて、さらに、（ｘ）および（ｙ）で示される群以外の部位において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
（ｂ３）配列番号１１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、または、配列番号１２で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。

上記（ｂ２）のポリペプチドは、増幅増強活性を保持する限度で、配列番号１１または１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」とも表す。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して、後述する本発明のＰＣＮＡをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントＰＣＮＡを得ることができる。バリアントＰＣＮＡには、ＰＣＮＡを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。

上記（ｂ３）のポリペプチドは、増幅増強活性を保持することを限度で、配列番号１１または１２に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＰＣＮＡが有するアミノ酸配列と配列番号１１または１２に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。例えば、前記（ｂ１）で示されるＰＣＮＡにおいて、さらに（ｘ）および（ｙ）で示される群以外の部位において改変が施されており、かつ、増幅増強活性を保持するものが挙げられる。

（１．４．２）
本発明の核酸増幅方法に用いるＰＣＮＡとして、より好ましいのは、配列番号１１または１２の、１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、または、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である。
本発明の中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。好ましくは、置換部位の周辺部位の立体構造に与える影響がもっとも小さいアラニンである。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リシンが挙げられる。好ましくはアルギニンである。

また、本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは発現量を増やすため、７３番目に相当するメチオニンを改変したものでもよい。より好ましくはＭ７３Ｌに改変したものがあげられるが、これに限定されない。

（１．４．３）
本発明の核酸増幅方法に用いるＰＣＮＡは、本明細書で具体的に配列を提示したＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにも適用される。例えば、図１３で示したように配列番号１１および１２に示されるＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにおいては、配列番号１１の８２、８４、１０９、１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなる多量体形成に関する領域と対応する領域のことを示す。

増幅増強活性を示す変異体（単独でＤＮＡにロードするＰＣＮＡ変異体）は、より好ましくは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる、
（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、または
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域に少なくともひとつの改変を有し、ＲＦＣがなくともＤＮＡにロードし、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を促進する変異体があげられる。

より好ましくは、ＷＯ２００７／００４６５４に記載のＰＣＮＡ変異体、第１４７番目のアミノ酸残基をアラニンに換えた配列（Ｄ１４７Ａ）、第８２番目、および第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ）、第１０９番目、および第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ）、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の核酸増幅方法に用いるＰＣＮＡは、単量体であっても前記単量体で構成された多量体のいずれであってもかまわないし、その両方の形態が混在していても良い。

本発明の核酸増幅方法に用いるＰＣＮＡは、ＰＣＲの熱サイクルに耐えられる耐熱性のものが望ましく、好ましくはＰＣＲ後も活性が残るものが望まれる。さらに好ましくは８０℃で３０分の熱処理を行っても可溶性であり、活性が５０%以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上残っているものが望まれる。

（１．５）アミノ酸改変の導入方法
本発明の核酸増幅方法に用いるＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＰＣＮＡを、改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。

アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。以下、ＤＮＡポリメラーゼの改変を例にとり説明する。
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）は、（１）目的とする遺伝子（野生型のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子）を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。
なお、上記方法において、野生型のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、そのアミノ酸配列が明らかになっている場合は、そのアミノ酸配列に対応するＤＮＡを合成して作製することができる。あるいは、前記ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＰＣＮＡの由来となる生物種よりクローニングして取得することができる。

次に、上記の方法などで得られた改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を、必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。

上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。

ＰＣＮＡの改変についても、ＤＮＡポリメラーゼの改変と同様に行うことができる。

（２）核酸増幅試薬
本発明の実施形態の一つは、以下の（ａ）から（ｅ）を含む、核酸増幅反応を行うための試薬である。本明細書において、試薬とはその態様は特に限定されず、キットの形態であっても良い。
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体
（ｂ）ＰＣＮＡ
（ｃ）プライマー対
（ｄ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））
（ｅ）Ｍｇイオンを含むバッファー溶液
必要に応じさらにその他の試薬類を含んでも良い。
この試薬を用いて、塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させることができる。

上記の本発明の核酸増幅試薬において、ＤＮＡ合成基質は、典型的には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸で構成されるが、本発明の核酸増幅方法ではｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ以外のデオキシヌクレオチド三リン酸、例えばｄＵＴＰやｄＩＴＰなどを含むものであってもよい。

上記の本発明の核酸増幅試薬において、プライマーは、典型的には、アデニン、シトシン、グアニン、チミンの４塩基からなるヌクレオチドで構成されるが、本発明の核酸増幅方法ではアデニン、シトシン、グアニン、チミン以外のヌクレオチド、例えばウラシルやイノシンなどを含むものであってもよい。

（２．１）ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法
ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法においてはＤＮＡ合成基質にｄＵＴＰ（デオキシウリジン）が用いられる。ｄＵＴＰの入手経路は特に限定されないが、市販のものを使用することができる。反応液中のｄＵＴＰの濃度は特に限定されないが、コンタミネーション除去の効率の観点から、好ましい下限は０．５μＭ以上、より好ましくは５０μＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上である。またＰＣＲ効率の観点から、ｄＵＴＰは高濃度で含まれていてもよい。好ましい上限は１ｍＭ以下、より好ましくは０．６ｍＭ以下である。
また、ＰＣＲ効率の観点からｄＴＴＰとｄＵＴＰが混在していてもよい。ｄＴＴＰとｄＵＴＰの比率は１００：１〜１：１００が好ましい。より好ましくは１０：１〜１：１０であり、さらに好ましくは１：１であるが、これらに限定されない。

以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。以下の実施例の記載はいかなる面においても本発明を限定しない。
（実施例１）
ＫＯＤ変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号２５）（ｐＫＯＤ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。

（実施例２）
Ｐｆｕ変異体の作製
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号２６）（ｐＰｆｕ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。

実施例１および実施例２で作製したプラスミドを表１および表２に示す。

（実施例３）
（実施例３−１）
改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製
実施例１および２で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。

（実施例３−２）
改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの減少した塩基類似体検出活性の評価
ウラシルの検出活性は、前述の（１．１．１）に記載の＜塩基類似体検出活性の測定方法＞に従い測定した。

結果、サーモコッカス・コダカラエンシス（ＫＯＤ）の野生型のＤＮＡポリメラーゼでは０．５μＭのｄＵＴＰの添加で阻害がかかり、ＰＣＲ産物が確認できないところ、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒのウラシル結合ポケットへの変異体では、多少のｄＵＴＰを添加してもＰＣＲ産物の確認が出来た。またＰ３６ＫとＰ３６Ｋ／Ｙ７Ａを比較すると、単変異に比べ２重変異を入れたものの方が、高濃度のｄＵＴＰ添加に寛容で、増幅量が多い結果となった（図１、図２）。

図１は、野生型（ＫＯＤ）と、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈの７種のＫＯＤ変異体の計８種を用いて、反応系に水または終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭとなるよう調製したｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加してＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。
野生型ではｄＵＴＰを添加した場合はＰＣＲ産物が確認できず（レーン２−６）、ｄＵＴＰ無添加の場合（レーン１）のみ増幅産物が確認された。これに対し、７種の変異型では、終濃度０．５μＭのｄＵＴＰを添加した際にも増幅産物が確認された。中でも、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈの６種については、ｄＵＴＰ終濃度０．５−２００μＭのすべての範囲で増幅産物が確認された。

図２は、まず、野生型（ＫＯＤ）、Ｎ２１０Ｄの変異により３‘−５’エキソヌクレアーゼを欠失させたＫＯＤ（ＫＯＤ Ｎ２１０Ｄ）およびＩ１４２Ｒの変異により３‘−５’エキソヌクレアーゼを欠失させたＫＯＤ（ＫＯＤ Ｉ１４２Ｒ）の３種を用意し、さらに、ＫＯＤおよびＫＯＤ Ｎ２１０ＤのそれぞれにＶ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａのいずれかの変異を加えたもの（計８種）、ＫＯＤ Ｉ１４２ＲにＶ９３Ｋ、Ｙ７Ａのいずれかの変異を加えたもの（２種）を作製した。また、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａの二重変異により３‘−５’エキソヌクレアーゼを欠失させたＫＯＤに、さらに、Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａのいずれかの変異を加えたもの（２種）を作製した。これらの計１５種を用いて、反応系に水または終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭとなるよう調製したｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加してＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。
野生型ではｄＵＴＰを添加した場合はＰＣＲ産物が確認できず（レーン２−６）、ｄＵＴＰ無添加の場合（レーン１）のみ増幅産物が確認された。これに対し、変異型では、終濃度０．５μＭのｄＵＴＰを添加した際にも増幅産物が確認された。野生型と３‘−５’エキソヌクレアーゼを欠損させた変異型（Ｎ２１０Ｄ、Ｉ１４２Ｒ）では、３‘−５’エキソヌクレアーゼ欠損の変異型の方がｄＵＴＰ耐性濃度が高いことが示された。また同じＹ７Ａの変異をもつ変異型でも３‘−５’エキソヌクレアーゼを欠損させた変異（Ｎ２１０Ｄ、Ｉ１４２Ｒ）と組み合わせることでより高いｄＵＴＰ濃度まで耐性が示された。同様にＶ９３ＱとＶ９３Ｑ／Ｎ２１０Ｄについても、３‘−５’エキソヌクレアーゼを欠損させたＶ９３Ｑ／Ｎ２１０Ｄの方が高いｄＵＴＰ濃度まで耐性が示された。これらのことから、ウラシル結合ポケットへの変異に加え、３‘−５’エキソヌクレアーゼに欠損を与える変異を加えるとｄＵＴＰの耐性能が向上することがわかる。

その他のＫＯＤ変異体でも同様の実験を行い、表３のｄＵＴＰ耐性の欄に増幅が見られたｄＵＴＰ濃度をまとめた。０は０．５μＭのｄＵＴＰでＰＣＲができなかったことを示し、同様に０．５や５、１００は、それぞれ０．５、５、１００μＭのｄＵＴＰでは増幅が見られたが、それぞれ１段階高い５、１００、２００μＭのｄＵＴＰでは増幅が見られなかったことを示す。＞２００は２００μＭを添加しても増幅が見られたことを示す。
結果、Ｙ７、Ｐ３６、Ｖ９３のウラシル結合ポケット変異はｄＵＴＰ耐性濃度を高くする傾向があり、エキソ（＋）に比べ、エキソ（−）の方が、ｄＵＴＰ耐性濃度が高くなる傾向が確認された。

ＫＯＤ変異体の評価結果を表３にまとめた。表３において、ｄＵＴＰ耐性における１１段階評価は、０に近いほど塩基類似体検出活性が強く、１０に近いほど塩基類似体検出活性が低いことを表す。また表３中、○は十分に増幅した、△はある程度増幅した、×は増幅しないことを表している。

ＰｆｕにおいてもＹ７ＡとＰ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋの単変異体とＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの多重変異体を比較し、多重変異体の方増幅量が多いといった同様の結果が得られた。

（実施例３−３）
改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた長鎖ＤＮＡ増幅の評価
表２に記載のＫＯＤ変異体を用いて、ｄＴＴＰなしのｄＵＴＰのみの条件でも、１．３ｋＢを超える長鎖ＤＮＡが増幅するかどうか調べた。表２ではエキソ領域のアミノ酸変異と、ウラシル結合に関するアミノ酸変異の両方が示されている。エキソ領域のアミノ酸変異に関して、エキソ（＋）とあるのは野生型を含め３‘−５’エキソヌクレアーゼを保持している変異、エキソ（−）とあるのは３‘−５’エキソヌクレアーゼを欠失させた変異であることをそれぞれ示す。
ｄＵＴＰを含むＰＣＲにおいてＨｕｍａｎ β−グロビンの１．３ｋｂｐおよび、２．８ｋｂｐ、３．６ｋｂｐの増幅を比較した。この際、各酵素は、１Ｕあたり１μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ変異体を用いた。

ＰＣＲにはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のものを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー（１．３ｋｂｐの増幅では配列番号１３及び１４、２．８ｋｂｐの増幅では配列番号１５および１６、３．６ｋｂｐの増幅では配列番号１７および１８）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液を用いた。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１ｋｂｐあたり約１分（１．３ｋｂｐの増幅では１分３０秒、２．８ｋｂｐの増幅では３分、３．６ｋｂｐの増幅では４分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にてＰＣＲを行った。

またコントロールとして、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼでの増幅も行った。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ−Ｔａｑ Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液を、９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１ｋｂｐあたり約１分（１．３ｋｂｐの増幅では１分３０秒、２．８ｋｂｐの増幅では３分、３．６ｋｂｐの増幅では４分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＰＣＲを行った。
それぞれ反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図３は、野生型（ＫＯＤ）と、Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋの１０種のＫＯＤ変異体との計１１種を用いて、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を終濃度０．２ｍＭ含む反応系で長さの異なるＨｕｍａｎ β−グロビンＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。図３において、１．３ｋｂｐがレーン１、２．８ｋｂｐがレーン２、３．６ｋｂｐがレーン３である。さらに対照として、Ｔａｑで同様の検討を行った。また、野生型ＫＯＤを用いて、通常のｄＴＴＰでＰＣＲを行った結果も合わせて示す。

図４は、まず野生型（ＫＯＤ）のエキソ領域に、Ｈ１４７Ｅ、Ｎ２１０Ｄ、Ｉ１４２Ｒ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａのいずれかの変異を加え、さらにそれぞれにＶ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈのいずれかの変異を加えたもの（計２４種）を作製し、これらの変異体を用いて、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を終濃度０．２ｍＭ含む反応系で長さの異なるＨｕｍａｎ β−グロビンＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。図４において、１．３ｋｂｐがレーン１、２．８ｋｂｐがレーン２、３．６ｋｂｐがレーン３である。

増幅量について、Ｖ９３ＫとＰ３６Ｈとの比較、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＫとＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈとの比較、Ｖ９３ＫとＰ３６Ｒとの比較、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＫとＹ７Ａ／Ｐ３６Ｒとの比較をそれぞれ行った結果、Ｖ９３Ｋの変異より、Ｐ３６位への変異の方が増幅量が多く、長いターゲットまで増幅できることが確認された。また、単変異のものよりウラシル結合ポケットへ二重変異入れたものの方が、増幅量が多くなった。これらの変異体はＴａｑでは増幅できないような長鎖長を増幅することが可能となっていた（図３）。
また、野生型のＤＮＡポリメラーゼにＶ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨおよびＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈの各変異を施したものとエキソ（−）の変異体であるＮ２１０Ｄ、Ｉ１４２Ｒ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａの変異体に、Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨおよびＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈの各変異を施したものを比較するとエキソ（−）のＤＮＡポリメラーゼに変異を施した方が、増幅量が多い結果となった（図３および図４）。
さらに、野生型のＤＮＡポリメラーゼにＶ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨおよびＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈの各変異を施したものとＰＣＲ効率が向上する変異体であるＨ１４７ＥにＶ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨおよびＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈの各変異を施したものを比較すると、Ｈ１４７Ｅ変異体の方が多い増幅量を示された。これはＨ１４７Ｅの改変の効果がウラシル結合ポケットへの改変とは独立しており、Ｈ１４７Ｅの改変による効果により増幅量が増えたことが考えられる。（図３および図４）

ＰｆｕにおいてもＹ７ＡとＰ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋの単変異体とＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの多重変異体を比較し、多重変異体の方が増幅量が多いといった同様の結果が得られた。

（実施例４）
（実施例４−１）
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ（配列番号２７）（ｐＫＯＤＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。

（実施例４−２）
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ変異体の作製
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス株由来のＰＣＮＡ（配列番号２８）（ｐＰｆｕＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。

実施例４で作製したプラスミドを表４に示す。

（実施例４−３）
改変型耐熱性ＰＣＮＡの作製
実施例４−２で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＤＨ５α（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＰＣＮＡを得た。

（実施例４−４）
ＰＣＮＡの評価
ＰＣＮＡの効果を確認するため、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ）を用いてｄＵＴＰ存在下ＰＣＲでの増幅量の違いを、Ｈｕｍａｎ β−グロビンの１．３ｋｂを増幅することで比較した。この際、ＤＮＡポリメラーゼは、実施例３で作製した変異体のうち、ＫＯＤ Ｖ９３Ｋ変異体を用いた。ＰＣＲにはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、およびを０．２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１３及び１４）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液を９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図５は、種々のＰＣＮＡ変異体を２５０ｎｇ添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体はＭ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆの計７種である。

ＰＣＮＡの添加がない場合（レーン８）やＰＣＮＡとしてＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ変異体を用いた場合（レーン１）では、バンドがわずかに見出されたに過ぎなかったが、他のＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体を添加した場合は、増幅量が多くなり、より明確なバンドが確認された。
ＰＣＮＡは多量体を形成し核酸の合成反応を促進するが、通常、ＲＦＣの働きなしではＤＮＡにロードできず反応が進まない。Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆの改変は、多量体形成に関わる部位への改変であり、適度に多量体形成が弱まったため、ＰＣＮＡがＤＮＡにロードでき、ＰＣＲ増幅量を向上させたことが考えられる（図５）。

Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ）でも同様の実験を行い、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ変異体では、ほとんどバンドが確認できなかったが、他のＰｆｕ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ）の添加でしっかりとしたバンドが確認された。

（実施例５）
変異型ＰＣＮＡを用いた長鎖ターゲットの増幅評価
ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系で長鎖ターゲットの増幅（ＨＢｇ８．５ｋｂ）を実施し、変異型ＰＣＮＡありなしで評価した。
酵素には１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体とＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体を用い、ＨＢｇの８．５ｋｂのＰＣＲを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、ＫＯＤのＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭまたは２．０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１９および２０）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には５０ｎｇのヒトゲノム（Ｒｏｃｈｅ製）を用いた。また、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｄ１４７Ａ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、９分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。

図６は、ｄＵＴＰを含む反応液８．５ｋｂの長鎖ターゲットを変異型ＰＣＮＡ（ＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）あり／なしで増幅し、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の１，２レーン目はＰＣＮＡなし、３，４レーン目はＰＣＮＡを添加したこと示す。１、３レーン目は１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２、４レーン目は２ｍＭ ＭｇＳＯ_４の増幅を示す。
結果、変異型ＰＣＮＡなし、ＫＯＤ Ｎ２１０Ｄ Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨではＭｇＳＯ_４が１．５ｍＭでも２．０ｍＭでも増幅は見られなかったものの、変異型ＰＣＮＡを添加することで、８．５ｋｂのしっかりしたバンドを増幅することができた（図６）。

（実施例６）
変異型ＰＣＮＡを用いた血液からの増幅評価
ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系で血液から様々な長さのターゲットの増幅を実施し、変異型ＰＣＮＡありなしで評価した。
酵素には１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体とＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、抗体を混合したＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とＡｎｔｉ−Ｔａｑ Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を等量混合したもの）を用い、ＨＢｇの４８２ｂｐ、１．３ｋｂ、２．８ｋｂ、３．６ｋｂ、５．７ｋｂのＰＣＲを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、ＫＯＤのＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（４８２ｂｐの増幅は配列番号２１および２２、１．３ｂｐの増幅は配列番号１３および１４、２．８ｋｂの増幅は配列番号１５および１６、３．６ｋｂの増幅は配列番号１７および１８、５．７ｋｂの増幅は配列番号２３および２４）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）または、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には血液１μｌを用いた。また、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｄ１４７Ａ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分／ｋｂ（４８２ｂｐの増幅は１分、１．３ｂｐの増幅は１．５分、２．８ｋｂの増幅は３分、３．６ｋｂの増幅は４分、５．７ｋｂの増幅は６分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲは、１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ製品）、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）または、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には血液１μｌを用いた。また、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分／ｋｂ（上記と同様）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ
ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図７は、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰを含む反応液で様々な長さのターゲットを変異型ＰＣＮＡ（ＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）ありなしで増幅し、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したことを示す。１レーン目は４８２ｂｐ、２レーン目は１．３ｋｂ、３レーン目は２．８ｋｂ、４レーン目は３．６ｋｂ、５レーン目は５．７ｋｂの増幅を示す。
結果、ｄＴＴＰとｄＵＴＰで増幅量を比べると、ｄＵＴＰで大きく阻害が見られることがわかる。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼでは、ｄＴＴＰでは４８２ｂｐが増幅しているところ、ｄＵＴＰでは４８２ｂｐの増幅は確認できなかった。ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体では、ｄＴＴＰではすべてのターゲットで良好な増幅が見られているが、ｄＵＴＰでは４８２ｂｐ以上のターゲットでほとんど増幅が見られなかった。そこに変異型ＰＣＮＡを添加した結果は、Ｔａｑでは大差はないものの、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体では、変異型ＰＣＮＡを添加することで、増幅できなかった２．８ｋｂ以上のターゲットを増幅することができた（図７）。ＰＣＮＡ変異体の添加でｄＵＴＰ存在下、ｄＴＴＰと同等の増幅ができることが示された。また、ＰＣＮＡの添加でクルードサンプルから直接ＰＣＲも可能であることが示された。

（実施例７）
ｄＵＴＰを含む反応液を用いたＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でＰＣＮＡの添加でクルード（血液）耐性が向上するかを評価した。
酵素には、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体を用い、ＨＢｇの４８２ｂｐの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。

ＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２１および２２）、２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して０．００２％、０．０２％、０．２％、２％、５％、１０％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図８は、試料として血液を用い、ｄＵＴＰを含む反応液に血液を０．００２％、０．０２％、０．２％、２％、５％、１０％ の割合になるよう添加して、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの添加ありなしでＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋでは血液を１０％添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは血液が１０％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図８）。ＰＣＮＡ変異体はｄＵＴＰ存在下のＰＣＲでも効果があることが示された。

（実施例８）
ｄＵＴＰを含む反応液を用いたＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
図８と同様、ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でもＰＣＮＡの添加でクルード（血液）耐性が向上するかを評価した。
酵素には、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄを用い、ＨＢｇの１．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＰｆｕ−ＰＣＮＡ
Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。

ＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１３および１４）、２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して０．０２％、０．２％、 ０．５％、２％、５％、１０％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＰｆｕ−ＰＣＮＡ
Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図９は、試料として血液を用い、反応液に占める血液の割合を０．０２％、０．２％、０．５％、２％、５％、１０％ になるよう反応液を調製して、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体および、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤにＰｆｕ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしでは阻害がかかり血液から増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは血液が１０％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図９）。図８と同様、ＰＣＮＡ変異体はｄＵＴＰ存在下のＰＣＲでも効果があることが示された。

（実施例９）
ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅
ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でもＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性が向上するかを評価した。
比較には、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼを用い、ｒｂｃＬ １．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。

鋳型にはイネの葉３ｍｍ角をＢｕｆｆｅｒＡ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１００μｌに添加し、９５℃、１０分の熱処理を行ったものをライセートとして用いた。
ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤのＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２９および３０）、２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ） 、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％、４％、８％、１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃ ３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ−Ｔａｑ Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％、４％、８％、１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１、５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図１０は、試料として植物ライセートを用い、反応液に占めるライセートの割合を２、４、８、１６％になるよう反応液を調製して、種々の酵素にＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いた酵素はＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼの計２種である。
各写真の１、２、８、１６は添加された植物ライセートの割合（％）を示し、−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したことを示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄでは植物ライセートを４％以上添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは植物ライセートが８％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図１０）。ＰＣＮＡ変異体はｄＵＴＰを含む反応液でも効果があることが示された。
一方、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼではないＴａｑポリメラーゼではＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性の変化は見られなかった。ＴａｑポリメラーゼにはＰＣＮＡ変異体を添加してもクルード耐性は変わらないことが示される。

（実施例１０）
体組織（爪、髪、口腔粘膜）からのＰＣＲ
爪や髪、口腔粘膜を鋳型に、ＰＣＲができるかを検討した。爪は爪きりで切断した一片を、髪は１本を、５０ｍＭ ＮａＯＨ１８０μｌに添加し、９５℃１０分の熱処理で破砕を行い、その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０μｌを加え中和した上清を鋳型として用いた。口腔粘膜は綿棒で採取した粘膜を２００μｌの水に懸濁したものを鋳型として用いた。
酵素には１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ（野生型）とＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体とＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体を用い、ＨＢｇの４８２ｂｐのＰＣＲを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、ＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２１および２２）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭ添加したものと、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には上記サンプル１μｌを用いた。また、各反応液にＰＣＲ増強因子であるＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図１１は、試料として爪、髪、口腔粘液を用い、種々のＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応を、ＫＯＤ由来のＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）の存在下で行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤ（野生型）、ＫＯＤの変異体２種（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）の計３種である。各写真の左側がｄＴＴＰを用いた場合、右側がｄＵＴＰを用いた場合である。１レーンは爪を試料とした場合、２レーンは髪、３レーンは口腔粘膜である。それぞれの「＋」レーンは、ＫＯＤ由来のＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）の存在下であり、「−」はＰＣＮＡなしであることを示す。
結果、野生型のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼはｄＵＴＰ存在下で増幅が確認されないところ、減少した塩基類似体検出活性を持つＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＫやＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体ではｄＵＴＰ存在下でもバンドが確認された（図１１）。そこにＰＣＮＡを添加した結果、添加していないものと比べ増幅量が向上していることが確認された。

ＫＯＤの他の変異体（Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）でも同様の反応条件で、体組織（爪、髪、口腔粘膜）からの増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。またこれらに、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ）を添加すると、上記と同様、増幅量の向上が確認できた。

（実施例１１）
バイサルファイト処理済みＤＮＡの増幅評価
バイサルファイト処理後、ウラシルが含まれるＤＮＡからの増幅ができるかを検討した。メチル化の影響をなくすため、バイサルファイトに供するＤＮＡは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用い、配列番号３１および３２のプライマーで増幅した１７．５ｋｂのＰＣＲ産物を用いた。バイサルファイトはＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ Ｘｃｅｅｄ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い、ＰＣＲ、バイサルファイト処理はそれぞれ添付の取扱い説明書に準じて行った。増幅の検討はＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（５７４ｂｐの増幅は配列番号３３および３４、５１９ｂｐの増幅は配列番号３５および３６、１００４ｂｐの増幅は配列番号３５および３７、１５６１ｂｐの増幅は配列番号３８および３９、１９９３ｂｐの増幅は配列番号３８および４０）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体を含む５０μｌの反応液中に、上記バイサルファイト処理済みのＤＮＡ２０ｎｇを添加し、ＰＣＲ増強因子であるＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ変異体の添加無しと２５０ｎｇ添加したものを比較した。ＰＣＲは９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、１０秒→６８℃、１分／ｋｂ（５７４ｂｐ、５１９ｂｐ、１００４ｂｐの増幅は１分、１５６１ｂｐ、１９９３ｂｐの増幅は２分）を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図１２は、バイサルファイト処理後のＤＮＡを鋳型として様々な長さのターゲットを増幅し、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）の添加ありなしで増幅量を比較した結果を示す。各写真の左側がＫＯＤ−ＰＣＮＡ（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加せずに反応した場合、右側がＫＯＤ−ＰＣＮＡ（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加して反応した場合である。１レーンは５７４ｂｐ、２レーンは５１９ｂｐ、３レーンは１００４ｂｐ、４レーンは１５６１ｂｐ、５レーンは１９９３ｂｐのターゲットを増幅した結果を示す。結果、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加していない反応では５７４ｂｐなど増幅できないターゲットがあるところ、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加したものでは全てのターゲットでしっかりとした増幅が確認された。また増幅量もＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加したものの方が多い結果となった（図１２）。

（実施例１２）
糞便からの増幅
ｄＵＴＰ、糞便存在下で遺伝子増幅ができるかを評価した。
酵素には、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼを用い、サルモネラのｉｎｖＡ遺伝子約７００ｂｐの増幅の違いをＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉを用いたリアルタイムＰＣＲ、および融解曲線で比較した。ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にはＰＣＲ増強因子としてＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものも実施した。

阻害物質には１０％糞便懸濁液を９５℃で１０分熱処理したものを用いた。
ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤのＰＣＲは、ＫＯＤ Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、５０コピーのサルモネラゲノム、４ｐｍｏｌのプライマー（配列番号４１および４２）、 ２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ） 、１／３００００ ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉ、ＫＯＤ抗体と混合した０．４Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液中に、糞便を反応液に対して０、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５％になるように加え、９５℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃ １０秒→６８℃、３０秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。ＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａは上記反応系に１００ｎｇ加え、ＰＣＮＡなしのものと比較した。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ−Ｔａｑ Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×Ｔａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｍｇ別添タイプ）、５０コピーのサルモネラゲノム、４ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、４ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１／３００００ ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉ、抗体と混合した１Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液中に、糞便を反応液に対して０、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５％になるように加え、９５℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃ １０秒→６８℃、３０秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。
それぞれ、反応終了後、融解曲線解析にて、８０℃後半に出現する目的ピークを確認した。

実施例１６のＣｑ値を表５に示す。

表５はｄＵＴＰ、糞便存在下で行ったリアルタイムＰＣＲのＣｑ値（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０のデフォルト設定）を示す。Ｎ．Ｄ．は増幅が見られず、Ｃｑ値が求められなかったことを示す。
結果、Ｔａｑポリメラーゼでは０．５％の糞便を添加すると増幅が見られなくなるところ、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄでは２．５％の糞便を添加しても増幅が確認された。また、ＰＣＮＡありなしを比較すると、ＰＣＮＡを添加したものの方が、Ｃｑ値が小さく、優れたＰＣＲ効率を示していることがわかった。

図１４は、ｄＵＴＰ、糞便存在下でＰＣＲを用い、得られた増幅産物の融解曲線解析の結果を示す。用いたポリメラーゼはＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したもの、Ｔａｑポリメラーゼの計３種である。
１はＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄの結果を、２はＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤにＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものの結果を、３はＴａｑポリメラーゼの結果を示す。
結果、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤではｄＵＴＰ、糞便存在下からでも増幅が確認され、糞便の添加でピークは低くなるものの、２．５％を添加しても、目的ピークを確認することができた。ＰＣＮＡを添加したものでも同様に、２．５％の添加でも目的ピークを確認することができた。しかし、Ｔａｑポリメラーゼでは０．２５％の添加で目的ピークが消失しており、糞便の影響で阻害を受けたことが示唆された（図１４）。

ＫＯＤの他の変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）でも同様に２．５％糞便が含まれる反応系で増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。

またＰＣＮＡも、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａの変異体で、同様の反応を行い、ＰＣＮＡ添加なしに比べＰＣＲ効率の向上が確認できた。

Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体でも同様に２．５％糞便が含まれる反応系で増幅を確認し、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの変異体で、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

本発明によって、ＤＮＡ精製の際のロスやキャリーオーバーの危険性をなくし、さらに時間・コストを削減することができる。また、ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法によるコンタミネーションを防げるため、研究分野だけでなく、同じサンプルを何度も増幅する遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等においても広く利用することができる。

Claims (11)

1. 塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させる方法であって、前記反応組成に、
   （ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体、および
   （ｂ）ＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ）
   を含む、前記核酸増幅方法。
2. 減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体が、以下の（ａ１）から（ａ３）のいずれかで示されるものである、請求項１に記載の核酸増幅方法。
   （ａ１）配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （ａ２）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目以外の部位において少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号１との同一性が８０％以上またはそのアミノ酸配列と配列番号２との同一性が８０％以上であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
   （ａ３）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
3. 減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項２に記載の核酸増幅法。
4. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがさらに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する変異体である、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅法。
5. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列のＤ１４１、Ｉ１４２、Ｅ１４３、Ｈ１４７、Ｎ２１０及びＹ３１１に相当するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変である、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅法。
6. ＰＣＮＡが、以下の（ｂ１）から（ｂ３）のいずれかで示されるものである、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸増幅方法。
   （ｂ１）配列番号１１または配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、下記（ｘ）および（ｙ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくともひとつの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチド。
   （ｘ）８２、８４、１０９番目のアミノ酸残基群
   （ｙ）１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸残基群
   （ｂ２）（ｂ１）で示されるＰＣＮＡにおいて、さらに、（ｘ）および（ｙ）で示される群以外の部位において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
   （ｂ３）配列番号１１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、または、配列番号１２で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
7. ＰＣＮＡが配列番号１１または配列番号１２の、１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、または、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅方法。
8. 精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する請求項１〜７のいずれかに記載の核酸増幅法。
9. 生体試料が、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルスのいずれかである請求項１〜８のいずれかに記載の核酸増幅法。
10. 以下の（ａ）から（ｅ）を含む、核酸増幅反応を行うための試薬。
    （ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体
    （ｂ）ＰＣＮＡ
    （ｃ）プライマー対
    （ｄ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））
    （ｅ）Ｍｇイオンを含むバッファー溶液
11. 請求項１０に記載の試薬を含むキット。