CN113260700A - 基于可检测标签与靶蛋白的CRISPR/Cas控制的整合而选择细胞的方法 - Google Patents

基于可检测标签与靶蛋白的CRISPR/Cas控制的整合而选择细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本文报道了一种用于提供表达来自标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白的细胞的方法，所述方法由以下步骤组成：a)用以下项转染所述细胞：i)额外含有核酸的Cas9编码质粒，所述核酸对于第一选择试剂具有抗性，ii)含有第一核酸和第二核酸的环状供体质粒，所述第一核酸赋予对于第二选择试剂的抗性，所述第二核酸编码所述标志物蛋白并且其3'和5'侧翼具有与所述细胞中的整合位点同源的核酸，iii)合适的合成crRNA，和iv)合适的合成tracrRNA；b)在存在所述第一选择试剂和所述第二选择试剂的情况下培养所述细胞；以及c)选择在步骤b)的条件下进行细胞分裂的细胞，并且由此提供/生产表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白的细胞。

Description

基于可检测标签与靶蛋白的CRISPR/Cas控制的整合而选择细 胞的方法
技术领域
本发明属于将核酸非治疗性(体外)靶向整合到细胞DNA中以生成以经标记的形式表达内源蛋白的细胞及其应用的技术领域。
背景技术
近年来，CRISPR/Cas技术在自然科学家中迅速普及(1)。尽管早在1987年就在大肠杆菌中发现了CRISPR基因的功能，但直到很晚之后的2007年才解释了CRISPR基因的功能(2,3)。2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier解码了完整的机制，并将其作为现有基因工程工具的一个很好的替代品(4)。2013年，张峰发表了第一篇关于人类细胞中基于CRISPR/Cas的基因组编辑的出版物(5)。
研究新的和/或未知的抗原的一个常见问题是缺乏市售的特异性抗体。这使表达或细胞定位方面的表征复杂化。
通常，待研究的抗原带有标签并已经在细胞中重组生产。由于表达发生在病毒启动子的控制下，导致抗原的过表达，因此实验通常会产生失真或不正确的数据。
发明内容
本发明的目的是一种新的提供细胞的方法，该细胞例如将药理学上有意义的细胞蛋白作为其与标志物蛋白(即，蛋白质性可检测标记物)的融合蛋白而表达。此类细胞能够研究这种细胞蛋白质以及这种蛋白质直接(即，在其自然环境中)参与细胞中或细胞表面的代谢过程。因此，经标记的蛋白质是在自然条件下从其天然基因座表达的，即，例如，相对于蛋白质的天然表达水平，没有过表达或表达不足，这通常发生在蛋白质作为与标志物的融合蛋白被重组引入细胞的情况下。
通过根据本发明的方法获得的细胞尤其可以用于鉴定和选择改变内源靶蛋白的生物学活性的抗体。
因此，本发明的目的是新的用于直接在细胞内或细胞表面上研究药学上感兴趣的蛋白质的方法，其中该蛋白质已经在细胞中通过与标志物蛋白融合而在其内源基因座中被修饰。
本文所述的发明至少部分地基于以下发现：通过使用CRISPR/Cas9技术，可以将蛋白质直接在细胞内与可检测标记物或标签直接在蛋白质的内源基因座处缀合，其中在/可以在经修饰的细胞中获得该蛋白质的天然表达水平。
本文所述的发明至少部分地基于以下发现：对Cas9核酸酶和供体质粒的抗生素介导的双重选择最适合于标志物蛋白(标签)的敲入。
本文所述的发明至少部分地基于以下发现：与使用线性化形式的供体质粒相比，使用环状构象的供体质粒可以实现显著更高的编辑率。
在根据本发明的方法中，包含第一抗性盒(例如，嘌呤霉素抗性盒)的Cas9编码质粒与作为修复模板的含有第二抗性盒(例如，潮霉素B抗性盒)的环状供体质粒以及合适的合成crRNA和tracrRNA共转染。选择是对两种抗性的双重选择，例如，潮霉素B用于对供体质粒的抗性，而嘌呤霉素用于对Cas9质粒的抗性。
本发明的一个方面是用于提供/生产表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白的细胞的(体外)方法，所述细胞内源靶蛋白来自靶蛋白的细胞内源基因座，其中所述方法包括以下步骤：
a)用以下项转染所述细胞：i)含有核酸的Cas9编码质粒，其赋予对于第一选择试剂的抗性，ii)环状供体质粒，其包含：a)第一核酸，其赋予对于第二选择试剂的抗性，和b)第二核酸，其编码标志物蛋白并且其3'和5'侧翼具有与该细胞整合位点同源的核酸，其中侧翼同源核酸中的一者与靶蛋白的末端编码序列同源，iii)合适的crRNA，以及iv)合适的tracrRNA，
b)在存在第一选择试剂和第二选择试剂的情况下培养细胞，以及
c)选择在步骤b)的条件下进行细胞分裂/生长的细胞，从而提供/生产表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白的细胞。
本发明的另一方面是一种用于确定/表征抗体对于其靶分子是激动性还是拮抗性(或无活性)的(体外)方法，其包括以下步骤：
-任选地确定靶蛋白的生物学活性，
-将表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白并且已经通过根据本发明的方法获得的细胞与待测抗体一起孵育，
-确定在存在待测抗体的情况下内源靶蛋白的生物学活性如何改变，并且，如果与抗体孵育后生物学活性增加，则将抗体表征为激动性抗体，和/或如果与抗体孵育后生物学活性降低，则将抗体表征为拮抗性的(和/或如果与抗体孵育后生物活性未改变，则将抗体表征为无活性的)。
本发明的另一方面是用于选择与靶分子特异性结合的抗体的(体外)方法，包括以下步骤：
-将表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白并且已经通过根据本发明的方法获得的细胞与一种待测抗体一起孵育或与两种或更多种抗体独立地一起孵育，
-确定内源靶蛋白的生物活性在存在待测抗体的情况是否改变，如果生物活性在与抗体孵育时发生改变，则选择该抗体。
在一个优选实施例中，用全部质粒和核酸同时转染细胞。
在一个实施例中，在步骤c)中，选择进行细胞分裂并且所述细胞中已经检测到融合蛋白的细胞。
在一个优选实施例中，步骤b)和步骤c)为以下步骤：
b)1)在仅存在第一选择试剂的情况下或在仅存在第二选择试剂的情况下培养细胞，
2)选择在步骤1)的条件下分裂/生长的细胞，
3)在存在步骤1)中未使用的选择试剂的情况下培养在步骤2)中选择的细胞，
c)选择在步骤b)3)的条件下进行细胞分裂/生长的细胞，从而提供/生产表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白的细胞。
在一个实施例中，第一选择试剂和第二选择试剂选自由以下项组成的组：新霉素/G418(新霉素磷酸转移酶)、组氨醇(组氨醇脱氢酶)、潮霉素B(潮霉素磷酸转移酶)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、胸苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、杀稻瘟菌素、嘌呤霉素、博莱霉素(zeocin)和霉酚酸。在一个优选实施例中，第一选择试剂和第二选择试剂是嘌呤霉素和潮霉素B，反之亦然。
在一个优选实施例中，最终潮霉素B浓度为50μg/mL。
在一个优选实施例中，最终嘌呤霉素浓度为2μg/mL。
在一个实施例中，细胞内源靶蛋白是可溶性蛋白或膜结合蛋白。
在一个实施例中，在存在多个用于标志物蛋白(标签)的可能插入位点的情况下，编码标志物蛋白的核酸被插入在含有更多个和/或更具特异性的gDNA结合位点的位点处。
在一个优选实施例中，细胞为哺乳动物细胞。
在一个实施例中，标志物蛋白被C端地或N端地引入到内源靶蛋白。在一个优选实施例中，标志物蛋白编码核酸被N端地直接插入到细胞内源蛋白的起始密码子之后。
在一个实施例中，
i)所述标志物蛋白被N端地插入到所述靶蛋白，
ii)编码所述标志物蛋白的核酸被插入到所述内源基因座中，使得其直接位于所述融合蛋白的mRNA中所述靶蛋白的第一密码子之前(对于所述第一密码子而言为3'方向)，
并且
iii)3'侧翼核酸包含编码所述靶蛋白的核酸的起始密码子，或/和5'侧翼核酸与所述靶蛋白的N端同源。
在一个实施例中，在标志物蛋白和靶蛋白之间插入长度最多为25个氨基酸的连接蛋白。在一个优选实施例中，连接蛋白包含4个至10个氨基酸残基。
在一个实施例中，标志物蛋白编码核酸被N端地直接插入到细胞内源蛋白的起始密码子之后。在该实施例中，3'侧翼核酸包含编码靶蛋白的核酸的起始密码子，或/和5'侧翼核酸与靶蛋白的N端同源，反之亦然。
在一个优选实施例中，编码标志物蛋白的核酸不含起始密码子。
在一个实施例中，标志物蛋白为荧光标志物蛋白。在一个实施例中，荧光标志物蛋白选自由以下项组成的组：绿色荧光蛋白(GFP)、TagBFP、mTagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire(H9-40)、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise(改善型SCFP3A)、mTurquoise2、单体Midoriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、单体Azami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、单体Kusabira orange、mKOκ、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby、mRuby2和UnaG。在一个实施例中，荧光标志物蛋白为GFP。在一个优选实施例中，荧光标志物蛋白为eGFP(增强型绿色荧光蛋白)。
在一个实施例中，标志物蛋白为Myc标签
在一个优选实施例中，3'和5'侧翼同源核酸具有约1000个核苷酸的长度(5'侧翼同源核酸包含插入位点上游序列的约1000个核苷酸，3'侧翼同源核酸包含插入位点下游序列的约1000个核苷酸)。
附图说明
图1在插入具有相应转录mRNA和从其翻译的蛋白质的N端eGFP标签之前，基因组中人类TUBA1B基因座的示意图。编码序列(深蓝色)侧翼是非翻译区(浅蓝色)以及内含子序列(灰色)。
图2在插入具有转录mRNA和从其翻译的蛋白质的N端eGFP标签之后，基因组中人类TUBA1B基因座的示意图。编码序列(深蓝色)侧翼是非翻译区(浅蓝色)以及内含子序列(灰色)。
图3用于在基因组TUBA1B基因座处引入外显子2上游的eGFP序列的敲入策略。三个特异性gRNA在外显子2的开头结合并使用Cas9生成双链断裂。供体质粒包含要插入的eGFP序列，周围是1kb同源序列，用于同源重组。供体质粒的3'同源序列上的星号(*)鉴定gRNA结合位点的点突变区域。
图4Cas9-PuroR质粒(Dharmacon)的质粒图谱。
图5pCas9-Guide-EF1α-CD4质粒(Origene)的质粒图谱
图6具有潮霉素B抗性盒的供体质粒的质粒图谱
图7用于制备供体质粒的eGFP潮霉素B质粒的质粒图谱。
图8HEK293A野生型细胞用两种TUBA1B特异性crRNA、tracrRNA、环状供体质粒和Cas9-PuroR质粒转染。用嘌呤霉素进行选择后，将单个细胞以96孔格式沉积。此处显示的是crRNA1样品的门控策略。经由FSC和SSC通道对可行的单细胞进行门控。可以通过FITC通道检测eGFP的存在。样品(蓝色)的FITC信号在直方图中与野生型(黑色)一起归一化，并放大显示。沉积来自经标记的P3门和P4门的单个细胞。
图9HEK293A野生型细胞用两种TUBA1B特异性crRNA、合成tracrRNA、环状供体质粒和Cas9-PuroR质粒转染。用嘌呤霉素进行选择后，将单个细胞以96孔格式沉积。显示了crRNA2样品的门控策略。经由FSC和SSC通道对可行的单细胞进行门控。可以通过FITC通道检测eGFP的存在。样品(蓝色)的FITC信号在直方图中与野生型(黑色)一起归一化，并放大显示。沉积来自经标记的P3门和P4门的单个细胞。
图10对来自敲入策略V1的克隆体的cDNA进行PCR以检查基因组水平的敲入。TUBA1B和eGFP-TUBA1B的cDNA以及供体质粒的一部分的示意图。箭头表示所用引物的结合位点。只有当TUBA1B前面发生eGFP的精确敲入时，两种引物才能结合。编码序列用浅蓝色标识，未翻译的区域用灰色标识。
图11对来自敲入策略V1的克隆体的cDNA进行PCR以检查基因组水平的敲入。将使用引物eGFP fwd和TUBA1B Exon4 rev对克隆体(1至23)和野生型(WT)的cDNA进行的PCR应用于琼脂糖凝胶。在精确敲入的情况下，应扩增999bp的产物。
图12通过成像分析来自敲入策略V1的克隆体中eGFP-TUBA1B蛋白的功能。将细胞固定、透化并用GFP-Alexa Fluor 647抗体染色。细胞核用Hoechst 33342染色。内源eGFP在488nm被刺激，来自GFP抗体的Alexa Fluor 647在647nm被刺激，结合的Hoechst 33342染料在355nm被刺激。从每种克隆体中，用40倍物镜记录40个像素。在每种情况下都显示了代表性的图像部分。
图13来自敲入策略V2的经转染样品的单细胞沉积。HEK293A野生型细胞用三种TUBA1B特异性crRNA、tracrRNA、环状或线性化供体质粒和Cas9-PuroR质粒转染。用潮霉素B和嘌呤霉素进行双重选择后，将单个细胞以96孔格式沉积。显示了crRNA1样品1L、crRNA2样品2L和crRNA3样品3L的FITC直方图，每个样品都具有线性化的供体质粒；以及crRNA1样品1Z、crRNA2样品2Z和crRNA3样品3Z的FITC直方图，每个都具有环状供体质粒。经由FSC和SSC通道对可行的单细胞进行门控。可以通过FITC通道检测eGFP的存在。样品(蓝色)的FITC信号在与野生型(黑色)的叠加图的直方图中归一化并放大。来自FITC阳性门的单细胞被沉积。
图14分析来自敲入V2的克隆体的完整eGFP-TUBA1B序列。将使用引物cDNA fwd和cDNA rev对克隆体和野生型(WT)的cDNA进行的PCR应用于琼脂糖凝胶。该PCR设计为扩增eGFP-TUBA1B的整个编码区，并在敲入时产生2085bp的产物。
图15通过成像分析敲入策略V2的克隆体中eGFP-TUBA1B的功能。将细胞固定、透化并用GFP-Alexa Fluor 647抗体染色。细胞核用Hoechst 33342染色。内源eGFP在488nm被刺激，用GFP-Alexa Fluor 647抗体进行的染色在647nm被刺激，而结合的Hoechst 33342染料在355nm被刺激。从每种克隆体中，用20倍物镜记录40个像素。此处显示了代表性图像部分。
图16来自敲入策略V3的经转染样品的CD4阳性细胞的池分选。HEK293A野生型细胞用三种具有不同gRNA序列的pCas-Guide EF1α-CD4质粒之一和环状或线性化供体质粒转染。48小时后，沉积了CD4阳性细胞池。来自gRNA1/2/3的经转染样品含有pCas-Guide-EF1α-CD4质粒和线性供体(1L/2L/3L)，而来自gRNA1/2/3的经转染样品含有pCas-Guide-EF1α-CD4和环状供体质粒(1Z/2Z/3Z)，并用APC缀合抗CD4抗体染色。直方图显示了被染色样品(蓝色)和被染色野生型(黑色)的归一化APC信号。来自APC阳性门的细胞被分类为来自细胞悬液的池。
图17来自敲入策略V3的CD4阳性池样品的单细胞沉积。在用潮霉素B对CD4进行池分选后24小时选择样品。来自生长细胞的单个细胞以96孔格式沉积。显示了gRNA1样品1L、gRNA2样品2L和gRNA3样品3L的FITC直方图，每个样品都具有线性化的供体质粒；以及gRNA1样品1Z、gRNA2样品2Z和gRNA3样品3Z的FITC直方图，每个都具有环状供体质粒。经由FSC和SSC通道对可行的单细胞进行门控。可以通过FITC通道检测eGFP的存在。样品(蓝色)的FITC信号在叠加的直方图中与野生型(黑色)一起归一化，并放大显示。沉积来自FITC阳性门的单个细胞。
图18分析来自敲入策略V3的克隆体的完整eGFP-TUBA1B序列。将使用引物cDNAfwd和cDNA rev对克隆体和野生型(WT)的cDNA进行的PCR应用于琼脂糖凝胶。通过这种PCR，当发生精确的敲入时，eGFP-TUBA1B的整个编码区应该被放大以得到2085bp的产物。
图19敲入策略V3的克隆体的PCR。使用引物Hygro fwd(SEQ ID NO:26)和Hygrorev(SEQ ID NO:27)对克隆体(1至27)、野生型(WT)和供体质粒(D)的cDNA进行PCR，扩增来自潮霉素B抗性盒中的一个区域。特异性产物具有324bp的大小。
图20敲入策略V3的克隆体的PCR。使用引物eGFP_2fwd和eGFP_2rev对克隆体(1至27)、野生型(WT)和供体质粒(D)的cDNA进行PCR，扩增来自eGFP序列的一个区域。特异性产物具有300bp的大小。
具体实施方式
定义
CRISPR：成簇的规则间隔短回文重复序列；规则间隔的成组短回文重复序列
CAS蛋白：CRISPR相关蛋白；具有核糖核酸酶活性，可以结合特定的RNA序列
CAS9：核酸内切酶Cas9；结合RNA序列GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)(crRNA重复序列)(SEQ ID NO:34)并在那里切割DNA
crRNA：由crRNA重复序列和crRNA间隔序列组成；具有特定的二级结构；crRNA被Cas9结合，从而诱导Cas9的构象变化，其中靶DNA可以被crRNA间隔序列(与靶DNA互补)结合；通过交换crRNA间隔序列，可以改变靶DNA(以靶向DNA互补RNA序列)；crRNA重复序列由20个核苷酸组成；与PAM基序相邻的12个核苷酸对于结合特异性至关重要
PAM基序：前间隔序列相邻基序；与前间隔序列相邻的基序；序列NGG；在靶DNA中；靶DNA的切割发生在PAM之前的三个核苷酸处
tracrRNA：反式作用CRISPR RNA；与crRNA部分地互补；形成RNA双螺旋；由RNaseIII激活；结合靶DNA；核酸内切酶功能在结合位点附近切割
sgRNA：单向导RNA；含有crRNA和tracerRNA的单链RNA
基因座：基因在染色体上的定位；基因在基因组中的位置；基因定位
内源：在细胞内自然发生；由细胞自然地生产；内源基因座/细胞内源基因座：细胞中天然存在的基因座；
3'侧翼序列：位于核苷酸序列3'末端(下游；下方)的序列
5'侧翼序列：位于核苷酸序列5'末端(上游、上方)的序列
供体序列：5'侧翼序列-靶序列-3'侧翼序列
供体质粒：含有供体序列的质粒
侧翼核苷酸序列：在待插入序列之前或之后的核酸序列片段(＝靶序列)
CRISPR/Cas9技术
在大约40％的细菌和90％的古细菌中发现了天然CRISPR/Cas系统，作为针对病毒入侵者的适应性免疫防御的一部分(1,6)。CRISPR(成簇的规则短间隔回文重复序列)是被特定间隔序列周期性打断的短序列重复序列。在基因组中，该基因座两侧是CRISPR相关基因，简称Cas。这些代码用于解旋酶和核酸酶(1,7)等。
使用CRISPR/Cas9的防御机制可以使用化脓性链球菌的示例解释如下：传入的外来DNA的前间隔序列被整合到天然CRISPR基因座中。该区域的翻译产生pre-crRNA(pre-CRISPR RNA)，它通过与tracrRNA(反式激活crRNA)的碱基配对形成复合物。这由RNase III等进一步处理，产生crRNA:tracrRNA双链体，该双链体作为向导RNA(gRNA)而发挥作用。gRNA与传入的外来DNA互补，通过募集和激活Cas9核酸内切酶退火并影响DNA裂解。这有两个核酸酶结构域，RuvC和HNH，每个结构域都会在DNA的两条链中产生断裂，从而导致双链断裂。这种机制的先决条件是一个短的、保守的序列，即PAM序列(前间隔序列相邻基序)位于gRNA靶序列的下方(下游)(3,8)。这是Cas9的结合信号，并因此对DNA裂解至关重要。在化脓性链球菌的例子中，Cas9核酸内切酶切割特定PAM 5'-NGG-3'序列上游的三个碱基。即使gRNA和DNA基因座具有完全互补的序列同源性，但在没有PAM序列的情况下，核酸酶也会跳过。这使免疫系统能够区分自己的DNA和外来DNA。细菌基因组CRISPR基因座中的靶序列不包含PAM序列，因此可免于核酸酶消化(6,9)。
通常，可以对各种CRISPR系统进行分类，它们的PAM序列以及涉及的Cas蛋白的数量和类型都不同。来自化脓性链球菌的II型是基因工程实验室中表征最好且最常使用的(8,10,11)。2012年，Doudna和Charpentier认识到了这种天然系统作为基因工程工具的潜力。他们还证明，crRNA和tracrRNA融合成单向导RNA(sgRNA)生成DNA裂解的效率与天然crRNA:tracrRNA双链体一样。结果是一个由sgRNA和Cas9组成的分子生物学双组分系统，可用于很容易地生成基因组修饰(4,12)。
DNA双链断裂的生成导致细胞中修复机制的激活。非同源末端接合(NHEJ)的特点是非常容易出错，因为它会导致插入缺失(indel)和移码突变的形成，并因此导致基因敲除。较少情况下，修复是通过同源定向修复(HDR)进行的。因此，可以在存在修复模板的情况下对基因座进行定义的修饰，甚至可以将整个序列块并入特定的基因组区域(13,14)。
本发明的示例性具体实施例
在研究新的和/或未知的蛋白质(例如，作为治疗性抗体的抗原)时经常出现的问题是缺乏针对所述蛋白质的市售特异性抗体。这使蛋白质的例如关于表达或细胞定位的表征复杂化。
迄今为止，待检测的蛋白质/抗原已经在体外与标志物蛋白质缀合，然后被重新引入细胞并重组生产。因为人工的(即外源的)融合蛋白被重组地引入细胞，表达发生在病毒启动子的控制下，这导致融合蛋白的与其内源表达水平相比的过表达。结果，基于这一点的实验经常产生失真或不正确的数据。
本发明至少部分地基于以下发现：通过CRISPR/Cas9技术，可以内源地将蛋白质/抗原与标志物蛋白质融合，即为其提供可检测的标签，其中融合蛋白在内源基因位点被表达，从而保持天然基因表达率/水平。
这种所谓的“敲入”序列到细胞的基因组DNA中已被证明是非常重要的。
本发明至少部分地基于以下发现：抗生素介导的对带有Cas9核酸酶的第一质粒和带有靶序列的第二供体质粒的双重选择最适合于标志物蛋白的敲入。尽管可以通过对Cas9核酸酶的单独选择获得正确敲入的克隆体，但效率明显较低。通过额外引入的CD4标志物进行选择并结合对供体质粒的抗生素选择被证明是完全不成功的。
本文所述的发明至少部分地基于以下发现：与当使用呈线性形式的供体质粒时相比，使用呈环状构象的供体质粒可获得明显更高的并入率/编辑率/效率。
应当注意，根据本发明的方法可以用靶细胞的任何内源基因进行。该基因的自然表达越强，可以通过融合的标志物蛋白获得的可检测信号越强。
还应注意，内源蛋白质的属性(即它是可溶的、膜结合的还是膜性的)在根据本发明的方法中没有作用。
标志物蛋白被引入的位置也是完全可变的。它可以被N端地、内部地(仅当蛋白质的生物学功能不会因此被破坏)或C端地融合/引入。尽管如此，内源蛋白质的N端和C端对于融合是优选的。
还应该注意的是，可以使用任何可检测的标志物蛋白。特别优选荧光标志物蛋白。然而，也可以使用构象标志物蛋白。其检测是通过经标记的二抗进行的。
应当注意，根据本发明的方法可以用任何细胞进行。优选哺乳动物细胞。更优选人细胞。
实例：α微管蛋白1β(TUBA1B)作为内源基因
选择内源α-微管蛋白1β链(TUBA1B)作为蛋白质/潜在抗原的非限制性实例。该蛋白质在N端用eGFP标志物蛋白作为可检测标记物进行标签化。
α微管蛋白1β(TUBA1B)是α-微管蛋白的亚型，是五种微管蛋白同工型之一，它们的表达差异性地取决于细胞类型、组织和发育阶段(15)。
内源TUBA1B基因通过CRISPR/Cas9技术在贴壁生长的HEK293A细胞中与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)标志物蛋白/标签/可检测标记物(SEQ ID NO:32)N端融合。为此目的，将eGFP编码序列(SEQ ID NO:33)插入到细胞的基因组中，使其在mRNA水平上紧随内源TUBA1B起始密码子之后。
当以基因组水平分析靶基因时，起始密码子ATG是外显子1的最后一个三联体。这导致标签有两个可能的插入位点：直接在外显子1的3'端ATG后面或外显子2前面的5'末端。检查这两个基因座的可能的gRNA结合位点。发现在外显子2的5'端附近存在比在外显子1的ATG后面更特异性的gRNA结合位点。
因此，在存在多个可能的插入位点的情况下，在本发明方法的一个实施例中，将编码标志物蛋白的核酸插入到细胞中靶蛋白的内源基因座的位点处，该位点含有更多个和/或更具特异性的gDNA结合位点。
在此基础上，使用三种特异性gRNA在外显子2前面进行了敲入(图1和图2)。通过招募Cas9核酸酶，这些在距离插入位点23到80个碱基处产生双链断裂。通过与修复模板(也称为供体质粒或短供体)共转染，eGFP标签通过同源重组被精确地并入。为此目的，将要并入的序列放置在供体质粒上，该序列准确地说是没有内部ATG但具有C端G4S连接基的eGFP序列，两侧各有一个1kb长的同源序列(臂)。5'同源序列包含来自插入位点的约1kb的上方/上游序列，3'同源序列包含来自插入位点的约1kb的下方/下游序列(图3)。
执行了三种敲入策略，其中所有策略都需要Cas9核酸酶、特异性gRNA和供体质粒。这些策略在使用的成分和选择方法上有所不同。
在敲入策略V1中，包含嘌呤霉素抗性盒的Cas9编码质粒与没有选择标志物的环状供体质粒以及特异性合成crRNA和tracrRNA共转染。专门用嘌呤霉素对Cas9编码质粒进行选择。
在敲入策略V2中，包含嘌呤霉素抗性盒的Cas9编码质粒与具有潮霉素B抗性盒的环状供体质粒以及特异性合成crRNA和tracrRNA共转染。选择以潮霉素B用于供体质粒和嘌呤霉素用于Cas9编码质粒的双重选择进行。
在敲入策略V3中，Cas9核酸酶和sgRNA组合在一个质粒上。这另外包含一个用于选择的CD4标志物。供体质粒对应于策略V2。因此，通过潮霉素B对供体质粒进行双重选择，对核酸酶/gRNA质粒进行CD4双重选择。
对于V2策略和V3策略，另外使用了两种不同的方法：在转染之前对供体质粒进行线性化和不进行线性化。
通过同源重组为eGFP标志物蛋白的特异性敲入生成修复模板：在一种情况下是没有选择标志物的供体质粒，在另一种情况下是具有潮霉素B抗性盒的供体质粒。
除了复制起点(ori)外，没有选择标志物的供体质粒还包含氨苄青霉素抗性盒，即待引入同源3'和5'侧翼序列的eGFP序列。通过PCR从基因组DNA扩增3'同源序列。凝胶提取后，将其作为模板用于使用具有3'同源序列特异性的引物的第二PCR。所有PCR样品在琼脂糖凝胶中都显示出预期大小的干净条带，并从凝胶中纯化出来。使用TUBA1B特异性引物D_5'HA fwd(SEQ ID NO:12)和D_5'HA rev(SEQ ID NO:13)对来自HEK293A野生型细胞的基因组DNA进行PCR，以生成5'同源序列。使用TUBA1B特异性引物D_3'HA-Z fwd(SEQ ID NO:18)和D_3'HA-Z rev(SEQ ID NO:19)对来自HEK293A野生型细胞的基因组DNA进行PCR以生成中间产物。由此通过使用引物D_3'HA fwd(SEQ ID NO:16)和D_3'HA rev(SEQ ID NO:17)的PCR生成具有gRNA1和gRNA2结合位点的点突变的3'同源序列。四个片段，即主链、5'HA、eGFP和3'HA(HA＝同源臂/序列)，在其末端具有重叠序列，允许通过无缝克隆以正确的顺序和取向进行同时连接。通过测序确认正确的克隆。供体质粒由具有潮霉素B抗性盒的最终构建体生成。这作为PCR的模板来放大完整的5'HA-eGFP-3'HA片段。将PCR产物直接纯化并用限制酶消化，并连接到质粒pAH-0163的主链中。除了ori外，它还包含一个氨苄青霉素抗性盒和一个潮霉素B抗性盒。经消化的样品在琼脂糖凝胶中分离、切除和纯化。正确取向的连接是通过限制性消化形成的互补末端完成的。还通过测序验证了具有潮霉素B抗性盒的供体质粒的正确性。
HEK293A野生型细胞分别用不同浓度的抗生素(a)潮霉素B和(b)嘌呤霉素处理72小时。细胞活力用CellTiter-Glo测定法确定。
在20μg/mL的浓度，HEK293A(野生型)细胞的细胞存活率降低至不到20％。在进一步增加至300μg/mL的浓度时，细胞的存活率在10％和30％之间变化。对于选择，使用50μg/mL的最终潮霉素B浓度。在此浓度下，预计存活率约为12％。
对于嘌呤霉素，细胞存活率在最低浓度缓慢下降，在2μg/mL嘌呤霉素的浓度低于15％。对于选择，使用2μg/mL的最终嘌呤霉素浓度，预计存活率约为12％。
1)敲入策略V1：通过抗生素进行Cas9编码质粒的单选
Cas9-PuroR质粒
环状供体质粒
crRNA1或crRNA2
tracrRNA
在第一种敲入策略中，将细胞用Cas9-PuroR质粒、环状供体质粒以及特异性合成crRNA和tracrRNA转染。专门用嘌呤霉素在Cas9质粒上进行10天的选择。此后，将分别用crRNA1(SEQ ID NO:07)或crRNA2(SEQ ID NO:08)转染的细胞的单细胞沉积在十个96孔板中。对于每个crRNA，沉积了九个含有来自P3门的活单细胞的板和一个具有来自P4门的FITC阳性活单细胞的板(图8和图9，样品的FITC信号(蓝色)被归一化并与直方图中的野生型(黑色)一起显示(放大))。可以通过FACS(荧光激活细胞分选)经由FITC通道检测并入细胞中的eGFP。在放大视图中，FITC信号的直方图显示一小部分细胞群指示FITC信号发生了变化(图8和图9)。增加的FITC信号可归因于eGFP的表达，因为缺少起始密码子，这只有在来自供体质粒的eGFP序列已被按框导入基因组中的翻译区域中时才有可能。
3周后，通过显微镜确定沉积的单细胞的生长率，总计63％。随后，通过FACS分析细胞的FITC信号(结果见表1)。
表1：对于每个crRNA和每个门，在单细胞沉积后鉴定潜在阳性克隆体的数量。经检查的克隆体总数在括号中说明。效率由潜在阳性克隆体的数量与经检查的克隆体的数量之比得出。
Figure BDA0003141216170000151
FITC信号显著高于野生型的克隆体被进一步扩展和表征。从总计983个分析的克隆体中检测到总计23个潜在阳性克隆体(见表1)。在第一个FACS筛选中，所有克隆体都提示向FITC阳性区域位移了大约一个对数步长。
通过FACS筛选定期分析克隆体以检查其在连续培养过程中的信号稳定性。17代培养后的FACS数据显示克隆体之间存在一些差异。许多克隆体具有与第一次FACS筛选相当的信号。两个克隆体的FITC信号强度显著下降(图10，表2)。
表2：通过FACS分析生长的克隆体的eGFP信号。经由FSC和SSC通道对可行的单细胞进行门控。可以通过FITC通道检测eGFP的存在。扩展并进一步分析转移到FITC阳性区域的克隆体。连续培养后，在第17代再次检查FITC信号的稳定性。++＝无变化；+＝信号略有减弱；o＝信号强烈减弱；-＝无信号。
Figure BDA0003141216170000152
Figure BDA0003141216170000161
FACS数据显示，许多已鉴别的克隆体具有稳定的eGFP信号。
在基因组水平上验证了敲入。为此目的，对克隆体的cDNA进行了PCR。从细胞中分离总RNA并转化为cDNA。使用在eGFP区域中结合的正向引物(SEQ ID NO:30)和在TUBA1B的外显子4中结合的反向引物(SEQ ID NO:31)进行PCR。选择引物以便只有在eGFP序列到TUBA1B的外显子2之前的精确引入已经发生时才能扩增特异性产物。在野生型细胞中，只有反向引物可以结合。只有正向引物可以与供体质粒结合，因为反向引物的结合位点位于3'同源序列的序列之外。因此，即使质粒可能随机整合到细胞的基因组中，也不应该出现扩增产物(图10)。
PCR在琼脂糖凝胶中产生干净的条带，没有任何明显的副产物(图11)。通过PCR和测序在DNA水平上验证了敲入(数据未显示)。将条带切除、纯化和测序。因此，所有克隆体的DNA中存在的三个序列差异都是沉默突变，不会导致蛋白质序列发生任何变化。
蛋白质的功能性，即eGFP-TUBA1B融合蛋白由此形成β-微管蛋白异二聚体和微管的能力，在显微镜下得到验证。为此，将细胞固定、透化并用Alexa Fluor 647缀合物抗GFP抗体染色。此外，细胞核用Hoechst 33342染色。共聚焦显微图像是在Operetta中拍摄的。图12显示了克隆体1、2和16的代表性图像。
对于所有克隆体，内源eGFP信号不足以进行显微镜检查，因此使用Alexa Fluor647缀合物抗GFP抗体对eGFP进行额外染色。这种染色揭示了微管蛋白细胞骨架的清晰可辨的结构，从而揭示了细丝和一些细胞突起(图12)。
在克隆体3和4中，一些细胞在抗体染色的帮助下显示出微弱的GFP信号，但也发现了没有检测到GFP的细胞。一般来说，克隆体3和4在所有实验中都显示出不清楚的结果。在测序中，有可能鉴定出各种混合序列。此外，显微镜分析表明，eGFP-TUBA1B仅存在于部分细胞中。这表明两种克隆体都是混合克隆体。
克隆体23的细胞在显微镜下未显示任何GFP信号，无论是内源性地还是在使用GFP抗体染色的情况下。无法在克隆体23的细胞中检测到eGFP-TUBA1B融合蛋白。然而，在DNA水平上多次检测到eGFP序列的正确插入。这表明该基因已在细胞中关闭。在这种克隆体中显然已经正确地实现了敲入。然而，如果没有修饰蛋白的表达，它就无法使用。
敲入策略V1的总结：
敲入策略V1基于用嘌呤霉素对Cas9核酸酶质粒进行单选。单细胞沉积后，可以鉴定出23种克隆体，通过FACS、成像分析、PCR和测序进行表征。通过这些分析，可以证明20种克隆体中发生了基因组水平上的敲入。所需的eGFP-TUBA1B融合蛋白在细胞中表达，并且证明了没有明显的功能丧失。表3总结了23种克隆体的特性。
表3：来自敲入策略V1的所有克隆体的列表以及总结的结果。
Figure BDA0003141216170000171
Figure BDA0003141216170000181
2)敲入策略V2：通过抗生素对Cas9和供体质粒进行双重选择
Cas9-PuroR质粒
具有潮霉素B抗性盒crRNA1或crRNA2或crRNA3的环状和线性化供体质粒
tracrRNA
在敲入策略V2中，与敲入策略V1中一样，用相同的crRNA和tracrRNA以及Cas9-PuroR质粒转染细胞。三种crRNA(SEQ ID NO:07至SEQ ID NO:09)中的每一种都与具有潮霉素B抗性盒的线性化或环状供体质粒组合。通过嘌呤霉素对Cas9质粒和潮霉素B对供体质粒进行总计10天的选择。随后用来自每次转染中的FITC阳性活细胞沉积四个96孔板。在放大的直方图视图中，野生型和转染细胞之间FITC信号的差异很明显。FITC阳性细胞的比例在0.4％到3.8％之间。当比较来自线性和环状供体质粒的样品时，发现使用环状供体质粒转染所有三种crRNA的FITC阳性细胞比例高于使用线性化供体质粒转染的比例。在crRNA3和环状供体质粒的样品中发现了最强的信号(图13)。
在培养箱中孵育三周后，通过显微镜确定所沉积的单细胞的生长速度。平均为34.3％。通过FACS分析所有生长的克隆体的FITC信号。与野生型(即未转染的细胞)相比，细胞中的eGFP表达导致检测到增加的FITC信号。从总计496个分析的克隆体中鉴定了总计118个潜在阳性克隆体。这对应于24.3％的整体效率。含有环状供体质粒的样品中潜在阳性克隆体的比例为33.3％，是线性化供体质粒的15.3％的两倍多(表4)。
表4：在单细胞沉积后使用FACS鉴定来自敲入策略V2的潜在阳性克隆体。对于每个具有线性或环状供体质粒的crRNA，给出了在单细胞沉积后鉴定的潜在阳性克隆体的数量。经检查的克隆体总数在括号中说明。效率由潜在阳性克隆体的数量与经检查的克隆体的数量之比得出。
Figure BDA0003141216170000191
在118种潜在阳性克隆体中，随机选择了40种克隆体并扩展以进行进一步验证。在连续培养过程中，通过FACS定期检查FITC信号的稳定性。在培养12代后进行的筛选中，与野生型相比，所检查的40种克隆体中有32种显示出增加的FITC信号。例如，对于克隆体V2 3ZP1 B5和V2 3Z P2 D10，这与第一次FACS筛选的结果相当。与第一次FACS筛选相比，一些克隆体在连续培养期间显示FITC信号降低。然而，与野生型相比，它更高。只有三种克隆体在12次传代后未能检测到任何FITC信号。
表5：通过FACS分析生长的克隆体的eGFP信号。经由FSC和SSC通道对可行的单细胞进行门控。可以通过FITC通道检测eGFP的存在。扩展并进一步分析转移到FITC阳性区域的克隆体。在连续培养后在第12代再次检查FITC信号的稳定性。++＝无变化；+＝信号略有减弱；o＝信号强烈减弱；-＝无信号。
Figure BDA0003141216170000192
Figure BDA0003141216170000201
除了FACS分析外，还通过成像以及PCR分析和测序对40种克隆体进行了进一步表征。
为了确认基因组水平的敲入，从克隆体的细胞中分离出mRNA并转录成cDNA。在cDNA上建立了PCR，可以扩增eGFP-TUBA1B的完整编码序列。只有当eGFP序列的插入位于TUBA1B之前时，两种引物才可能结合(图10)。在琼脂糖凝胶上分析PCR并显示预期大小的干净条带。正如预期的那样，在野生型测试中没有产生产物，因为只有反向引物能够结合(图14)。
将条带切除、纯化和测序。DNA中检测到的两个序列差异是沉默突变，不会导致蛋白质序列发生任何变化。两种序列变体都对应于预期的蛋白质。TUBA1B部分与野生型相同。
可以通过PCR和测序确定三种阴性克隆体的正确DNA序列。例如，克隆体1L P2 F5在所有分析中都显示出阳性结果，但通过显微镜检查，只有大约一半的细胞显示出阳性信号。
在显微镜下分析了eGFP-TUBA1B融合蛋白的功能。使用Operetta系统进行了一项研究，以查看标志物蛋白是否继续参与克隆体中微管的形成，从而有助于维持细胞功能。为此，将细胞固定、透化并用Alexa Fluor 647缀合物抗GFP抗体染色。此外，细胞核用Hoechst33342染色。例如，即使在使用抗GFP抗体染色的情况下，克隆体10也没有显示任何信号。在克隆体41中，具有抗GFP抗体的信号很弱且非常分散。另一方面，克隆体28在所有细胞中都显示出来自使用抗体染色的清晰信号。细胞突起显示出良好的信号(图15)。
敲入策略V2的总结：
在敲入策略V2中，细胞用crRNA和tracrRNA、Cas9-PuroR质粒和具有潮霉素B抗性盒的供体质粒转染。三种crRNA中的每一种都与各自的线性化或环状供体质粒组合使用。通过嘌呤霉素对Cas9质粒进行选择，通过潮霉素B对供体质粒进行选择。在筛选出的496种克隆体中，鉴定出118种阳性克隆体。为了进一步分析，随机选择并扩增了40种克隆体。FACS分析、测序和成像的结果表明，在29种克隆体中实现了精确的eGFP敲入。
表6总结了40种选定克隆体的特性。
表6：来自敲入策略V2的所有克隆体的列表以及总结的结果。
Figure BDA0003141216170000211
Figure BDA0003141216170000221
3)敲入策略V3：使用抗生素和CD4标志物对Cas9和供体质粒进行双重选择
pCas-Guide-EF1α-CD4质粒
具有潮霉素B抗性盒的环状和线性化供体质粒
crRNA1或crRNA2或crRNA3
tracrRNA
在敲入策略V3中，用环状或线性供体质粒和pCas-Guide EF1α-CD4质粒转染细胞。该质粒被称为“多合一”，编码Cas9核酸酶、gRNA和CD4。在该策略中，通过潮霉素B对供体质粒进行选择，通过CD4对Cas9核酸酶和gRNA进行选择。使用了三种不同的pCas-Guide-EF1α-CD4质粒，每种质粒都编码三种gRNA中的一种。这导致该方法进行了六次转染：三种不同的gRNA，每种都与环状或线性化的供体质粒组合。转染后约48小时，细胞用APC缀合抗CD4抗体染色。HEK293A野生型细胞本身不表达CD4，因此这些细胞定义了APC负门。只有摄入pCas-Guide-EF1α-CD4质粒的细胞在细胞表面表达CD4，FACS可通过抗体染色后升高的APC信号检测到CD4。样品都提示APC信号显著增加。APC阳性门中的转染细胞在63％和86％之间。将具有来自每个gRNA的线性和环状供体质粒的样品进行比较，可以看到成比例地更多的APC，因此，在具有环状供体质粒的样品中检测到CD4阳性细胞。从每次转染中，使用FACS分选将大约5×105个CD4阳性细胞作为细胞池沉积(图16)。
在进行池分选后，将细胞在6孔板中培养24h。接下来，用潮霉素B对供体质粒进行10天的选择。随后，将来自每次转染的单个细胞沉积在四个96孔板中。在放大的直方图视图中，野生型和转染样品之间FITC信号的差异很明显。样品1L、1Z和2L仅显示非常微弱的FITC阳性信号，远低于1％。与野生型相比，样品2Z和3Z的FITC信号没有差异。样品3L甚至显示出比野生型更弱的FITC信号。因此，几乎不可能对FITC阳性细胞进行门控。尽可能沉积来自FITC阳性门的活单细胞(图17)。
单细胞沉积后三周，然后对克隆体进行FITC信号的第一次筛选，并且因此进行FACS中存在eGFP的筛选。此前，已经通过显微镜确定平均增长率为43％。共筛选出952种克隆，其中33种鉴定为潜在阳性克隆体。这对应于3.4％的效率。在三个样品1L、3L和3Z中没有鉴定到克隆体。再次，可以看到环状供体质粒样品比具有线性化供体质粒的样品产生更多的潜在阳性克隆体(表7)。
表7：在单细胞沉积后使用FACS鉴定来自敲入策略V3的潜在阳性克隆体。每种gRNA和门都说明了单细胞沉积后鉴定的潜在阳性克隆体的数量。经检查的克隆体总数在括号中说明。效率由潜在克隆体的数量与经检查的克隆体的数量之比得出。
Figure BDA0003141216170000241
第一次FACS筛选的FITC直方图显示，与野生型相比，信号差异非常小。一些克隆体在FITC阳性区域显示出相对较强的位移，但这还不到一个对数步长。
总计33种具有升高的FITC信号的克隆体可以被识别和扩展以进行进一步分析。在培养过程中，通过流式细胞仪(FACS)定期检查eGFP信号的稳定性。经过几次传代，发现大部分克隆体已经完全失去了之前的低FITC信号。在叠加图中，它们的信号与野生型相同。
通过对克隆体的cDNA进行PCR，可以扩增eGFP-TUBA1B的完整编码区。为此目的，从克隆体中分离出总RNA并转录为cDNA。选择用于PCR的引物，以便仅在精确插入eGFP时才形成特异性产物。在琼脂糖凝胶中分析PCR。正如预期的那样，在野生型样品中没有扩增产物。同样，在任何克隆体中均未检测到扩增子。来自敲入策略V1的克隆体1作为PCR的阳性对照，产生了2085bp的特异性产物。在DNA水平上，所分析的克隆体无一能显示出eGFP的特异性敲入(图18)。
用显微镜检查一些克隆体。经固定和透化的细胞用Alexa Fluor 647缀合抗GFP抗体和Hoechst 33342染色。在任何克隆体中都无法检测到eGFP。同样，没有GFP信号，因此没有具有eGFP-TUBA1B融合蛋白的丝状微管蛋白结构可以通过抗体染色检测到。
尽管用潮霉素B进行选择但克隆体仍然存活的原因，是通过使用eGFP或潮霉素B抗性盒(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27)的特异性引物对克隆体的cDNA进行PCR来确定的。正如预期的那样，在野生型试验中，潮霉素B特异性引物无法扩增产物。供体质粒含有潮霉素B抗性盒，因此用作阳性对照。可以使用所有克隆体的潮霉素B抗性盒的引物在PCR中扩增特定条带(图19)。使用eGFP特异性引物对克隆体的cDNA进行的PCR也显示，在野生型中没有产物。供体质粒包含没有起始密码子ATG的eGFP序列，并作为所选引物的阳性对照。在一些克隆体中，例如克隆体4、7、14和19，在琼脂糖凝胶中的预期高度出现了明显的条带。其他克隆体，诸如克隆体1或12，仅显示一条强度较弱的条带。对于克隆体2、3、5、8和27，使用该PCR在琼脂糖凝胶中未检测到特异性产物(图20)。
敲入策略V3总结：
在敲入策略V3中，用两种质粒转染细胞。供体质粒包含要引入的eGFP序列，周围是插入位点周围的同源序列。第二种质粒pCas-Guide-EF1α-CD4，称为多合一质粒，它除了编码Cas9核酸酶外，还编码gRNA。此外，质粒上存在CD4标志物。该选择基于对Cas9和gRNA的CD4池分选，然后用潮霉素B对供体质粒进行选择。从总计952种筛选的克隆体中，鉴定出33种潜在阳性克隆体。以下实验表明所有克隆体均为阴性克隆体。无法通过PCR在DNA水平检测到在所需基因座处的精确敲入。
所分析的33种克隆体的特性总结在表8中。
表8：来自敲入策略V3的所有克隆体的列表以及总结的结果。
Figure BDA0003141216170000251
Figure BDA0003141216170000261
4)讨论
使用CRISPR/Cas9生成特异性敲入以精确修饰内源蛋白质被证明是非常重要的。例如，这通过在HEK293A细胞中将eGFP敲入到TUBA1B模型基因的N端得到证明。
TUBA1B上的这种GFP敲入已经被几个小组实现，例如使用锌指核酸酶在U2O2骨肉瘤细胞中实现(16)或使用CRISPR/Cas9在人类诱导多能干细胞(iPSC)中实现(17)。Roberts等人直接通过活细胞延时成像中的GFP标签分析了人类iPSC中的经N端标签化的TUBA1B的结构。
本文中举例说明的敲入基于相同的基本策略，该策略以三种不同的变型进行：V1、V2和V3。
在敲入策略V2中，克隆体的FACS筛选在eGFP信号中显示出明显更多的异质强度。特别地，具有crRNA3和环状供体质粒的克隆体在长期培养后显示出非常强的eGFP信号稳定性，超过87％的细胞在FITC阳性范围内。通过FACS，具有crRNA1和环状供体质粒的克隆体显示出广泛的多样性，因为21％至75％的细胞处于FITC阳性范围。
使用敲入策略V3，根本不可能产生阳性克隆体。在第一次FACS筛选中，由于具有可检测eGFP信号的细胞比例很小，其中超过5％的细胞处于FITC阳性范围内，因此选择了克隆体。在这些克隆体中，整个细胞群没有明显的位移到FITC阳性区域。在连续培养期间的分析表明，经过几次传代后，无法再检测到eGFP信号。在DNA水平上，在TUBA1B基因前面没有检测到eGFP序列的敲入。很可能在第一次FACS筛选中在这些细胞上测量到了假阳性信号。使用潮霉素B特异性引物进行的PCR在所有克隆体中都产生了阳性结果，表明这些克隆体能够在抗生素选择中存活下来。此外，通过PCR在许多克隆体中检测到eGFP序列的部分。这些结果表明，鉴定出的潜在阳性克隆体将供体质粒随机整合到它们的基因组中。eGFP序列不在供体质粒上携带其自身的启动子或起始密码子。因此，eGFP不太可能随机整合到转录基因座中的正确阅读框中。在任何克隆体中都没有检测到精确的敲入。
在一些来自敲入策略V1和V2的克隆体中，通过对cDNA的PCR检测到了单等位基因敲入(数据未显示)(另请参见17)。
比较三种测试的敲入策略V1、V2和V3的有效性，发现潮霉素B和嘌呤霉素的双重选择显示出最高的效率。对于40种潜在阳性克隆体中的29种，可以验证正确的eGFP敲入。因此，被鉴定为潜在阳性的克隆体中有17.5％是假阳性，而72.5％是实际阳性。如果这适用于最初确定的118种潜在阳性克隆体，则在496种所分析的克隆体中预计会有86种阳性克隆体。这对应于17.3％的总效率。在文献中，同源重组的效率差异很大，范围在0.1％到5％之间。在优化条件下并取决于各自的基因座，也显示出高达24％的效率(17,18)。
影响同源重组效率的最重要因素之一是供体模板。在测试的策略中，使用的质粒通过NotI的限制被环状或线性化。结果表明，线性化供体质粒的敲入效率低于环状质粒。在许多文章中对各种供体变体进行了测试和比较。Stieger等人证明，与具有5'突出端的环状或线性化供体相比，在具有3'突出端的线性供体的靶基因座中可以鉴定出更多的插入缺失突变。Liang等人已经描述了类似的发现。他们证明，与没有突出端的供体相比，在具有30个核苷酸突出端的线性双链供体中可以实现显著更好的HDR效率(19)。Zhang等人在完全去除质粒主链的HEK293T细胞中使用环状以及双切供体。使用环状供体实现了5％的HDR效率，使用线性双切供体甚至达到了21％。与环状供体质粒相比，双切供体显著提高了敲入率，并且所需的同源序列明显短得多(20)。Chu等人的工作组以生成的具有1kb同源序列的PCR产物作为模板，在HEK293细胞中实现了最佳的敲入结果(21)。
为了获得成功敲入的细胞，需要精确选择未编辑的野生型细胞。在使用的变体中，抗生素选择在对两种质粒进行时最有效。
PCR分析显示，在策略V1中，23种克隆体中只有两种显示无Cas9序列。
多合一pCas-Guide-EF1α-CD4有望带来益处，因为CD4选择仅用于分离经转染的细胞。CD4分选并没有人为地强迫细胞保留质粒以便存活，大约7天后它们就丢失了。
在Roberts等人的文献中，FACS仅通过GFP信号进行选择，并且尽管没有抗生素，但在45％的克隆体中检测到了供体质粒的偶然整合，这取决于所使用的crRNA(17)。
eGFP标签的优势在于，即使没有额外的抗体染色，它也能提供信号，例如，在克隆体的FACS筛选中，这在时间和成本方面更加经济。另选地，可以使用较小的Myc标签。
序列
gRNA1正向 SEQ ID NO:01
gRNA1反向 SEQ ID NO:02
gRNA2正向 SEQ ID NO:03
gRNA2反向 SEQ ID NO:04
gRNA3正向 SEQ ID NO:05
gRNA3反向 SEQ ID NO:06
crRNA1 SEQ ID NO:07
crRNA2 SEQ ID NO:08
crRNA3 SEQ ID NO:09
D_Hygro fwd SEQ ID NO:10
D_Hygro rev SEQ ID NO:11
D_5'HA fwd SEQ ID NO:12
D_5'HA rev SEQ ID NO:13
D_eGFP fwd SEQ ID NO:14
D_eGFP_rev SEQ ID NO:15
D_3'HA fwd SEQ ID NO:16
D_3'HA rev SEQ ID NO:17
D_3'HA-Z fwd SEQ ID NO:18
D_3'HA-Z fwd SEQ ID NO:19
快速变化fwd SEQ ID NO:20
QuickChange rev SEQ ID NO:21
eGFP fwd SEQ ID NO:22
TUBA1B exon4rev SEQ ID NO:23
cDNA fwd SEQ ID NO:24
cDNA rev SEQ ID NO:25
Hygro fwd SEQ ID NO:26
Hygro rev SEQ ID NO:27
Cas9 fwd SEQ ID NO:28
Cas9 rev SEQ ID NO:29
eGFP_2fwd SEQ ID NO:30
eGFP_2rev SEQ ID NO:31
eGFP标签氨基酸序列 SEQ ID NO:32
eGFP标签核苷酸序列 SEQ ID NO:33
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材料与方法
消耗品：
Figure BDA0003141216170000321
Figure BDA0003141216170000331
化学品：
Figure BDA0003141216170000332
Figure BDA0003141216170000341
质粒：
Cas9质粒购自Dharmacon(图4)和Origene(图5)。供体质粒是自克隆的(图6(具有潮霉素B抗性盒)，图7(pAH-0163))。所有质粒都在-20℃储存。
酶：
所有使用的酶均购自NEB并在-20℃储存。
Figure BDA0003141216170000342
Figure BDA0003141216170000351
缓冲液和溶液：
Figure BDA0003141216170000352
Figure BDA0003141216170000361
寡核苷酸：
TUBA1B特异性crRNA和gRNA
Figure BDA0003141216170000362
引物：
所有的引物均以100μM的浓度溶解的形式购自metabion，并在-20℃保存。
Figure BDA0003141216170000363
Figure BDA0003141216170000371
Figure BDA0003141216170000381
细胞系、细胞培养基和添加剂：
所有实验均使用HEK293A细胞(量子生物技术公司(Quantum BiotechnologiesInc.))进行。
材料 制造商
Accutase Sigma
胎牛血清(FCS) Gibco
潮霉素B(50mg/mL) Gibco
L-谷氨酰胺(200mM) Gibco
PBS(1×) PAN
青霉素-链霉素(10,000U/mL) Gibco
嘌呤霉素二盐酸盐(10mg/mL) Gibco
RPMI 1640 PAN
抗体：
根据制造商的说明将抗体在4℃或-20℃储存。
Figure BDA0003141216170000382
试剂盒：
Figure BDA0003141216170000383
Figure BDA0003141216170000391
方法：
1.分子生物学工作
1.1.合成寡核苷酸的杂交
来自Origene的多合一pCas-Guide EF1α-CD4质粒中的gRNA编码DNA序列作为合成寡核苷酸。为了能够将它们克隆到载体中，首先必须杂交互补的单链。将它们设计为使得每个5'突出端与线性化载体的3'突出端互补。这实现了在所需取向上的精确连接。
杂交反应设定如下：
退火缓冲液(10×) 2μL
正向寡核苷酸(100μM) 1μL
反向寡核苷酸(100μM) 1μL
水 16μL
总计 20μL
根据以下程序将混合物充分混合并在热循环仪中孵育：
95℃ 5分钟
95℃至20℃ -2℃/分钟
20℃ 60分钟
4℃ ∞
将样品用水按1:10稀释并在-20℃储存直至进一步使用。
1.2.聚合酶链反应
聚合酶链反应，简称PCR，使用Novagen的KOD热启动DNA聚合酶试剂盒进行。除其他事项外，该方法还用于生成同源序列和eGFP片段，用于克隆供体质粒，随后表征选定的克隆体。为了生成供体质粒的片段，专门设计了PCR引物以在相邻片段的末端生成短的15bp同源序列。使用这种微同源性，后来使用英杰公司(Invitrogen)的无缝克隆和组装试剂盒确保以正确的顺序和取向进行准确的连接。
此外，用于生成3'同源臂的正向引物D_3'HA fwd包含几个沉默点突变。它们位于由所使用的crRNA结合的序列区域中。为了保护供体质粒免受Cas9核酸酶前的转染，必须对crRNA结合位点进行突变。由于阅读框的原因，在PAM序列中引入沉默突变是不可能的，并且会导致蛋白质序列发生变化。因此，所有后来不会在蛋白质序列中产生任何变化的可能碱基都被交换。
PCR反应由以下方法组成：
Figure BDA0003141216170000401
PCR程序因模板类型、PCR产物的长度和所用引物的属性(诸如GC含量和解链温度)而异。默认情况下，使用以下PCR程序：
Figure BDA0003141216170000402
1.3.限制性消化
克隆的一个组成部分是使用序列特异性限制性核酸内切酶进行限制性消化。一方面，制备待克隆的DNA片段。另一方面，该方法可用作限制性分析，其中检查克隆质粒的正确组装。优选使用来自NEB的优化的高保真限制性内切酶。
通常，限制性混合物由以下组分组成：
DNA(例如，质粒、PCR产物) xμL
限制酶 0.25μL/μg DNA
CutSmart缓冲液(10×) 3μL
水 yμL
总计 30μL
将混合物充分混合并在热块中在37℃孵育至少一小时。随后，将温度升至70℃保持10分钟以灭活限制酶。
以这种方式，还使用核酸内切酶NotI-HF将具有潮霉素B抗性盒的供体质粒线性化以进行转染。然后将1μL虾碱性磷酸酶(rSAP)直接加入限制性混合物中，并再次在37℃孵育1小时。这使载体末端去磷酸化，防止质粒的随机重新连接。
当使用在不同温度或不同缓冲液中表现出最大活性的限制性内切酶时，消化必须在两个温度步骤中完成，或者应该增加一个重新缓冲步骤。
1.4.琼脂糖凝胶电泳和凝胶提取
通过凝胶电泳，琼脂糖凝胶中的DNA片段混合物可以根据其大小进行分离。将样品与6×上样缓冲液一起加入其中，并上样到含有0.5μg/mL溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上。将样品上样后，施加100V的电压一小时。结果，带负电的DNA经过凝胶朝向阳极行进。DNA的大小和构象对于凝胶中的运行行为至关重要。凝胶电泳是制备型限制性消化或PCR的标准。在质粒的限制性消化中，所需的DNA片段因此可以与质粒的剩余部分分离，并且可以从凝胶中切下特定的DNA带。
在PCR中，最好只扩增一个特定片段。凝胶电泳显示PCR的纯度如何以及是否形成了非特异性副产物。同样，特定的DNA条带可以在预期的高度从凝胶上切下。
使用来自Qiagen的QIAquick凝胶提取试剂盒，根据随附的方案，从切除的琼脂糖凝胶片中提取所需的DNA。简而言之，将凝胶片溶解在50℃的结合缓冲液中，用异丙醇处理并置于柱上。DNA与柱的硅胶膜结合，并在用洗脱缓冲液短暂洗涤后从柱上洗脱。因此，可以从反应混合物中除去盐、酶或其他杂质，这些杂质以后可能会干扰诸如测序反应之类的应用。在NanoDrop2000上分析经纯化的DNA并在-20℃储存。
1.5.大肠杆菌中的连接和转化
在连接中，使用依赖于ATP的DNA连接酶将具有互补末端的DNA片段连接在一起。对于连接反应，使用来自NEB的T4 DNA连接酶。在连接批次中以1:10的摩尔比使用质粒主链和插入片段。
一般的方法是：
DNA主链 xμL
DNA插入 yμL
连接缓冲液(10×) 2μL
T4 DNA连接酶 1μL
水 zμL
总计 20μL
将混合物充分混合并在热循环仪中于16℃孵育至少1小时。随后，在70℃将连接酶灭活10分钟。
一个例外是供体质粒的片段的连接。根据随附的方案，使用英杰公司(Invitrogen)的无缝克隆和组装试剂盒组装这些片段。由于使用了引物，相邻的片段具有15bp的短微同源性，基于该同源性，片段以正确的顺序和取向进行了连接。
然后将所得质粒引入化学感受态大肠杆菌中进行繁殖。使用来自英杰公司(Invitrogen)的化学感受态OneShot Top10大肠杆菌进行转化。为此目的，将储存在-80℃的细菌在冰上解冻，与2μL的连接混合物混合并在冰上孵育至少30分钟。然后发生热休克，其中将质粒引入感受态细胞内。为此目的，将细胞在42℃的水浴中孵育30秒，然后在冰上孵育2分钟。添加200μL SOC培养基后，将细胞在热振荡器中于37℃和700rpm孵育一小时。将50μL转化混合物接种在LB琼脂板上。取决于抗性盒，琼脂板在所并入的质粒中含有100μg/mL氨苄青霉素或50μg/mL卡那霉素。平板在37℃孵育过夜，只允许已经接受所需质粒的细菌菌落生长。
1.6.质粒制备
质粒制备是一种从转化的大肠杆菌中分离经克隆的质粒DNA的方法。为此，从琼脂板上挑取单个菌落，转移到LB培养基中，并在37℃和200rpm培养过夜。根据所需的产量，使用LB培养基进行不同规格的方法。2mL的迷你型制备物、150mL的中等制备物、400mL的最大制备物和最多2.5L的千兆级制备物之间存在区别。
根据随附的方案，使用来自Qiagen和Macherey-Nagel的试剂盒进行所有质粒制备。原则上，离心过夜培养物，用含RNase的缓冲液重新悬浮细菌沉淀。细胞用裂解缓冲液裂解5分钟，并置于柱上。DNA与柱的硅胶膜结合，并在用洗脱缓冲液进行洗涤步骤后被洗脱。在培养基和最大制备物中，洗脱液中的DNA再次用异丙醇沉淀并以4,500rpm离心一小时。用70％乙醇洗涤后，将DNA沉淀在室温干燥15分钟，然后用500μL TRIS缓冲液重新溶解。在NanoDrop2000上进行的样品分析揭示了DNA的浓度和纯度。将如此获得的DNA在-20℃储存，随后用于HEK293A转染。
2.人类细胞培养
HEK293A细胞在37℃和5％CO2的培养箱中培养。完全培养基由含有10％FCS和2mML-谷氨酰胺的RPMI 1640组成。对于连续培养，细胞每周分割两次，达到70％至90％的汇合。为此，吸出培养基，将细胞用PBS洗涤并用Accutase分离。用新鲜培养基重新悬浮后，将1/10的细胞悬浮液转移到新的T75细胞培养瓶中。当达到25代时，丢弃连续培养物并解冻来自内部细胞库的新鲜细胞。
生成的克隆体在与野生型细胞相同的完全培养基中培养，每周以1:5分割两次。从每种克隆体中至少冷冻三个具有3×106个细胞的冷冻管作为备用。为此目的，将细胞以300g离心5分钟，并重新悬浮在1mL由FCS和7.5％DMSO组成的冷冻培养基中。将细胞转移到冷冻管中，并在-80℃的冷冻箱中冷冻过夜。第二天，将冷冻的细胞转移到氮气罐中长期保存。
3.Lipofectamine转染
为了在细胞中实现特异性敲入，必须将各种质粒DNA和部分合成产生的RNA引入细胞中。取决于要引入的样品，使用两种转染试剂，即来自Dharmacon的DharmaFECT Duo和来自Origene的TurboFectin 8.0。
对于敲入实验，转染以6孔格式进行，其中转染方案的优化以96孔格式进行。细胞在前一天接种，以便它们在转染时达到约70％至80％的汇合。通常，对于用lipofectamines转染，DNA和转染试剂在血清减少的Opti-MEM中混合在一起。这些批次必须在室温孵育一段时间以形成lipofectamine和核酸的复合物。随后，将转染混合物滴加到细胞中。
取决于转染试剂，以下优化方案以6孔格式使用：
Figure BDA0003141216170000441
4.CellTiter-Glo测定
使用CellTiter-Glo测定法确定样品中活细胞的数量。该方法基于ATP量的量化，作为代谢活性细胞的指标。使用来自Promega的CellTiter-Glo发光细胞存活率测定试剂盒进行实验。CellTiter-Glo试剂是在每次实验前新鲜制备的。为此目的，将尤其含有荧光素和荧光素酶的底物溶解在伴随的缓冲液中。在直接添加到细胞培养基中后，首先发生细胞裂解。活细胞在其线粒体中产生ATP，从而将其释放。在存在ATP的情况下，荧光素被UltraGlo r-荧光素酶转化。这会产生稳定的发光信号，该信号与存在的ATP量成正比，因此与活细胞的数量成正比。
该测定用于优化转染并滴定测量用于转染后选择的潮霉素B和嘌呤霉素的最佳抗生素浓度。在所有测定中，都将细胞接种在具有透明底的黑色平底96孔板中。在滴定测量抗生素浓度时，每孔接种7,500个细胞。第二天，细胞用不同浓度的抗生素处理。48小时后，通过将100μL CellTiter-Glo试剂加入每个孔中的测定来确定细胞的存活率。之后，将板在平板振荡器上以200rpm振荡2分钟。在黑暗中孵育10分钟后，在光度计上测量发光信号。
5.流式细胞术
5.1.FACS分选
FACS代表荧光激活细胞分选，是流式细胞术的一种特殊形式。通过FACS分选，可以从细胞悬液中分选出所需的细胞。将所需细胞作为Falcon中的细胞池储存或作为96孔板中的单个细胞储存之间存在区别。实验在来自BD的FACS Aria III分选机上进行。
使用FACS分选，对经转染的和部分已经选择的细胞进行分选。收获它们，用PBS洗涤并在FACS缓冲液中调节至1×106个细胞/mL的细胞数。在所需的细胞群被门控并在设备上进行所有设置以进行分选后，可以丢弃所选细胞。单细胞沉积以96孔格式进行。将板与每孔200μL的培养基一起在37℃储存，以调节培养基并保持尽可能低的细胞应激。每个敲入试验都涉及在20到24个板中的沉积。然后，对于生长，细胞需要在37℃和5％CO2的培养箱中生长约3周。对所有板进行显微镜分析以确定生长速率，然后检查克隆体的eGFP表达。
在敲入V3中，pCas9-Guide-EF1α-CD4质粒包含一个CD4盒作为选择标志物。转染后48小时收获细胞并用PBS洗涤两次，以选择CD4阳性细胞。接下来，将细胞重悬于250μL FACS缓冲液中，并添加5μLα-CD4-Alexa647抗体。这对应于1.5μg/mL的最终抗体浓度。在冰上于黑暗中孵育1小时后，将细胞用FACS缓冲液洗涤三次，然后进行测量。对于池分选，每个样品大约1.5×105个CD4阳性细胞被分选到其中已经放置了5mL完全培养基的15mL Falcon中。随后，将细胞以300g离心5分钟，重悬于3mL新鲜的完全培养基中，并接种到6孔板中。24小时后，细胞再次贴壁，可用供体质粒上的潮霉素B进行筛选。一旦选定的细胞成熟，就再次进行96孔格式的单细胞沉积。
5.2.分析型流式细胞术
分析型流式细胞术基于与FACS分选相同的功能原理。唯一的区别是不能分选细胞，而只能检查细胞的大小、粒度和可能的荧光特性。
该方法主要用于筛选生成的克隆体。为此目的，从96孔板中完全去除培养基，用25μL Accutase分离细胞并用40μL FACS缓冲液重新悬浮。将40μL细胞悬液转移至锥形底96孔板上，并直接在来自BD的FACS Canto II上进行测量。克隆体的eGFP信号总是参考HEK293A野生型细胞。评估是使用FlowJo v10.0.7软件完成的。具有明显eGFP信号的潜在阳性克隆体被扩展并进一步表征。
6.总蛋白质提取和BCA测定
为了在蛋白质水平上验证eGFP敲入，必须从细胞中提取总蛋白质。为此目的，收获1×106个细胞，以300g离心5分钟，并用冰冷的PBS洗涤。在重复离心步骤后，从细胞中完全去除上清液。将细胞沉淀重悬在60μL新鲜制备的RIPA缓冲液中，并在冰上孵育至少30分钟。然后将裂解物在4℃以14,000rpm离心15分钟以去除细胞碎片。将上清液转移到新的反应容器中并在-20℃储存。
使用二辛可宁酸测定，简称BCA测定，将裂解物中的蛋白质浓度定量。该测定依赖于二价铜离子到一价铜离子的蛋白质依赖性还原，单价铜离子与BCA形成有颜色的复合物。反应引起的颜色变化与蛋白质浓度成正比。根据相关方案，使用ThermoFisher Pierce BCA蛋白质测定试剂盒进行测定。从2mg/mL BSA储备溶液制备蛋白质浓度介于2mg/mL和125μg/mL之间的标准品系列。在平底96孔板中加入10μL BSA标准品或10μL的经稀释的裂解液，在每种情况下进行两次平行确定。然后将200μL由BCA试剂A和B组成的BCA溶液以50:1的比率添加到每个孔中。将板在板振荡器上振荡30秒，然后在37℃孵育30分钟。在光度计上以562nm的波长测量所得颜色变化。标准品系列的值用于创建校准线，从其函数方程可以计算裂解物中的蛋白质浓度。
7.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS page)和免疫印迹
为了在蛋白质水平上验证eGFP敲入，使用所得蛋白质裂解物进行SDS-Page，然后进行免疫印迹。
在每种情况下，用PBS将15μg总蛋白质调整为10.8μL，并添加6μL 2.8倍LDS上样缓冲液。然后将样品在95℃煮沸10分钟，并以12,000rpm离心2分钟。将样品上样到英杰公司(Invitrogen)的NuPAGE 4％至12％Bis-Tris凝胶上，并在220V和120mA下运行50分钟。在免疫印迹中，蛋白质在30V和220mA在硝酸纤维素膜上印迹一小时。作为成功的蛋白质转移的对照，使用了有色蛋白质标准品。将膜在室温于5％封闭溶液中在振荡器上孵育至少两小时，以封闭蛋白质的表位并减少后来的非特异性抗体结合。将一抗稀释在5％的封闭液中，并在4℃的摇床上孵育过夜。第二天，将膜用TBST洗涤三次，每次15分钟，以去除未结合的一抗。随后，将膜与稀释在5％封闭溶液中的二抗在室温于振荡器上孵育两小时。再一次，TBT必须洗涤三次，每次15分钟，以去除未结合的二抗。为了将印迹显影，使用了罗氏公司(Roche)的Lumi-Light免疫印迹底物试剂盒。将鲁米诺增强剂溶液和过氧化物酶溶液以相同的比例混合，加入膜中并在黑暗中孵育3分钟。二抗与辣根过氧化物酶(HRP)偶联，可催化鲁米诺的氧化。所得的发光信号可以在Lumi成像仪上检测到。曝光时间根据条带强度而变化。显影后，将膜在室温于Restore PLUS免疫印迹剥离缓冲液中孵育15分钟，从膜上去除结合的抗体。接着用TBST将膜洗涤三次，每次10分钟，并且再次用5％封闭溶液在室温孵育至少两小时。然后在略低于50kDa标记条带处切割膜。将膜的上部与稀释在5％封闭溶液中的α-GFP HRP偶联抗体在4℃孵育过夜。将膜的下部在5％封闭溶液中储存过夜，并在第二天于室温与α-β-肌动蛋白HRP偶联抗体孵育15分钟。膜的两个部分都用TBST洗涤三次，每次15分钟。由于这两种一抗是HRP偶联的，因此无需与前一天类似的二抗进一步孵育即可将膜显影。
8.Operetta系统中的共聚焦显微分析
通过共聚焦显微镜分析，检查了潜在克隆体中的微管蛋白细胞骨架。实验是在Perkin Elmer的Operetta CLS高内涵成像系统上进行的。使用该系统，可以在短时间内以96孔格式自动筛选大量克隆体。由于Operetta系统中用于分辨率的内源eGFP信号非常微弱，因此仍使用α-GFP-Alexa Fluor 647抗体对细胞进行染色以进行信号放大。
为了进行筛选，将1.2×104个细胞接种在96孔板中。这些板是具有透明底的黑色平底板，除了它们的低自发荧光外，还防止杂散光进入相邻孔。第二天，细胞用PBS洗涤并用冰冷的甲醇固定5分钟。所使用的α-GFP Alexa Fluor 647抗体在山羊血清稀释缓冲液(GSDB)中按1:1,000稀释至终浓度为1μg/mL。缓冲液中尤其含有Triton-X-100，它导致细胞膜的透化，从而允许抗体渗透到细胞中。在室温于黑暗中孵育两小时后，从细胞中去除抗体。对于细胞核的染色，将Hoechst 33342在PBS中按1:10,000稀释，并在室温于黑暗中孵育10分钟。进行数次洗涤以从细胞中去除游离抗体和未结合的Hoechst染料。首先，用高盐磷酸钠缓冲液洗涤两次，每次5分钟。随后，用低盐磷酸钠缓冲液类似地重复洗涤步骤，这促进了游离抗体从细胞中运出。对于Operetta系统中的荧光成像，在用200μL PBS洗涤后，覆盖细胞。
必须首先完成Operetta系统中的所有必要设置。除了选择板几何的目标和一般设置外，这还包括选择所需的荧光通道以及相应的曝光时间和锐化水平。该设备在每个标记的孔中运行所有选定的像素，并为每个通道分别拍摄一张照片。这些是使用相关的Harmony成像和分析软件进行处理和评估的。
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Claims (13)

1.一种用于生产或提供表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白的细胞的方法，所述细胞内源靶蛋白来自所述靶蛋白的内源基因座，其中所述方法包括以下步骤：
a)用以下项转染所述细胞：
i)包含核酸的Cas9编码质粒，所述核酸赋予对于第一选择试剂的抗性，
ii)环状供体质粒，其包含：
a)第一核酸，其赋予对于第二选择试剂的抗性，和
b)第二核酸，其编码所述标志物蛋白，
其中所述第二核酸的3'和5'侧翼具有与所述细胞中的整合位点同源的核酸，并且其中侧翼同源核酸中的一者与所述靶蛋白的末端编码序列同源，
iii)crRNA，
和
iv)tracrRNA，
b)在存在所述第一选择试剂和所述第二选择试剂的情况下培养所述细胞，以及
c)选择在步骤b)的条件下进行细胞分裂的细胞，并且由此提供表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的所述融合蛋白的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中用全部所述质粒和所述核酸同时转染所述细胞。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中在步骤c)中选择细胞，所述细胞进行细胞分裂并且在所述细胞中已经检测到所述融合蛋白。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤b)和步骤c)是下述步骤：
b)1)在仅存在所述第一选择试剂的情况下或在仅存在所述第二选择试剂的情况下培养所述细胞，
2)选择在步骤1)的条件下进行细胞分裂的细胞，
3)在存在步骤1)中未使用的所述选择试剂的情况下培养在步骤2)中选择的细胞，
c)选择细胞，所述细胞在步骤b)3)的条件下进行细胞分裂并且在所述细胞中已经检测到所述融合蛋白，并且由此提供表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的所述融合蛋白的细胞，所述细胞内源靶蛋白来自所述靶蛋白的所述内源基因座。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述选择试剂为嘌呤霉素和潮霉素B。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在步骤b)中或在步骤b)1)和步骤b)3)中，最终潮霉素B浓度为50μg/mL，并且最终嘌呤霉素浓度为2μg/mL。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在存在多个用于所述标志物蛋白编码核酸的可能插入位点的情况下，编码所述标志物蛋白的核酸被插入在含有更多个和/或更具特异性的gDNA结合位点的位点处。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中
i)所述标志物蛋白被N端地插入到所述靶蛋白，
ii)编码所述标志物蛋白的核酸被插入到所述内源基因座中，使得其直接位于所述融合蛋白的mRNA中所述靶蛋白的第一密码子之前(对于所述第一密码子而言为3'方向)，
并且
iii)3'侧翼核酸包含编码所述靶蛋白的核酸的起始密码子，或/和5'侧翼核酸与所述靶蛋白的N端同源。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中编码所述标志物蛋白的核酸不包括起始密码子。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述标志物蛋白为荧光标志物蛋白。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述荧光标志物蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中3'侧翼同源核酸和5'侧翼同源核酸具有约1000个核苷酸的大小。
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