CN114196694A - 一种pProTB质粒、其构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种pProTB质粒、其构建方法及应用，属于质粒构建技术领域。所述pProTB质粒的构建方法，包括如下步骤：步骤1：构建HygroR‑luciferase载体；步骤2：构建pProTB质粒；步骤3：验证pProTB质粒是否构建成功。本发明还公开了一种pProTB质粒及其应用。本发明构建得到的pProTB质粒，整合了HygroR、TagBFP和Fluc三种基因的优点，一是可以通过HygroR筛选阳性细胞，可用于细胞药物筛选；二是可以通过TagBFP对细胞进行筛选或者鉴定药物筛选阳性的细胞；三是可以通过Fluc在活体动物中追踪该质粒转染的细胞。

Description

一种pProTB质粒、其构建方法及应用
技术领域
本发明涉及一种pProTB质粒、其构建方法及应用，属于质粒构建技术领域。
背景技术
潮霉素B抗性基因(HygroR)能够构建在多种载体上，通过潮霉素B(HygroR)筛选转染HygroR抗性基因阳性细胞，从而筛选到目的细胞，这项技术广泛应用与医学生物研究领域。不过潮霉素B筛选后会出现部分耐药细胞，达不到精确筛选阳性细胞的目的，影响研究结果的准确性。
蓝色荧光蛋白(TagBFP)可以通过对细胞进行标记从而追踪细胞，在生物和医学研究中有广泛的应用。不过，该项技术通常需要使用流式细胞仪，很多实验室可能不具备开展这项实验的条件，而且，使用TagBFP在活体动物中进行细胞追踪获得的图像背景信号信噪比高，因此定量检测性能差。
萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,简称FLuc)可以在活体动物中进行细胞追踪，获得的图像背景信号信噪比低，适用于活体动物定量研究。但缺点是没有药物抗性，不能进行流氏分选从而筛选细胞，另外FLuc只有在活细胞内才会产生发光现象，且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
综上，如何克服HygroR筛选后出现耐药细胞，TagBFP需要特定设备和无法在活体动物体内进行精确定量追踪，以及Fluc不能筛选细胞的缺点？目前尚未有将HygroR、TagBFP和Fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种pProTB质粒的构建方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种pProTB质粒的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：构建HygroR-luciferase载体
步骤1.1：取HygroR抗性基因，进行PCR扩增反应，得到HygroR PCR扩增产物；将HygroR PCR扩增产物进行酶切，得到HygroR酶切反应液；将HygroR酶切反应液再纯化，得到HygroR酶切产物；
步骤1.2：将Fluc载体进行酶切，得到Fluc载体酶切反应液；将Fluc载体酶切反应液再纯化，得到Fluc载体酶切产物；
步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的HygroR酶切产物和步骤1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒HygroR-luciferase；
步骤1.4：将质粒HygroR-luciferase转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到HygroR-luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤2：构建pProTB质粒
步骤2.1：取TagBFP载体，进行PCR扩增反应，得到TagBFP PCR扩增产物；将TagBFPPCR扩增产物进行酶切，得到TagBFP酶切反应液；将TagBFP酶切反应液再纯化，得到TagBFP酶切纯化产物；
步骤2.2：将步骤1.4得到的HygroR-luciferase载体进行酶切，得到HygroR-luciferase酶切反应液；将HygroR-luciferase酶切反应液再纯化，得到HygroR-luciferase酶切纯化产物；
步骤2.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤2.1得到的TagBFP酶切纯化产物和步骤2.2得到的HygroR-luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到TagBFP-HygroR-luciferase载体，即为pProTB质粒，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
步骤3：验证pProTB质粒是否构建成功
将步骤2构建的pProTB质粒转染人肾上皮细胞系293T，验证pProTB质粒是否构建成功。
其中，HygroR-luciferase载体的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaagaagcttggcattccggtactgttggtaaagccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaa。
pProTB质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：
atgagcgagctgattaaggagaacatgcacatgaagctgtacatggagggcaccgtggacaaccatcacttcaagtgcacatccgagggcgaaggcaagccctacgagggcacccagaccatgagaatcaaggtggtcgagggcggccctctccccttcgccttcgacatcctggctactagcttcctctacggcagcaagaccttcatcaaccacacccagggcatccccgacttcttcaagcagtccttccctgagggcttcacatgggagagagtcaccacatacgaggacgggggcgtgctgaccgctacccaggacaccagcctccaggacggctgcctcatctacaacgtcaagatcagaggggtgaacttcacatccaacggccctgtgatgcagaagaaaacactcggctgggaggccttcaccgagacgctgtaccccgctgacggcggcctggaaggcagaaacgacatggccctgaagctcgtgggcgggagccatctgatcgcaaacatcaagaccacatatagatccaagaaacccgctaagaacctcaagatgcctggcgtctactatgtggactacagactggaaagaatcaaggaggccaacaacgagacctacgtcgagcagcacgaggtggcagtggccagatactgcgacctccctagcaaactggggcacaagcttaatagatctatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaagaagcttggcattccggtactgttggtaaagccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaa。
本发明的原理是：
第一点，本发明的步骤1中，TagBFP在荧光显微镜下显示明亮的蓝色，可作为报告基因研究基因表达与调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。
第二点，本发明的步骤2中，HygroR基因编码抗稻瘟菌素抗性蛋白，转染细胞后可以抵抗稻瘟菌素的杀死作用，筛选出转染HygroR抗性的细胞。
第三点，Firefly Luciferase(萤火虫荧光素酶)催化luciferin(萤光素)氧化成oxyluciferin(氧化萤光素)，会发出生物荧光,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。
综上，本发明通过融合HygroR、TagBFP和Fluc这三种基因，构建出pProTB质粒，可以在细胞水平检测蓝色荧光蛋白，潮霉素B药物筛选耐药细胞，在活体动物上灵敏检测Luciferase，满足实验中药物筛选的要求。
本发明的pProTB质粒的构建方法的有益效果是：
1、现有技术中并未有将HygroR、TagBFP和Fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。本发明构建得到的pProTB质粒，整合了HygroR、TagBFP和Fluc三种基因的优点，一是可以通过HygroR筛选阳性细胞，用于细胞筛选；二是可以通过TagBFP鉴定药物筛选阳性细胞，区别药物筛选后的耐药细胞；三是可以通过Fluc在活体动物体内追踪该质粒转染的细胞。因此，可以克服HygroR筛选后出现耐药细胞，TagBFP需要特定设备和不能在活体动物精确定量追踪，以及Fluc不能筛选细胞的缺点，可以满足实验中药物筛选的要求，具有广泛的应用前景。
2、本发明的构建方法简单，操作容易，应用领域广泛，适合规模化推广应用，能产生积极效果。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1.1中，所述PCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO4 2μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.3所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ IDNO.4所示的反向引物1.5μl,模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将HygroR进行PCR扩增。
其中，HygroR正向引物(SEQ ID NO.3)：
agatctatgaaaaagcctgaactcac；
HygroR反向引物(SEQ ID NO.4)：
aagcttcttcctttgccctcggacgag。
进一步，步骤1.1中，所述HygroR PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，BglII酶1μl，HygroR PCR扩增产物30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到HygroR酶切反应液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将HygroRPCR扩增产物进行酶切。上述HindⅢ酶1μl，BglII酶1μl，均购自NEB公司。
进一步，步骤1.1中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)HygroR酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到酶切HygroR酶切产物。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将HygroR酶切反应液或进行纯化。
进一步，步骤1.2中，所述Fluc载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer5μl，HindⅢ酶1μl，BglII酶1μl，Fluc载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到Fluc载体酶切反应液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将Fluc载体进行酶切。
进一步，步骤1.2中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)Fluc载体酶切产物凝胶中加入500ul结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到Fluc载体酶切产物。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将Fluc载体酶切反应液进行纯化。
进一步，步骤2.1中，所述PCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO42μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.5所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ IDNO.6所示的反向引物1.5μl,pcDNA3.1-TagBFP模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将TagBFP载体进行PCR扩增反应。
其中，TagBFP正向引物(SEQ ID NO.5)：
gctagcgccaccatgagcgagctgattaaggag；
TagBFP反向引物(SEQ ID NO.6)：
agatctattaagcttgtgccccagtt。
进一步，步骤2.1中，所述TagBFP PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，BglII酶1μl，NheⅠ酶1μl，TagBFP PCR扩增产物30μl和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h,得到TagBFP酶切反应液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将TagBFPPCR扩增产物进行酶切。
进一步，步骤2.1中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)TagBFP酶切产物凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到TagBFP酶切产物。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将TagBFP酶切反应液进行纯化。
进一步，步骤2.2中，所述HygroR-luciferase载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，BglII酶1μl，NheⅠ酶1μl，HygroR-luciferase载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl，将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到HygroR-luciferase酶切反应液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将HygroR-luciferase载体进行酶切。
进一步，步骤2.2中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)HygroR-luciferase载体酶切产物凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到HygroR-luciferase酶切纯化产物。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将HygroR-luciferase酶切反应液进行纯化。
进一步，步骤3中，所述转染的具体方法是：
在100μl减血清培养基和1μg步骤2得到的pProTB质粒，混匀，得到质粒溶液；
在100μl减血清培养基中加入5μl转染试剂Lipo2000，混匀，静置5min,得到Lipo2000溶液；
将上述质粒溶液轻轻滴入上述Lipo2000溶液中，混匀，静置20min，得到转染混合液；
将上述转染混合液滴入培养密度为80％的人肾上皮细胞系293T中，24h后，更换新的减血清培养基。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以将步骤2构建的pProTB质粒转染至人肾上皮细胞系293T中。
进一步，步骤3中，所述验证pProTB质粒是否构建成功的具体方法是：
(1)转染48h后,在荧光显微镜下，如果观察到蓝色荧光，则初步判断TagBFP构建成功；
(2)转染48h后,使用浓度为500×的Hygromycin筛选3天，若Hygromycin可以杀死未转染细胞，则初步判断HygroR构建成功；
(3)在293T细胞中检测到luciferase表达，则判断在细胞水平Fireluciferase构建成功；
同时具备以上三条，则判断pProTB质粒构建成功。
本发明的目的之二，是提供上述构建得到的pProTB质粒。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述构建得到的pProTB质粒。
上述构建得到的pProTB质粒的有益效果是：
上述构建得到的pProTB质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，整合了HygroR、TagBFP和Fluc三种基因的优点，可以满足实验中药物筛选的要求，具有广泛的应用前景。
本发明的目的之三，是提供上述构建得到的pProTB质粒的应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述构建得到的pProTB质粒在基因功能研究和干细胞分离中的应用。
上述构建得到的pProTB质粒的应用的有益效果是：
上述构建得到的pProTB质粒，构建在干扰载体或者高表达载体上，可以用于研究基因的功能；构建在启动子下游，可以用于分离和研究干细胞，对生物医学基础研究具有重要意义，适合规模化推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例构建的pProTB质粒的结构图。
图2为pProTB质粒转染293T细胞后的蓝色荧光图。其中图2A表示pProTB质粒转染293T细胞培养3天白场下的细胞，图2B表示pProTB质粒转染293T细胞3天后在荧光显微镜下观察到蓝色荧光蛋白的细胞。
图3为pProTB质粒转染293T细胞后进行Hygromycin筛选。其中图3A表示pProTB质粒转染293T细胞培养3天后的细胞，图3B表示pProTB质粒转染293T细胞HygroR筛选3天后的细胞，图3C表示293T细胞HygroR培养3天后的细胞。
图4为应用Synergy H4全功能酶标仪，检测293T细胞和pProTB质粒转染293T细胞Fluc生物发光图。
图5为应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪，检测293T细胞(左侧3个)和HygroR筛选的293T-pProTB细胞(右侧3个)Fluc生物发光图。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本实施例的pProTB质粒的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：构建HygroR-luciferase载体
步骤1.1：取HygroR，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO42μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.3所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.4所示的反向引物1.5μl,模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环，得到HygroR PCR扩增产物。
将HygroR PCR扩增产物进行酶切，所述HygroR PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，BglII酶1μl，HygroR PCR扩增产物30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到HygroR酶切反应液。
将HygroR酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)HygroR酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到酶切HygroR酶切产物。
步骤1.2：将luciferase载体进行酶切，所述luciferase载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，BglII酶1μl，Fluc载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到Fluc载体酶切反应液。
将Fluc载体酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)Fluc载体酶切产物凝胶中加入500ul结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到Fluc载体酶切产物。
步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的HygroR酶切产物和步骤1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒HygroR-luciferase。
步骤1.4：将质粒HygroR-luciferase转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到HygroR-luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤2：构建pProTB质粒
步骤2.1：取TagBFP载体，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO42μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.5所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.6所示的反向引物1.5μl,pcDNA3.1-TagBFP模板DNA50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环，得到TagBFP PCR扩增产物。
将TagBFP PCR扩增产物进行酶切，所述TagBFP PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，BglII酶1μl，NheⅠ酶1μl，TagBFP PCR扩增产物30μl和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h,得到TagBFP酶切反应液。
将TagBFP酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)TagBFP酶切产物凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到TagBFP酶切产物。
步骤2.2：将步骤1.4得到的HygroR-luciferase载体进行酶切，所述HygroR-luciferase载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，BglII酶1μl，NheⅠ酶1μl，HygroR-luciferase载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl，将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到HygroR-luciferase酶切反应液。
将HygroR-luciferase酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)HygroR-luciferase载体酶切产物凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到HygroR-luciferase酶切纯化产物。
步骤2.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤2.1得到的TagBFP酶切纯化产物和步骤2.2得到的HygroR-luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到TagBFP-HygroR-luciferase载体，即为pProTB质粒，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示，其结构图，如图1所示。
步骤3：验证pProTB质粒是否构建成功
将步骤2构建的pProTB质粒转染人肾上皮细胞系293T，验证pProTB质粒是否构建成功。
所述转染的具体方法是：
在100μl减血清培养基和1μg步骤2得到的pProTB质粒，混匀，得到质粒溶液；
在100μl减血清培养基中加入5μl转染试剂Lipo2000，混匀，静置5min,得到Lipo2000溶液；
将上述质粒溶液轻轻滴入上述Lipo2000溶液中，混匀，静置20min，得到转染混合液；
将上述转染混合液滴入培养密度为80％的人肾上皮细胞系293T中，24h后，更换新的减血清培养基。
所述验证pProTB质粒是否构建成功的具体方法是：
(1)转染48h后,在荧光显微镜下，如果观察到蓝色荧光，则初步判断TagBFP构建成功；
(2)转染48h后,使用浓度为500×的Hygromycin筛选3天，若Hygromycin可以杀死未转染细胞，则初步判断HygroR构建成功；
(3)在293T细胞中检测到luciferase表达，则判断在细胞水平Fireluciferase构建成功；
同时具备以上三条，则判断pProTB质粒构建成功。
pProTB质粒感染293T细胞后的蓝色荧光图，如图2所示。结果是pProTB质粒的感染293T细胞后发蓝色荧光，可构建在干扰载体/高表达载体或者启动子下游，用于研究基因功能或者分离干细胞。
pProTB质粒感染293T细胞后进行HygroR筛选，如图3所示。结果是293T-pProTB培养3天后铺满培养皿(图3A),293T-pProTB经过HygroR筛选3天阳性克隆(图3B)；293T细胞经过HygroR培养3天全部死亡(图3C)，说明感染pProTB质粒的293T细胞可以经过HygroR筛选并分离出稳定转染的细胞。
应用Synergy H4全功能酶标仪检测pProTB转染293T细胞后的Fluc生物发光，如图4所示。结果是HygroR筛选后的293T-pProTB细胞Fluc生物发光是未转染pProTB的293T细胞约50倍(见表1)，说明构建的质粒可用于Fluc生物发光，可对Fluc进行定量的结果。
表1
293T 293T 293T 293T-pProTB 293T-pProTB 293T-pProTB
14 15 17 706 849 787
应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪检测pProTB质粒转染293T细胞后的Fluc生物发光，如图5所示。结果是应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪检测到未转染pProTB质粒的293T细胞没有观察到Fluc生物发光，HygroR筛选后的293T-pProTB细胞fireluciferase生物发光，三个重复组ROI平均值为1×108，说明构建的质粒可用于Fluc生物发光，可对Fluc进行定量的结果,见表2所示。
表2
293T 293T 293T 293T-pProTB 293T-pProTB 293T-pProTB
0 0 0 3.306×10<sup>8</sup> 3.795×10<sup>8</sup> 3.956×10<sup>8</sup>
现有技术中并未有将HygroR、TagBFP和Fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。本发明成功构建得到的pProTB质粒，整合了HygroR、TagBFP和Fluc三种基因的优点，一是可以通过HygroR筛选阳性细胞，用于细胞筛选；二是可以通过TagBFP鉴定药物筛选阳性细胞，区别药物筛选后的耐药细胞；三是可以通过Fluc在活体动物体内追踪该质粒转染的细胞。因此，可以克服HygroR筛选后出现耐药细胞，TagBFP需要特定设备和不能在活体动物精确定量追踪，以及Fluc不能筛选细胞的缺点，可以满足实验中药物筛选的要求，具有广泛的应用前景。
本实施例还提供上述构建方法构建得到的pProTB质粒。
本实施例还提供上述构建方法构建得到的pProTB质粒在基因功能研究和干细胞分离中的应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 贵州医科大学附属医院
<120> 一种pProTB质粒、其构建方法及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2712
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60
agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120
gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180
cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240
ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300
caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360
gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420
atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480
cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540
ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600
tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660
atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720
tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780
cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840
ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900
gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960
tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020
gaagaagctt ggcattccgg tactgttggt aaagccacca tggaagacgc caaaaacata 1080
aagaaaggcc cggcgccatt ctatccgctg gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat 1140
aaggctatga agagatacgc cctggttcct ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc 1200
gaggtggaca tcacttacgc tgagtacttc gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg 1260
aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa 1320
ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac 1380
atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt atgggcattt cgcagcctac cgtggtgttc 1440
gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg aacgtgcaaa aaaagctccc aatcatccaa 1500
aaaattatta tcatggattc taaaacggat taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc 1560
gtcacatctc atctacctcc cggttttaat gaatacgatt ttgtgccaga gtccttcgat 1620
agggacaaga caattgcact gatcatgaac tcctctggat ctactggtct gcctaaaggt 1680
gtcgctctgc ctcatagaac tgcctgcgtg agattctcgc atgccagaga tcctattttt 1740
ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt 1800
ggaatgttta ctacactcgg atatttgata tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga 1860
tttgaagaag agctgtttct gaggagcctt caggattaca agattcaaag tgcgctgctg 1920
gtgccaaccc tattctcctt cttcgccaaa agcactctga ttgacaaata cgatttatct 1980
aatttacacg aaattgcttc tggtggcgct cccctctcta aggaagtcgg ggaagcggtt 2040
gccaagaggt tccatctgcc aggtatcagg caaggatatg ggctcactga gactacatca 2100
gctattctga ttacacccga gggggatgat aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca 2160
ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat accgggaaaa cgctgggcgt taatcaaaga 2220
ggcgaactgt gtgtgagagg tcctatgatt atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg 2280
accaacgcct tgattgacaa ggatggatgg ctacattctg gagacatagc ttactgggac 2340
gaagacgaac acttcttcat cgttgaccgc ctgaagtctc tgattaagta caaaggctat 2400
caggtggctc ccgctgaatt ggaatccatc ttgctccaac accccaacat cttcgacgca 2460
ggtgtcgcag gtcttcccga cgatgacgcc ggtgaacttc ccgccgccgt tgttgttttg 2520
gagcacggaa agacgatgac ggaaaaagag atcgtggatt acgtcgccag tcaagtaaca 2580
accgcgaaaa agttgcgcgg aggagttgtg tttgtggacg aagtaccgaa aggtcttacc 2640
ggaaaactcg acgcaagaaa aatcagagag atcctcataa aggccaagaa gggcggaaag 2700
atcgccgtgt aa 2712
<210> 2
<211> 3417
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagcgagc tgattaagga gaacatgcac atgaagctgt acatggaggg caccgtggac 60
aaccatcact tcaagtgcac atccgagggc gaaggcaagc cctacgaggg cacccagacc 120
atgagaatca aggtggtcga gggcggccct ctccccttcg ccttcgacat cctggctact 180
agcttcctct acggcagcaa gaccttcatc aaccacaccc agggcatccc cgacttcttc 240
aagcagtcct tccctgaggg cttcacatgg gagagagtca ccacatacga ggacgggggc 300
gtgctgaccg ctacccagga caccagcctc caggacggct gcctcatcta caacgtcaag 360
atcagagggg tgaacttcac atccaacggc cctgtgatgc agaagaaaac actcggctgg 420
gaggccttca ccgagacgct gtaccccgct gacggcggcc tggaaggcag aaacgacatg 480
gccctgaagc tcgtgggcgg gagccatctg atcgcaaaca tcaagaccac atatagatcc 540
aagaaacccg ctaagaacct caagatgcct ggcgtctact atgtggacta cagactggaa 600
agaatcaagg aggccaacaa cgagacctac gtcgagcagc acgaggtggc agtggccaga 660
tactgcgacc tccctagcaa actggggcac aagcttaata gatctatgaa aaagcctgaa 720
ctcaccgcga cgtctgtcga gaagtttctg atcgaaaagt tcgacagcgt ctccgacctg 780
atgcagctct cggagggcga agaatctcgt gctttcagct tcgatgtagg agggcgtgga 840
tatgtcctgc gggtaaatag ctgcgccgat ggtttctaca aagatcgtta tgtttatcgg 900
cactttgcat cggccgcgct cccgattccg gaagtgcttg acattgggga attcagcgag 960
agcctgacct attgcatctc ccgccgtgca cagggtgtca cgttgcaaga cctgcctgaa 1020
accgaactgc ccgctgttct gcagccggtc gcggaggcca tggatgcgat cgctgcggcc 1080
gatcttagcc agacgagcgg gttcggccca ttcggaccgc aaggaatcgg tcaatacact 1140
acatggcgtg atttcatatg cgcgattgct gatccccatg tgtatcactg gcaaactgtg 1200
atggacgaca ccgtcagtgc gtccgtcgcg caggctctcg atgagctgat gctttgggcc 1260
gaggactgcc ccgaagtccg gcacctcgtg cacgcggatt tcggctccaa caatgtcctg 1320
acggacaatg gccgcataac agcggtcatt gactggagcg aggcgatgtt cggggattcc 1380
caatacgagg tcgccaacat cttcttctgg aggccgtggt tggcttgtat ggagcagcag 1440
acgcgctact tcgagcggag gcatccggag cttgcaggat cgccgcggct ccgggcgtat 1500
atgctccgca ttggtcttga ccaactctat cagagcttgg ttgacggcaa tttcgatgat 1560
gcagcttggg cgcagggtcg atgcgacgca atcgtccgat ccggagccgg gactgtcggg 1620
cgtacacaaa tcgcccgcag aagcgcggcc gtctggaccg atggctgtgt agaagtactc 1680
gccgatagtg gaaaccgacg ccccagcact cgtccgaggg caaaggaaga agcttggcat 1740
tccggtactg ttggtaaagc caccatggaa gacgccaaaa acataaagaa aggcccggcg 1800
ccattctatc cgctggaaga tggaaccgct ggagagcaac tgcataaggc tatgaagaga 1860
tacgccctgg ttcctggaac aattgctttt acagatgcac atatcgaggt ggacatcact 1920
tacgctgagt acttcgaaat gtccgttcgg ttggcagaag ctatgaaacg atatgggctg 1980
aatacaaatc acagaatcgt cgtatgcagt gaaaactctc ttcaattctt tatgccggtg 2040
ttgggcgcgt tatttatcgg agttgcagtt gcgcccgcga acgacattta taatgaacgt 2100
gaattgctca acagtatggg catttcgcag cctaccgtgg tgttcgtttc caaaaagggg 2160
ttgcaaaaaa ttttgaacgt gcaaaaaaag ctcccaatca tccaaaaaat tattatcatg 2220
gattctaaaa cggattacca gggatttcag tcgatgtaca cgttcgtcac atctcatcta 2280
cctcccggtt ttaatgaata cgattttgtg ccagagtcct tcgataggga caagacaatt 2340
gcactgatca tgaactcctc tggatctact ggtctgccta aaggtgtcgc tctgcctcat 2400
agaactgcct gcgtgagatt ctcgcatgcc agagatccta tttttggcaa tcaaatcatt 2460
ccggatactg cgattttaag tgttgttcca ttccatcacg gttttggaat gtttactaca 2520
ctcggatatt tgatatgtgg atttcgagtc gtcttaatgt atagatttga agaagagctg 2580
tttctgagga gccttcagga ttacaagatt caaagtgcgc tgctggtgcc aaccctattc 2640
tccttcttcg ccaaaagcac tctgattgac aaatacgatt tatctaattt acacgaaatt 2700
gcttctggtg gcgctcccct ctctaaggaa gtcggggaag cggttgccaa gaggttccat 2760
ctgccaggta tcaggcaagg atatgggctc actgagacta catcagctat tctgattaca 2820
cccgaggggg atgataaacc gggcgcggtc ggtaaagttg ttccattttt tgaagcgaag 2880
gttgtggatc tggataccgg gaaaacgctg ggcgttaatc aaagaggcga actgtgtgtg 2940
agaggtccta tgattatgtc cggttatgta aacaatccgg aagcgaccaa cgccttgatt 3000
gacaaggatg gatggctaca ttctggagac atagcttact gggacgaaga cgaacacttc 3060
ttcatcgttg accgcctgaa gtctctgatt aagtacaaag gctatcaggt ggctcccgct 3120
gaattggaat ccatcttgct ccaacacccc aacatcttcg acgcaggtgt cgcaggtctt 3180
cccgacgatg acgccggtga acttcccgcc gccgttgttg ttttggagca cggaaagacg 3240
atgacggaaa aagagatcgt ggattacgtc gccagtcaag taacaaccgc gaaaaagttg 3300
cgcggaggag ttgtgtttgt ggacgaagta ccgaaaggtc ttaccggaaa actcgacgca 3360
agaaaaatca gagagatcct cataaaggcc aagaagggcg gaaagatcgc cgtgtaa 3417
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agatctatga aaaagcctga actcac 26
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagcttcttc ctttgccctc ggacgag 27
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctagcgcca ccatgagcga gctgattaag gag 33
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agatctatta agcttgtgcc ccagtt 26

Claims (10)

1.一种pProTB质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：构建HygroR-luciferase载体
步骤1.1：取HygroR抗性基因，进行PCR扩增反应，得到HygroR PCR扩增产物；将HygroRPCR扩增产物进行酶切，得到HygroR酶切反应液；将HygroR酶切反应液再纯化，得到HygroR酶切产物；
步骤1.2：将Fluc载体进行酶切，得到Fluc载体酶切反应液；将Fluc载体酶切反应液再纯化，得到Fluc载体酶切产物；
步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的HygroR酶切产物和步骤1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒HygroR-luciferase；
步骤1.4：将质粒HygroR-luciferase转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到HygroR-luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤2：构建pProTB质粒
步骤2.1：取TagBFP载体，进行PCR扩增反应，得到TagBFP PCR扩增产物；将TagBFP PCR扩增产物进行酶切，得到TagBFP酶切反应液；将TagBFP酶切反应液再纯化，得到TagBFP酶切纯化产物；
步骤2.2：将步骤1.4得到的HygroR-luciferase载体进行酶切，得到HygroR-luciferase酶切反应液；将HygroR-luciferase酶切反应液再纯化，得到HygroR-luciferase酶切纯化产物；
步骤2.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤2.1得到的TagBFP酶切纯化产物和步骤2.2得到的HygroR-luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到TagBFP-HygroR-luciferase载体，即为pProTB质粒，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
步骤3：验证pProTB质粒是否构建成功
将步骤2构建的pProTB质粒转染人肾上皮细胞系293T，验证pProTB质粒是否构建成功。
2.根据权利要求1所述的pProTB质粒的构建方法，其特征在于，步骤1.1中，所述HygroRPCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO4 2μl,10pmol/μl的SEQID NO.3所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.4所示的反向引物1.5μl,模板DNA50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环；
所述HygroR PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，BglII酶1μl，HygroR PCR扩增产物30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到HygroR酶切反应液；
所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)HygroR酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到酶切HygroR酶切产物。
3.根据权利要求1所述的pProTB质粒的构建方法，其特征在于，步骤1.2中，所述Fluc载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，BglII酶1μl，Fluc载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到luciferase载体酶切反应液；
所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)Fluc载体酶切产物凝胶中加入500ul结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到Fluc载体酶切产物。
4.根据权利要求1所述的pProTB质粒的构建方法，其特征在于，步骤2.1中，所述TagBFPPCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO4 2μl,10pmol/μl的SEQID NO.5所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.6所示的反向引物1.5μl,pcDNA3.1-TagBFP模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环；
所述TagBFP PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，BglII酶1μl，NheⅠ酶1μl，TagBFP PCR扩增产物30μl和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h,得到TagBFP酶切反应液；
所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)TagBFP酶切产物凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到TagBFP酶切产物。
5.根据权利要求1所述的pProTB质粒的构建方法，其特征在于，步骤2.2中，所述HygroR-luciferase载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，BglII酶1μl，NheⅠ酶1μl，HygroR-luciferase载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl，将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到HygroR-luciferase酶切反应液。
6.根据权利要求1所述的pProTB质粒的构建方法，其特征在于，步骤2.2中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)HygroR-luciferase载体酶切产物凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到HygroR-luciferase酶切纯化产物。
7.根据权利要求1所述的pProTB质粒的构建方法，其特征在于，步骤3中，所述转染的具体方法是：
在100μl减血清培养基和1μg步骤2得到的pProTB质粒，混匀，得到质粒溶液；
在100μl减血清培养基中加入5μl转染试剂Lipo2000，混匀，静置5min,得到Lipo2000溶液；
将上述质粒溶液轻轻滴入上述Lipo2000溶液中，混匀，静置20min，得到转染混合液；
将上述转染混合液滴入培养密度为80％的人肾上皮细胞系293T中，24h后，更换新的减血清培养基。
8.根据权利要求1所述的pProTB质粒的构建方法，其特征在于，步骤3中，所述验证pProTB质粒是否构建成功的具体方法是：
(1)转染48h后,在荧光显微镜下，如果观察到蓝色荧光，则初步判断TagBFP构建成功；
(2)转染48h后,使用浓度为500×Hygromycin筛选3天，若Hygromycin可以杀死未转染细胞，则初步判断HygroR构建成功；
(3)在293T细胞中检测到luciferase表达，则判断在细胞水平luciferase构建成功；
同时具备以上三条，则判断pProTB质粒构建成功。
9.权利要求1-8任一项构建方法构建得到的pProTB质粒。
10.权利要求1-8任一项构建方法构建得到的pProTB质粒在基因功能研究和干细胞分离中的应用。
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