CN114231548A - 一种pProTM质粒、其构建方法及应用 - Google Patents

一种pProTM质粒、其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种pProTM质粒、其构建方法及应用，属于质粒构建技术领域。所述pProTM质粒的构建方法，包括如下步骤：步骤1：构建BSDR‑luciferase载体；步骤2：构建pProTM质粒；步骤3：验证pProTM质粒是否构建成功。本发明还公开了一种pProTM质粒及其应用。本发明构建得到的pProTM质粒，整合了BSDR、mCherry和Fluc三种基因的优点，一是可以通过BSDR筛选阳性细胞，可用于细胞药物筛选；二是可以通过mCherry对细胞进行筛选或者鉴定药物筛选阳性的细胞；三是可以通过Fluc在活体动物中追踪该质粒转染的细胞。

Description

一种pProTM质粒、其构建方法及应用
技术领域
本发明涉及一种pProTM质粒、其构建方法及应用，属于质粒构建技术领域。
背景技术
杀稻瘟菌素抗性基因(BSDR)能够构建在多种载体上，通过杀稻瘟菌素(BSD) 筛选转染BSDR抗性基因阳性细胞，从而筛选到目的细胞，这项技术广泛应用与医学生物研究领域。不过杀稻瘟菌素筛选后会出现部分耐药细胞，达不到精确筛选阳性细胞的目的，影响研究结果的准确性。
红色荧光蛋白(mCherry)可以通过对细胞进行标记从而追踪细胞，在生物和医学研究中有广泛的应用。不过，该项技术通常需要使用流式细胞仪，很多实验室可能不具备开展这项实验的条件，而且，使用mCherry在活体动物中进行细胞追踪获得的图像背景信号信噪比高，因此定量检测性能差。
萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,简称FLuc)可以在活体动物中进行细胞追踪，获得的图像背景信号信噪比低，适用于活体动物定量研究。但缺点是没有药物抗性，不能进行流氏分选从而筛选细胞，另外FLuc只有在活细胞内才会产生发光现象，且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
综上，如何克服BSD筛选后出现耐药细胞，mCherry需要特定设备和无法在活体动物体内进行精确定量追踪，以及Fluc不能筛选细胞的缺点，目前尚未有将BSDR、mCherry和Fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种pProTM质粒的构建方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种pProTM质粒的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：构建BSDR-luciferase载体
步骤1.1：取Blasticidin S抗性基因，进行PCR扩增反应，得到BSDR PCR 扩增产物；将BSDR PCR扩增产物进行酶切，得到BSDR酶切反应液；将BSDR酶切反应液再纯化，得到BSDR酶切产物；
步骤1.2：将Fluc载体进行酶切，得到Fluc载体酶切反应液；将Fluc载体酶切反应液再纯化，得到Fluc载体酶切产物；
步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的BSDR酶切产物和步骤 1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒BSD-luciferase；
步骤1.4：将质粒BSDR-luciferase转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到BSDR-luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；
步骤2：构建pProTM质粒
步骤2.1：取mCherry载体，进行PCR扩增反应，得到mCherry PCR扩增产物；将mCherry PCR扩增产物进行酶切，得到mCherry酶切反应液；将mCherry 酶切反应液再纯化，得到mCherry酶切纯化产物；
步骤2.2：将步骤1.4得到的BSDR-luciferase载体进行酶切，得到 BSDR-luciferase酶切反应液；将BSDR-luciferase酶切反应液再纯化，得到 BSDR-luciferase酶切纯化产物；
步骤2.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤2.1得到的mCherry酶切纯化产物和步骤2.2得到的BSDR-luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌DH5 ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到mCherry-BSD-luciferase载体，即为pProTM质粒，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
步骤3：验证pProTM质粒是否构建成功
将步骤2构建的pProTM质粒转染人肾上皮细胞系293T，验证pProTM质粒是否构建成功。
其中，BSDR-luciferase载体的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
atggccaagcctttgtctcaagaagaatccaccctcattgaaagagcaacggctacaatcaaca gcatccccatctctgaagactacagcgtcgccagcgcagctctctctagcgacggccgcatcttcact ggtgtcaatgtatatcattttactgggggaccttgtgcagaactcgtggtgctgggcactgctgctgc tgcggcagctggcaacctgacttgtatcgtcgcgatcggaaatgagaacaggggcatcttgagcccct gcggacggtgccgacaggtgcttctcgatctgcatcctgggatcaaagccatagtgaaggacagtgat ggacagccgacggcagttgggattcgtgaattgctgccctctggttatgtgtgggagggcgccaccat ggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggag agcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacat atcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacg atatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccgg tgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattg ctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaatttt gaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagg gatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtg ccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcc taaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttg gcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgttt actacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtt tctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcg ccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctccc ctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgg gctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaa agaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaa cgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacact tcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattg gaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgc cggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtgg attacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagta ccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaaggg cggaaagatcgccgtgtaa。
pProTM质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：
atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgc acatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgag ggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtc ccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagc tgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtg acccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttccc ctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccg aggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgct gaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaa gttggacatcacctctcacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgcc actccaccggcggcatggacgagctgtacaagaagcttatggccaagcctttgtctcaagaagaatcc accctcattgaaagagcaacggctacaatcaacagcatccccatctctgaagactacagcgtcgccag cgcagctctctctagcgacggccgcatcttcactggtgtcaatgtatatcattttactgggggacctt gtgcagaactcgtggtgctgggcactgctgctgctgcggcagctggcaacctgacttgtatcgtcgcg atcggaaatgagaacaggggcatcttgagcccctgcggacggtgccgacaggtgcttctcgatctgca tcctgggatcaaagccatagtgaaggacagtgatggacagccgacggcagttgggattcgtgaattgc tgccctctggttatgtgtgggagggcgccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcg ccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccct ggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcg aaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgta tgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgc gcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaa attattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctca tctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcac tgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgc gtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaag tgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgag tcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagt gcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatc taatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaaga ggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattaca cccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtgga tctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgatta tgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattct ggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaa gtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcg acgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggag cacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaa gttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaa aaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaa。
本发明的原理是：
第一点，本发明的步骤1中，mCherry在荧光显微镜下显示明亮的红色，可作为报告基因研究基因表达与调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。
第二点，本发明的步骤2中，BSDR基因编码抗稻瘟菌素抗性蛋白，转染细胞后可以抵抗稻瘟菌素的杀死作用，筛选出转染BSDR抗性的细胞。
第三点，Firefly Luciferase(Fluc,萤火虫荧光素酶)催化luciferin(萤光素)氧化成oxyluciferin(氧化萤光素)，会发出生物荧光,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。
综上，本发明通过融合BSDR、mCherry和Fluc这三种基因，构建出pProTM 质粒，可以在细胞水平检测红色荧光蛋白，杀稻瘟菌素药物筛选耐药细胞，在活体动物上灵敏检测Fluc，满足实验中药物筛选的要求。
本发明的pProTM质粒的构建方法的有益效果是：
1、现有技术中并未有将BSDR、mCherry和Fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。本发明构建得到的pProTM质粒，整合了BSDR、mCherry和Fluc 三种基因的优点，一是可以通过BSDR筛选阳性细胞，用于细胞筛选；二是可以通过mCherry鉴定药物筛选阳性细胞，区别药物筛选后的耐药细胞；三是可以通过Fluc在活体动物体内追踪该质粒转染的细胞。因此，可以克服BSD筛选后出现耐药细胞，mCherry需要特定设备和不能在活体动物精确定量追踪，以及 Fluc不能筛选细胞的缺点，可以满足实验中药物筛选的要求，具有广泛的应用前景。
2、本发明的构建方法简单，操作容易，应用领域广泛，适合规模化推广应用，能产生积极效果。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1.1中，所述BSDR PCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μ l,2mMdNTPs 5μl,25mM MgSO42μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.3所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.4所示的反向引物1.5μl,模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将BSDR 进行PCR扩增。
其中，BSDR正向引物(SEQ ID NO.3)：
ggaagcttatggccaagcctttgtctcaag；
BSDR反向引物(SEQ ID NO.4)：
ggccatggtggcgccctcccacacataac。
进一步，步骤1.1中，所述BSDR PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10 ×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，BSD PCR扩增产物 30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到BSD酶切反应液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将BSDR PCR扩增产物进行酶切。上述HindⅢ酶和NcoⅠ酶均购自NEB公司。
进一步，步骤1.1中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)BSDR酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到酶切BSDR酶切产物。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将BSDR酶切反应液或进行纯化。
进一步，步骤1.2中，所述Fluc载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，Fluc载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到Fluc载体酶切反应液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将Fluc 载体进行酶切。
进一步，步骤1.2中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)Fluc酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到Fluc载体酶切产物。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将Fluc载体酶切反应液进行纯化。
进一步，步骤2.1中，所述mCherry PCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mMdNTPs 5μl,25mM MgSO42μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.5所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.6所示的反向引物1.5μl, pcDNA3.1-mCherry模板DNA 50ng,1.0U/μl的KODPlus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将 mCherry载体进行PCR扩增反应。
其中，mCherry正向引物(SEQ ID NO.5)：
tgctagcgccaccatggtgagcaagggcgag；
mCherry反向引物(SEQ ID NO.6)：
aagcttcttgtacagctcgtccatgc。
进一步，步骤2.1中，所述mCherry PCR扩增产物进行酶切的反应体系为： 10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NheⅠ酶1μl，mCherry PCR扩增产物30μl和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅 1h,得到mCherry酶切反应液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将 mCherryPCR扩增产物进行酶切。
进一步，步骤2.1中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)mCherry酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到mCherry酶切产物。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将mCherry酶切反应液进行纯化。
进一步，步骤2.2中，所述BSDR-luciferase载体进行酶切的反应体系为： 10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NheⅠ酶1μl，BSDR-luciferase 载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl，将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到BSD-luciferase酶切反应液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将 BSDR-luciferase载体进行酶切。
进一步，步骤2.2中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)BSDR-luciferase酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到BSDR-luciferase 酶切纯化产物。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将BSDR-luciferase 酶切反应液进行纯化。
进一步，步骤3中，所述转染的具体方法是：
在100μl减血清培养基和1μg步骤2得到的pProTM质粒，混匀，得到质粒溶液；
在100μl减血清培养基中加入5μl转染试剂Lipo2000，混匀，静置5min, 得到Lipo2000溶液；
将上述质粒溶液轻轻滴入上述Lipo2000溶液中，混匀，静置20min，得到转染混合液；
将上述转染混合液滴入培养密度为80％的人肾上皮细胞系293T中，24h后，更换新的减血清培养基。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以将步骤2构建的pProTM 质粒转染至人肾上皮细胞系293T中。
进一步，步骤3中，所述验证pProTM质粒是否构建成功的具体方法是：
(1)转染48h后,在荧光显微镜下，如果观察到红色荧光，则初步判断 mCherry构建成功；
(2)转染48h后,使用浓度为5μg/ml的BSD筛选3天，若BSD可以杀死未转染细胞，则初步判断BSDR构建成功；
(3)在293T细胞中检测到Fluc表达，则判断在细胞水平Fluc构建成功；
同时具备以上三条，则判断pProTM质粒构建成功。
本发明的目的之二，是提供上述构建得到的pProTM质粒。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述构建得到的pProTM质粒。
上述构建得到的pProTM质粒的有益效果是：
上述构建得到的pProTM质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，整合了 BSDR、mCherry和Fluc三种基因的优点，可以满足实验中药物筛选的要求，具有广泛的应用前景。
本发明的目的之三，是提供上述构建得到的pProTM质粒的应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述构建得到的pProTM质粒在基因功能研究和干细胞分离中的应用。
上述构建得到的pProTM质粒的应用的有益效果是：
上述构建得到的pProTM质粒，构建在干扰载体或者高表达载体上，可以用于研究基因的功能；构建在启动子下游，可以用于分离和研究干细胞，对生物医学基础研究具有重要意义，适合规模化推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例构建的pProTM质粒的结构图。
图2为pProTM质粒转染293T细胞后的红色荧光图。
图3为pProTM质粒转染293T细胞后进行BSD筛选。其中图3A表示pProTM 质粒转染293T细胞培养3天后的细胞，图3B表示pProTM质粒转染293T细胞 BSD筛选3天后的细胞，图3C表示293T细胞BSD培养3天后的细胞。
图4为pProTM质粒转染293T细胞BSD筛选的荧光融合图。其中图4A显示荧光镜下的细胞，图4B显示白场镜下的细胞。
图5为应用Synergy H4全功能酶标仪，检测293T细胞和细胞 fireluciferase生物发光图。
图6为应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪，检测BSD筛选293T细胞(左侧3个)和293T-pProTM细胞(右侧3个)fireluciferase生物发光图。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本实施例的pProTM质粒的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：构建BSDR-luciferase载体
步骤1.1：取BSDR，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的体系为： 10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO42μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.3 所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.4所示的反向引物1.5μl, 模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次； 68℃延伸10min,4℃，无限循环，得到BSD PCR扩增产物。
将BSDR PCR扩增产物进行酶切，所述BSDR PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，BSDR PCR 扩增产物30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到BSDR酶切反应液。
将BSDR酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)BSDR酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到酶切BSDR酶切产物。
步骤1.2：将Fluc载体进行酶切，所述Fluc载体进行酶切的反应体系为： 10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，Fluc载体1μg 和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到 luciferase载体酶切反应液。
将Fluc载体酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)Fluc酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到Fluc载体酶切产物。
步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的BSDR酶切产物和步骤 1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒BSDR-luciferase。
步骤1.4：将质粒BSDR-luciferase转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到BSDR-luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
步骤2：构建pProTM质粒
步骤2.1：取mCherry载体，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO42μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.5 所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.6所示的反向引物1.5μ l,pcDNA3.1-mCherry模板DNA50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环，得到mCherry PCR扩增产物。
将mCherry PCR扩增产物进行酶切，所述mCherry PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NheⅠ酶1μl， mCherry PCR扩增产物30μl和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h,得到mCherry酶切反应液。
将mCherry酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)mCherry酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到mCherry酶切产物。
步骤2.2：将步骤1.4得到的BSDR-luciferase载体进行酶切，所述 BSDR-luciferase载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，Hind Ⅲ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，BSDR-luciferase载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl，将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到BSDR-luciferase酶切反应液。
将BSDR-luciferase酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1mi，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)BSDR-luciferase酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到BSDR-luciferase 酶切纯化产物。
步骤2.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤2.1得到的mCherry酶切纯化产物和步骤2.2得到的BSDR-luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌DH5 ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到mCherry-BSD-luciferase载体，即为pProTM质粒，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示，其结构图，如图1所示。
步骤3：验证pProTM质粒是否构建成功
将步骤2构建的pProTM质粒转染人肾上皮细胞系293T，验证pProTM质粒是否构建成功。
所述转染的具体方法是：
在100μl减血清培养基和1μg步骤2得到的pProTM质粒，混匀，得到质粒溶液；
在100μl减血清培养基中加入5μl转染试剂Lipo2000，混匀，静置5min, 得到Lipo2000溶液；
将上述质粒溶液轻轻滴入上述Lipo2000溶液中，混匀，静置20min，得到转染混合液；
将上述转染混合液滴入培养密度为80％的人肾上皮细胞系293T中，24h后，更换新的减血清培养基。
所述验证pProTM质粒是否构建成功的具体方法是：
(1)转染48h后,在荧光显微镜下，如果观察到红色荧光，则初步判断 mCherry构建成功；
(2)转染48h后,使用浓度为2μg/μl的BSD筛选3天，若BSD可以杀死未转染细胞，则初步判断BSDR构建成功；
(3)在293T细胞中检测到luciferase表达，则判断在细胞水平 Fireluciferase构建成功；
同时具备以上三条，则判断pProTM质粒构建成功。
pProTM质粒感染293T细胞后的红色荧光图，如图2所示。结果是pProTM 质粒的感染293T细胞后发红色荧光，可构建在干扰载体/高表达载体或者启动子下游，用于研究基因功能或者分离干细胞。
pProTM质粒感染293T细胞后进行BSD筛选，如图3所示。结果是 293T-pProTM培养3天后铺满培养皿(图3A),293T-pProTM经过BSD筛选3天阳性克隆(图3B)；293T细胞经过BSD培养3天全部死亡(图3C)，说明感染 pProTM质粒的293T细胞可以经过BSD筛选并分离出稳定转染的细胞。
pProTM质粒感染293T细胞后进行BSD筛选和荧光融合图，如图4所示。白场镜下293T-pProTM经过BSD筛选3天阳性克隆(图4A),荧光显微镜下显示 293T-pProTM经过BSD筛选3天的红色荧光蛋白细胞(图4B),说明经过BSD筛选后的293T-pProTM可以在镜下观察到红色荧光蛋白，克服了BSD筛选后出现耐药细胞，且不需要使用流式细胞仪的结果。
应用Synergy H4全功能酶标仪检测pProTM转染293T细胞后的 fireluciferase生物发光，如图5所示。结果是BSD筛选后的293T-pProTM细胞fireluciferase生物发光是未转染pProTM的293T细胞约80倍，见表1所示，说明构建的质粒可用于fireluciferase生物发光，可对Luciferase进行定量的结果。
表1
293T 293T 293T 293T-pProTM 293T-pProTM 293T-pProTM
11 14 11 814 822 847
应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪检测pProTM质粒转染293T细胞后的fireluciferase生物发光，如图6所示。结果是应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪检测到未转染pProTM质粒的293T细胞没有观察到fireluciferase生物发光，BSD筛选后的293T-pProTM细胞fireluciferase生物发光，三个重复组 ROI平均值为1×106，说明构建的质粒可用于fireluciferase生物发光，可对 Luciferase进行定量的结果,见表2所示。
表2
293T 293T 293T 293T-pProTM 293T-pProTM 293T-pProTM
0 0 0 3.167×10<sup>8</sup> 3.053×10<sup>8</sup> 2.960×10<sup>8</sup>
现有技术中并未有将BSDR、mCherry和Fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。本发明成功构建得到的pProTM质粒，整合了BSDR、mCherry和Fluc 三种基因的优点，一是可以通过BSDR筛选阳性细胞，用于细胞筛选；二是可以通过mCherry鉴定药物筛选阳性细胞，区别药物筛选后的耐药细胞；三是可以通过Fluc在活体动物体内追踪该质粒转染的细胞。因此，可以克服BSD筛选后出现耐药细胞，mCherry需要特定设备和不能在活体动物精确定量追踪，以及 Fluc不能筛选细胞的缺点，可以满足实验中药物筛选的要求，具有广泛的应用前景。
本实施例还提供上述构建方法构建得到的pProTM质粒。
本实施例还提供上述构建方法构建得到的pProTM质粒在基因功能研究和干细胞分离中的应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 贵州医科大学附属医院
<120> 一种pProTM质粒、其构建方法及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2055
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccaagc ctttgtctca agaagaatcc accctcattg aaagagcaac ggctacaatc 60
aacagcatcc ccatctctga agactacagc gtcgccagcg cagctctctc tagcgacggc 120
cgcatcttca ctggtgtcaa tgtatatcat tttactgggg gaccttgtgc agaactcgtg 180
gtgctgggca ctgctgctgc tgcggcagct ggcaacctga cttgtatcgt cgcgatcgga 240
aatgagaaca ggggcatctt gagcccctgc ggacggtgcc gacaggtgct tctcgatctg 300
catcctggga tcaaagccat agtgaaggac agtgatggac agccgacggc agttgggatt 360
cgtgaattgc tgccctctgg ttatgtgtgg gagggcgcca ccatggaaga cgccaaaaac 420
ataaagaaag gcccggcgcc attctatccg ctggaagatg gaaccgctgg agagcaactg 480
cataaggcta tgaagagata cgccctggtt cctggaacaa ttgcttttac agatgcacat 540
atcgaggtgg acatcactta cgctgagtac ttcgaaatgt ccgttcggtt ggcagaagct 600
atgaaacgat atgggctgaa tacaaatcac agaatcgtcg tatgcagtga aaactctctt 660
caattcttta tgccggtgtt gggcgcgtta tttatcggag ttgcagttgc gcccgcgaac 720
gacatttata atgaacgtga attgctcaac agtatgggca tttcgcagcc taccgtggtg 780
ttcgtttcca aaaaggggtt gcaaaaaatt ttgaacgtgc aaaaaaagct cccaatcatc 840
caaaaaatta ttatcatgga ttctaaaacg gattaccagg gatttcagtc gatgtacacg 900
ttcgtcacat ctcatctacc tcccggtttt aatgaatacg attttgtgcc agagtccttc 960
gatagggaca agacaattgc actgatcatg aactcctctg gatctactgg tctgcctaaa 1020
ggtgtcgctc tgcctcatag aactgcctgc gtgagattct cgcatgccag agatcctatt 1080
tttggcaatc aaatcattcc ggatactgcg attttaagtg ttgttccatt ccatcacggt 1140
tttggaatgt ttactacact cggatatttg atatgtggat ttcgagtcgt cttaatgtat 1200
agatttgaag aagagctgtt tctgaggagc cttcaggatt acaagattca aagtgcgctg 1260
ctggtgccaa ccctattctc cttcttcgcc aaaagcactc tgattgacaa atacgattta 1320
tctaatttac acgaaattgc ttctggtggc gctcccctct ctaaggaagt cggggaagcg 1380
gttgccaaga ggttccatct gccaggtatc aggcaaggat atgggctcac tgagactaca 1440
tcagctattc tgattacacc cgagggggat gataaaccgg gcgcggtcgg taaagttgtt 1500
ccattttttg aagcgaaggt tgtggatctg gataccggga aaacgctggg cgttaatcaa 1560
agaggcgaac tgtgtgtgag aggtcctatg attatgtccg gttatgtaaa caatccggaa 1620
gcgaccaacg ccttgattga caaggatgga tggctacatt ctggagacat agcttactgg 1680
gacgaagacg aacacttctt catcgttgac cgcctgaagt ctctgattaa gtacaaaggc 1740
tatcaggtgg ctcccgctga attggaatcc atcttgctcc aacaccccaa catcttcgac 1800
gcaggtgtcg caggtcttcc cgacgatgac gccggtgaac ttcccgccgc cgttgttgtt 1860
ttggagcacg gaaagacgat gacggaaaaa gagatcgtgg attacgtcgc cagtcaagta 1920
acaaccgcga aaaagttgcg cggaggagtt gtgtttgtgg acgaagtacc gaaaggtctt 1980
accggaaaac tcgacgcaag aaaaatcaga gagatcctca taaaggccaa gaagggcgga 2040
aagatcgccg tgtaa 2055
<210> 2
<211> 2769
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctctcacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagaa gcttatggcc 720
aagcctttgt ctcaagaaga atccaccctc attgaaagag caacggctac aatcaacagc 780
atccccatct ctgaagacta cagcgtcgcc agcgcagctc tctctagcga cggccgcatc 840
ttcactggtg tcaatgtata tcattttact gggggacctt gtgcagaact cgtggtgctg 900
ggcactgctg ctgctgcggc agctggcaac ctgacttgta tcgtcgcgat cggaaatgag 960
aacaggggca tcttgagccc ctgcggacgg tgccgacagg tgcttctcga tctgcatcct 1020
gggatcaaag ccatagtgaa ggacagtgat ggacagccga cggcagttgg gattcgtgaa 1080
ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc gccaccatgg aagacgccaa aaacataaag 1140
aaaggcccgg cgccattcta tccgctggaa gatggaaccg ctggagagca actgcataag 1200
gctatgaaga gatacgccct ggttcctgga acaattgctt ttacagatgc acatatcgag 1260
gtggacatca cttacgctga gtacttcgaa atgtccgttc ggttggcaga agctatgaaa 1320
cgatatgggc tgaatacaaa tcacagaatc gtcgtatgca gtgaaaactc tcttcaattc 1380
tttatgccgg tgttgggcgc gttatttatc ggagttgcag ttgcgcccgc gaacgacatt 1440
tataatgaac gtgaattgct caacagtatg ggcatttcgc agcctaccgt ggtgttcgtt 1500
tccaaaaagg ggttgcaaaa aattttgaac gtgcaaaaaa agctcccaat catccaaaaa 1560
attattatca tggattctaa aacggattac cagggatttc agtcgatgta cacgttcgtc 1620
acatctcatc tacctcccgg ttttaatgaa tacgattttg tgccagagtc cttcgatagg 1680
gacaagacaa ttgcactgat catgaactcc tctggatcta ctggtctgcc taaaggtgtc 1740
gctctgcctc atagaactgc ctgcgtgaga ttctcgcatg ccagagatcc tatttttggc 1800
aatcaaatca ttccggatac tgcgatttta agtgttgttc cattccatca cggttttgga 1860
atgtttacta cactcggata tttgatatgt ggatttcgag tcgtcttaat gtatagattt 1920
gaagaagagc tgtttctgag gagccttcag gattacaaga ttcaaagtgc gctgctggtg 1980
ccaaccctat tctccttctt cgccaaaagc actctgattg acaaatacga tttatctaat 2040
ttacacgaaa ttgcttctgg tggcgctccc ctctctaagg aagtcgggga agcggttgcc 2100
aagaggttcc atctgccagg tatcaggcaa ggatatgggc tcactgagac tacatcagct 2160
attctgatta cacccgaggg ggatgataaa ccgggcgcgg tcggtaaagt tgttccattt 2220
tttgaagcga aggttgtgga tctggatacc gggaaaacgc tgggcgttaa tcaaagaggc 2280
gaactgtgtg tgagaggtcc tatgattatg tccggttatg taaacaatcc ggaagcgacc 2340
aacgccttga ttgacaagga tggatggcta cattctggag acatagctta ctgggacgaa 2400
gacgaacact tcttcatcgt tgaccgcctg aagtctctga ttaagtacaa aggctatcag 2460
gtggctcccg ctgaattgga atccatcttg ctccaacacc ccaacatctt cgacgcaggt 2520
gtcgcaggtc ttcccgacga tgacgccggt gaacttcccg ccgccgttgt tgttttggag 2580
cacggaaaga cgatgacgga aaaagagatc gtggattacg tcgccagtca agtaacaacc 2640
gcgaaaaagt tgcgcggagg agttgtgttt gtggacgaag taccgaaagg tcttaccgga 2700
aaactcgacg caagaaaaat cagagagatc ctcataaagg ccaagaaggg cggaaagatc 2760
gccgtgtaa 2769
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaagcttat ggccaagcct ttgtctcaag 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggccatggtg gcgccctccc acacataac 29
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgctagcgcc accatggtga gcaagggcga g 31
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagcttcttg tacagctcgt ccatgc 26

Claims (10)

1.一种pProTM质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：构建BSDR-luciferase载体
步骤1.1：取Blasticidin S抗性基因，进行PCR扩增反应，得到BSDR PCR扩增产物；将BSDR PCR扩增产物进行酶切，得到BSDR酶切反应液；将BSDR酶切反应液再纯化，得到BSDR酶切产物；
步骤1.2：将Fluc载体进行酶切，得到Fluc载体酶切反应液；将Fluc载体酶切反应液再纯化，得到Fluc载体酶切产物；
步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的BSDR酶切产物和步骤1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒BSD-luciferase；
步骤1.4：将质粒BSDR-luciferase转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到BSDR-luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤2：构建pProTM质粒
步骤2.1：取mCherry载体，进行PCR扩增反应，得到mCherry PCR扩增产物；将mCherryPCR扩增产物进行酶切，得到mCherry酶切反应液；将mCherry酶切反应液再纯化，得到mCherry酶切纯化产物；
步骤2.2：将步骤1.4得到的BSDR-luciferase载体进行酶切，得到BSDR-luciferase酶切反应液；将BSDR-luciferase酶切反应液再纯化，得到BSDR-luciferase酶切纯化产物；
步骤2.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤2.1得到的mCherry酶切纯化产物和步骤2.2得到的BSDR-luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到mCherry-BSD-luciferase载体，即为pProTM质粒，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
步骤3：验证pProTM质粒是否构建成功
将步骤2构建的pProTM质粒转染人肾上皮细胞系293T，验证pProTM质粒是否构建成功。
2.根据权利要求1所述的pProTM质粒的构建方法，其特征在于，步骤1.1中，所述BSDRPCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO4 2μl,10pmol/μl的SEQID NO.3所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.4所示的反向引物1.5μl,模板DNA50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环；
所述BSDR PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，BSD PCR扩增产物30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到BSDR酶切反应液；
所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)BSDR酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到酶切BSDR酶切产物。
3.根据权利要求1所述的pProTM质粒的构建方法，其特征在于，步骤1.2中，所述Fluc载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，luciferase载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到Fluc载体酶切反应液；
所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)Fluc酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到Fluc载体酶切产物。
4.根据权利要求1所述的pProTM质粒的构建方法，其特征在于，步骤2.1中，所述mCherry PCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO4 2μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.5所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.6所示的反向引物1.5μl,pcDNA3.1-mCherry模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环；
所述mCherry PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NheⅠ酶1μl，mCherry PCR扩增产物30μl和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h,得到mCherry酶切反应液；
所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)mCherry酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到mCherry酶切产物。
5.根据权利要求1所述的pProTM质粒的构建方法，其特征在于，步骤2.2中，所述BSD-luciferase载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NheⅠ酶1μl，BSDR-luciferase载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl，将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到BSD-luciferase酶切反应液。
6.根据权利要求1所述的pProTM质粒的构建方法，其特征在于，步骤2.2中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)BSDR-luciferase酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到BSDR-luciferase酶切纯化产物。
7.根据权利要求1所述的pProTM质粒的构建方法，其特征在于，步骤3中，所述转染的具体方法是：
在100μl减血清培养基和1μg步骤2得到的pProTM质粒，混匀，得到质粒溶液；
在100μl减血清培养基中加入5μl转染试剂Lipo2000，混匀，静置5min,得到Lipo2000溶液；
将上述质粒溶液轻轻滴入上述Lipo2000溶液中，混匀，静置20min，得到转染混合液；
将上述转染混合液滴入培养密度为80％的人肾上皮细胞系293T中，24h后，更换新的减血清培养基。
8.根据权利要求1所述的pProTM质粒的构建方法，其特征在于，步骤3中，所述验证pProTM质粒是否构建成功的具体方法是：
(1)转染48h后,在荧光显微镜下，如果观察到红色荧光，则初步判断mCherry构建成功；
(2)转染48h后,使用浓度为5μg/ml的BSD筛选3天，若BSD可以杀死未转染细胞，则初步判断BSDR构建成功；
(3)在293T细胞中检测到Fluc表达，则判断在细胞水平Fluc构建成功；
同时具备以上三条，则判断pProTM质粒构建成功。
9.权利要求1-8任一项构建方法构建得到的pProTM质粒。
10.权利要求1-8任一项构建方法构建得到的pProTM质粒在基因功能研究和干细胞分离中的应用。
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