CN114164233A - 一种pProTG质粒、其构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种pProTG质粒、其构建方法及应用，属于质粒构建技术领域。所述pProTG质粒的构建方法，包括如下步骤：步骤1：构建puromycinR‑luciferase载体；步骤2：构建pProTG质粒；步骤3：验证pProTG质粒是否构建成功。本发明还公开了一种pProTG质粒及其应用。本发明构建得到的pProTG质粒，整合了puroR、EGFP和Fluc三种基因的优点，一是可以通过puroR筛选阳性细胞，可用于细胞药物筛选；二是可以通过EGFP对细胞进行筛选或者鉴定药物筛选阳性的细胞；三是可以通过Fluc在活体动物中追踪该质粒转染的细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种pProTG质粒、其构建方法及应用，属于质粒构建技术领域。
背景技术
嘌呤霉素抗性基因(puroR)能够构建在多种载体上，通过嘌呤霉素(puromycin)筛选转染puroR抗性基因阳性细胞，从而筛选到目的细胞，这项技术广泛应用与医学生物研究领域。不过嘌呤霉素筛选后会出现部分耐药细胞，达不到精确筛选阳性细胞的目的，影响研究结果的准确性。
增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，简称EGFP)可以通过对细胞进行标记从而追踪细胞，在生物和医学研究中有广泛的应用。不过，该项技术通常需要使用流式细胞仪，很多实验室可能不具备开展这项实验的条件，而且，使用EGFP在活体动物中进行细胞追踪获得的图像背景信号信噪比高，因此定量检测性能差。
萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,简称FLuc)可以在活体动物中进行细胞追踪，获得的图像背景信号信噪比低，适用于活体动物定量研究。但缺点是没有药物抗性，不能进行流氏分选从而筛选细胞，另外FLuc只有在活细胞内才会产生发光现象，且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
综上，如何克服puromycin筛选后出现耐药细胞，EGFP需要特定设备和无法在活体动物体内进行精确定量追踪，以及Fluc不能筛选细胞的缺点？目前尚未有将puroR、EGFP和Fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种pProTG质粒的构建方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种pProTG质粒的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：构建puromycinR-luciferase载体
步骤1.1：取puromycinR，进行PCR扩增反应，得到puromycinR PCR扩增产物；将puromycinR PCR扩增产物进行酶切，得到puromycinR酶切反应液；将puromycinR酶切反应液再纯化，得到puromycinR酶切产物；
步骤1.2：将Fluc载体进行酶切，得到Fluc载体酶切反应液；将Fluc载体酶切反应液再纯化，得到Fluc载体酶切产物；
步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的puromycin酶切产物和步骤1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒puromycinR-luciferase；
步骤1.4：将质粒puromycinR-luciferase转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到puromycinR-luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤2：构建pProTG质粒
步骤2.1：取EGFP载体，进行PCR扩增反应，得到EGFP PCR扩增产物；将EGFP PCR扩增产物进行酶切，得到EGFP酶切反应液；将EGFP酶切反应液再纯化，得到EGFP酶切纯化产物；
步骤2.2：将步骤1.4得到的puromycinR-luciferase载体进行酶切，得到puromycinR-luciferase酶切反应液；将puromycinR-luciferase酶切反应液再纯化，得到puromycinR-luciferase酶切纯化产物；
步骤2.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤2.1得到的EGFP酶切纯化产物和步骤2.2得到的puromycinR-luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到EGFP-puromycinR-luciferase载体，即为pProTG质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤3：验证pProTG质粒是否构建成功
将步骤2构建的pProTG质粒转染人肾上皮细胞系293T，验证pProTG质粒是否构建成功。
其中，puromycinR-luciferase载体的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
atgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgccgccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaa。
pProTG质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：
gccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagaagcttatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgccgccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaa。
本发明的原理是：
第一点，本发明的步骤1中，EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein，增强绿色荧光蛋白)是GFP(绿色荧光蛋白)的突变体，在荧光显微镜下显示明亮的绿色，可作为报告基因研究基因表达与调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。
第二点，本发明的步骤2中，puromycin(嘌呤霉素)是由白黑链霉菌发酵产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成杀死细胞。puroR抗性编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶，产生嘌呤霉素抗性，转染细胞后可以抵抗嘌呤霉素的杀死作用，筛选出转染puroR抗性的细胞。
Firefly Luciferase(萤火虫荧光素酶)催化luciferin(萤光素)氧化成oxyluciferin(氧化萤光素)，会发出生物荧光,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。
综上，本发明通过融合puroR、EGFP和Fluc这三种基因，构建出pProTG质粒，可以在细胞水平检测绿色荧光蛋白，嘌呤霉素药物筛选耐药细胞，在活体动物上灵敏检测Luciferase，满足实验中药物筛选的要求。
本发明的pProTG质粒的构建方法的有益效果是：
1、现有技术中并未有将puroR、EGFP和Fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。本发明构建得到的pProTG质粒，整合了puroR、EGFP和Fluc三种基因的优点，一是可以通过puroR筛选阳性细胞，用于细胞筛选；二是可以通过EGFP鉴定药物筛选阳性细胞，区别药物筛选后的耐药细胞；三是可以通过Fluc在活体动物体内追踪该质粒转染的细胞。因此，可以克服puromycin筛选后出现耐药细胞，EGFP需要特定设备和不能在活体动物精确定量追踪，以及Fluc不能筛选细胞的缺点，可以满足实验中药物筛选的要求，具有广泛的应用前景。
2、本发明的构建方法简单，操作容易，应用领域广泛，适合规模化推广应用，能产生积极效果。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1.1中，所述puromycinR PCR扩增反应的体系为：10xBuffer5μl,2mMdNTPs 5μl,25mM MgSO42μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.3所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.4所示的反向引物1.5μl,模板DNA50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将puromycinR进行PCR扩增。
其中，puro正向引物(SEQ ID NO.3)：
ggaagcttatgaccgagtacaagcccac；
puro反向引物(SEQ ID NO.4)：
ggccatggtggcggcaccgggcttgcg。
进一步，步骤1.1中，所述puromycinR PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，puromycinR PCR扩增产物30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到puromycinR酶切反应液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将puromycinR PCR扩增产物进行酶切。上述HindⅢ酶和NcoⅠ酶均购自NEB公司。
进一步，步骤1.1中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)puromycinR酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到酶切puromycinR酶切产物。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将puromycinR酶切反应液或进行纯化。
进一步，步骤1.2中，所述Fluc载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，Fluc载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到Fluc载体酶切反应液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将Fluc载体进行酶切。
进一步，步骤1.2中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)Fluc酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到Fluc载体酶切产物。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将Fluc载体酶切反应液进行纯化。
进一步，步骤2.1中，所述EGFP PCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs5μl,25mM MgSO42μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.5所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ IDNO.6所示的反向引物1.5μl,pcDNA3.1-EGFP模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将EGFP载体进行PCR扩增反应。
其中，EGFP正向引物(SEQ ID NO.5)：
gggctagcgccaccatggtgagcaagggcgagga；
EGFP反向引物(SEQ ID NO.6)：
ggaagcttcttgtacagctcgtccatgc。
进一步，步骤2.1中，所述EGFP PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NheⅠ酶1μl，EGFP PCR扩增产物30μl和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h,得到EGFP酶切反应液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将EGFP PCR扩增产物进行酶切。
进一步，步骤2.1中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)EGFP酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到EGFP酶切产物。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将EGFP酶切反应液进行纯化。
进一步，步骤2.2中，所述puromycinR-luciferase载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NheⅠ酶1μl，puromycinR-luciferase载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl，将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到puromycinR-luciferase酶切反应液。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，能够将puromycinR-luciferase载体进行酶切。
进一步，步骤2.2中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)puromycinR-luciferase酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到puromycinR-luciferase酶切纯化产物。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，能够将puromycinR-luciferase酶切反应液进行纯化。
进一步，步骤3中，所述转染的具体方法是：
在100μl减血清培养基和1μg步骤2得到的pProTG质粒，混匀，得到质粒溶液；
在100μl减血清培养基中加入5μl转染试剂Lipo2000，混匀，静置5min,得到Lipo2000溶液；
将上述质粒溶液轻轻滴入上述Lipo2000溶液中，混匀，静置20min，得到转染混合液；
将上述转染混合液滴入培养密度为80％的人肾上皮细胞系293T中，24h后，更换新的减血清培养基。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以将步骤2构建的pProTG质粒转染至人肾上皮细胞系293T中。
进一步，步骤3中，所述验证pProTG质粒是否构建成功的具体方法是：
(1)转染48h后,在荧光显微镜下，如果观察到绿色荧光，则初步判断EGFP构建成功；
(2)转染48h后,使用浓度为2μg/μl的puromycin筛选3天，若puromycin可以杀死未转染细胞，则初步判断puroR构建成功；
(3)在293T细胞中检测到luciferase表达，则判断在细胞水平Fireluciferase构建成功；在动物体内检测到luciferase表达，则判断在动物水平Fireluciferase构建成功；
同时具备以上三条，则判断pProTG质粒构建成功。
本发明的目的之二，是提供上述构建得到的pProTG质粒。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述构建得到的pProTG质粒。
上述构建得到的pProTG质粒的有益效果是：
上述构建得到的pProTG质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，整合了puroR、EGFP和Fluc三种基因的优点，可以满足实验中药物筛选的要求，具有广泛的应用前景。
本发明的目的之三，是提供上述构建得到的pProTG质粒的应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述构建得到的pProTG质粒在基因功能研究和干细胞分离中的应用。
上述构建得到的pProTG质粒的应用的有益效果是：
上述构建得到的pProTG质粒，构建在干扰载体或者高表达载体上，可以用于研究基因的功能；构建在启动子下游，可以用于分离和研究干细胞，对生物医学基础研究具有重要意义，适合规模化推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例构建的pProTG质粒的结构图。
图2为pProTG质粒转染293T细胞后的绿色荧光图。
图3为pProTG质粒转染293T细胞后进行Puro筛选。其中图3A表示pProTG质粒转染293T细胞培养3天后的细胞，图3B表示pProTG质粒转染293T细胞puro筛选3天后的细胞，图3C表示293T细胞puro培养3天后的细胞。
图4为pProTG质粒转染293T细胞Puro筛选的荧光融合图。其中图4A显示荧光镜下的细胞，图4B显示白场镜下的细胞，图4C表示荧光和白场镜下的合并的细胞。
图5为应用Synergy H4全功能酶标仪，检测puro筛选293T-pProTG细胞和293T细胞fireluciferase生物发光图。
图6为应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪，检测puro筛选293T-pProTG细胞(左侧3个)和293T细胞(右侧3个)fireluciferase生物发光图。
图7为应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪，在裸鼠身体左侧从上到下分别注射1×106、1×105和×104的293T-pProTG细胞，检测到的fireluciferase生物发光图。
图8为应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪，在裸鼠身体右侧从上到下分别注射1×103和1×102的293T-pProTG细胞，检测到的fireluciferase生物发光图。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本实施例的pProTG质粒的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：构建puromycinR-luciferase载体
步骤1.1：取puromycinR，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO42μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.3所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.4所示的反向引物1.5μl,pLKO.1模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环，得到puromycinR PCR扩增产物。
将puromycinR PCR扩增产物进行酶切，所述puromycinR PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，puromycinR PCR扩增产物30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到puromycinR酶切反应液。
将puromycinR酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)puromycinR酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到酶切puromycinR酶切产物。
步骤1.2：将Fluc载体进行酶切，所述Fluc载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，Fluc载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到Fluc载体酶切反应液。
将Fluc载体酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)Fluc酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到Fluc载体酶切产物。
步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的puromycinR酶切产物和步骤1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒puromycinR-luciferase。
步骤1.4：将质粒puromycinR-luciferase转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到puromycinR-luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤2：构建pProTG质粒
步骤2.1：取EGFP载体，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的体系为：10xBuffer5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO42μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.5所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.6所示的反向引物1.5μl,pcDNA3.1-EGFP模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环，得到EGFP PCR扩增产物。
将EGFP PCR扩增产物进行酶切，所述EGFP PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NheⅠ酶1μl，EGFP PCR扩增产物30μl和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h,得到EGFP酶切反应液。
将EGFP酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)EGFP酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到EGFP酶切产物。
步骤2.2：将步骤1.4得到的puromycinR-luciferase载体进行酶切，所述puromycinR-luciferase载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NheⅠ酶1μl，puromycinR-luciferase载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl，将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到puromycinR-luciferase酶切反应液。
将puromycinR-luciferase酶切反应液再纯化，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)puromycinR-luciferase酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到
puromycinR-luciferase酶切纯化产物。
步骤2.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤2.1得到的EGFP酶切纯化产物和步骤2.2得到的puromycinR-luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到EGFP-puromycinR-luciferase载体，即为pProTG质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其结构图，如图1所示。
步骤3：验证pProTG质粒是否构建成功
将步骤2构建的pProTG质粒转染人肾上皮细胞系293T，验证pProTG质粒是否构建成功。
所述转染的具体方法是：
在100μl减血清培养基和1μg步骤2得到的pProTG质粒，混匀，得到质粒溶液；
在100μl减血清培养基中加入5μl转染试剂Lipo2000，混匀，静置5min,得到Lipo2000溶液；
将上述质粒溶液轻轻滴入上述Lipo2000溶液中，混匀，静置20min，得到转染混合液；
将上述转染混合液滴入培养密度为80％的人肾上皮细胞系293T中，24h后，更换新的减血清培养基。
所述验证pProTG质粒是否构建成功的具体方法是：
(1)转染48h后,在荧光显微镜下，如果观察到绿色荧光，则初步判断EGFP构建成功；
(2)转染48h后,使用浓度为2μg/μl的puromycin筛选3天，若puromycin可以杀死未转染细胞，则初步判断puroR构建成功；
(3)在293T细胞中检测到luciferase表达，则判断在细胞水平Fireluciferase构建成功；在动物体内检测到luciferase表达，则判断在动物水平Fireluciferase构建成功；
同时具备以上三条，则判断pProTG质粒构建成功。
pProTG质粒感染293T细胞后的绿色荧光图，如图2所示。结果是pProTG质粒的感染293T细胞后发绿色荧光，可构建在干扰载体/高表达载体或者启动子下游，用于研究基因功能或者分离干细胞。
pProTG质粒感染293T细胞后进行Puro筛选，如图3所示。结果是293T-pProTG培养3天后铺满培养皿(图3A),293T-pProTG经过puro筛选3天阳性克隆(图3B)；293T细胞经过puro培养3天全部死亡(图3C)，说明感染pProTG质粒的293T细胞可以经过Puro筛选并分离出稳定转染的细胞。
pProTG质粒感染293T细胞后进行Puro筛选和荧光融合图，如图4所示。白场镜下293T-pProTG经过puro筛选3天阳性克隆(图4A),荧光显微镜下显示293T-pProTG经过puro筛选3天的绿色荧光蛋白细胞(图4B)；白场镜下和荧光显微镜下合并的293T-pProTG细胞经过puro筛选3天的细胞(图4C)，说明经过Puro筛选后的293T-pProTG可以在镜下观察到绿色荧光蛋白，克服了Puro筛选后出现耐药细胞，且不需要使用流式细胞仪的结果。
应用Synergy H4全功能酶标仪检测pProTG转染293T细胞后的fireluciferase生物发光，如图5所示。结果是Puro筛选后的293T-pProTG细胞fireluciferase生物发光是未转染pProTG的293T细胞约300倍(见表1)，说明构建的质粒可用于fireluciferase生物发光，可对Luciferase进行定量的结果。
应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪检测pProTG质粒转染293T细胞后的fireluciferase生物发光，如图6所示。结果是应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪检测到Puro筛选后的293T-pProTG细胞fireluciferase生物发光，三个重复组ROI平均值为1×106，未转染pProTG质粒的293T细胞没有观察到fireluciferase生物发光，说明构建的质粒可用于fireluciferase生物发光，可对Luciferase进行定量的结果。
应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪，检测Puro筛选后的293T-pProTG细胞ROI荧光值，如表1所示。
表1
| 293T-pProTG | 293T-pProTG | 293T-pProTG | 293T | 293T | 293T |
| 1.17×10<sup>6</sup> | 9.04×10<sup>5</sup> | 1.01×10<sup>6</sup> | 0 | 0 | 0 |
应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪，在裸鼠身体左侧从上到下分别注射1×106、1×105和×104的293T-pProTG细胞，检测到的fireluciferase生物发光图，如图7所示。应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪，检测Puro筛选的293T-pProTG细胞在裸鼠身体左侧表达的ROI荧光值，如表2所示。应用IVISLuminaⅢ活体动物成像仪，在裸鼠身体右侧从上到下分别注射1×103和1×102的Puro，筛选293T-pProTG细胞检测到的fireluciferase生物发光图，如图8所示。应用IVIS LuminaⅢ活体动物成像仪检测Puro筛选的293T-pProTG细胞在裸鼠身体右侧表达的ROI荧光值，如表3所示。
表2
| 图像编号 | ROI | 图层 | 总光通量(p/s) |
| CLS20190513121701_001 | ROI1 | 覆盖 | 1.124×e<sup>8</sup> |
| CLS20190513121701_001 | ROI2 | 覆盖 | 2.194×e<sup>7</sup> |
| CLS20190513121701_001 | ROI3 | 覆盖 | 1.228×e<sup>7</sup> |
表3
| 图像编号 | ROI | 图层 | 总光通量(p/s) |
| CLS20190513122314_001 | ROI1 | 覆盖 | 1.189×e<sup>6</sup> |
| CLS20190513122314_001 | ROI2 | 覆盖 | 1.247×e<sup>6</sup> |
结果是在裸鼠上接种293T-pProTG细胞，应用IV IS LuminaⅢ活体动物成像仪检测到荧光素酶发光，且当细胞数目为1×106、1×105、1×104和1×103时，ROI值分别为1.124×e8、2.194×e7、1.228×e7和1.189×e6。得到在动物水平上，裸鼠上接种293T-pProTG细胞数目越多，ROI值越大，发光强度与标记细胞的数目线性相关的结果。
现有技术中并未有将puroR、EGFP和Fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。本发明成功构建得到的pProTG质粒，整合了puroR、EGFP和Fluc三种基因的优点，一是可以通过puroR筛选阳性细胞，用于细胞筛选；二是可以通过EGFP鉴定药物筛选阳性细胞，区别药物筛选后的耐药细胞；三是可以通过Fluc在活体动物体内追踪该质粒转染的细胞。因此，可以克服puromycin筛选后出现耐药细胞，EGFP需要特定设备和不能在活体动物精确定量追踪，以及Fluc不能筛选细胞的缺点，可以满足实验中药物筛选的要求，具有广泛的应用前景。
本实施例还提供上述构建方法构建得到的pProTG质粒。
本实施例还提供上述构建方法构建得到的pProTG质粒在基因功能研究和干细胞分离中的应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 贵州医科大学附属医院
<120> 一种pProTG质粒、其构建方法及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2256
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 60
cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 120
cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 180
atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 240
agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300
tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360
cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420
agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480
gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540
gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgccgcc 600
accatggaag acgccaaaaa cataaagaaa ggcccggcgc cattctatcc gctggaagat 660
ggaaccgctg gagagcaact gcataaggct atgaagagat acgccctggt tcctggaaca 720
attgctttta cagatgcaca tatcgaggtg gacatcactt acgctgagta cttcgaaatg 780
tccgttcggt tggcagaagc tatgaaacga tatgggctga atacaaatca cagaatcgtc 840
gtatgcagtg aaaactctct tcaattcttt atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga 900
gttgcagttg cgcccgcgaa cgacatttat aatgaacgtg aattgctcaa cagtatgggc 960
atttcgcagc ctaccgtggt gttcgtttcc aaaaaggggt tgcaaaaaat tttgaacgtg 1020
caaaaaaagc tcccaatcat ccaaaaaatt attatcatgg attctaaaac ggattaccag 1080
ggatttcagt cgatgtacac gttcgtcaca tctcatctac ctcccggttt taatgaatac 1140
gattttgtgc cagagtcctt cgatagggac aagacaattg cactgatcat gaactcctct 1200
ggatctactg gtctgcctaa aggtgtcgct ctgcctcata gaactgcctg cgtgagattc 1260
tcgcatgcca gagatcctat ttttggcaat caaatcattc cggatactgc gattttaagt 1320
gttgttccat tccatcacgg ttttggaatg tttactacac tcggatattt gatatgtgga 1380
tttcgagtcg tcttaatgta tagatttgaa gaagagctgt ttctgaggag ccttcaggat 1440
tacaagattc aaagtgcgct gctggtgcca accctattct ccttcttcgc caaaagcact 1500
ctgattgaca aatacgattt atctaattta cacgaaattg cttctggtgg cgctcccctc 1560
tctaaggaag tcggggaagc ggttgccaag aggttccatc tgccaggtat caggcaagga 1620
tatgggctca ctgagactac atcagctatt ctgattacac ccgaggggga tgataaaccg 1680
ggcgcggtcg gtaaagttgt tccatttttt gaagcgaagg ttgtggatct ggataccggg 1740
aaaacgctgg gcgttaatca aagaggcgaa ctgtgtgtga gaggtcctat gattatgtcc 1800
ggttatgtaa acaatccgga agcgaccaac gccttgattg acaaggatgg atggctacat 1860
tctggagaca tagcttactg ggacgaagac gaacacttct tcatcgttga ccgcctgaag 1920
tctctgatta agtacaaagg ctatcaggtg gctcccgctg aattggaatc catcttgctc 1980
caacacccca acatcttcga cgcaggtgtc gcaggtcttc ccgacgatga cgccggtgaa 2040
cttcccgccg ccgttgttgt tttggagcac ggaaagacga tgacggaaaa agagatcgtg 2100
gattacgtcg ccagtcaagt aacaaccgcg aaaaagttgc gcggaggagt tgtgtttgtg 2160
gacgaagtac cgaaaggtct taccggaaaa ctcgacgcaa gaaaaatcag agagatcctc 2220
ataaaggcca agaagggcgg aaagatcgcc gtgtaa 2256
<210> 2
<211> 2985
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccaccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 60
ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 120
acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 180
cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 240
atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 300
atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 360
accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 420
gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 480
aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 540
ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 600
aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 660
atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 720
aagaagctta tgaccgagta caagcccacg gtgcgcctcg ccacccgcga cgacgtcccc 780
agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc gccgactacc ccgccacgcg ccacaccgtc 840
gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc 900
gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg gacgacggcg ccgcggtggc ggtctggacc 960
acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag 1020
ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg 1080
cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc gtcggcgtct cgcccgacca ccagggcaag 1140
ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc 1200
gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac ctccccttct acgagcggct cggcttcacc 1260
gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc 1320
ggtgccgcca ccatggaaga cgccaaaaac ataaagaaag gcccggcgcc attctatccg 1380
ctggaagatg gaaccgctgg agagcaactg cataaggcta tgaagagata cgccctggtt 1440
cctggaacaa ttgcttttac agatgcacat atcgaggtgg acatcactta cgctgagtac 1500
ttcgaaatgt ccgttcggtt ggcagaagct atgaaacgat atgggctgaa tacaaatcac 1560
agaatcgtcg tatgcagtga aaactctctt caattcttta tgccggtgtt gggcgcgtta 1620
tttatcggag ttgcagttgc gcccgcgaac gacatttata atgaacgtga attgctcaac 1680
agtatgggca tttcgcagcc taccgtggtg ttcgtttcca aaaaggggtt gcaaaaaatt 1740
ttgaacgtgc aaaaaaagct cccaatcatc caaaaaatta ttatcatgga ttctaaaacg 1800
gattaccagg gatttcagtc gatgtacacg ttcgtcacat ctcatctacc tcccggtttt 1860
aatgaatacg attttgtgcc agagtccttc gatagggaca agacaattgc actgatcatg 1920
aactcctctg gatctactgg tctgcctaaa ggtgtcgctc tgcctcatag aactgcctgc 1980
gtgagattct cgcatgccag agatcctatt tttggcaatc aaatcattcc ggatactgcg 2040
attttaagtg ttgttccatt ccatcacggt tttggaatgt ttactacact cggatatttg 2100
atatgtggat ttcgagtcgt cttaatgtat agatttgaag aagagctgtt tctgaggagc 2160
cttcaggatt acaagattca aagtgcgctg ctggtgccaa ccctattctc cttcttcgcc 2220
aaaagcactc tgattgacaa atacgattta tctaatttac acgaaattgc ttctggtggc 2280
gctcccctct ctaaggaagt cggggaagcg gttgccaaga ggttccatct gccaggtatc 2340
aggcaaggat atgggctcac tgagactaca tcagctattc tgattacacc cgagggggat 2400
gataaaccgg gcgcggtcgg taaagttgtt ccattttttg aagcgaaggt tgtggatctg 2460
gataccggga aaacgctggg cgttaatcaa agaggcgaac tgtgtgtgag aggtcctatg 2520
attatgtccg gttatgtaaa caatccggaa gcgaccaacg ccttgattga caaggatgga 2580
tggctacatt ctggagacat agcttactgg gacgaagacg aacacttctt catcgttgac 2640
cgcctgaagt ctctgattaa gtacaaaggc tatcaggtgg ctcccgctga attggaatcc 2700
atcttgctcc aacaccccaa catcttcgac gcaggtgtcg caggtcttcc cgacgatgac 2760
gccggtgaac ttcccgccgc cgttgttgtt ttggagcacg gaaagacgat gacggaaaaa 2820
gagatcgtgg attacgtcgc cagtcaagta acaaccgcga aaaagttgcg cggaggagtt 2880
gtgtttgtgg acgaagtacc gaaaggtctt accggaaaac tcgacgcaag aaaaatcaga 2940
gagatcctca taaaggccaa gaagggcgga aagatcgccg tgtaa 2985
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaagcttat gaccgagtac aagcccac 28
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggccatggtg gcggcaccgg gcttgcg 27
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggctagcgc caccatggtg agcaagggcg agga 34
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaagcttct tgtacagctc gtccatgc 28
Claims (10)
1.一种pProTG质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：构建puromycinR-luciferase载体
步骤1.1：取puromycinR，进行PCR扩增反应，得到puromycinR PCR扩增产物；将puromycinR PCR扩增产物进行酶切，得到puromycinR酶切反应液；将puromycinR酶切反应液再纯化，得到puromycinR酶切产物；
步骤1.2：将Fluc载体进行酶切，得到Fluc载体酶切反应液；将Fluc载体酶切反Fluc应液再纯化，得到Fluc载体酶切产物；
步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的puromycinR酶切产物和步骤1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒puromycinR-luciferase；
步骤1.4：将质粒puromycinR-luciferase转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到puromycinR-luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤2：构建pProTG质粒
步骤2.1：取EGFP载体，进行PCR扩增反应，得到EGFP PCR扩增产物；将EGFP PCR扩增产物进行酶切，得到EGFP酶切反应液；将EGFP酶切反应液再纯化，得到EGFP酶切纯化产物；
步骤2.2：将步骤1.4得到的puromycinR-luciferase载体进行酶切，得到puromycinR-luciferase酶切反应液；将puromycinR-luciferase酶切反应液再纯化，得到puromycinR-luciferase酶切纯化产物；
步骤2.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤2.1得到的EGFP酶切纯化产物和步骤2.2得到的puromycinR-luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到EGFP-puromycinR-luciferase载体，即为pProTG质粒，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
步骤3：验证pProTG质粒是否构建成功
将步骤2构建的pProTG质粒转染人肾上皮细胞系293T，验证pProTG质粒是否构建成功。
2.根据权利要求1所述的pProTG质粒的构建方法，其特征在于，步骤1.1中，所述puromycinR PCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO4 2μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.3所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.4所示的反向引物1.5μl,模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环；
所述puromycinR PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，puromycin PCR扩增产物30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到puromycinR酶切反应液；
所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)puromycinR酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到酶切puromycinR酶切产物。
3.根据权利要求1所述的pProTG质粒的构建方法，其特征在于，步骤1.2中，所述Fluc载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，luciferase载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到Fluc载体酶切反应液；
所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)Fluc酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到Fluc载体酶切产物。
4.根据权利要求1所述的pProTG质粒的构建方法，其特征在于，步骤2.1中，所述EGFPPCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO4 2μl,10pmol/μl的SEQID NO.5所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.6所示的反向引物1.5μl,pcDNA3.1-EGFP模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环；
所述EGFP PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NheⅠ酶1μl，EGFP PCR扩增产物30μl和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h,得到EGFP酶切反应液；
所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)EGFP酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到EGFP酶切产物。
5.根据权利要求1所述的pProTG质粒的构建方法，其特征在于，步骤2.2中，所述puromycinR-luciferase载体进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NheⅠ酶1μl，puromycinR-luciferase载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl，将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到puromycinR-luciferase酶切反应液。
6.根据权利要求1所述的pProTG质粒的构建方法，其特征在于，步骤2.2中，所述纯化的具体方法是：
(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)puromycinR-luciferase酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；
(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH2O溶解，即得到puromycinR-luciferase酶切纯化产物。
7.根据权利要求1所述的pProTG质粒的构建方法，其特征在于，步骤3中，所述转染的具体方法是：
在100μl减血清培养基和1μg步骤2得到的pProTG质粒，混匀，得到质粒溶液；
在100μl减血清培养基中加入5μl转染试剂Lipo2000，混匀，静置5min,得到Lipo2000溶液；
将上述质粒溶液轻轻滴入上述Lipo2000溶液中，混匀，静置20min，得到转染混合液；
将上述转染混合液滴入培养密度为80％的人肾上皮细胞系293T中，24h后，更换新的减血清培养基。
8.根据权利要求1所述的pProTG质粒的构建方法，其特征在于，步骤3中，所述验证pProTG质粒是否构建成功的具体方法是：
(1)转染48h后,在荧光显微镜下，如果观察到绿色荧光，则初步判断EGFP构建成功；
(2)转染48h后,使用浓度为2μg/μl的puromycin筛选3天，若puromycin可以杀死未转染细胞，则初步判断puroR构建成功；
(3)在293T细胞中检测到luciferase表达，则判断在细胞水平Fireluciferase构建成功；在动物体内检测到luciferase表达，则判断在动物水平Fireluciferase构建成功；
同时具备以上三条，则判断pProTG质粒构建成功。
9.权利要求1-8任一项构建方法构建得到的pProTG质粒。
10.权利要求1-8任一项构建方法构建得到的pProTG质粒在基因功能研究和干细胞分离中的应用。
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| CN102803508A (zh) * | 2009-09-09 | 2012-11-28 | 通用电气公司 | 用于干细胞成像的组合物和方法 |
| WO2017152482A1 (zh) * | 2016-03-07 | 2017-09-14 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种可投送自主发光元件的分枝杆菌噬菌体及其应用 |
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