CN1784496B - 多基因转录活性测定系统 - Google Patents

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Abstract

以实现稳定表达的方式导入哺乳动物细胞的一种基因构建体，其含有可以用单一发光底物发射不同颜色光的至少两种光蛋白基因的任意一个；一种利用导入上述基因构建体所获得的哺乳动物细胞分析光蛋白表达量来多重测定与每个光蛋白连接的各启动子转录活性的系统；等等。

Description

多基因转录活性测定系统
技术领域
本发明涉及通过使用发射不同颜色光的荧光素酶而多重测定活细胞中基因转录活性的基因构建体、含有该构建体的表达载体、含有该构建体或表达载体的转化哺乳动物细胞、使用该哺乳动物细胞的药物筛选方法和用于多重测定不同启动子转录活性的系统。
本发明还涉及用于通过使用发射红色、橙色或蓝色光的荧光素酶测定活细胞中转录活性的系统的基因和多肽。
背景技术
在生命科学领域，细胞内基因转录活性通常被测定并用于评估给予细胞的外来因素、分析细胞内信号转导或个体蛋白质组的表达。基因转录活性通过Western印迹法等直接测定，或用荧光素酶基因或发光酶基因作为报告基因间接测定。具体而言，常规使用萤火虫发光酶基因基于发光强度对转录活性进行定量。荧光蛋白几乎在其细胞内表达的同时不需要辅因子而表现出荧光活性。荧光蛋白已用作监控蛋白，例如通过使用其细胞内荧光活性作为指标来定位蛋白质。但其难以定量，不可用作基因表达的报告基因。
分析蛋白质基因表达的量、时间动态变化很重要，但基因的转录活性主要在传统报告基因技术中进行分析。然而近来，已经可以从市场上购得通过向细胞中导入两个基因构建体来测定两种转录活性的系统(双重分析系统，Promega)，即将转录活性区A插入萤火虫发光酶基因，将转录活性区B插入海肾发光酶基因。然而该方法是通过分别加入不同的发光底物来测定转录活性的一种系统，两种活性不能同时测定，并且只能测定两种转录活性。此外，因为使用萤火虫荧光素酶，其波长随pH改变，所以难于精确测定。
细胞内来回传递多种信号，有必要建立定量测定多种转录活性的技术。例如，在人生物钟中，提供24小时节律的Per基因受Clock和BMAL基因产物的控制。因此要精确评价生物钟，必须测定多种、至少3种转录活性。到目前为止，单个基因的转录活性已经利用萤火虫荧光素酶报告基因测定，但一次只能观察一个基因转录的动态变化，生物钟相关基因表达的相互作用还不清楚。
由于致癌基因活化引起的细胞异常生长或由于抑癌基因失活引起的控制消除而造成的细胞异常生长，发生癌变过程。因此，为评价癌变因素和癌变过程的细胞内信号转导，需要测定致癌基因、抑癌基因和有丝分裂标志基因的基因转录活性。然而，常规方法中，一次只能观察一个基因转录的动态变化，一次不能评估三个基因的转录活性，因而参与癌变的三个基因的相互作用还没有充分了解。
抑制或促进基因表达的物质与称作基因产物上游启动子区的基因序列上特定序列相结合引起基因转录。E盒和cAMP结合位点是这些序列的代表。通过将一定长度的启动子区插入到报告基因上游可以测定基因转录活性。此外，随后合成被认为有效的特定序列，并插入报告基因上游，以检测特定序列的作用。为检测特定序列的转录控制作用，有必要同时评价原始启动子区的转录活性和可标准化组合作用的转录活性。然而常规方法中只能观察一个基因的转录动态变化，无法充分评价控制转录活性的特定序列。
荧光素酶用作直接观察细胞中基因转录活性的工具，并已经用作基因表达的检测监控蛋白。有很多种荧光素酶，但还没有基于其多样性测定转录活性的报告基因。如果使用发射不同颜色光的荧光素酶基因作为报告基因，并且将不同转录活性区插入哺乳动物细胞中，就可以测定多种转录活性。来自铁路蠕虫的发红光的荧光素酶有最长的发光波长，与来自萤火虫和叩头虫的荧光素酶相比容易鉴别，并由于发红光而可以高度穿透细胞。然而，铁路蠕虫发红和绿光的荧光素酶的表达只在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功实现(US2002/0119542-A1)，还没有作为哺乳动物细胞包括人类细胞中系统的成功实例。
也有实例通过修饰其基因结构使得铁路蠕虫的荧光素酶基因在哺乳动物细胞中表达(WO 2003/016839)。
来自大场雌光萤(Rhagophthalmus ohba)的荧光素酶作为荧光素酶也是已知的。
只在大肠杆菌中成功实现了大场雌光萤发绿光的荧光素酶表达(Ohmiya，Y.Sumiya，M.Viviani，VR.And Ohba N.；Comparative aspects of a luciferase molecule from the Japanese luminous beetle Rhagophthalmus ohba.Sci.Rept.Yokosuka City Mus..47，31-38，2000)。基于这个序列，构建了来自大场雌光萤的发橙光的荧光素酶并已经在大肠杆菌中成功表达(Viviani，VR.，Uchida，A.，Suenaga，N.，Ryufuku M.and Ohmiya Y.：Thr-226 is a key-residue for bioluminescence spectra determination in beetle luciferases.Biochem.Biophys.Res.Commun.，280，1286-1291，2001)。另外，来自腰鞭毛虫和海肾的发蓝光的荧光素酶作为荧光素酶也是已知的。
本发明的目的是构建和优化可同时或在同一阶段测定或定量细胞内多种转录活性的报告基因，并利用该报告基因组进一步开发多种基因转录活性测定系统，以及利用它们进行生命科学中的细胞功能分析、疾病治疗/检查以及新药开发。
本发明的另一个目的是构建一种基因构建体，从而使铁路蠕虫的发红或绿光的荧光素酶在哺乳动物细胞或动物中稳定转录并稳定翻译。
本发明的另一个目的是构建一种基因构建体，从而使大场雌光萤的发橙或绿光的荧光素酶在哺乳动物细胞或动物中稳定转录并稳定翻译。
这样可以稳定测定和显示哺乳动物细胞或动物中基因转录活性的变化。
附图说明
图1表示测定多种基因转录活性的略图以及与常规方法的区别。
图2表示一种哺乳动物细胞表达载体的结构和Hela细胞中的发光活性。
图3表示培养的哺乳动物细胞中产生的铁路蠕虫发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶的发光谱。
图4表示培养的哺乳动物细胞中产生的铁路蠕虫发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶的细胞内寿命。
图5表示培养的哺乳动物细胞中产生的发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶的同步发光谱和用于颜色识别(color identification)的滤光片特性(透光率)。
图6表示发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶的发光反应曲线和发光活性测定时间。
图7表示发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶的丰度比和发光活性(使用图5中的滤光片)。
图8表示实际多种转录活性测定的结果，即通过来自发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶的光同时测定两种转录活性，通过来自发蓝光的荧光素酶的光测定标准基因的转录活性，并标准化两种转录活性。
图9表示培养的哺乳动物细胞中产生的发红光的荧光素酶、发绿光的荧光素酶和发蓝光的荧光素酶的同步发光谱，以及用于颜色识别的滤光片特性(透光率)。
图10所示结果表明由发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶表示的转录活性由连续监测两种转录活性而获得。
图11表示通过初步筛选对很多样品全部进行分析的实例。
图12表示通过二次筛选评价单个事件的实例。
图13示出本发明中铁路蠕虫的发红光荧光素酶基因突变体的DNA序列(SEQ IDNO：7)与铁路蠕虫的野生型发红光荧光素酶基因的DNA序列(SEQ ID NO：3)的同源性。
图14示出最大发光波长为630nm的铁路蠕虫的发红光荧光素酶基因突变体的DNA序列(SEQ ID NO：7)与最大发光波长为622nm的WO 2003/016839的铁路蠕虫的发红光荧光素酶基因突变体的DNA序列(SEQ ID NO：6)的同源性。
图15示出野生型铁路蠕虫的发红光荧光素酶与突变型铁路蠕虫的发红光荧光素酶的发光活性的区别。
图16示出导入并在哺乳动物细胞(小鼠NIH3T3细胞，粗线)中产生的突变体(SEQ ID NO：7)和昆虫家蚕细胞(细线)中产生的铁路蠕虫野生型(SEQ ID NO：3)的发光谱。
图17示出大场雌光萤发绿光的荧光素酶突变体的DNA序列(SEQ ID NO：10)与其野生型序列(SEQ ID NO：8)的同源性。
图18示出大场雌光萤的发绿光荧光素酶的野生型与突变型和大场雌光萤的发橙光荧光素酶的野生型与突变型的发光活性的区别。
图19示出用一种底物萤火虫荧光素检测三种基因表达的方法。在本具体实施方式的方法中，通过用红、橙和绿色光而传达三种转录活性并识别对应颜色来进行测定。
图20示出大场雌光萤发绿光和橙光、铁路蠕虫发红光的荧光素酶的混合物的发光谱和一组分光滤光片(split filter)的透射曲线。
图21示出两种颜色荧光素酶((A)发绿-红光、(B)发绿-橙光和(C)发橙-红光的荧光素酶的组合)的丰度比和发光活性(使用图22所示的滤光片时)。
图22示出三种颜色荧光素酶((A)当发红光的荧光素酶是1时发绿-橙光的荧光素酶；(B)当发橙光的荧光素酶是1时发绿-红光的荧光素酶；和(C)当发绿光的荧光素酶是1时发橙-红光的荧光素酶)的丰度比和发光活性(使用图20所示的滤光片时)。
发明内容
作为解决上述主题的深入研究的结果，本发明人构建了一种报告基因构建体，它可以基于发射不同颜色光(包括红、橙、绿和蓝)的荧光素酶或多种发光底物，分别对来自2种或更多种、优选3种或更多种、更优选4种或更多种荧光素酶(发红、橙、绿和蓝光)的光进行定量。根据本发明，优选同时或在同一阶段可以测定2种或更多种、优选3种或更多种、更优选4种或更多种基因活性，因为来自每种荧光素酶的发光强度对应每个启动子的转录活性，即每个启动子原始连接的基因的活性。因为发光波长不会由于测定条件(pH等)而变化，所以也可以进行精确测定。例如在本发明的一个优选实施方案中，通过构建铁路蠕虫发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶和大场雌光萤发绿光的荧光素酶和发橙光的荧光素酶的报告基因构建体，并同时使用海肾、海洋介形类甲壳动物、发光腰鞭毛虫、叩头虫、水母发光蛋白等的荧光素酶报告基因，从而构建一种简单并高度定量测定多种基因转录活性的系统。
此外，本发明人已经发现，通过(1)改变cDNA序列使其他转录因子无法结合和(2)将cDNA序列中昆虫的密码子偏向性(密码子使用频率偏向性)转变为哺乳动物的密码子偏向性并因为很多限制酶位点限制cDNA的应用而进一步减少cDNA序列中的限制酶位点，从而使在哺乳动物细胞中很少表达或根本不表达的荧光素酶易于在哺乳动物细胞中转录。
本发明提供以下多肽、基因、基因构建体、哺乳动物细胞、药物筛选方法和使用哺乳动物细胞测定多种启动子转录活性的系统。
1.在哺乳动物细胞中稳定表达的、编码选自铁路蠕虫发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶与大场雌光萤发绿光的荧光素酶和发橙光的荧光素酶的至少一种荧光素酶的DNA，其特征在于(1)该DNA没有哺乳动物细胞中其他转录因子的结合序列并具有哺乳动物的密码子偏向性。
2.根据上述1的DNA，其特征在于哺乳动物是人类，DNA具有选自SEQ IDNOs：7、10、11和16的至少一种核苷酸序列。
3.使编码铁路蠕虫或大场雌光萤荧光素酶的DNA在哺乳动物细胞中表达的方法，其特征在于具有
1)改变cDNA序列使其他转录因子不结合的步骤；
2)将cDNA序列中昆虫的密码子偏向性改成哺乳动物的密码子偏向性的步骤；和任选地
3)由于使用时应用受限而改变具有很多限制酶位点的cDNA序列的步骤。
4.根据上述3的方法，其特征在于不改变荧光素酶的氨基酸序列。
5.多肽，其是最大发光波长为630nm的荧光素酶，由以下任意一个表示：
(1)具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的多肽；和
(2)具有SEQ ID NO：4序列中一个或多个氨基酸替换、增加或缺失的多肽。
6.根据上述5的多肽，表达于哺乳动物细胞中。
7.基因构建体，引入要在哺乳动物细胞中稳定表达的一个或两个或更多个荧光素酶基因，所述荧光素酶发光波长基本上不依赖于测定条件且最大发光波长为535-635nm。
8.根据上述7的基因构建体，通过将最大发光波长为460-520nm的一个或两个或更多个荧光素酶基因和发光波长基本上不依赖于测定条件且最大发光波长为535-635nm的一个或两个或更多个荧光素酶基因一起引入，从而引入可稳定表达于哺乳动物细胞中的3个或更多个荧光素酶基因。
9.根据上述7的基因构建体，其中上述荧光素酶基因是编码选自铁路蠕虫发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶与大场雌光萤发绿光的荧光素酶和发橙光的荧光素酶的至少一种荧光素酶的基因。
10.根据上述7的基因构建体，含有促进翻译效率的元件和/或稳定mRNA的元件。
11.基因构建体，能够通过引入发光波长基本上不依赖于测定条件的一个或两个或更多个荧光素酶基因和根据需要的受不同启动子控制的发光波长不同且基本上不依赖于测定条件的荧光素酶基因，分别测定从两种或更多种荧光素酶发射的每种光。
12.表达载体，包含根据上述7-11中任意一项的基因构建体。
13.哺乳动物细胞，转化有根据上述7-11中任意一项的基因构建体或者根据上述12的表达载体。
14.哺乳动物细胞，稳定表达地整合可在哺乳动物细胞中受不同启动子控制的、发光波长基本上不依赖于测定条件的两种或更多种荧光素酶的基因。
15.根据上述13或14的哺乳动物细胞，其中两种或更多种上述荧光素酶的最大发光波长为535-635nm且可用一种底物发光。
16.根据上述15的哺乳动物细胞，含有铁路蠕虫发红光的荧光素酶基因，还含有受不同启动子控制且选自铁路蠕虫发绿光的荧光素酶基因、大场雌光萤发绿光的荧光素酶基因、大场雌光萤发橙光的荧光素酶基因、以及发蓝光的荧光素酶基因的至少两种或更多种。
17.根据上述14的哺乳动物细胞，稳定表达地整合可在哺乳动物细胞中受不同启动子控制的、发光波长基本上不依赖于测定条件的三种或更多种荧光素酶的基因。
18.根据上述14的哺乳动物细胞，具有受不同启动子控制的三个或更多个荧光素酶基因，其中第一个荧光素酶基因受恒定表达启动子控制，第二个荧光素酶基因受毒性评价启动子控制，剩余的一个或多个荧光素酶基因受待评价启动子控制。
19.根据上述14的哺乳动物细胞，具有受不同启动子控制的三个或更多个荧光素酶基因，其中第一个荧光素酶基因受恒定表达启动子控制，第二个荧光素酶基因受假启动子控制，剩余的一个或多个荧光素酶基因受待评价启动子控制。
20.根据上述14的哺乳动物细胞，具有受不同启动子控制的四个或更多个荧光素酶基因，其中第一个荧光素酶基因受恒定表达启动子控制，第二个荧光素酶基因受毒性评价启动子控制，第三个荧光素酶基因受外来因素感受蛋白的启动子控制，剩余的一个或多个荧光素酶基因受待评价启动子控制。
21.根据上述14的哺乳动物细胞，其中具有受不同启动子控制的四个或更多个荧光素酶基因，其中第一个荧光素酶基因受恒定表达启动子控制，第二个荧光素酶基因受假启动子控制，第三个荧光素酶基因受外来因素感受蛋白的启动子控制，剩余的一个或多个荧光素酶基因受待评价启动子控制。
22.根据上述14的哺乳动物细胞，具有受不同启动子控制的两个荧光素酶基因，其中第一个荧光素酶基因受恒定表达启动子控制，第二个荧光素酶基因受毒性评价启动子控制。
23.根据上述14的哺乳动物细胞，具有受不同启动子控制的两个荧光素酶基因，其中第一个荧光素酶基因受恒定表达启动子控制，第二个荧光素酶基因受假启动子控制。
24.一种药物筛选方法，包括在哺乳动物细胞培养基中、在药物候选化合物的存在下培养根据上述18-21中任意一项的哺乳动物细胞的步骤，存在或缺少候选化合物的条件下对上述荧光素酶进行定量的步骤，和评价候选化合物对与至少一种荧光素酶相连的待评价启动子的作用的步骤。
25.一种系统，通过改变根据上述13-23中任意一项的哺乳动物细胞的培养环境而多重测定改变培养环境前后与每个荧光素酶连接的各启动子的转录活性，并评价两种或多种荧光素酶的表达量，所述两种或多种荧光素酶发射发光波长不依赖于测定条件的不同光。
26.根据上述23的系统，用于同时测定两种或多种荧光素酶的表达量。
27.根据上述23的系统，能测定三种或多种荧光素酶的表达量。
下面将对本发明进行详细说明。
本发明的两种或更多种荧光素酶需要发光波长基本上不依赖于测定条件(例如pH)，因为重要的是测定两种或更多种荧光素酶的发光强度并计算其相对比值。
本文所用的“发光波长基本上不依赖于测定条件”表示即使pH、温度、浓度或其他条件改变，最大发光波长的变化为3nm或更小，优选为2nm或更小，更优选为1nm或更小，特别优选为0.5nm或更小。当用滤光片分光来测定多种荧光素酶的表达量时，如果最大发光波长的变化量在此范围内，这是优选的，因为荧光素酶的相对比值几乎不变。
本文所用的“发射不同光的两种或更多荧光素酶”表示可以用滤光片(滤色片、带通滤光片等)测定各种光的发光强度比值。例如，对于铁路蠕虫发红光的荧光素酶、发绿光的荧光素酶和大场雌光萤发橙光的荧光素酶、发绿光的荧光素酶，可以通过用滤光片滤除绿光来测定各种光的发光强度比值。为了能测定各种光的发光强度比值，优选最大发光波长相互分开通常20nm或更多，优选30nm或更多，更优选40nm或更多，特别优选50nm或更多。
用于本发明的优选荧光素酶包括铁路蠕虫的发绿到红光(包括其突变体，最大发光波长：535-635nm，例如540-630nm)的荧光素酶、叩头虫的发橙到绿光(包括其突变体，最大发光波长：530-600nm)的荧光素酶和大场雌光萤的发橙到绿光(包括其突变体，最大发光波长：550-590nm)的荧光素酶等等。例如，对于铁路蠕虫的荧光素酶，已知最大发光波长为622nm的发红光的荧光素酶和最大发光波长为545nm的发绿光的荧光素酶(US 2002/0119542)，但本发明人已经鉴定，除了这两种以外，还存在很多发光在540-635nm的荧光素酶。这些荧光素酶都可以使用。例如，本发明人已经证实铁路蠕虫的最大发光波长为622nm(表达于昆虫或大肠杆菌中)的发红光的荧光素酶表达于哺乳动物细胞中时，最大发光波长迁移到630nm。铁路蠕虫的最大发光波长为630nm的发红光的这种荧光素酶由本发明人首次发现。
当使用多种荧光素酶利用滤光片分别测定每种发射光时，需要最大发光波长相互分开20nm或更多，优选30nm或更多，更优选40nm或更多，特别优选50nm。通过使最大发光波长分开到这种程度，可以通过使用位于最大发光波长之间的滤光片、测量滤光片前后每种光的透光率并转换而同时对各种光的发光强度进行定量。
例如，图20中荧光素酶的最大发光波长是发红光(630nm)、橙光(580nm)、和绿光(550nm)，它们可以充分分开。
具体而言，当使用来自具有最大发光波长分开一定程度的多种荧光素酶的铁路蠕虫和大场雌光萤的荧光素酶时，可以使用一种发光底物(例如萤火虫荧光素可用于铁路蠕虫、大场雌光萤和叩头虫的荧光素酶)同时对共表达的多种荧光素酶的发光强度进行定量，并精确测定启动子的表达量比值。因为这些荧光素酶发光波长不依赖于测定条件(例如pH)，还可以进一步组合使用海肾荧光素酶、腰鞭毛虫的多种荧光素酶(包括全序列或发光结构域如结构域1、2和3；JP-2002-335961；Li L.，Hong R.，Hasting JW.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94，8954)和海洋介形类甲壳动物荧光素酶。当使用来自铁路蠕虫、大场雌光萤和叩头虫的荧光素酶时，可以使用萤火虫荧光素，因此可以减少背景。优选腰鞭毛虫荧光素酶与荧光素的组合，因为其背景低。
在本发明的一个优选实施方案中，通过使用铁路蠕虫、大场雌光萤的荧光素酶(例如铁路蠕虫发红光的荧光素酶、大场雌光萤发橙光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶)，可以用一种荧光素对至少3个启动子的表达量进行定量(VR.Viviani，A.Uchida，N.Suenaga，M.Ryufuku&Y.Ohumiya：Thr-226 is a key-residue for bioluminescence spectra determination in beetle luciferases(2001)Biochem.Biophys.Res.Communi.280，1286-1291)。也可以通过组合发蓝光的荧光素酶(海肾、腰鞭毛虫或海洋介形类甲壳动物的每种荧光素酶)对四种或更多种进行定量。通过成功设置滤光片，可以分析540-635nm(发绿到红光)、优选540-630nm的多种表达。此外，可以再加一种底物不同的发蓝光的荧光素酶。因此，至于荧光素酶的同时测定，当使用相同荧光素时可以同时对三种或更多种进行定量，当使用不同荧光素时可以同时对四种或更多种进行定量。
常规上，已知海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶是可在哺乳动物细胞中表达的荧光素酶。然而，萤火虫荧光素酶所发出的光的颜色随细胞裂解液的pH不同从绿光变成黄光。因此比较两种或更多种荧光素酶的表达量时，具有缺乏准确度的缺陷。需要自海肾荧光素酶发出的蓝光，是因为其发光波长基本上不依赖于测定条件，但在与萤火虫荧光素酶组合的测定系统中，必须分开进行使用萤火虫荧光素的和使用海肾荧光素的两种定量。因此其缺陷是缺乏简单性和准确性。
与海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶相比，本发明人更关注来自铁路蠕虫的荧光素酶，并试图在哺乳动物细胞中表达这种蛋白，但使用常用表达系统无法在哺乳动物细胞中表达铁路蠕虫的荧光素酶。这被认为是除了海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶外为何没有其他荧光素酶在哺乳动物细胞中、特别是在人类细胞中表达的原因。
根据本发明人迄今为止的发现，在本发明的一个优选实施方案中，影响铁路蠕虫荧光素酶、大场雌光萤荧光素酶和海洋介形类甲壳动物荧光素酶的实际应用的是：铁路蠕虫荧光素酶基因、大场雌光萤荧光素酶基因和海洋介形类甲壳动物荧光素酶基因的稳定转录和稳定翻译。在用于本发明实施例的技术中，已经证明通过使转录的mRNA稳定和增加一定量的翻译频率，实际应用成为可能。也就是说，在这种情况下，通过插入球蛋白内含子以延长mRNA寿命并插入Kozak序列以增加翻译频率，从而首次使来自铁路蠕虫的荧光素酶基因可以在哺乳动物细胞中表达。
在本发明优选的其他实施方案中的其他技术包括，例如，将cDNA序列从昆虫的密码子偏向性(密码子使用频率偏向性)转变为哺乳动物的密码子偏向性以增加mRNA拷贝数，改变cDNA序列使其他转录因子无法结合，改变具有很多限制酶位点的cDNA序列，因为这种序列的应用受到限制。这些技术用于在哺乳动物细胞中表达铁路蠕虫荧光素酶和大场雌光萤荧光素酶。具体而言，转变为哺乳动物的密码子偏向性(密码子使用频率偏向性)和改变cDNA序列使其他转录因子无法结合更有用。
通过依次考虑以下1)到4)的步骤，可对cDNA序列进行改变：
1)尽可能不改变荧光素酶的氨基酸序列(优选完全不改变)；
2)随后，改变cDNA序列使其他转录因子无法结合；
3)此外，将cDNA序列中昆虫的密码子偏向性转变为哺乳动物的密码子偏向性；和
4)根据需要，改变cDNA序列以减少限制酶位点。
以上描述了铁路蠕虫荧光素酶和大场雌光萤荧光素酶的表达，但来自其他生物如叩头虫的荧光素酶被认为可用相似的方法表达。
本文所用的“荧光素酶”包括一组发光酶，如催化荧光素光化学反应的荧光素酶，也包括诸如水母发光蛋白的那些。通过改变催化作用(氧化荧光素以转化发光物质的作用)较弱的荧光素酶结构而获得的具有发光作用的蛋白质也包括在本发明的荧光素酶范围内，前提是其发光波长基本上不依赖于测定条件(例如pH)。
至于荧光素酶，需要组合使用相同发光底物发射光的两个或更多种荧光素酶。对于发光波长基本上不随测定条件改变且使用相同底物发光的优选荧光素酶，优选列举铁路蠕虫发红光的荧光素酶和铁路蠕虫发绿光的荧光素酶或铁路蠕虫的发光波长为约540-635nm、优选约540-630nm的其他荧光素酶，还有大场雌光萤发绿光的荧光素酶和大场雌光萤发橙光的荧光素酶。除此之外，来自叩头虫的荧光素酶(约530-600nm)也是具体实例。具体而言，铁路蠕虫发红/绿光的荧光素酶和大场雌光萤发橙/绿光的荧光素酶可方便地用于多重定量启动子转录活性，因为当荧光素酶的量相同时发光强度也几乎相同。
本发明中，哺乳动物包括人、牛、马、绵羊、猴、猪、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔和狗，优选的是人。
优选的是，至少两种荧光素酶基因用相同底物发射不同颜色的光并且其细胞内寿命相似。从这一角度说，优选铁路蠕虫的发红/绿光的荧光素酶和大场雌光萤的发橙/绿光的荧光素酶。具体而言，优选铁路蠕虫的发红光的荧光素酶和大场雌光萤的发橙/绿光的荧光素酶。
此外，为了用简单装置量化每种发光颜色，优选能用滤光片分离至少一种、优选至少两种用于本发明的发光波长不随测定条件(例如pH)变化的荧光素酶和用于标准化上述荧光素酶的其他荧光素酶所发出光的不同颜色。例如，如图5所示，优选来自铁路蠕虫的发红/绿光的荧光素酶，因为它们可以容易地用滤光片分开。此外，特别优选铁路蠕虫发红/绿光的荧光素酶与海肾或腰鞭毛虫荧光素酶(最大发光波长：474-480nm)的组合，因为发射光可以容易地用图10所示的两个滤光片分开。铁路蠕虫发红光的荧光素酶和大场雌光萤发橙/绿光的荧光素酶发出的光可用两个滤光片相互分开(图19)。
上文已经了解到铁路蠕虫荧光素酶在大肠杆菌中表达，还了解到尚未在哺乳动物细胞中、尤其是人类细胞中表达。事实上，即使试图在人类细胞中表达荧光素酶(发红光、发绿光)时，如图2和实施例1所示，单独使用作为代表性的哺乳动物细胞表达启动子的SV40或CMV启动子也不能诱导其表达。就大场雌光萤的荧光素酶而言，公知序列表达水平太低而不具有实用性，但与野生型荧光素酶相比，本发明的突变体表达水平是其44倍(绿光)和57倍(橙光)，具有显著的实用性。在本发明的优选实施方案中，野生型的表达量不足，因为特定颜色的荧光素酶的表达量利用滤光片在发光谱方面进行评价。
铁路蠕虫荧光素酶(发红光、发绿光)的基因序列公开于US 2002/0119542-A1中。US 2002/0119542-A1中发红光的荧光素酶基因(有错误)示于SEQ ID NO：5中。铁路蠕虫荧光素酶的正确的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1(发绿光的荧光素酶基因)和SEQ ID NO：3(发红光的荧光素酶基因)中，正确的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2(发绿光的荧光素酶基因)和SEQ ID NO：4(发红光的荧光素酶基因)中。
可以使用完整的野生型或突变型荧光素酶基因作为本发明的荧光素酶基因，也可以使用能够在严谨条件下与荧光素酶基因杂交的DNA和编码在荧光素酶中替换、添加、缺失或插入一个或更多个氨基酸并具有荧光素酶活性之多肽的DNA作为荧光素酶基因。
在一个优选实施方案中，通过验证多种表达系统，本发明人已经发现：对于在哺乳动物细胞中稳定表达荧光素酶重要的是向基因构建体中引入促进翻译效率的元件和/或稳定mRNA的元件。至于促进翻译效率的元件，Kozak序列(Ko)等是具体实例。至于稳定mRNA的元件，β-珠蛋白内含子II等是具体实例。为了在哺乳动物细胞中稳定表达荧光素酶，具体而言，优选(珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发红/绿光的荧光素酶)的部分结构。还已经证实：对于在哺乳动物细胞中稳定表达荧光素酶，优选将cDNA序列中昆虫的密码子偏向性(密码子使用频率偏向性)转变为哺乳动物的密码子偏向性并改变cDNA序列使其他转录因子无法结合。
在一个优选实施方案中本发明的基因构建体可包含荧光素酶基因、启动子、基因上游促进翻译效率的元件和/或稳定mRNA的元件，还可包含增强子、IRES、SV40pA、药物抗性基因(Neor等)等。
本发明的优选基因构建体的实例如下所示。
(1)(CMV增强子)-(鸡β-肌动蛋白启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发红/绿光的荧光素酶)-(SV40 poly A序列)
(2)(CMV增强子)-(鸡β-肌动蛋白启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发红/绿光的荧光素酶)-(IRES)-(Neo基因)-(SV40 poly A序列)
本发明的基因构建体可直接导入哺乳动物细胞，但优选整合到载体(例如包括质粒和病毒载体)上导入哺乳动物细胞。当在基因构建体中可表达地整合多个荧光素酶时，可将一个基因构建体或表达载体导入到哺乳动物细胞中，而当一个基因构建体中整合一个荧光素酶时，根据标准方法，可将多个基因构建体或表达载体同时或依次导入哺乳动物细胞中。
作为需要通过本发明的系统同时测定的基因组合，
-时钟基因(Per基因、Clock基因、BMAL基因等)
-癌基因(致癌基因、抑癌基因、有丝分裂标志基因等)
-疾病相关基因(病理相关基因、生死敏感的细胞凋亡基因、激素基因等)
-恒定表达基因(肌动蛋白基因、GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶)基因、猴源SV40病毒基因等)等基因是具体实例。
本发明中可以进行以下应用。
(1)初步筛选：假定大规模分析很多样品的条件下，同时获得3种或更多信息很重要。很明显可以想到多种组合。考虑到药物发现，需要评价药物作用的阳性点和阴性毒性点。此外，两个转录水平基因的变化反映细胞本身的状态，因而优选使用指示细胞状态的恒定表达启动子作为对照。因此，在药物发现筛选中，以下组合是具体实例。
在表1和2中，仅举例说明发红/蓝/绿光的荧光素酶。无需多言，也可以使用其他荧光素酶包括发橙光的荧光素酶或其组合。具体而言，特别优选铁路蠕虫和大场雌光萤的发红/橙/绿光的荧光素酶，因为它们可用萤火虫荧光素同时测定。
可以任意选择多种颜色的荧光素酶。
表1
药物发现筛选
在这种情况下，毒性评价和恒定表达启动子是经受药物评价的启动子的对照，因此也可用于构建在一个载体中。已经导入了这种载体的细胞自身是用于筛选的基础细胞。
表2
寻找目标启动子序列
Figure B2004800120741D00152
在这种情况下，假启动子和恒定表达启动子是经受筛选的启动子的对照，因此也可用于(非必需的)构建在一个载体中。已经导入了这种载体的细胞自身是用于筛选的基础细胞。
用一种底物，发红/橙/绿光的组合可完成表1和2中所示的筛选。也就是说，发蓝光的荧光素酶可用发橙光的荧光素酶代替。在此情况下，可用一种底物进行测定，且测定方法更简单。为测定发蓝光的荧光素酶，需要裂解细胞，但萤火虫荧光素可以浓度梯度渗透到活细胞中并发光，因而可以在活细胞中测定三种发射光。因此该方法的特征在于无需裂解细胞即可进行筛选。
与此同时，发红/橙/绿/蓝光的组合具有优势，可以同时评价外来因素如环境破坏因素，并可以在受外来因素影响的细胞中测定多种基因转录活性的变化。例如，包括监测直接感受外来因素的受体的表达。
表3
在这种情况下，可以评价感受外来因素的蛋白质、因此而受影响的蛋白质以及细胞自身的安全性，同时通过用恒定表达启动子的蛋白对照使它们标准化，还可以准确评价外来因素给予细胞的信息。因而，也可用于(非必需的)构建在一个载体中。已经导入了这种载体的细胞自身是用于筛选的基础细胞。
初步筛选的实施例示于图11。
(2)二次筛选：假定评价所关注药物作用和启动子信号的条件下，同时获得3种或更多信息很重要。在药物发现中，经常假设药物的多种作用。了解指示细胞状态改变的基因、药物的一过性作用(例如毒性、冲击应答(shock response)等)和实际作用也很重要。例如，如表4和5所示，可以举例说明时钟相关的药物作用评价系统。
表4
时钟相关的药物作用评价系统
表5
时钟相关的药物作用评价系统
具体而言，如上所述，可以用一种底物测定活细胞中的三种发射光。因此，该方法特征在于可在不裂解细胞的情况下根据时间轴评价药物作用。
对相同细胞进行一系列操作，因而可以评价药物对多种操作的组合(历史)的作用。
二次筛选的实施例示于图12。
如上所述，通过优选地同时评价2个或更多个、特别是3个或更多个或者4个或更多个启动子的表达量，当评价了一个启动子的作用时，可以标准化活性、毒性等或者标准化假信息。
此外，当要阐明哺乳动物中多种基因表达复杂相关的现象时，本发明的系统极其有用。
在本发明的特别优选的实施方案中，提供了使用铁路蠕虫的发红光的荧光素酶基因、发绿光的荧光素酶基因、大场雌光萤的发绿光的荧光素酶基因、发橙光的荧光素酶基因、和发蓝光的荧光素酶基因同时对三种或四种基因转录活性进行定量的方法/系统。通过使用这种系统，可以同时测定细胞中的多种转录活性。可以将它们用于病理学治疗/检查和新药开发。
此时，进行颜色识别，通过使用专用于发红、绿、橙和蓝光的滤光片测定发光活性，可同时测定细胞中的多种转录活性。可以同时得到细胞变化的大量信息，这些信息常规上难以从一种转录活性的变化信息中获得，并可用于治疗多种疾病和新药开发。
本发明中，根据权利要求14的具有位于不同启动子(1)或(2)控制下的两个荧光素酶基因的哺乳动物细胞可以用作中间细胞，通过进一步将一个或多个荧光素酶基因位于待分析启动子控制下的基因构建体导入这些哺乳动物细胞来产生用于药物筛选的哺乳动物细胞，所述的(1)中第一个荧光素酶基因受恒定表达启动子控制而第二个荧光素酶基因受毒性评价启动子控制，所述的(2)中第一个荧光素酶基因受恒定表达启动子控制而第二个荧光素酶基因受假启动子控制。
具体实施方式
下面将参照以下实施例，对本发明进行更详细的说明，但无需多言，本发明不限于这些实施例。
实施例1
铁路蠕虫发绿光的荧光素酶基因和发红光的荧光素酶基因(SEQ ID NO：1、3)在大肠杆菌中得到了表达，但单独使用代表性的哺乳动物表达启动子SV40或CMV启动子不能在哺乳动物细胞中诱导它们的表达。因而，将其中插入稳定基因表达的Kozak序列和β-珠蛋白内含子II、并进一步选择鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子的构建体连接到发红或绿光的荧光素酶基因上以构建一种基因构建体，并测定酶活性(图2)。将这种基因构建体与荧光素酶基因插入到SV40启动子、CMV启动子或CAG启动子下游的基因构建体进行比较。用Lipofectamine使培养的成纤维细胞NIH3T3转染各基因，24小时后测定细胞中的发光活性(图2)。为了测定发光活性，分别用发光底物混合溶液(由Toyo B-Net Co.，Ltd提供)和AB-2000(由ATTO Corporation提供)作为底物和发光测定装置。向50μL细胞提取液中加入50μL PicaGene。结果，在导入(CMV增强子)-(鸡β-肌动蛋白启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发红/绿光的荧光素酶)-(SV40 poly A序列)基因的细胞中获得最高活性。在导入(IRES)-(Neo基因)-(SV40 poly A序列)取代(SV40 poly A序列)而插入的构建体的细胞中获得次最高活性。然而，只有SV40启动子或CMV启动子几乎得不到活性。但是基于由(CMV增强子)-(鸡β-肌动蛋白启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发红/绿光的荧光素酶)-(IRES)-(Neo基因)-(SV40 poly A序列)基因得到的活性，由(CMV增强子)-(鸡β-肌动蛋白启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(发红/绿光的荧光素酶)-(IRES)-(Neo基因)-(SV40 poly A序列)基因得到的活性约为500/l，而由(CMV启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发红/绿光的荧光素酶)-(SV40 poly A序列)基因得到的活性约为10/l。因此，证实了：为稳定表达铁路蠕虫发绿光的荧光素酶基因并测定基因的转录活性，优选在不直接影响转录活性的酶基因上游区域插入(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)。这被认为归因于Kozak序列促进翻译效率，而β-珠蛋白内含子II稳定mRNA。已经证明，包括荧光素酶基因的效率促进和转录本的稳定是实际应用的关键。
实施例2
对表达于哺乳动物细胞中的铁路蠕虫发红光的荧光素酶基因和发绿光的荧光素酶基因的发光谱进行分析。向15μL细胞提取液中加入15μL PicaGene，其中细胞中已经导入表现出最高活性的(CMV增强子)-(鸡β-肌动蛋白启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发红/绿光的荧光素酶)-(SV40 poly A序列)基因，并用由ATTO Corporation提供的弱发光谱测量装置测定发光谱。图3示出单独表达光谱时的发光谱，在发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶中观察到最大发光波长分别是630和550nm。这些光谱不受pH和溶液环境的影响，并完全不改变。
实施例3
对表达于哺乳动物细胞中的铁路蠕虫发红光的荧光素酶基因和发绿光的荧光素酶基因的细胞寿命进行评价。使用导入了(CMV增强子)-(鸡β-肌动蛋白启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发红光、发绿光的荧光素酶)-(IRES)-(Neo基因)-(SV40 poly A序列)基因的细胞。通过脂质体转染方法用要在细胞中表达的上述荧光素酶基因转染培养的成纤维细胞NIH3T3细胞。转染后48小时将培养基更换为含100μM蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺的培养基，并培养细胞30分钟。随后用与实施例1中相同的方法随时间测定发光活性。结果，对于发红和绿光的荧光素酶，其活性都以相似的时程降低，且每种酶在细胞中的半衰期都是约3.5小时(图4)。
实施例4
铁路蠕虫发红光的荧光素酶基因和发绿光的荧光素酶基因、(CMV增强子)-(鸡β-肌动蛋白启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发红/绿光的荧光素酶)-(SV40 poly A序列)基因共表达于培养的成纤维细胞NIH3T3中。用与实施例2中相同的方法，测定通过裂解共表达细胞而获得的细胞提取液中铁路蠕虫发红光的荧光素酶基因和发绿光的荧光素酶基因的发光谱。图5示出共表达细胞的发光谱。由于发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶的发光而观察到两个峰。这是同时测定两个基因转录活性的结果。当通过利用光电倍增管的发光测定仪测定这些发光活性时，观察到铁路蠕虫的发红光和发绿光的两种荧光素酶基因发光活性的总和。因而，为了仅测定发绿光的荧光素酶的发光活性，屏蔽发红光的荧光素酶的发光。从发光谱评价，选择使用图5中用点线表示的光波长的屏蔽滤光片。通过使用这种滤光片，可以检测到8％发绿光的荧光素酶活性和76％发红光的荧光素酶活性，通过转换可以评价发红和绿光的荧光素酶的发光强度及其丰度。
实施例5
向50μL含发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶的细胞提取液中加入50μLPicaGene，使用ATTO Corporation提供的皿型发光测定仪AB2500以一分钟间隔测定发光活性，得到如图6所示的发光反应曲线。反应开始后5分钟内活性不稳定，但6分钟以后活性都稳定。因而，当测量已经共表达了发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶的细胞中的发光活性时，在发光反应稳定的时间区间上测量活性。测量方法如下：1)不用滤光片(Hoya Corporation提供的R54型滤色片)而测量发光强度(发红光和发绿光的荧光素酶的发光活性)；2)将实施例4中测定的滤光片(Hoya Corporation提供的R54型滤色片)插入发光测定仪，测量发光强度而得到发绿光的荧光素酶的发光活性；和3)通过转换滤光片(Hoya Coporation提供的R54型滤色片)的透光率计算发红光的荧光素酶的发光活性。
实施例6
在模式实验中验证不同丰度比的发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶是否可以用实施例5中的方法来进行定量。图7中，对于发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶的丰度比已经改变的样品，1)测量总发光强度；2)只测量发绿光的荧光素酶，和3)确定发红光和发绿光的荧光素酶的量。结果表明，发光活性随丰度比成线性关系变化。这表示借助插入滤色片(Hoya Corporation提供的R54型滤色片)的发光测定仪，可以确定细胞中表达量不同的发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶的量。
实施例7
为验证本系统的可用性，测量两个时钟基因的基因转录活性，并同时用表现恒定基因转录活性的启动子作为第三个基因转录活性进行标准化。具体地，用(E54)、小鼠Per启动子中连接E盒3、4、5的元件-(鸡β-肌动蛋白启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发红光的荧光素酶)-(SV4 0poly A序列)基因和小鼠BMAL1启动子中的REV-ERV/ROR元件1、2(RORE)-(鸡β-肌动蛋白启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发绿光的荧光素酶)-(SV40poly A序列)基因、和用于标准化的发蓝光的荧光素酶载体(phRL-TK，Promega)，与人BMAL1、人CLOCK和小鼠ROR-4表达载体一起共转染NIH3T3细胞。24小时后裂解细胞并用光度计分析细胞中荧光素酶的发光波长。作为结果，检测这两种荧光素酶的发光波长，表现出与单独表达每个荧光素酶时相同的发光谱。因而，测量发红光和发绿光的荧光素酶的发光活性。通过用发蓝光的荧光素酶的活性值进一步标准化这些活性值而得到的转录活性表示于图8。在独立实验中，已经知道，当在细胞中表达BMAL1和CLOCK蛋白时，连接E盒3、4、5的元件(E54)启动子被激活而(RORα)启动子失活，然而当在细胞中表达小鼠ROR-4时，(RORα)启动子被高度激活。本实验中同时定量测量的发红光和发绿光的荧光素酶的活性表现出(E54)启动子和(RORα)启动子的转录活性差异。
实施例8
铁路蠕虫发红光的荧光素酶基因和发绿光的荧光素酶基因、(CMV增强子)-(鸡3-肌动蛋白启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发红/绿光的荧光素酶)-(SV40 poly A序列)基因和发蓝光的荧光素酶载体(phRL-TK，Promega)共表达于培养的成纤维细胞NIH3T3中。裂解共表达细胞，用与实施例2中相同的方法测量细胞提取液中铁路蠕虫发红光的荧光素酶和发绿光的荧光素酶和海肾发蓝光的荧光素酶的发光谱。图9示出共表达细胞的发光谱。观察到发红光、发绿光和发蓝光的荧光素酶发出的三个峰，峰高度反映相应启动子活性的强度。通过使用具有可识别发光颜色的滤光片的发光强度测定装置转换成红、绿或蓝光的发光强度，可以评价三个基因的转录活性。
实施例9
通过脂质体转染方法用铁路蠕虫发红光的荧光素酶基因和发绿光的荧光素酶基因、(CMV增强子)-(鸡β-肌动蛋白启动子)-(3-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)-(发红/绿光的荧光素酶)-(SV40 poly A序列)基因共转染NIH3T3细胞。培养16小时后，将培养基换成含100nM地塞米松的培养基，并培养细胞2小时。随后，将培养基换成含100μM萤火虫荧光素的培养基，使用ATTO Corporation提供的皿型发光测定仪AB2500连续测量发红光和发绿光的荧光素酶的发光活性。图10表示连续测量转录活性的结果。如果使用可识别发光颜色的连续发光强度测定装置，可以连续测量两种转录活性。
实施例10
为了在哺乳动物细胞中稳定表达，设计发红光的荧光素酶基因序列时谨记以下内容。通过(1)改变34个转录因子结合位点(48个DNA序列)(表6)；(2)改变279个DNA序列使密码子使用频率接近哺乳动物的使用频率(表7)；和(3)改变15个常见的限制酶位点(45个DNA序列中有4个与转录因子结合位点中的那些相同)(表8)，设计SEQ ID NO：7的序列并人工构建一种构建体(SEQ ID NO：7)。该序列与铁路蠕虫野生型发红光的荧光素酶基因(SEQ ID NO：3)有77.5％的同源性，与WO 2003/016839中描述的发红光的荧光素酶突变体有82.8％的同源性(图13和14)。
表6
Figure B2004800120741D00241
表7
表8
  限制酶位点   改变前序列   改变后序列
  35BssSI   Ctggtg   Ctcgga
  92SsPI   Aatatt   Aatact
  118ClaI   Atcgat   Atcgac
  146NdeI   Catatg   Cctatg
  155SsPI   Aatatt   Gatttt
  189XbaI   Tctaga   Cctgga
  282EcoT14I   Ccaagg   Ccaggg
  417XbaI   Tctaga   Cctgga
  460EcoRV   Gatatc   Gacatc
  524ApoI   Aaattt   Aagttc
  553EcoT14I   Ccttgg   Ccctgg
  570PshBI   Attaat   Gctgat
  769AflIII   Cttaag   Ctgaag
  790ApoI   Aaattt   Aagttt
  802ApoI，EcoRI   Gaattc   Gagttc
  955EcoRV   Gatatc   Gacatc
  1030Aor51HI   Agcgct   Agcgcc
  1076MunI   Caattg   Ccatcg
  1094NdeI   Catatc   Cctatg
  1117EcoRV   Gatatc   Gacatc
  1193EcoRV   Gatatc   Gctacc
  1217BssSI   Ctcgt   Ccagg
  限制酶位点   改变前序列   改变后序列
  1301ClaI   Atcgat   Atcggc
  1331EcoRV   Gatatc   Gctacc
  1381SspI   Aatatt   Aacatc
  1406EcoRI，ApoI   Gaattc   Gcatcc
  1410AccIII   Tccgga   Cccaga
  1417ApoI   Gaattt   Gagttt
  1605SspI   Aatatt   Catctt
  1613SmaI   Cccggg   Cccgcg
实施例11
制备野生型或突变型荧光素酶基因插入到三种启动子(CMV、SV40或CAG{CAG：(CMV增强子)-(鸡β-肌动蛋白启动子)-(β-珠蛋白内含子II)-(Kozak序列)})下游的载体(野生型：CMV-Red、CAG-Red，突变型：CMV-REDm、CAG-REDm)。同时，制备其中称作C端过氧物酶体转移序列的SKL序列已被删除的载体(野生型：SV40-Red(-SKL)，突变型：SV40-REDm(-SKL)、CAG-REDm)。
使用Lipofectamine将每个基因转染NIH3T3细胞，24小时后测量细胞中的发光活性(图15)。为了测定发光活性，分别用发光底物混合溶液(由Toyo B-Net Co.，Ltd提供)和AB2500(由ATTO Corporation提供)作为底物和发光测定装置。向50μL细胞提取液中加入50μL PicaGene而得到样品。含CMV-Red或SV40-Red(-SKL)的样品显示约1000RLU的值，而含CMV-REDm或SV40-REDm(-SKL)的样品显示值为2×107-4×107RLU。如图15所示，含CAG-Red的样品中观察到高活性，但在含突变体的样品中活性增加约两倍。SKL序列被认为参与活性增加，但含SKL的样品活性仅增加百分之几。从这些结果来看，已经表明，CAG和REDm可用作分析哺乳动物基因表达的报告基因。通过实施例10的方法，可以在哺乳动物细胞中稳定表达来自铁路蠕虫的荧光素酶。因此，通过相似的方法，修改了来自铁路蠕虫的发绿光的荧光素酶基因序列(SEQ ID NO：16)。在修改序列中，野生型中16个转录因子结合位点被修改，并与野生型有76％同源性。
实施例12
对表达于哺乳动物细胞中的来自铁路蠕虫的发红光的荧光素酶基因的发光谱进行分析。向15μL转染有活性最高的CMV-REDm基因的细胞(来自小鼠的NIH3T3，来自大鼠的Rat-1，来自人的A543细胞)提取液中加入15μL PicaGene，并用由ATTOCorporation提供的弱发光谱测量装置测定发光谱。作为参照，也测量转染有SEQ IDNO：3所述基因的家蚕昆虫细胞提取液的发光谱。图16表示表达于小鼠NIH3T3细胞(粗线)和家蚕昆虫细胞(细线)的发光谱。小鼠NIH3T3细胞中的最大发光波长是630nm，家蚕昆虫细胞中的最大发光波长是622nm。这些发光谱不受pH和溶液环境的影响，并且总是表现为相同的发光谱。源于大鼠的Rat-1细胞和源于人的A543细胞中的最大发光波长也是630nm。
实施例13
为在哺乳动物细胞中稳定表达，谨记以下内容，在野生型大场雌光萤发绿光的荧光素酶(基因序列和氨基酸序列分别表示在SEQ ID NO：8和12中)和野生型大场雌光萤发橙光的荧光素酶(基因序列和氨基酸序列分别表示在SEQ ID NO：9和13中)序列中，人工构建基因构建体。
(1)改变15个转录因子结合位点(20个DNA序列)(表9)
(2)改变322个DNA序列使密码子使用频率接近哺乳动物的密码子偏向性(表10)。
(3)改变30个常见的限制酶位点(49个DNA序列中有2个与转录因子结合位点中的那些相同)(表11)。
表10和11中，RoLWT代表野生型大场雌光萤荧光素酶，RoLM代表突变型大场雌光萤荧光素酶。
所得突变型大场雌光萤发绿光的荧光素酶基因的基因序列及其氨基酸序列分别表示在SEQ ID NO：10和14中，所得突变型大场雌光萤发橙光的荧光素酶基因的基因序列及其氨基酸序列分别表示在SEQ ID NO：11和15中。
突变型大场雌光萤发绿光的荧光素酶基因序列(SEQ ID NO：10)与野生型大场雌光萤发绿光的荧光素酶基因序列(SEQ ID NO：8)的同源性是76.0％(图17)。
表9
Figure B2004800120741D00291
表10
表11
Figure B2004800120741D00311
实施例14
制备野生型或突变型荧光素酶基因(来自大场雌光萤的发橙或绿光的荧光素酶)插入到三种启动子SV40下游的载体(野生型：SV40-RoL(绿)和SV40-RoL(橙)，突变型：SV40-RoL(绿)m和SV40-RoL(橙)m)。用Lipofectamine Plus将每个基因转染培养的成纤维细胞NIH3T3细胞，24小时后测量细胞中的发光活性。分别用发光底物混合溶液(由Toyo B-Net Co.，Ltd提供)和LB9506(由Berthold提供)作为底物和发光测定装置。向50μL细胞提取液中加入50μL PicaGene而得到样品。结果，含野生型SV40-RoL(绿)和SV40-RoL(橙)的样品的显示值分别为约1×106和4×105RLU，而含突变型SV40-RoL(绿)m和SV40-RoL(橙)m的样品的显示值分别为约5×108和8×107RLU。比较野生型与突变型，当野生型的值是1时，突变的绿和橙色荧光素酶中活性值分别增加约44倍和约57倍。这些结果表明突变体可用作分析哺乳动物基因表达的报告基因。
实施例15
用一种底物同时测量哺乳动物细胞中三种基因的转录活性的方法示意图示于图19。在培养的细胞中共表达启动子序列插入到铁路蠕虫发红光的荧光素酶基因、大场雌光萤发绿光的荧光素酶基因和大场雌光萤发橙光的荧光素酶基因上游的三个基因载体。细胞处理一段时间之后裂解共表达细胞。随后，通过用滤色片分开细胞提取液中铁路蠕虫发红光的荧光素酶、大场雌光萤发绿光的荧光素酶和大场雌光萤发橙光的荧光素酶的发光活性，测量三种转录活性。因而，向独立表达铁路蠕虫发红光的荧光素酶、大场雌光萤发绿光的荧光素酶和大场雌光萤发橙光的荧光素酶的15μL细胞提取液中加入15μL PicaGene。然后用由ATTO Corporation提供的弱发光谱测量装置测定发光谱(图20)。作为发光谱的分析结果，证实了通过选择Hoya Co.，Ltd.提供的用于分开绿和橙色光的O-54型滤色片和选择Hoya Co.，Ltd.提供的用于分开橙和红色光的R-60型滤色片，可以将颜色分开。测量过程如下。(1)不用滤光片而测量发光强度(发红光、橙光和发绿光的荧光素酶的发光活性)。(2)将O-54型滤色片插入发光测定仪，测量发光强度而得到发绿光的荧光素酶的发光活性。(3)将R-60型滤色片插入发光测定仪，测量发光强度而得到发绿光和橙光的荧光素酶的发光活性。(4)通过转换滤光片的透光率计算发红光的荧光素酶的发光活性。此外，校正三种颜色荧光素酶的活性。如此就可以评价发红光、绿光和橙光的荧光素酶的发光强度和丰度。
实施例16
在模式实验中考查丰度比不同的发红光、橙光和绿光的荧光素酶组成不同的两种酶是否可以用实施例15中的方法来定量。图21中，对于发红光和绿光的荧光素酶(A)、发绿光和橙光的荧光素酶(B)、和发橙光和红光的荧光素酶(C)，可通过以下操作获得具有不同丰度比的样品的发光活性：(1)测量总发光强度，(2)用滤光片组并转换。结果表明发光活性随丰度比成线性关系变化。这说明利用插入滤光片的发光测定仪，可以对哺乳动物细胞中发红光、橙光和绿光的荧光素酶的不同表达量进行定量。
实施例17
在模式实验中考查组成不同的两种酶是否可以用实施例15中的方法，通过使丰度比不同的发红光、橙光和绿光的荧光素酶中一种发光酶的量恒定来进行定量。图22中，对于发橙光和绿光的荧光素酶使发红光的荧光素酶恒定(A)、对于发绿光和红光的荧光素酶使发橙光的荧光素酶恒定(B)、对于发橙光和红光的荧光素酶使发绿光的荧光素酶恒定(C)，通过以下操作获得具有不同丰度比的样品的发光活性：(1)测量总发光强度，(2)用滤光片组并转换。结果表明发光活性随丰度比成线性关系变化。这说明利用插入滤光片的发光测定仪，可以对哺乳动物细胞中表达的发红光、橙光和绿光的荧光素酶的不同表达量进行定量。因此，证实了用一种底物可以对三种荧光素酶进行定量，并可以测量三种基因的转录活性量。
序列表
<110>独立行政法人产业技术综合研究所
<120>多基因转录活性测定系统
<130>P04-31
<150>JP2003-127629
<151>2003-05-06
<150>JP2003-407564
<151>2003-12-05
<160>65
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1638
<212>DNA
<213>野生型Phrixothrix发绿光的荧光素酶
<400>1
atggaagaag aaaacattag gcatggagag cgtcctcgtg atatagtcca tcctggctcg  60
gcaggacaac aattatacca atcattgtat aaatttgcat cttttcctga agcaataatc  120
gatgctcata caaatgaagt aatatcatat gctcaaatat ttgaaaccag ctgccgctta  180
gctgttagta tagaacaata tggcttgaat gaaaacaatg ttgtgggtgt atgcagtgaa  240
aacaatataa acttttttaa tcctgtcctt gctgctttat acttaggaat accagtagca  300
acatcaaatg atatgtacac agatggagag ttaactggtc atttgaatat atcaaaacca  360
actatcatgt ttagttcaaa gaaagcactc ccgcttattc tgagagtaca gcaaaatcta  420
agtttcatta aaaaagtcgt agttatcgat agcatgtacg acattaatgg cgttgaatgc  480
gtatctacct ttgttgcacg ttatactgac cacacctttg atccattgtc atttacacca  540
aaagattttg atccccttga aaaaatcgca ttaattatgt catcatctgg aacaactgga  600
ttgcctaagg gtgtagtact gagccataga agtctaacta taagattcgt tcatagcagg  660
gatcccattt atggcactcg tacggttcca caaacatcaa ttctttcctt agtaccgttc  720
catcatgcct ttggaatgtt tactacatta tcttactttg tagtaggact taaggttgta  780
atgttgaaga aatttgaggg cgcacttttc ttaaaaacca tacagaatta caaaatcccc  840
actattgtag tggcccctcc agttatggtg tttttggcta aaagcccatt agtcgatcaa  900
tacgatttat cgagcttaac ggaagttgct actggaggag ctcctttagg aaaagatgtc  960
gcagaagcag tagcaaagag gttgaaatta cctggaatca tacaaggata tggattaact  1020
gaaacttgct gcgctgtaat gattacccct cataatgctg tgaaaacagg ttcaactgga  1080
agacccttgc catacattaa agctaaagtt ttagataacg ctactgggaa ggcgctagga  1140
ccaggagaaa gaggcgaaat atgctttaaa agtgaaatga ttatgaaagg atattacaac  1200
aatccggaag caactattga tactattgac aaagatggtt ggcttcattc tggagatatt  1260
ggatattacg acgaagatgg aaatttcttt atagttgatc gattgaaaga acttattaaa  1320
tacaagggat atcaggttgc gcctgctgaa ctggaaaatc tgcttttaca acatccaagt  1380
attgctgatg cgggtgttac tggagttccg gacgaatttg ctggacaatt acctgctgct  1440
tgtgttgtgt tagaatctgg caagacgctg actgaaaagg aagttcaaga ttttattgca  1500
gcacaagtca ctccaacaaa gcatcttcga ggcggtgtcg tatttgtaga cagtattccg  1560
aaaggcccta ctggaaaact catcagaaag gagctccgag aaatatttgc ccagcgagca  1620
ccaaaatcaa aattataa                                                1638
<210>2
<211>545
<212>PRT
<213>野生型Phrixothrix发绿光的荧光素酶
<400>2
Met Glu Glu Glu Asn Ile Arg His Gly Glu Arg Pro Arg Asp Ile Val
1               5                   10                  15
His Pro Gly Ser Ala Gly Gln Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Tyr Lys Phe
            20                  25                  30
Ala Ser Phe Pro Glu Ala Ile Ile Asp Ala His Thr Asn Glu Val Ile
        35                  40                  45
Ser Tyr Ala Gln Ile Phe Glu Thr Ser Cys Arg Leu Ala Val Ser Ile
    50                  55                  60
Glu Gln Tyr Gly Leu Asn Glu Asn Asn Val Val Gly Val Cys Ser Glu
65                  70                  75                  80
Asn Asn Ile Asn Phe Phe Asn Pro Val Leu Ala Ala Leu Tyr Leu Gly
                85                  90                  95
Ile Pro Val Ala Thr Ser Asn Asp Met Tyr Thr Asp Gly Glu Leu Thr
            100                 105                 110
Gly His Leu Asn Ile Ser Lys Pro Thr Ile Met Phe Ser Ser Lys Lys
        115                 120                 125
Ala Leu Pro Leu Ile Leu Arg Val Gln Gln Asn Leu Ser Phe Ile Lys
    130                 135                 140
Lys Val Val Val Ile Asp Ser Met Tyr Asp Ile Asn Gly Val Glu Cys
145                 150                 155                 160
Val Ser Thr Phe Val Ala Arg Tyr Thr Asp His Thr Phe Asp Pro Leu
                165                 170                 175
Ser Phe Thr Pro Lys Asp Phe Asp Pro Leu Glu Lys Ile Ala Leu Ile
            180                 185                 190
Met Ser Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Val Leu Ser
        195                 200                 205
His Arg Ser Leu Thr Ile Arg Phe Val His Ser Arg Asp Pro Ile Tyr
    210                 215                 220
Gly Thr Arg Thr Val Pro Gln Thr Ser Ile Leu Ser Leu Val Pro Phe
225                 230                 235                 240
His His Ala Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Ser Tyr Phe Val Val Gly
                245                 250                 255
Leu Lys Val Val Met Leu Lys Lys Phe Glu Gly Ala Leu Phe Leu Lys
            260                 265                 270
Thr Ile Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Thr Ile Val Val Ala Pro Pro Val
        275                 280                 285
Met Val Phe Leu Ala Lys Ser Pro Leu Val Asp Gln Tyr Asp Leu Ser
    290                 295                 300
Ser Leu Thr Glu Val Ala Thr Gly Gly Ala Pro Leu Gly Lys Asp Val
305                 310                 315                 320
Ala Glu Ala Val Ala Lys Arg Leu Lys Leu Pro Gly Ile Ile Gln Gly
                325                 330                 335
Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys Cys Ala Val Met Ile Thr Pro His Asn
            340                 345                 350
Ala Val Lys Thr Gly Ser Thr Gly Arg Pro Leu Pro Tyr Ile Lys Ala
        355                 360                 365
Lys Val Leu Asp Asn Ala Thr Gly Lys Ala Leu Gly Pro Gly Glu Arg
    370                 375                 380
Gly Glu Ile Cys Phe Lys Ser Glu Met Ile Met Lys Gly Tyr Tyr Asn
385                 390                 395                 400
Asn Pro Glu Ala Thr Ile Asp Thr Ile Asp Lys Asp Gly Trp Leu His
                405                 410                 415
Ser Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Asp Gly Asn Phe Phe Ile Val
            420                 425                 430
Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro
        435                 440                 445
Ala Glu Leu Glu Asn Leu Leu Leu Gln His Pro Ser Ile Ala Asp Ala
    450                 455                 460
Gly Val Thr Gly Val Pro Asp Glu Phe Ala Gly Gln Leu Pro Ala Ala
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Cys Val Val Leu Glu Ser Gly Lys Thr Leu Thr Glu Lys Glu Val Gln
                485                 490                 495
Asp Phe Ile Ala Ala Gln Val Thr Pro Thr Lys His Leu Arg Gly Gly
            500                 505                 510
Val Val Phe Val Asp Ser Ile Pro Lys Gly Pro Thr Gly Lys Leu Ile
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Arg Lys Glu Leu Arg Glu Ile Phe Ala Gln Arg Ala Pro Lys Ser Lys
    530                 535                 540
Leu
545
<210>3
<211>1641
<212>DNA
<213>野生型Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>3
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gcaggactac aattatatca atcattatat aaatattcat atattactga cggaataatc  120
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gcagttagtc tagaaaaata tggcttggat cataacaatg ttgtggcaat atgcagtgaa  240
aacaacatac acttttttgg ccctttaatt gctgctttat accaaggaat accaatggca  300
acatcaaatg atatgtacac agaaagggag atgattggcc atttgaatat atcgaaacca  360
tgccttatgt tttgttcaaa gaaatcactc ccatttattc tgaaagtaca aaaacatcta  420
gatttcctta aaaaagtcat agtcattgat agtatgtacg atatcaatgg cgttgaatgc  480
gtatttagct ttgtttcacg ttatactgat cacgcctttg atccagtgaa atttaaccca  540
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ttgcctaaag gggtagtaat aagccataga agtataacta taagattcgt ccatagcagt  660
gatcccatct atggtactcg tattgctcca gatacatcaa ttcttgctat agcaccgttc  720
catcatgcct ttggactgtt tactgcacta gcttactttc cagtaggact taagattgta  780
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tctattgtag ttcctcctcc aattatggta tatttggcta aaagtccatt agtcgatgaa  900
tacaatttat cgagcttaac ggaaattgct tgtggagggt ctcctttagg aagagatatc  960
gcagataaag tagcaaagag attgaaagta catggaatcc tacaaggata tggattaacc  1020
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<210>4
<211>546
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<400>4
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Val Phe Ser Phe Val Ser Arg Tyr Thr Asp His Ala Phe Asp Pro Val
                165                 170                 175
Lys Phe Asn Pro Lys Glu Phe Asp Pro Leu Glu Arg Thr Ala Leu Ile
            180                 185                 190
Met Thr Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Val Ile Ser
        195                 200                 205
His Arg Ser Ile Thr Ile Arg Phe Val His Ser Ser Asp Pro Ile Tyr
    210                 215                 220
Gly Thr Arg Ile Ala Pro Asp Thr Ser Ile Leu Ala Ile Ala Pro Phe
225                 230                 235                 240
His His Ala Phe Gly Leu Phe Thr Ala Leu Ala Tyr Phe Pro Val Gly
                245                 250                 255
Leu Lys Ile Val Met Val Lys Lys Phe Glu Gly Glu Phe Phe Leu Lys
            260                 265                 270
Thr Ile Gln Asn Tyr Lys Ile Ala Ser Ile Val Val Pro Pro Pro Ile
        275                 280                 285
Met Val Tyr Leu Ala Lys Ser Pro Leu Val Asp Glu Tyr Asn Leu Ser
    290                 295                 300
Ser Leu Thr Glu Ile Ala Cys Gly Gly Ser Pro Leu Gly Arg Asp Ile
305                 310                 315                 320
Ala Asp Lys Val Ala Lys Arg Leu Lys Val His Gly Ile Leu Gln Gly
                325                 330                 335
Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys Ser Ala Leu Ile Leu Ser Pro Asn Asp
            340                 345                 350
Arg Glu Leu Lys Lys Gly Ala Ile Gly Thr Pro Met Pro Tyr Val Gln
        355                 360                 365
Val Lys Val Ile Asp Ile Asn Thr Gly Lys Ala Leu Gly Pro Arg Glu
    370                 375                 380
Lys Gly Glu Ile Cys Phe Lys Ser Gln Met Leu Met Lys Gly Tyr His
385                 390                 395                 400
Asn Asn Pro Gln Ala Thr Arg Asp Ala Leu Asp Lys Asp Gly Trp Leu
                405                 410                 415
His Thr Gly Asp Leu Gly Tyr Tyr Asp Glu Asp Arg Phe Ile Tyr Val
            420                 425                 430
Val Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala
        435                 440                 445
Pro Ala Glu Leu Glu Asn Leu Leu Leu Gln His Pro Asn Ile Ser Asp
    450                 455                 460
Ala Gly Val Ile Gly Ile Pro Asp Glu Phe Ala Gly Gln Leu Pro Ser
465                 470                 475                 480
Ala Cys Val Val Leu Glu Pro Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu Val
                485                 490                 495
Gln Asp Tyr Ile Ala Glu Leu Val Thr Thr Thr Lys His Leu Arg Gly
            500                 505                 510
Gly Val Val Phe Ile Asp Ser Ile Pro Lys Gly Pro Thr Gly Lys Leu
        515                 520                 525
Met Arg Asn Glu Leu Arg Ala Ile Phe Ala Arg Glu Gln Ala Lys Ser
    530                 535                 540
Lys Leu
545
<210>5
<211>1760
<212>DNA
<213>US2002-0119542-A1中的Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>5
gtgacagttt agttcagtag aagatttttt tgagatcaaa atggaagaag aaaacgttgt  60
gaatggagat cgtcctcgtg atctagtttt tcctggcaca gcaggactac aattatatca  120
atcattatat aaatattcat atattactga cggaataatc gatgcccata ccaatgaagt  180
aatatcatat gctcaaatat ttgaaaccag ctgccgcttg gcagttagtc tagaaaaata  240
tggcttggat cataacaatg ttgtggcaat atgcagtgaa aacaacatac acttttttgg  300
ccctttaatt gctgctttat accaaggaat accaatggca acatcaaatg atatgtacac  360
agaaagggag atgattggcc atttgaatat atcgaaacca tgccttatgt tttgttcaaa  420
gaaatcactc ccatttattc tgaaagtaca aaaacatcta gatttcctta aaagagtcat  480
agtcattgat agtatgtacg atatcaatgg cgttgaatgc gtatttagct ttgattcacg  540
taatactgat cacgcctttg atccagtgaa atttaaccca aaagagtttg atcccttgga  600
aagaaccgca ttaattatga catcatctgg aacaactgga ttgcctaaag gggtagtaat  660
aagccataga agtataacta taagattcgt ccatagcagt gatcccatct atggtactcg  720
tattgctcca gatacatcaa ttcttgctat agcaccgttc catcatgcct ttggactgtt  780
tactgcacta gcttactttc cagtaggact taagattgta atggtgaaga aatttgaggg  840
cgaattcttc ttaaaaacca tacaaaatta caaaatcgct tctattgtag ttcctcctcc  900
aattatggta tatttggcta aaagtccatt agtcgatgaa tacaattgct cgagcttaac  960
ggaaattgct agtggaggct ctcctttagg aagagatatc gcagataaag tagcaaagag  1020
attgaaagta catggaatcc tacaaggata tggattaacc gaaacctgca gcgctctaat  1080
acttagcccc aatgatcgag aacttaaaaa aggtgcaatt ggaacgccta tgccatatgt  1140
tcaagttaaa gttatagata tcaatactgg gaaggcgcta ggaccaagag aaaaaggcga  1200
aatatgcttc aaaagtcaaa tgcttatgaa aggatatcac aacaatccgc aagcaactcg  1260
tgatgctctt gacaaagatg gttggcttca tactggggat cttggatatt acgacgaaga  1320
cagatttatc tatgtagttg atcgattgaa agaacttatt aaatataaag gatatcaggt  1380
tgcgcctgct gaactggaaa atctgctttt acaacatcca aatatttctg atgcgggtgt  1440
tattgaattc cggacgaatt tgctggtcaa ttacctttcc gcgtgtgttg tgttagagcc  1500
tggtaagaca atgaccgaaa aggaagttca ggattatatt gcagagctag tcactacaac  1560
taaacatctt cgaggcggtg tcgtatttat agatagtatt ccaaaaggcc caacaggaaa  1620
actcatgaga aacgaactcc gagcaatatt tgcccgggaa caggcaaaat caaaattata  1680
agctcaatat attgctttag ttataaaatg tatgtaatca aattttagaa cctaatacat  1740
tcattgagag cctaaaaaaa                                              1760
<210>6
<211>1641
<212>DNA
<213>WO2003/016839中的Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>6
atggaagaag aaaacgtggt gaatggagat cggcctaggg atctggtgtt tcccggcaca  60
gcaggactcc agctgtacca gtcactgtat aagtattcat acatcactga cgggataatc  120
gacgcccata ccaacgaggt catctcatat gctcagatct ttgaaacctc ctgccggctg  180
gcagtgtcac tggagaagta tggcctggat cacaacaatg tggtggccat ctgttctgaa  240
aacaacatac actttttcgg ccccctgatt gctgccctgt accaaggcat cccaatggca  300
acatcaaacg acatgtacac agagagggag atgataggcc atctgaacat ctccaagcca  360
tgcctgatgt tctgttcaaa gaaatcactg cccttcattc tgaaggtgca gaagcacctg  420
gactttctga aaaaagtcat agtcattgat tccatgtacg atatcaatgg cgtggagtgc  480
gtcttctcct ttgtctcgag gtacactgat cacgccttcg acccagtgaa gttcaacccc  540
aaagagttcg accccctcga aagaaccgcc ctgattatga catcatctgg gacaactgga  600
ctgcctaagg gggtcgtgat ctcccacaga tctataacta tcagattcgt ccattcttcc  660
gatcccatct acggcaccag gattgcccca gacacatcaa ttctggctat cgcacccttc  720
catcacgcct ttggactgtt tactgcactg gcttacttcc ctgtcggact gaagattgtc  780
atggtgaaga aatttgaggg cgagttcttt ctgaaaacca tacaaaatta caagatcgct  840
tctattgtcg tgcctcctcc tattatggtc tatctggcta agtcccccct ggtcgatgaa  900
tacaatttat cttctctgac cgaaatcgca tgcggaggct ctcctctggg gagagacatc  960
gcagataaag tcgccaagag actgaaagtg catggaatcc tccagggata tgggctgacc  1020
gagacctgtt ccgctctgat actgtctccc aacgatcggg aactgaaaaa gggggcaatc  1080
ggaaccccta tgccatacgt gcaagtgaaa gtgatcgaca tcaataccgg gaaggccctg  1140
ggaccaagag agaaaggcga gatctgcttc aagtctcaga tgctgatgaa ggggtatcac  1200
aacaatcctc aggccactag ggatgctctg gacaaggatg ggtggctgca cactggggac  1260
ctgggatatt acgacgaaga cagatttatc tatgtcgtgg acaggctgaa agagctgatc  1320
aagtataaag ggtatcaggt cgcccctgct gagttggaaa acctgctgtt gcagcacccc  1380
aatatctctg atgccggcgt gattggaatt ccggacgaat ttgctggtca attaccttcc  1440
gcctgtgtgg tgctggagcc tggcaagaca atgaccgaga aagaagtgca ggactacatt  1500
gcagagctgg tcactacaac taaacatctg aggggggggg tcgtctttat agattccatt  1560
ccaaagggcc caacagggaa actgatgaga aacgaactga gggcaatctt tgctcgggaa  1620
caggcaaaaa tcgctgtgta a                                            1641
<210>7
<211>1641
<212>DNA
<213>本发明的突变型Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>7
atggaagaag agaacatcgt gaatggcgat cgccctcggg atctggtgtt ccctggcaca  60
gccggcctgc agctgtatca gtccctgtat aaatactctt acatcaccga cggaatcatc  120
gacgcccaca ccaacgaggt gatctcctat gcccagattt tcgaaacaag ttgccgcctg  180
gccgtgagcc tggagaagta tggcctggat cacaacaacg tggtggccat ttgcagcgag  240
aacaacatcc acttcttcgg ccctctgatc gctgccctat accaggggat tccaatggcc  300
acatccaacg atatgtacac cgagagggag atgatcggcc acctgaacat ctccaagcca  360
tgtctgatgt tctgttccaa gaagtccctg ccattcatcc tgaaggtgca gaagcacctg  420
gactttctca agaaggtgat cgtgatcgac agcatgtacg acatcaacgg cgtggagtgc  480
gtgttcagtt tcgtgtcccg gtacaccgat cacgcgttcg atccagtgaa gttcaaccct  540
aaagagtttg atcccctgga gagaaccgcg ctgatcatga catcctctgg aacaaccggc  600
ctgcctaagg gcgtggtgat cagccacagg agcatcacca tcagattcgt ccacagcagc  660
gatcccatct acggcacccg catcgcccca gatacatcca tcctggccat cgcccctttc  720
caccacgcct tcggactgtt taccgccctg gcttactttc cagtgggcct gaagatcgtg  780
atggtgaaaa agtttgaggg cgagttcttc ctgaagacca tccagaacta caagatcgct  840
tctatcgtgg tgcctcctcc aatcatggtg tatctggcca agagccctct ggtggatgag  900
tacaatctgt ccagcctgac agagatcgcc tgtggcggct cccctctggg cagagacatc  960
gccgacaagg tggccaagag actgaaggtc cacggcatcc tgcagggcta tggcctgacc  1020
gagacctgta gcgccctgat cctgagcccc aacgatagag agctgaagaa gggcgccatc  1080
ggcaccccta tgccctatgt ccaggtgaag gtgattgaca tcaacaccgg caaagccctg  1140
ggaccaagag agaagggcga gatttgcttc aagagccaga tgctgatgaa gggctaccac  1200
aacaacccac aggccaccag ggatgccctg gacaaggacg ggtggctgca caccggcgat  1260
ctgggctact acgacgagga cagattcatc tatgtggtgg atcggctgaa agagctcatc  1320
aagtacaagg gctaccaggt ggcccctgcc gagctggaga acttgcttct gcagcaccct  1380
aacatctctg atgccggcgt catcggcatc ccagacgagt ttgccggcca gctgccttcc  1440
gcctgtgtcg tgctggagcc tggcaagacc atgaccgaga aggaggtgca ggattatatc  1500
gccgagctgg tgaccaccac caagcacctg cggggcggcg tggtgttcat cgacagcatt  1560
ccgaaaggcc caacaggcaa gctgatgaga aacgagctga gggccatctt tgcccgcgag  1620
caggccaagt ccaagctgta a                                            1041
<210>8
<211>1632
<212>DNA
<213>野生型大场雌光萤的发绿光的荧光素酶
<400>8
atgcctaatg aaatcatttt acatggggcc aaacctcgag acccgttaga cctgggaact  60
gcaggaattc aattgtatag ggctttgacg aatttttcct ttttaaggga agccttgatc  120
gacgctcaca ccgaggaagt agtatcttac gcggacattt tggaaaacag ctgtcgatta  180
gcaaaatgct acgaaaacta tggattacgc caaaacagcg tcatatcggt gtgcagcgaa  240
aacagcacga tcttcttcta ccccgtaatt gccgctttgt atatgggagt cataacagca  300
accgtaaatg atagttatac cgaacgggaa ttattggaaa ccttaaatat atcaaaaccg  360
gaattagtgt tctgctcgaa gaaagccatt aaaaatatga tggcattgaa aaggaacgtc  420
aattttatta aaaaggtagt acttttggat agtaaggaag acatgggcga agcccagtgt  480
cttagcaact ttatggcacg ctattcggaa cccaatttgg acgtaagaaa ttttaaacca  540
cgcgattttg atgctaaaga acaagtcgct ttgatcatgt cctcatcggg aacaaccggg  600
ctgcccaaag gggtcgtgtt aacccatcga aatttaagcg ttcgcttcgt acactgcaag  660
gatcccttat tcggcacaag aactattcca tcaacttcga ttttatctat cgttcccttc  720
catcatgcgt ttggaatgtt tacaacgttg tcttatttta tagtagggct tagagttgta  780
ttactgaaaa gattcgaaga gaagtttttc ttaagcacca ttgaaaagta cagaattcca  840
actatcgttc ttgcgccgcc cgtaatggta ttcctagcta agagcccctt agttgatcag  900
tacgatttgt ccagtattag agaagtcgct accggtggcg cacctgttgg aactgaagtg  960
gcagtggccg ttgcgaaacg gttgaaaatt ggcggaatcc ttcagggcta cggattgacc  1020
gaaacgtgtt gcgccgtatt aattacccct catgacgacg ttaaaacagg ttctaccggg  1080
agggtagctc cttacgtcca agcgaaaatt gtagatctta ccaccggaaa atctctgggg  1140
ccaaataaaa gaggagagct ttgttttaaa agtgagatca ttatgaaggg ctatttcaac  1200
aataaacaag ctacggaaga agccatcgat aaagaaggat ggttacattc tggagatgtt  1260
gggtattatg acgacgatgg tcatttcttc gtagtcgatc gtttaaagga acttatcaag  1320
tacaagggat atcaagtagc accggctgaa ctggagtggt tgcttttgca acatccatct  1380
attaaagatg ccggtgttac tggcgttccc gacgaagctg ctggagaact accaggtgct  1440
tgtatagttc tccaagaagg aaaaagtctt actgaacaag aaattattga ctatatagcc  1500
gaacgagttt cgccaactaa acgtatacgt ggtggagtgg tcttcgttga tgatattcct  1560
aaaggggcga ctggaaaact ggtcagaagt gaattacgaa aacttcttgc tcagaagaaa  1620
tcgaaactat aa                                                      1632
<210>9
<211>1632
<212>DNA
<213>野生型大场雌光萤发橙光的荧光素酶
<400>9
atgcctaatg aaatcatttt acatggggcc aaacctcgag acccgttaga cctgggaact  60
gcaggaattc aattgtatag ggctttgacg aatttttcct ttttaaggga agccttgatc  120
gacgctcaca ccgaggaagt agtatcttac gcggacattt tggaaaacag ctgtcgatta  180
gcaaaatgct acgaaaacta tggattacgc caaaacagcg tcatatcggt gtgcagcgaa  240
aacagcacga tcttcttcta ccccgtaatt gccgctttgt atatgggagt cataacagca  300
accgtaaatg atagttatac cgaacgggaa ttattggaaa ccttaaatat atcaaaaccg  360
gaattagtgt tctgctcgaa gaaagccatt aaaaatatga tggcattgaa aaggaacgtc  420
aattttatta aaaaggtagt acttttggat agtaaggaag acatgggcga agcccagtgt  480
cttagcaact ttatggcacg ctattcggaa cccaatttgg acgtaagaaa ttttaaacca  540
cgcgattttg atgctaaaga acaagtcgct ttgatcatgt cctcatcggg aacaaccggg  600
ctgcccaaag gggtcgtgtt aacccatcga aatttaagcg ttcgcttcgt acactgcaag  660
gatcccttat tcggcaatag aactattcca tcaacttcga ttttatctat cgttcccttc  720
catcatgcgt ttggaatgtt tacaacgttg tcttatttta tagtagggct tagagttgta  780
ttactgaaaa gattcgaaga gaagtttttc ttaagcacca ttgaaaagta cagaattcca  840
actatcgttc ttgcgccgcc cgtaatggta ttcctagcta agagcccctt agttgatcag  900
tacgatttgt ccagtattag agaagtcgct accggtggcg cacctgttgg aactgaagtg  960
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<210>10
<211>1632
<212>DNA
<213>本发明的突变型大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>10
atggctaacg agatcatcct gcacggcgcc aagcccaggg accccctgga cctgggcacc  60
gccggcattc agctctacag ggccctgacc aacttctcct tcctgaggga ggccctgatc  120
gacgcccaca ccgaggaggt ggtgtcttac gccgacatcc tggagaacag ctgtagactg  180
gctaagtgct acgagaacta cggcctgcgc cagaacagcg tgatctccgt gtgcagcgag  240
aatagcacca tcttcttcta ccccgtgatc gccgccctgt acatgggcgt gatcaccgcc  300
accgtgaacg acagctacac cgagcgggag ctgctggaga ccctgaacat ctccaagccc  360
gaactggtgt tctgctccaa gaaggccatc aagaacatga tggccctgaa gaggaacgtg  420
aacttcatca agaaggtggt gctgctggac agcaaggagg atatgggcga ggcccagtgc  480
ctgagcaact tcatggcccg gtactccgag cccaacctgg acgtgagaaa cttcaagcca  540
agggacttcg acgccaagga gcaggtggcc cttattatgt cctcctctgg caccaccggc  600
ctgccaaagg gcgtggtgct gacccacagg aacctgagcg tgcgcttcgt ccactgcaag  660
gaccccctgt tcggcaccag aaccatcccc tccacctcca tcctgtccat cgtgcccttc  720
caccacgcct tcggaatgtt cacaaccctg tcctacttca tcgtgggcct gagagtggtg  780
ctgctgaaga gattcgagga gaagttcttc ctgagcacca tcgagaagta cagaatccca  840
acaatcgtgc tggcccctcc tgtgatggtg ttcctggcta agagccccct ggtggaccag  900
tacgacctgt ccagcatcag agaggtggcc accggcggcg cccctgtggg caccgaggtt  960
gccgtggccg tggccaagcg gctgaagatc ggcggcatcc tccagggcta cggcctgacc  1020
gagacctgct gcgccgtgct gatcaccccc cacgacgacg tgaagaccgg ctccaccggc  1080
agggtagccc cctacgtgca ggctaagatc gtggacctga ccaccggcaa gtccctggga  1140
cctaacaaga gaggcgagct gtgcttcaag agcgagatca tcatgaaggg ctacttcaac  1200
aacaagcagg ccaccgagga ggccatcgac aaggagggct ggctgcactc cggcgacgtg  1260
ggatactacg acgacgatgg acatttcttc gtggtggacc ggctgaaaga gctgatcaag  1320
tacaagggct accaggtggc ccccgccgag ctggagtggc tgctgctcca gcacccatcc  1380
atcaaggatg ccggcgtgac cggcgtgccc gacgaggccg ccggcgagct gcccggcgcc  1440
tgcatcgtgc tccaggaggg caagagcctg accgagcagg agatcatcga ctacatcgcc  1500
gagcgagtgt ctcccaccaa gcgcatccgg ggcggagtcg tcttcgtgga cgacatcccc  1560
aagggcgcca ccggcaagct ggtgagaagc gagctgcgga agctgctggc ccagaagaag  1620
tccaagctgt aa                                                      1632
<210>11
<211>1632
<212>DNA
<213>本发明的突变型大场雌光萤的发橙光的荧光素酶
<400>11
atggctaacg agatcatcct gcacggcgcc aagcccaggg accccctgga cctgggcacc  60
gccggcattc agctctacag ggccctgacc aacttctcct tcctgaggga ggccctgatc  120
gacgcccaca ccgaggaggt ggtgtcttac gccgacatcc tggagaacag ctgtagactg  180
gctaagtgct acgagaacta cggcctgcgc cagaacagcg tgatctccgt gtgcagcgag  240
aatagcacca tcttcttcta ccccgtgatc gccgccctgt acatgggcgt gatcaccgcc  300
accgtgaacg acagctacac cgagcgggag ctgctggaga ccctgaacat ctccaagccc  360
gaactggtgt tctgctccaa gaaggccatc aagaacatga tggccctgaa gaggaacgtg  420
aacttcatca agaaggtggt gctgctggac agcaaggagg atatgggcga ggcccagtgc  480
ctgagcaact tcatggcccg gtactccgag cccaacctgg acgtgagaaa cttcaagcca  540
agggacttcg acgccaagga gcaggtggcc cttattatgt cctcctctgg caccaccggc  600
ctgccaaagg gcgtggtgct gacccacagg aacctgagcg tgcgcttcgt ccactgcaag  660
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caccacgcct tcggaatgtt cacaaccctg tcctacttca tcgtgggcct gagagtggtg  780
ctgctgaaga gattcgagga gaagttcttc ctgagcacca tcgagaagta cagaatccca  840
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gccgtggccg tggccaagcg gctgaagatc ggcggcatcc tccagggcta cggcctgacc  1020
gagacctgct gcgccgtgct gatcaccccc cacgacgacg tgaagaccgg ctccaccggc  1080
agggtagccc cctacgtgca ggctaagatc gtggacctga ccaccggcaa gtccctggga  1140
cctaacaaga gaggcgagct gtgcttcaag agcgagatca tcatgaaggg ctacttcaac  1200
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ggatactacg acgacgatgg acatttcttc gtggtggacc ggctgaaaga gctgatcaag  1320
tacaagggct accaggtggc ccccgccgag ctggagtggc tgctgctcca gcacccatcc  1380
atcaaggatg ccggcgtgac cggcgtgccc gacgaggccg ccggcgagct gcccggcgcc  1440
tgcatcgtgc tccaggaggg caagagcctg accgagcagg agatcatcga ctacatcgcc  1500
gagcgagtgt ctcccaccaa gcgcatccgg ggcggagtcg tcttcgtgga cgacatcccc  1560
aagggcgcca ccggcaagct ggtgagaagc gagctgcgga agctgctggc ccagaagaag  1620
tccaagctgt aa                                                      1632
<210>12
<211>543
<212>PRT
<213>野生型大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>12
Met Pro Asn Glu Ile Ile Leu His Gly Ala Lys Pro Arg Asp Pro Leu
1               5                   10                  15
Asp Leu Gly Thr Ala Gly Ile Gln Leu Tyr Arg Ala Leu Thr Asn Phe
            20                  25                  30
Ser Phe Leu Arg Glu Ala Leu Ile Asp Ala His Thr Glu Glu Val Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ala Asp Ile Leu Glu Asn Ser Cys Arg Leu Ala Lys Cys Tyr
    50                  55                  60
Glu Asn Tyr Gly Leu Arg Gln Asn Ser Val Ile Ser Val Cys Ser Glu
65                  70                  75                  80
Asn Ser Thr Ile Phe Phe Tyr Pro Val Ile Ala Ala Leu Tyr Met Gly
                85                  90                  95
Val Ile Thr Ala Thr Val Asn Asp Ser Tyr Thr Glu Arg Glu Leu Leu
            100                 105                 110
Glu Thr Leu Asn Ile Ser Lys Pro Glu Leu Val Phe Cys Ser Lys Lys
        115                 120                 125
Ala Ile Lys Asn Met Met Ala Leu Lys Arg Asn Val Asn Phe Ile Lys
    130                 135                 140
Lys Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Glu Asp Met Gly Glu Ala Gln Cys
145                 150                 155                 160
Leu Ser Asn Phe Met Ala Arg Tyr Ser Glu Pro Asn Leu Asp Val Arg
                165                 170                 175
Asn Phe Lys Pro Arg Asp Phe Asp Ala Lys Glu Gln Val Ala Leu Ile
            180                 185                 190
Met Ser Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Val Leu Thr
        195                 200                 205
His Arg Asn Leu Ser Val Arg Phe Val His Cys Lys Asp Pro Leu Phe
    210                 215                 220
Gly Thr Arg Thr Ile Pro Ser Thr Ser Ile Leu Ser Ile Val Pro Phe
225                 230                 235                 240
His His Ala Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Ser Tyr Phe Ile Val Gly
                245                 250                 255
Leu Arg Val Val Leu Leu Lys Arg Phe Glu Glu Lys Phe Phe Leu Ser
            260                 265                 270
Thr Ile Glu Lys Tyr Arg Ile Pro Thr Ile Val Leu Ala Pro Pro Val
        275                 280                 285
Met Val Phe Leu Ala Lys Ser Pro Leu Val Asp Gln Tyr Asp Leu Ser
    290                 295                 300
Ser Ile Arg Glu Val Ala Thr Gly Gly Ala Pro Val Gly Thr Glu Val
305                 310                 315                 320
Ala Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Lys Ile Gly Gly Ile Leu Gln Gly
                325                 330                 335
Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys Gys Ala Val Leu Ile Thr Pro His Asp
            340                 345                 350
Asp Val Lys Thr Gly Ser Thr Gly Arg Val Ala Pro Tyr Val Gln Ala
        355                 360                 365
Lys Ile Val Asp Leu Thr Thr Gly Lys Ser Leu Gly Pro Asn Lys Arg
    370                 375                 380
Gly Glu Leu Cys Phe Lys Ser Glu Ile Ile Met Lys Gly Tyr Phe Asn
385                 390                 395                 400
Asn Lys Gln Ala Thr Glu Glu Ala Ile Asp Lys Glu Gly Trp Leu His
                405                 410                 415
Ser Gly Asp Val Gly Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly His Phe Phe Val Val
            420                 425                 430
Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro
        435                 440                 445
Ala Glu Leu Glu Trp Leu Leu Leu Gln His Pro Ser Ile Lys Asp Ala
    450                 455                 460
Gly Val Thr Gly Val Pro Asp Glu Ala Ala Gly Glu Leu Pro Gly Ala
465                 470                 475                 480
Cys Ile Val Leu Gln Glu Gly Lys Ser Leu Thr Glu Gln Glu Ile Ile
                485                 490                 495
Asp Tyr Ile Ala Glu Arg Val Ser Pro Thr Lys Arg Ile Arg Gly Gly
            500                 505                 510
Val Val Phe Val Asp Asp Ile Pro Lys Gly Ala Thr Gly Lys Leu Val
        515                 520                 525
Arg Ser Glu Leu Arg Lys Leu Leu Ala Gln Lys Lys Ser Lys Leu
    530                 535                 540
<210>13
<211>543
<212>PRT
<213>野生型大场雌光萤发橙光的荧光素酶
<400>13
Met Pro Asn Glu Ile Ile Leu His Gly Ala Lys Pro Arg Asp Pro Leu
1               5                   10                  15
Asp Leu Gly Thr Ala Gly Ile Gln Leu Tyr Arg Ala Leu Thr Asn Phe
            20                  25                  30
Ser Phe Leu Arg Glu Ala Leu Ile Asp Ala His Thr Glu Glu Val Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ala Asp Ile Leu Glu Asn Ser Cys Arg Leu Ala Lys Cys Tyr
    50                  55                  60
Glu Asn Tyr Gly Leu Arg Gln Asn Ser Val Ile Ser Val Cys Ser Glu
65                  70                  75                  80
Asn Ser Thr Ile Phe Phe Tyr Pro Val Ile Ala Ala Leu Tyr Met Gly
                85                  90                  95
Val Ile Thr Ala Thr Val Asn Asp Ser Tyr Thr Glu Arg Glu Leu Leu
            100                 105                 110
Glu Thr Leu Asn Ile Ser Lys Pro Glu Leu Val Phe Cys Ser Lys Lys
        115                 120                 125
Ala Ile Lys Asn Met Met Ala Leu Lys Arg Asn Val Asn Phe Ile Lys
    130                 135                 140
Lys Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Glu Asp Met Gly Glu Ala Gln Cys
145                 150                 155                 160
Leu Ser Asn Phe Met Ala Arg Tyr Ser Glu Pro Asn Leu Asp Val Arg
                165                 170                 175
Asn Phe Lys Pro Arg Asp Phe Asp Ala Lys Glu Gln Val Ala Leu Ile
            180                 185                 190
Met Ser Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Val Leu Thr
        195                 200                 205
His Arg Asn Leu Ser Val Arg Phe Val His Cys Lys Asp Pro Leu Phe
    210                 215                 220
Gly Asn Arg Thr Ile Pro Ser Thr Ser Ile Leu Ser Ile Val Pro Phe
225                 230                 235                 240
His His Ala Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Ser Tyr Phe Ile Val Gly
                245                 250                 255
Leu Arg Val Val Leu Leu Lys Arg Phe Glu Glu Lys Phe Phe Leu Ser
            260                 265                 270
Thr Ile Glu Lys Tyr Arg Ile Pro Thr Ile Val Leu Ala Pro Pro Val
        275                 280                 285
Met Val Phe Leu Ala Lys Ser Pro Leu Val Asp Gln Tyr Asp Leu Ser
    290                 295                 300
Ser Ile Arg Glu Val Ala Thr Gly Gly Ala Pro Val Gly Thr Glu Val
305                 310                 315                 320
Ala Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Lys Ile Gly Gly Ile Leu Gln Gly
                325                 330                 335
Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys Cys Ala Val Leu Ile Thr Pro His Asp
            340                 345                 350
Asp Val Lys Thr Gly Ser Thr Gly Arg Val Ala Pro Tyr Val Gln Ala
        355                 360                 365
Lys Ile Val Asp Leu Thr Thr Gly Lys Ser Leu Gly Pro Asn Lys Arg
    370                 375                 380
Gly Glu Leu Cys Phe Lys Ser Glu Ile Ile Met Lys Gly Tyr Phe Asn
385                 390                 395                 400
Asn Lys Gln Ala Thr Glu Glu Ala Ile Asp Lys Glu Gly Trp Leu His
                405                 410                 415
Ser Gly Asp Val Gly Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly His Phe Phe Val Val
            420                 425                 430
Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro
        435                 440                 445
Ala Glu Leu Glu Trp Leu Leu Leu Gln His Pro Ser Ile Lys Asp Ala
    450                 455                 460
Gly Val Thr Gly Val Pro Asp Glu Ala Ala Gly Glu Leu Pro Gly Ala
465                 470                 475                 480
Cys Ile Val Leu Gln Glu Gly Lys Ser Leu Thr Glu Gln Glu Ile Ile
                485                 490                 495
Asp Tyr Ile Ala Glu Arg Val Ser Pro Thr Lys Arg Ile Arg Gly Gly
            500                 505                 510
Val Val Phe Val Asp Asp Ile Pro Lys Gly Ala Thr Gly Lys Leu Val
        515                 520                 525
Arg Ser Glu Leu Arg Lys Leu Leu Ala Gln Lys Lys Ser Lys Leu
    530                 535                 540
<210>14
<211>543
<212>PRT
<213>本发明的突变型大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>14
Met Ala Asn Glu Ile Ile Leu His Gly Ala Lys Pro Arg Asp Pro Leu
1               5                   10                  15
Asp Leu Gly Thr Ala Gly Ile Gln Leu Tyr Arg Ala Leu Thr Asn Phe
            20                  25                  30
Ser Phe Leu Arg Glu Ala Leu Ile Asp Ala His Thr Glu Glu Val Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ala Asp Ile Leu Glu Asn Ser Cys Arg Leu Ala Lys Cys Tyr
    50                  55                  60
Glu Asn Tyr Gly Leu Arg Gln Asn Ser Val Ile Ser Val Cys Ser Glu
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Asn Ser Thr Ile Phe Phe Tyr Pro Val Ile Ala Ala Leu Tyr Met Gly
                85                  90                  95
Val Ile Thr Ala Thr Val Asn Asp Ser Tyr Thr Glu Arg Glu Leu Leu
            100                 105                 110
Glu Thr Leu Asn Ile Ser Lys Pro Glu Leu Val Phe Cys Ser Lys Lys
        115                 120                 125
Ala Ile Lys Asn Met Met Ala Leu Lys Arg Asn Val Asn Phe Ile Lys
    130                 135                 140
Lys Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Glu Asp Met Gly Glu Ala Gln Cys
145                 150                 155                 160
Leu Ser Asn Phe Met Ala Arg Tyr Ser Glu Pro Asn Leu Asp Val Arg
                165                 170                 175
Asn Phe Lys Pro Arg Asp Phe Asp Ala Lys Glu Gln Val Ala Leu Ile
            180                 185                 190
Met Ser Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Val Leu Thr
        195                 200                 205
His Arg Asn Leu Ser Val Arg Phe Val His Cys Lys Asp Pro Leu Phe
    210                 215                 220
Gly Thr Arg Thr Ile Pro Ser Thr Ser Ile Leu Ser Ile Val Pro Phe
225                 230                 235                 240
His His Ala Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Ser Tyr Phe Ile Val Gly
                245                 250                 255
Leu Arg Val Val Leu Leu Lys Arg Phe Glu Glu Lys Phe Phe Leu Ser
            260                 265                 270
Thr Ile Glu Lys Tyr Arg Ile Pro Thr Ile Val Leu Ala Pro Pro Val
        275                 280                 285
Met Val Phe Leu Ala Lys Ser Pro Leu Val Asp Gln Tyr Asp Leu Ser
    290                 295                 300
Ser Ile Arg Glu Val Ala Thr Gly Gly Ala Pro Val Gly Thr Glu Val
305                 310                 315                 320
Ala Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Lys Ile Gly Gly Ile Leu Gln Gly
                325                330                 335
Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys Cys Ala Val Leu Ile Thr Pro His Asp
            340                 345                 350
Asp Val Lys Thr Gly Ser Thr Gly Arg Val Ala Pro Tyr Val Gln Ala
        355                 360                 365
Lys Ile Val Asp Leu Thr Thr Gly Lys Ser Leu Gly Pro Asn Lys Arg
    370                 375                 380
Gly Glu Leu Cys Phe Lys Ser Glu Ile Ile Met Lys Gly Tyr Phe Asn
385                 390                 395                 400
Asn Lys Gln Ala Thr Glu Glu Ala Ile Asp Lys Glu Gly Trp Leu His
                405                 410                 415
Ser Gly Asp Val Gly Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly His Phe Phe Val Val
            420                 425                 430
Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro
        435                 440                 445
Ala Glu Leu Glu Trp Leu Leu Leu Gln His Pro Ser Ile Lys Asp Ala
    450                 455                 460
Gly Val Thr Gly Val Pro Asp Glu Ala Ala Gly Glu Leu Pro Gly Ala
465                 470                 475                 480
Cys Ile Val Leu Gln Glu Gly Lys Ser Leu Thr Glu Gln Glu Ile Ile
                485                 490                 495
Asp Tyr Ile Ala Glu Arg Val Ser Pro Thr Lys Arg Ile Arg Gly Gly
            500                 505                 510
Val Val Phe Val Asp Asp Ile Pro Lys Gly Ala Thr Gly Lys Leu Val
        515                 520                 525
Arg Ser Glu Leu Arg Lys Leu Leu Ala Gln Lys Lys Ser Lys Leu
    530                 535                 540
<210>15
<211>543
<212>PRT
<213>本发明的突变型大场雌光萤发橙光的荧光素酶
<400>15
Met Ala Asn Glu Ile Ile Leu His Gly Ala Lys Pro Arg Asp Pro Leu
1               5                   10                  15
Asp Leu Gly Thr Ala Gly Ile Gln Leu Tyr Arg Ala Leu Thr Asn Phe
            20                  25                  30
Ser Phe Leu Arg Glu Ala Leu Ile Asp Ala His Thr Glu Glu Val Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ala Asp Ile Leu Glu Asn Ser Cys Arg Leu Ala Lys Cys Tyr
    50                  55                  60
Glu Asn Tyr Gly Leu Arg Gln Asn Ser Val Ile Ser Val Cys Ser Glu
65                  70                  75                  80
Asn Ser Thr Ile Phe Phe Tyr Pro Val Ile Ala Ala Leu Tyr Met Gly
                85                  90                  95
Val Ile Thr Ala Thr Val Asn Asp Ser Tyr Thr Glu Arg Glu Leu Leu
            100                 105                 110
Glu Thr Leu Asn Ile Ser Lys Pro Glu Leu Val Phe Cys Ser Lys Lys
        115                 120                 125
Ala Ile Lys Asn Met Met Ala Leu Lys Arg Asn Val Asn Phe Ile Lys
    130                 135                 140
Lys Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Glu Asp Met Gly Glu Ala Gln Cys
145                 150                 155                 160
Leu Ser Asn Phe Met Ala Arg Tyr Ser Glu Pro Asn Leu Asp Val Arg
                165                 170                 175
Asn Phe Lys Pro Arg Asp Phe Asp Ala Lys Glu Gln Val Ala Leu Ile
            180                 185                 190
Met Ser Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Val Leu Thr
        195                 200                 205
His Arg Asn Leu Ser Val Arg Phe Val His Cys Lys Asp Pro Leu Phe
    210                 215                 220
Gly Asn Arg Thr Ile Pro Ser Thr Ser Ile Leu Ser Ile Val Pro Phe
225                 230                 235                 240
His His Ala Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Ser Tyr Phe Ile Val Gly
                245                 250                 255
Leu Arg Val Val Leu Leu Lys Arg Phe Glu Glu Lys Phe Phe Leu Ser
            260                 265                 270
Thr Ile Glu Lys Tyr Arg Ile Pro Thr Ile Val Leu Ala Pro Pro Val
        275                 280                 285
Met Val Phe Leu Ala Lys Ser Pro Leu Val Asp Gln Tyr Asp Leu Ser
    290                 295                 300
Ser Ile Arg Glu Val Ala Thr Gly Gly Ala Pro Val Gly Thr Glu Val
305                 310                 315                 320
Ala Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Lys Ile Gly Gly Ile Leu Gln Gly
                325                 330                 335
Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys Cys Ala Val Leu Ile Thr Pro His Asp
            340                 345                 350
Asp Val Lys Thr Gly Ser Thr Gly Arg Val Ala Pro Tyr Val Gln Ala
        355                 360                 365
Lys Ile Val Asp Leu Thr Thr Gly Lys Ser Leu Gly Pro Asn Lys Arg
    370                 375                 380
Gly Glu Leu Cys Phe Lys Ser Glu Ile Ile Met Lys Gly Tyr Phe Asn
385                 390                 395                 400
Asn Lys Gln Ala Thr Glu Glu Ala Ile Asp Lys Glu Gly Trp Leu His
                405                 410                 415
Ser Gly Asp Val Gly Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly His Phe Phe Val Val
            420                 425                 430
Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro
        435                 440                 445
Ala Glu Leu Glu Trp Leu Leu Leu Gln His Pro Ser Ile Lys Asp Ala
    450                 455                 460
Gly Val Thr Gly Val Pro Asp Glu Ala Ala Gly Glu Leu Pro Gly Ala
465                 470                 475                 480
Cys Ile Val Leu Gln Glu Gly Lys Ser Leu Thr Glu Gln Glu Ile Ile
                485                 490                 495
Asp Tyr Ile Ala Glu Arg Val Ser Pro Thr Lys Arg Ile Arg Gly Gly
            500                 505                 510
Val Val Phe Val Asp Asp Ile Pro Lys Gly Ala Thr Gly Lys Leu Val
        515                 520                 525
Arg Ser Glu Leu Arg Lys Leu Leu Ala Gln Lys Lys Ser Lys Leu
    530                 535                 540
<210>16
<211>1638
<212>DNA
<213>突变型Phrixothrix发绿光的荧光素酶
<400>16
atggaagaag agaacatcag gcacggcgag cgccctcggg acatcgtcca ccctggctcc  60
gccggccagc agctgtacca gtccctgtac aagttcgcct ccttccctga ggccatcatc  120
gacgcccaca ccaacgaggt gatctcctac gcccagattt tcgaaaccag ctgccgcctg  180
gccgtgagca tcgagcagta cggcctgaac gagaacaacg tggtgggcgt ctgtagcgag  240
aacaacatca acttcttcaa ccctgtgctg gccgccctgt acctcggcat cccagtggcc  300
acctccaacg atatgtacac cgatggcgag ctgaccggcc acctgaacat ctccaagcca  360
accatcatgt tcagctccaa gaaggccctg cccctgatcc tgagagtgca gcagaacctg  420
agcttcatca agaaggtggt ggtgatcgac agcatgtacg acatcaacgg cgtggagtgc  480
gtgtctacct tcgttgcccg gtacaccgac cacaccttcg acccactgtc cttcacccca  540
aaggacttcg accccctgga gaagatcgcc ctgatcatgt catcctccgg caccaccggc  600
ctgcctaagg gcgtggtgct gagccacaga agcctgacca tcagattcgt ccacagcagg  660
gaccccatct acggcacccg caccgtgccc cagacctcca tcctgtccct ggtgccattt  720
caccacgcct tcggcatgtt caccaccctg tcctacttcg tggtgggcct gaaggtggtg  780
atgctgaaga agttcgaggg cgccctcttc ctgaagacca tccagaacta caagatccct  840
acaatcgtgg tggcccctcc agtgatggtg ttcctggcta agagcccact ggtggatcag  900
tacgatctgt ccagcctcac cgaggtggct accggcggcg ctcctctggg caaggatgtg  960
gccgaggctg tggccaagag attgaagctg cctggcatca tccagggcta cggcctgacc  1020
gagacctgct gcgctgtgat gatcacccct cacaacgctg tgaagaccgg ctccaccggc  1080
agacccctgc catacatcaa ggctaaggtg ctggataacg ctaccggcaa agccctggga  1140
ccaggcgaga gaggcgagat ttgcttcaag agcgagatga tcatgaaggg ctactacaac  1200
aaccctgagg ccaccatcga caccatcgac aaggatggct ggctgcactc tggcgacatc  1260
ggctactacg acgaggatgg caacttcttc atcgtggatc ggctgaaaga gctgatcaag  1320
tacaagggct accaggtggc ccctgctgag ctggagaact tgcttctgca gcacccaagc  1380
atcgctgatg ccggcgtgac cggcgtgccc gacgagttcg ctggccagct gcctgctgct  1440
tgtgtcgtgc tggagtctgg caagacattg accgagaagg aggtgcaaga tttcatcgcc  1500
gcccaggtga ccccaactaa gcacctgcgg ggcggcgtgg tgttcgtgga cagcatccct  1560
aaaggcccta ccggcaagct gatcagaaag gagctgcggg agattttcgc ccagagagcc  1620
ccaaagtcca agctgtaa                                                1638
<210>17
<211>75
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>17
cagcaggact acaattatat caatcattat ataaatattc ttatattact gacggaataa    60
tcgatgccca tacca                                                     75
<210>18
<211>71
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>18
gcaggactac aattatatca atcattatat aaatactcgt atattactga cggaataatc    60
gatgcccata c                                                         71
<210>19
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>19
caatgaagta atatcatatg ctcaaatatt tgaaacaagt tgccgcttgg cagttagtct    60
agaaaaatat ggcttgg                                                   77
<210>20
<211>75
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>20
aatatttgaa accagctgcc gcttggcagt tagtctagag aaatatggct tggatcataa    60
caatgttgtg gcaat                                                     75
<210>21
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>21
gaaaacaaca tacacttttt tggcccttta attgctgccc tataccaagg aataccaatg    60
gcaacatcaa atgatat                                                   77
<210>22
<211>73
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>22
acttttttgg ccctttaatt gctgctttat accaagggat accaatggca acatcaaatg    60
atatgtacac aga                                                       73
<210>23
<211>71
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>23
catcaaatga tatgtacaca gaaagggaga tgatcggcca tttgaatata tcgaaaccat    60
gccttatgtt t                                                         71
<210>24
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>24
tttattctga aagtacaaaa acatctagat tttctcaaaa aagtcatagt cattgatagt    60
atgtacgata tcaatgg                                                   77
<210>25
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>25
atgtacgata tcaatggcgt tgaatgcgta tttagttttg tttcacgtta tactgatcac    60
gcctttgatc cagtgaa                                                   77
<210>26
<211>75
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>26
atatcaatgg cgttgaatgc gtatttagct ttgtttcacg gtatactgat cacgcctttg    60
atccagtgaa attta                                                     75
<210>27
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>27
gtatttagct ttgtttcacg ttatactgat cacgcgttcg atccagtgaa atttaaccca    60
aaagagtttg atccctt                                                   77
<210>28
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>28
tttaacccaa aagagtttga tcccttggaa agaaccgcgc taattatgac atcatctgga    60
acaactggat tgcctaa                                                   77
<210>29
<211>81
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>29
gaaccgcatt aattatgaca tcatctggaa caactggcct gcctaaaggg gtagtaataa    60
gccatagaag tataactata a                                              81
<210>30
<211>73
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>30
ctggattgcc taaaggggta gtaataagcc ataggagtat aactataaga ttcgtccata    60
gcagtgatcc cat                                                       73
<210>31
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>31
aagaaatttg agggcgaatt cttcttaaaa accatccaaa attacaaaat cgcttctatt    60
gtagttcctc ctccaat                                                   77
<210>32
<211>71
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>32
agggcgaatt cttcttaaaa accatacaaa actacaaaat cgcttctatt gtagttcctc    60
ctccaattat g                                                         71
<210>33
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>33
gttcctcctc caattatggt atatttggct aaaagtcctc tagtcgatga atacaattta    60
tcgagcttaa cggaaat                                                   77
<210>34
<211>73
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>34
tttggctaaa agtccattag tcgatgaata caatctgtcg agcttaacgg aaattgcttg    60
tggagggtct cct                                                       73
<210>35
<211>73
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>35
ggaaattgct tgtggagggt ctcctttagg aagagacatc gcagataaag tagcaaagag    60
attgaaagta cat                                                       73
<210>36
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>36
gggtctcctt taggaagaga tatcgcagat aaagtagcca agagattgaa agtacatgga    60
atcctacaag gatatgg                                                   77
<210>37
<211>73
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>37
ggatatggat taaccgaaac ctgcagcgct ctaatactga gccccaatga tcgagaactt    60
aaaaaaggtg caa                                                       73
<210>38
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>38
ccgaaacctg cagcgctcta atacttagcc ccaacgatag agaacttaaa aaaggtgcaa    60
ttggaacgcc tatgcca                                                   77
<210>39
<211>81
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>39
ctaatactta gccccaatga tcgagaactt aaaaagggtg caattggaac gcctatgcca    60
tatgttcaag ttaaagttat a                                              81
<210>40
<211>73
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>40
tgggaaggcg ctaggaccaa gagaaaaagg cgagatttgc ttcaaaagtc aaatgcttat    60
gaaaggatat cac                                                       73
<210>41
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>41
aaaaggcgaa atatgcttca aaagtcaaat gcttatgaag ggctatcaca acaatccgca    60
agcaactcgt gatgctc                                                   77
<210>42
<211>75
<212>DNA    
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>42
tccgcaagca actcgtgatg ctcttgacaa agatgggtgg cttcatactg gggatcttgg    60
atattacgac gaaga                                                     75
<210>43
<211>73
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>43
gacagattta tctatgtagt tgatcgattg aaagagctta ttaaatataa aggatatcag    60
gttgcgcctg ctg                                                       73
<210>44
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>44
atttatctat gtagttgatc gattgaaaga actcatcaaa tataaaggat atcaggttgc    60
gcctgctgaa ctggaaa                                                   77
<210>45
<211>75
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>45
cgcctgctga actggaaaat ctgcttttac aacacccaaa tatttctgat gcgggtgtta    60
ttggaattcc ggacg                                                     75
<210>46
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>46
ctgaactgga aaatctgctt ttacaacatc ctaatatttc tgatgcgggt gttattggaa    60
ttccggacga atttgct                                                   77
<210>47
<211>75
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>47
ttacaacatc caaatatttc tgatgcgggt gtcattggaa ttccggacga atttgctggt    60
caattacctt ccgcg                                                     75
<210>48
<211>77
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>48
tgcgggtgtt attggaattc cggacgaatt tgctggtcag ttaccttccg cgtgtgttgt    60
gttagagcct ggtaaga                                                   77
<21D>49
<211>73
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>49
aactaaacat cttcgaggcg gtgtcgtatt tatcgacagt attccaaaag gcccaacagg    60
aaaactcatg aga                                                       73
<210>50
<211>48
<212>DNA
<213>Phrixothrix发红光的荧光素酶
<400>50
gaactccgtg caatatttgc ccgggaacag gcaaaatcaa aactataa                 48
<210>51
<211>77
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>51
cccagggacc ccctggacct gggcaccgcc ggcattcagc tctacagagc cctgaccaac    60
ttctccttcc tgaggga                                                   77
<210>52
<211>77
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>52
cctgggcacc gccggcatcc agctgtacag ggccctgacc aacttctcct tcctgaggga    60
ggccctgatc gacgccc                                                   77
<210>53
<211>79
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>53
gtggtgtctt acgccgacat cctggagaac agctgtagac tggctaagtg ctacgagaac    60
tacggcctgc gccagaaca                                                 79
<210>54
<211>79
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>54
gcgccagaac agcgtgatct ccgtgtgcag cgagaatagc accatcttct tctaccccgt    60
gatcgccgcc ctgtacatg                                                 79
<210>55
<211>81
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>55
tcaagaaggt ggtgctgctg gacagcaagg aggatatggg cgaggcccag tgcctgagca    60
acttcatggc ccggtactcc g                                              81
<210>56
<211>81
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>56
tcaagccaag ggacttcgac gccaaggagc aggtggccct tattatgtcc tcctctggca    60
ccaccggcct gccaaagggc g                                              81
<210>57
<211>75
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>57
atcgagaagt acagaatccc aacaatcgtg ctggcccctc ctgtgatggt gttcctggcc    60
aagagccccc tggtg                                                     75
<210>58
<211>79
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>58
atcccaacaa tcgtgctggc cccccccgtg atggtgttcc tggctaagag ccccctggtg    60
gaccagtacg acctgtcca                                                 79
<210>59
<211>75
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>59
gagaggtggc caccggcggc gcccctgtgg gcaccgaggt tgccgtggcc gtggccaagc    60
ggctgaagat cggcg                                                     75
<210>60
<211>75
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>60
gccatcgaca aggagggctg gctgcactcc ggcgacgtgg gatactacga cgacgatggc    60
cacttcttcg tggtg                                                     75
<210>61
<211>73
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>61
ctccggcgac gtgggctact acgacgacga tggacatttc ttcgtggtgg accggctgaa    60
ggagctgatc aag                                                       73
<210>62
<211>81
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>62
cgacgatggc cacttcttcg tggtggaccg gctgaaagag ctgatcaagt acaagggcta    60
ccaggtggcc cccgccgagc t                                              81
<210>63
<211>71
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>63
agtggctgct gctccagcac ccatccatca aggatgccgg cgtgaccggc gtgcccgacg    60
aggccgccgg c                                                         71
<210>64
<211>75
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>64
ccgagcagga gatcatcgac tacatcgccg agcgagtgtc tcccaccaag cgcatccggg    60
gcggcgtcgt cttcg                                                     75
<210>65
<211>71
<212>DNA
<213>大场雌光萤发绿光的荧光素酶
<400>65
gagcgggtgt cccccaccaa gcgcatccgg ggcggagtcg tcttcgtgga cgacatcccc    60
aagggcgcca c                                                         71

Claims (6)

1.基因构建体，其中引入了编码能在哺乳动物细胞中稳定表达的三种荧光素酶即来自铁路蠕虫的发红光的荧光素酶、来自大场雌光萤的发绿光的荧光素酶及发橙光的荧光素酶的基因，所述基因在不同启动子控制下引入，
所述基因构建体含有Kozak序列作为促进翻译效率的元件并含有β-珠蛋白内含子II作为稳定mRNA的元件，
所述基因构建体能够在将所述基因引入哺乳动物细胞时测定这三种萤光素酶中每一种所发出的光。
2.表达载体，包含根据权利要求1的基因构建体。
3.哺乳动物细胞，转化有根据权利要求1的基因构建体或者根据权利要求2的表达载体。
4.根据权利要求3的哺乳动物细胞，其中一种荧光素酶基因受恒定表达启动子控制，另一种荧光素酶基因受毒性评价启动子控制，其余的一种荧光素酶基因受待评价启动子控制。
5.根据权利要求3的哺乳动物细胞，其中一种荧光素酶基因受恒定表达启动子控制，另一种荧光素酶基因受假启动子控制，其余的一种荧光素酶基因受待评价启动子控制。
6.一种药物筛选方法，包括在哺乳动物细胞培养基中、在药物候选化合物的存在下培养根据权利要求4或5的哺乳动物细胞的步骤，在存在或缺少该候选化合物的条件下对上述荧光素酶进行定量的步骤，和评价该候选化合物对与至少一种荧光素酶相连的待评价启动子的作用的步骤。
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