JP2006271300A - Ｔプラスミドベクター - Google Patents

Abstract

【課題】塩基配列によらず、標的核酸配列をレポーター遺伝子に連結可能なプラスミドベクターに関し、さらには、前記プラスミドベクターを含むことを特徴とするキットを提供する。
【解決手段】プロモーター活性の測定に用いるレポーター遺伝子として発光甲虫に由来する赤色発光酵素遺伝子を含むプラスミドベクターをTプラスミドベクターへと改変する。さらに、前記Tプラスミドベクターを含むことを特徴とするTAクローニングキットを構築する。
【選択図】なし

Description

本発明は、発光甲虫由来の赤色発光酵素遺伝子を含むことを特徴とするTプラスミドベクターに関する。さらに詳しくは、前記Tプラスミドベクターを含むことを特徴とするTAクローニングキットに関する。

遺伝子発現制御機能を解析する手法として、レポーター遺伝子に連結されたシス作用性塩基配列要素（プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列或いはその候補）を含むベクターを適当な細胞に導入して、ある条件下において発現されるレポーター酵素の活性測定を行うレポーターアッセイが挙げられる。これまで、レポーター遺伝子として、大腸菌chloramphenicol acethyltransferase(CAT)、ヒトgrowth hormone、alkaline phosphatase、ホタル（Photinus Pyralis）ｌuciferase、大腸菌β-galactosidase、蛍光タンパク質（GFP）などが用いられてきたが、これらの中でluciferase遺伝子の発光を利用したシステムは感度が高く活性測定が簡便なことから、現在特に用いられている。

レポーターアッセイのサンプル間には、トランスフェクション効率、細胞死、細胞等によるバラツキなど、レポーターの発現量差をもたらす意図されていない要因が存在する。そのため、試験配列に連結されたレポーター遺伝子とあわせて、コントロールプロモーターに連結された基質特異性（反応性）の異なるレポーター分子を内部標準としてサンプル間を標準化する必要がある。このような場合を含め、2つ以上の遺伝子発現を同時に測定するには、上記の遺伝子を併用する、あるいは異なった基質特異性を示すウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase）を用いるなどの手段がとられて来た。

前記方法では、サンプル間を第２の内部標準用のレポータータンパク質活性で標準化し、サンプル間の第１のレポータータンパク質の活性を比較することによって、第１のレポーター遺伝子に連結されたシス作用性塩基配列要素の活性を解析する。しかしながら、このような比較では、複数のプロモーター活性の動態比較は間接的である。さらに、この比較の間には、実験操作のバラツキなどによる、擬陽性、擬陰性を含んでしまう可能性がある。

本発明者らは、特許文献1において、前記問題を克服した複数の標的核酸配列をより直接的に、かつ同時に比較解析するレポーターアッセイシステムとして、鉄道虫由来の赤色発光たんぱく質、イリオモテボタル由来の緑、橙色発光タンパク質を用いて、３つのプロモーター活性を同時に測定する方法を開示している。

遺伝子発現制御配列をレポーター遺伝子に連結する方法としては、制限酵素を用いたクローニングが用いられてきた。この方法を実施するためには、機能を調べたい核酸配列（標的核酸配列）の両端にプラスミドベクター中のマルチクローニング部位に存在する制限酵素認識配列と一致する配列が存在し、かつ核酸配列中には、同じ制限酵素認識配列が存在しないことが好ましい。標的核酸配列中に適当な制限酵素配列が存在しない場合には、5‘端側に制限酵素認識配列を付加したプライマーを用いたPCR（Polymerase Chain Reaction）による制限酵素認識配列の付加が必要である。また、標的核酸配列中に不要な制限酵素認識部位が存在する場合は、部位特異的変異導入法などによる不要な制限酵素認識配列の消去が必要となるが、このような操作が標的核酸配列のプロモーター活性に影響を与える可能性もあり、好ましくない。特に、塩基配列が十分に分かっていない、あるいは周辺配列がよく分からない核酸配列を標的とする場合、クローニングに使用する制限酵素を決定し、クローニングを行う際に、このような問題が生じやすい。また、複数の配列をクローニングしたい場合、あるいは精査することを目的としてクローニングを行いたい場合などにも、同様の問題が生じ、多大な労力および時間を要していた。
WO2004/099421 Viviani V., Uchida, A., Suenaga, N., Ryufuku, M., and Ohmiya, Y.;Thr226 Is a Key Residue for Bioluminescene Spectra Determination in Beetle Luciferase.;Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001;280, 1286-1291 Arashi-Heese, N., Miwa, M., and Shibata, H.;XcmI Site-Containing Vector for Direct Cloning and In Vitro Transcription of PCR Product.;Molecular Biotechnology 1999;12, 281-283 Zhou MY.,Gomez-Sanchez C.;Universal TA Cloning.;Curr. Issues Mol. Biol. 2000;2(1), 1-7

本発明の目的は標的核酸配列を、その塩基配列によらずレポーター遺伝子に連結可能なプラスミドベクターを提供することである。さらには、本発明をより簡便に実施するためのキットを提供することである。

本発明者らは、プロモーター活性の測定に用いるレポーター遺伝子を含むプラスミドベクターをTプラスミドベクターへと改変することにより、課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明は以下のような構成から成る。
項１．発光甲虫に由来する最大発光波長600nm以上を有する赤色発光酵素遺伝子を含むことを特徴とするTプラスミドベクター。
項２．発光甲虫が鉄道虫である項１に記載のTプラスミドベクター。
項３．項１に記載のTプラスミドベクターを含むことを特徴とするTAクローニングキット。

本発明を用いることにより、標的核酸配列をその塩基配列によらず、簡便にレポーター遺伝子に連結することが可能となる。また、より迅速及び／または多数の核酸配列を連結することが可能となる。さらに、前記Tプラスミドベクターを含むTAクローニングキットを構築することにより、一層の簡便化を実現した。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明は標的核酸配列を、その塩基配列によらずレポーター遺伝子に連結可能なプラスミドベクターである。具体的には、そのマルチクローニング部位の中に、3’端にデオキシチミン（dT）1塩基の突出末端を有するTプラスミドベクターである。

Tプラスミドベクターに含まれるレポーター遺伝子としては、発光甲虫由来の赤色発光酵素遺伝子を用いる。前記発光酵素は最大発光波長600nm以上、好ましくは620nm以上を有するルシフェラーゼであることが好ましい。発光甲虫由来のルシフェラーゼとしては、ホタル科、ホタルモドキ科、コメツキ科、ヒカリコメツキ科、イリオモテボタル科が挙げられる。中でも、ホタルモドキ科鉄道虫、とりわけPhrixothrix hirtus由来の赤色発光ルシフェラーゼが好ましい。前記ルシフェラーゼは現在までに見つかっている赤色ルシフェラーゼの中では最長の630nm付近に最大発光波長を有し、発光スペクトルはpHに対して安定である（非特許文献1）。

本発明のTプラスミドベクター及びTAクローニングキットは、標的遺伝子を最大発光波長600nm以上を有する赤色発光酵素遺伝子に連結し、標的遺伝子の機能を調べるために使用される。

標的遺伝子としては、シス作用性塩基配列要素（プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列或いはその候補）が好ましく例示される。また、機能が不明な核酸配列を標的核酸配列としてクローニングし、遺伝子発現制御機能の解析することもできる。

標的核酸配列を得るために用いられる一般的な方法として、哺乳類またはウィルスのゲノムDNA、RNA、ライブラリーなどを鋳型としたPCR（Polymerase Chain Reaction）法が挙げられる。PCR法は試験管内で特定のDNA断片を指数関数的に増幅させることができる方法であり、耐熱性DNAポリメラーゼを用いることで可能となる。

代表的な耐熱性DNAポリメラーゼであるPolI型DNAポリメラーゼ、または、これを含む混合型DNAポリメラーゼを用いてPCR増幅されたDNA断片の多くは3’端にデオキシアデニン（dA）の突出を持つという特徴がある。DNA断片を挿入したいプラスミドベクターの3’端にdTの突出を作り、Tプラスミドベクター化することで、dAとdTの相補性を利用したクローニングが可能となる。この方法をTAクローニング法と言い、核酸配列のクローニング法として広く用いられている。

Tプラスミドベクター化の方法としては、XcmI、MboII、HphI、MnlI、AhdI、Eam1105Iなどの3’端に1塩基突出末端作製可能な制限酵素を用いて、3’dT突出末端を作製する方法（非特許文献2）と、AluI、DpnI、RsaI、AfeI、DraI、EcoRV、HaeIIIなどの平滑末端を作製可能な制限酵素で処理した後、Taq DNAポリメラーゼ、あるいはターミナルデオキシトランスフェラーゼのようなDNA断片の3’端へ塩基を付加する活性を有する酵素を用いて、3’dT突出末端を作製する方法が挙げられる（非特許文献3）。

PolI型DNAポリメラーゼとともに汎用されているα型DNAポリメラーゼによってPCR増幅されたDNA断片は3’端にdA突出を持たないが、3’端にdAの突出を作製する処理を行うことでTAクローニング法によるクローニングは可能となる。

α型DNAポリメラーゼによりPCR増幅されたDNA断片の3’端にdA突出を作製する方法としては、Taq DNAポリメラーゼ、あるいはターミナルデオキシトランスフェラーゼのような核酸配列の3’端へ塩基を付加する活性を有する酵素で処理する方法が挙げられる。

本発明は、キットの形態であってもよい。具体的には、Tプラスミドベクター、前記プラスミドベクターのdTと標的核酸配列のdAを連結する酵素であるT4 DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼによる連結反応（ライゲーション反応）に適した組成の緩衝液を含むキットである。さらに、前記キットには、α型DNAポリメラーゼによってPCR増幅されたDNA断片の3’端にdAを付加する物質（Taq DNAポリメラーゼ、あるいはターミナルデオキシトランスフェラーゼなど）が含まれていてもよい。

本発明を用いて薬剤応答遺伝子などをクローニングすることで、レポーターアッセイによる薬剤スクリーニング、未知試料中の刺激因子の存在の有無の検査などへの利用が可能である。また、ゲノム研究により、ヒトをはじめとする生物のゲノム配列が明らかとなり、未知の遺伝子が取得可能となってきているが、これらの遺伝子の機能を解析することで細胞内情報伝達などに関する知見が得られる可能性は高い。本発明を用いれば、最小限の労力と時間で、多数の未知遺伝子がクローニング可能であるだけでなく、その配列を精査することも可能である。

解析した結果は、創薬などに利用されうる。

以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
実施例 Histone H3.3Bプロモーターのクローニング
ヒトゲノムDNA 80 ngを鋳型として、オリゴヌクレオチド1、2（PRORIGO）（配列番号1、2）を用いて、Histone H3.3Bプロモーターを5% DMSO存在下でrTaq DNAポリメラーゼ（東洋紡績）によりPCR増幅した。SLR TA Cloning Kit（東洋紡績）を用いて、24℃、30分間ライゲーション反応を行い、増幅断片と赤色発光ルシフェラーゼを有するTプラスミドベクターpSLR-Tを連結した(pSLR-H3.3B)。

薬剤応答遺伝子などをクローニングすることでレポーターアッセイによる薬剤スクリーニング、未知試料中の刺激因子の存在の有無の検査などへの利用が可能である。また、本発明はハイスループットシステムの適用が可能であり、創薬などの産業界に寄与することが大である。

Claims (3)

1. 発光甲虫に由来する最大発光波長600nm以上を有する赤色発光酵素遺伝子を含むことを特徴とするTプラスミドベクター。
2. 発光甲虫が鉄道虫である請求項１に記載のTプラスミドベクター。
3. 請求項１に記載のTプラスミドベクターを含むことを特徴とするTAクローニングキット。