JPWO2006088165A1 - 遺伝子検出用試薬及びその利用 - Google Patents

Abstract

標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備える遺伝子検出用試薬であって、前記標的核酸とのハイブリダイズにより高次構造変化が誘起され、レポータータンパク質への翻訳が開始されることを特徴とする遺伝子検出用試薬。被験試料とこの遺伝子検出用試薬とを混合し、レポータータンパク質の発現量を被験試料が存在しない場合と比較することにより、被験試料中の標的核酸を検出する。

Description

本発明は、外来遺伝子の存在や遺伝子の構造異常の検査に用いられる遺伝子検出用試薬、及びキット、並びに遺伝子検出方法に関する。

遺伝子検査は、自己に存在しない外来遺伝子の存在を検査するものと、遺伝子の構造異常を解析するものとに分けられる。外来遺伝子の存在を検査する場合として、培養困難な微生物の同定検査、抗生物質加療中や感染初期の病原微生物の検出などが挙げられる。また、遺伝子構造異常の検査として、遺伝病の確定診断のための検査や遺伝病の予測検査、表現型には影響しないＤＮＡ多型の検査（親子鑑定や法医学鑑定）などが挙げられる。

従来は、目的遺伝子を増幅できるＰＣＲプライマーを用いて被験試料についてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をシークエンスする方法により、その遺伝子の存在や突然変異などを検出していた。

近年、細胞から遺伝子を抽出することなく、細胞そのままの状態で遺伝子診断することができる試薬が提案されており、その代表例としてモレキュラービーコン(molecular beacon)が挙げられる。このような試薬として、例えば、標的配列に相補的なループ部分とその両端に存在するステム形成配列とからなるオリゴヌクレオチドであって、一端に蛍光色素が結合し、他端に消光剤が結合したものが提案されている（非特許文献１）。
この試薬は、標的核酸とハイブリダイズしていない状態で、光照射すると、両端の蛍光色素と消光剤とが近接しているため、蛍光色素が発する蛍光が消光剤にエネルギー移動して蛍光を発せず、又は本来の蛍光とは異なる波長の光を発する。一方、標的核酸がループ部分にハイブリダイズすると、ループ部分が２本鎖になり剛直になるためステム形成部分が解離する。これにより蛍光色素と消光剤とが離れるため、蛍光物質本来の蛍光を発するようになる。従って、蛍光強度又は波長を検出することにより、標的配列が存在するか否かを検出することができる。同文献のモレキュラービーコンによる標的配列の検出の様子を図８に示す。

しかし、この方法は、モレキュラービーコンに結合した蛍光色素が発する光をそのまま検出するため、モレキュラービーコンを大量に使用しない限り検出感度が低い。

また、ループに標的核酸がハイブリダイズしたか否かを検出するために、蛍光色素と消光剤との組み合わせに加えて、ＤＮＡザイム／リボザイムを用いるモレキュラービーコンも提案されている（非特許文献２）。図９にこのモレキュラービーコンを用いた標的核酸の検出方法を示す。ＤＮＡザイムは、２価金属イオンと結合した触媒活性を示すループ部分の両側に標的核酸配列と相補的な２つの領域を存在させたものであり、この２つの領域で標的核酸とハイブリダイズしてループ部分でそれを切断すると考えられている。同文献に記載のモレキュラービーコンは、このようなＤＮＡザイムの一方の標的結合領域を利用してステム−ループ構造を形成したものである。ループ部分は標的核酸配列と相補的な配列を有する。

この分子は、標的核酸の非存在下ではステム−ループ構造を形成しているため、ＤＮＡザイムがその標的核酸に結合できず、切断活性は発現しない。一方、ループ領域に標的核酸がハイブリダイズするとループが開き、ＤＮＡザイムがその標的核酸に結合して切断活性が発現する。この切断活性を検出することにより、ループ部分にハイブリダイズできる配列の存否を確認することができる。

しかし、この方法も、モレキュラービーコン分子自体の切断活性を検出するため、検出感度が低い。

検出感度の高いモレキュラービーコンとして、非特許文献３は、酵素に１本鎖ＤＮＡ断片を介してこの酵素に対するインヒビターを結合したものを報告している。このモレキュラービーコンは、１本鎖ＤＮＡ断片中に標的核酸配列と相補的な配列を含むものであり、標的核酸が存在しないときは１本鎖ＤＮＡ断片が柔軟であるためインヒビターが酵素の相互作用部位と結合しているが、標的核酸とＤＮＡ断片とがハイブリダイズするとその部分が剛直になって伸びるためインヒビターが酵素から外れて酵素活性が発現する。このモレキュラービーコンは、酵素による基質の変換を検出するため、その分検出感度が高くなる。

しかし、この分子は、酵素タンパク質と核酸と低分子化合物という異質な物質を結合させる手間を要し、コスト高になる。

なお、特許文献１は、リボレギュレーターと呼ばれるＲＮＡを用いて特定遺伝子の翻訳開始のオン・オフを調節して特定タンパク質の発現をコントロールし、生体内でのそのタンパク質の機能を解明する方法を教えている。同文献のリボレギュレーターは、リボソーム結合領域（ＲＢＳ）、開始コドン、及び緑色蛍光タンパク質コード領域を含み、ＲＢＳの上流に「シスリプレッシブＲＮＡ」領域を有するｍＲＮＡ分子である。
シスリプレッシブＲＮＡ領域は、分子内でＲＢＳとハイブリダイズできる配列からなり、通常はこの領域とＲＢＳとがハイブリダイズしているため、リボソームはＲＢＳに結合せず緑色蛍光タンパク質への翻訳は行われない。さらに、シスリプレッシブＲＮＡ領域に相補的な領域を有する「トランスアクティベーティングＲＮＡ」をシスリプレッシブＲＮＡにハイブリダイズさせることにより、シスリプレッシブＲＮＡとＲＢＳとが解離し、緑色蛍光タンパク質への翻訳が行われる。

同文献の方法では、トランスアクティベーティングＲＮＡがリボソーム結合領域と略同じ配列でなければならない。従って、このリボレギュレーターは、任意の塩基配列の存在を検出できるものではない。
Tyagi, S.; Kramer, F. R. Nat. Biotechnol. 1996, 14, 303. Stojanovic MN. et al. ChemBioChem 2001, 2, 411 Saghatelian, A. et al. J. Am. Chem. Soc. 2003、125、344. ＷＯ２００４／０４６３２１号公報

本発明は、核酸からなる高感度な遺伝子検出用試薬、この試薬を含むキット、核酸を用いて標的遺伝子の有無を高感度に検出することができる方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(i) 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備え、標的核酸とそれに相補的な領域とのハイブリダイズにより誘起される高次構造変化がレポータータンパク質への翻訳を開始させるようなＲＮＡは、レポータータンパク質の発現を検出することにより、標的核酸を検出することができ、遺伝子検出用試薬として使用できる。
(ii) 例えば、上流より順に、リボソーム結合領域（以下、「ＲＢＳ」ということもある）、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備え、リボソーム結合領域の上流に、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域（Ａ）を介して、リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域（Ｂ）を備えるＲＮＡは、標的核酸の非存在下では、領域（Ｂ）とＲＢＳとがハイブリダイズして、領域（Ａ）をループとするループ−ステム構造を採る。また、標的核酸の存在下では、標的核酸と領域（Ａ）とがハイブリダイズすることによりこの領域が剛直になってループが伸び、その結果、ＲＢＳと領域（Ｂ）とが解離する。これにより、ＲＢＳにリボソームが結合できるようになり、レポーター遺伝子の翻訳が開始される。

この現象を利用して、レポーター遺伝子の発現の有無を検出することにより、被験試料中の標的核酸の有無や一塩基多型を判定することができる。

本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の遺伝子検出用試薬、遺伝子検出用キット、及び遺伝子検出方法を提供する。

項１． 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備える遺伝子検出用試薬であって、前記標的核酸とのハイブリダイズにより高次構造変化が誘起され、レポータータンパク質への翻訳が開始される遺伝子検出用試薬。

項２． 少なくとも、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域がＲＮＡである項１に記載の遺伝子検出用試薬。

項３． リボソーム結合領域にリボソームが結合できない状態にあり、標的核酸とハイブリダイズできる領域と標的核酸とのハイブリダイズにより誘起される高次構造変化がリボソーム結合領域へのリボソームの結合を可能にしてレポータータンパク質への翻訳を開始させるものである項２に記載の遺伝子検出用試薬。

項４． 上流より順に、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備え、リボソーム結合領域のさらに上流に、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域を介して、リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域を備えるものである項３に記載の遺伝子検出用試薬。

項５． リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域の塩基数に対する、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域の塩基数の比率が１〜１０である項４に記載の遺伝子検出用試薬。

項６． リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域が５〜３０塩基からなり、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域が５〜６０塩基からなる項４に記載の遺伝子検出用試薬。

項７． 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域が、標的核酸配列と相補的な領域である項１に記載の遺伝子検出用試薬。

項８． 標的核酸とハイブリダイズした場合に自己切断するリボザイムとして機能する領域を含むものである項１に記載の遺伝子検出用試薬。

項９． レポータータンパク質が酵素である項１に記載の遺伝子検出用試薬。

項１０． 前記酵素が可視光を発生する物質の生産に関与するものである項９に記載の遺伝子検出用試薬。

項１１． 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備え、標的核酸とのハイブリダイズにより誘起される高次構造変化がレポータータンパク質への翻訳を開始させるＲＮＡに転写され得るＤＮＡを含む遺伝子検出用試薬。

項１２． 前記ＲＮＡが、リボソーム結合領域にリボソームが結合できない状態にあり、標的核酸とハイブリダイズできる領域と標的核酸とのハイブリダイズにより誘起される高次構造変化がリボソーム結合領域へのリボソームの結合を可能にしてレポータータンパク質への翻訳を開始させるものである項１１に記載の遺伝子検出用試薬。

項１３． 前記ＲＮＡが、上流より順に、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備え、リボソーム結合領域のさらに上流に、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域を介して、リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域を備えるものである項１２に記載の遺伝子検出用試薬。

項１４． リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域の塩基数に対する、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域の塩基数の比率が１〜１０である項１３に記載の遺伝子検出用試薬。

項１５． リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域が５〜３０塩基からなり、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域が５〜６０塩基からなる項１３に記載の遺伝子検出用試薬。

項１６． 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域が、標的核酸配列と相補的な領域である項１１に記載の遺伝子検出用試薬。

項１７． 前記ＲＮＡが、標的核酸とハイブリダイズした場合に自己切断するリボザイムとして機能する領域を含むものである項１１に記載の遺伝子検出用試薬。

項１８． レポータータンパク質が酵素である項１１に記載の遺伝子検出用試薬。

項１９． 前記酵素が可視光を発生する物質の生産に関与するものである項１８に記載の遺伝子検出用試薬。

項２０． 項１に記載の遺伝子検出用試薬を備える遺伝子検出用キット。

項２１． さらに、原核細胞抽出液を備える項２０に記載の遺伝子検出用キット。

項２２． さらに、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素を備える項２０に記載の遺伝子検出用キット。

項２３． 項１１に記載の遺伝子検出用試薬を備える遺伝子検出用キット。

項２４． さらに、原核細胞抽出液を備える項２３に記載の遺伝子検出用キット。

項２５． さらに、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素を備える項２３に記載の遺伝子検出用キット。

項２６． 被験試料と項１に記載の遺伝子検出用試薬とを混合する第１工程と、遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量を、被験試料の非存在下での項１に記載の遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量と比較することにより、被験試料中の標的核酸の有無を判定する第２工程とを含む遺伝子検出方法。

項２７． 遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現を原核細胞抽出液の存在下で行う項２６に記載の方法。

項２８． 第１工程において、被験試料と、項１に記載の遺伝子検出用試薬と、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素とを混合する工程を含む項２６に記載の方法。

項２９． 被験試料と項１１に記載の遺伝子検出用試薬とを混合する第１工程と、遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量を、被験試料の非存在下での項１１に記載の遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量と比較することにより、被験試料中の標的核酸の有無を判定する第２工程とを含む遺伝子検出方法。

項３０． 遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現を原核細胞抽出液の存在下で行う項２９に記載の方法。

項３１． 第１工程において、被験試料と、項１に記載の遺伝子検出用試薬と、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素とを混合する工程を含む項２９に記載の方法。

項３２． 被験試料と、項１に記載の遺伝子検出用試薬と、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素とを混合する第１工程と、遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量を、被験試料の非存在下での項１に記載の遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量と比較することにより、被験試料中の標的核酸の有無を判定する第２工程とを含む１塩基多型の検出方法。

項３３． 被験試料と、項１１に記載の遺伝子検出用試薬と、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素とを混合する第１工程と、遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量を、被験試料の非存在下での項１１に記載の遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量と比較することにより、被験試料中の標的核酸の有無を判定する第２工程とを含む１塩基多型の検出方法。

項３４． 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備える核酸であって、前記標的核酸とのハイブリダイズにより高次構造変化が誘起され、レポータータンパク質への翻訳が開始される核酸の遺伝子検出用試薬としての使用。

項３５． 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備えるＲＮＡであり、標的核酸とのハイブリダイズにより誘起される高次構造変化がレポータータンパク質への翻訳を開始させるＲＮＡに転写され得るＤＮＡの遺伝子検出用試薬としての使用。

本発明の第１の試薬であるＲＮＡからなる遺伝子検出用試薬によれば、被験試料中の標的核酸の存否が、レポータータンパク質をコードするＲＮＡからレポータータンパク質への翻訳の有無として現れる。この翻訳により１分子のＲＮＡから例えば複数分子のレポータータンパク質が生産可能になるため、蛍光等の検出シグナルを増幅でき、検出感度の向上を図ることができる。このため、本発明の試薬を用いる場合は、被験試料中の核酸をＰＣＲなどで予め増幅することを必ずしも要さず、細胞溶解液などを直接被験試料として用いることができる。

また、本発明の第２の試薬であるＤＮＡからなる遺伝子検出用試薬によれば、ＤＮＡからＲＮＡへの転写課程が加わり、ＤＮＡ１分子から複数分子のＲＮＡが生成する。また、ＤＮＡは非常に安定であるため、試薬として使い易いものとなる。

さらに、レポータータンパク質として、例えばルシフェラーゼやβ−ガラクトシダーゼのような酵素を用いる場合は、１分子の酵素から複数分子の基質が変換されるため、より一層検出感度が高くなる。

また、本発明の遺伝子検出用試薬とともに、ＤＮＡとハイブリダイズしたＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素を用いる場合は、本発明の第１の試薬であるＲＮＡ又は第２の試薬であるＤＮＡの転写産物ＲＮＡと標的核酸（通常はＤＮＡ）とがハイブリダイズすると、試薬側のＲＮＡ鎖が切断され、標的核酸から乖離する。標的核酸はさらに別のＲＮＡ分子と結合することができ、同様に酵素の作用で試薬ＲＮＡの切断、及び標的核酸からの乖離のサイクルを形成する。このようにして、１分子の標的核酸が次々に本発明試薬とハイブリダイズすることにより、レポーター遺伝子の発現を増幅させることができる。このため、検出感度が一層向上し、標的核酸がフェムトモルオーダーしか存在しない場合でも、標的核酸をＰＣＲ等で増幅させることなく遺伝子検出を行うことができる。

ここで、本発明の試薬においては、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域が長くなるほど塩基配列選択性が低下し、即ちミスマッチが存在する場合に検出可能なそのミスマッチ塩基数が少なくなる。一方、試薬ＲＮＡ分子において、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域を短くする場合は、高次構造変化を引き起こす力が弱くなるため、その分、ハイブリダイズによる高次構造変化を起こし易い構造にする必要がある。この場合は、非特異的なＲＮＡ分子の高次構造変化が生じ易くなる。従って、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域を短くする場合は、ハイブリダイズによる高次構造変化を起こし易くするために、例えば、リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域の長さをその分短くする必要がある。この場合、非特異的にリボソームがリボソーム結合領域と結合してレポーター遺伝子の発現が生じ易くなる。

このような状況の下で、本発明の試薬と共に、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖のＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素を用いる場合は、標的核酸が試薬ＲＮＡ分子と結合するとＲＮＡ分解酵素がこのＲＮＡ分子を切断して強制的に高次構造変化を起こさせる。即ち、リボソーム結合領域や開始コドンがそれに相補的な配列とハイブリダイズしている状態が解消される。このため、試薬ＲＮＡ分子の標的核酸配列とハイブリダイズできる領域の長さが短く、かつ高次構造変化を起こし難い分子構造としても（例えばリボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域を長くしても）、ハイブリダイズにより一層確実に高次構造変化が起こるようになる。これにより、標的核酸と標的核酸とハイブリダイズできる領域との間の１塩基のミスマッチでも一層確実に検出できるようになり、即ち１塩基多型の検出が可能になる。また、完全にマッチする塩基対のみを切断するというＲＮＡ分解酵素の性質によっても、１塩基ミスマッチの選択性が上昇する。

また、試薬ＲＮＡ自体が、標的核酸とハイブリダイズした場合に自己切断する能力を有するリボザイムである場合も、上記ＲＮＡ分解酵素を使用する場合と同様の効果が得られる。

本発明試薬を用いたこのような遺伝子検出は、「触媒的遺伝子検出」と称することができる。

また、本発明の遺伝子検出用試薬は、蛍光物質や酵素インヒビターのような合成化合物を含まず、核酸のみから構成されるため、製造が簡単である。また、使用に当たり、細胞抽出液を用いるだけでよい。また、生体由来材料だけを用いて製造、及び使用できるため、将来的な生体への適用可能性が広がる。

実施例１で構築したＭＢ−ルシフェラーゼｍＲＮＡの構造を示す図である。 ＭＢ−ルシフェラーゼｍＲＮＡを鋳型とした場合の、フルマッチオリゴデオキシヌクレオチド、及びミスマッチオリゴデオキシヌクレオチドの存在下での化学発光強度を、こられのターゲットが存在しない場合の化学発光強度に対する相対値で表したグラフである。 ＭＢ−ルシフェラーゼ発現ｄｓＤＮＡを鋳型とした場合の、フルマッチオリゴデオキシヌクレオチド、及びミスマッチオリゴデオキシヌクレオチドの存在下での化学発光強度を、これらのターゲットが存在しない場合の化学発光強度に対する相対値で表したグラフである。 ＭＢ−ルシフェラーゼ発現ｄｓＤＮＡを鋳型とした場合の、フルマッチオリゴデオキシヌクレオチド、及びミスマッチオリゴデオキシヌクレオチドの存在下での各反応混合物の化学発光像をＶｅｒｓａｄｏｃ３０００で測定したものである。 フルマッチオリゴデオキシヌクレオチドの存在下及びターゲットの非存在下で、鋳型ＭＢ−ルシフェラーゼＤＮＡをリボソーム、及びｔＲＮＡを含まないセルフリー転写／翻訳システムを用いて転写したときの蛍光像をＡＴＴＯデンシトグラフで測定したものである。 ターゲット量に対する化学発光強度の関係を示すグラフである。 ＭＢ−ルシフェラーゼｍＲＮＡを鋳型とした場合の、フルマッチオリゴデオキシヌクレオチド、及び１塩基ＧＴミスマッチオリゴデオキシヌクレオチドの存在下での化学発光強度を、ターゲットが存在しない場合の化学発光強度に対する相対値で表したグラフである。また、ＲＮａｓｅＨの使用による効果を示すグラフである。 ＭＢ−ルシフェラーゼｍＲＮＡを鋳型とした場合の、フルマッチオリゴデオキシヌクレオチドの存在下での化学発光強度を、ターゲットが存在しない場合の化学発光強度に対する相対値で表したグラフである。また、ＲＮａｓｅＨの使用による効果を示すグラフである。 図（Ａ）は、ＭＢ−β−ガラクトシダーゼｄｓＲＮＡを鋳型とした場合の、フルマッチオリゴデオキシヌクレオチドの存在下でのニトロフェノールによる吸光度を、ターゲットが存在しない場合の吸光度に対する相対値で表したグラフである。また、ＲＮａｓｅＨの使用による効果を示すグラフである。図（Ｂ）は、β−ガラクトシダーゼｄｓＤＮＡを鋳型とした場合のニトロフェノールによる発色を目視観察した結果である。 従来のモレキュラービーコンの１例を用いた遺伝子検出を説明する図である。 従来のモレキュラービーコンの他の例を用いた遺伝子検出を説明する図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）遺伝子検出用試薬
ＲＮＡからなる試薬
本発明の第１の遺伝子検出用試薬は、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備え、標的核酸とのハイブリダイズにより誘起される高次構造変化がレポータータンパク質への翻訳を開始させる試薬である。

この試薬は、少なくともリボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域がＲＮＡからなっていればよい。それ以外の部分は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は人工核酸等のいずれの核酸配列であってもよい。人工核酸としては、ペプチド核酸(PNA;Peptide Nucleic Acid)、LNA(Locked Nucleic Acid)等が挙げられる。

この試薬の構造は、標的核酸とハイブリダイズできる領域に標的核酸が結合することにより、翻訳開始に必要な因子がこの試薬に結合できるようになる構造であれば良い。このような構造として、標的核酸にハイブリダイズできる領域をループとし、その両側に存在する２領域が塩基対形成によりステムを形成しているようなヘアピン構造が挙げられる。ステムを形成する２領域としては、例えば、リボソーム結合領域及びそれを含む領域とハイブリダイズできる領域、開始コドン及びそれを含む領域とハイブリダイズできる領域などが挙げられる。

このようなヘアピン構造を有することにより、通常は、リボソーム結合領域や開始コドン等が２本鎖状態であるため、翻訳に必要な因子が結合することができず、レポータータンパク質への翻訳は実質的に起こらない。さらに、標的核酸とハイブリダイズできる領域に標的核酸が結合すると、このループが剛直になって伸び、その結果ステムの２本鎖の全部又は一部が解消して、翻訳開始に必要な因子がリボソーム結合領域や開始コドン等に結合できるようになり、レポータータンパク質への翻訳が開始する。

リボソーム結合領域と、それを含む領域とハイブリダイズできる領域とが２本鎖のステムを形成するような試薬としては、上流より順に、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備え、リボソーム結合領域のさらに上流に、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域を介して、リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域を備える試薬が挙げられる。この試薬は、通常は、リボソーム結合領域と、この試薬分子中のリボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域とがハイブリダイズしてステムを形成し、その間に存在する標的核酸相補的領域をループとするヘアピン構造を採っている。ここに、標的核酸が存在すると、これが標的核酸相補的領域とハイブリダイズしてループが伸び、リボソーム結合領域が１本鎖状態になる。この高次構造変化により、リボソーム結合領域へのリボソームの結合が可能になってレポータータンパク質への翻訳が開始される。

リボソーム結合領域には、原核細胞で機能するもの、真核細胞で機能するもの、ウィルス由来のものなどが含まれる。原核細胞で機能するリボソーム結合領域は、原核細胞ｍＲＮＡにおいてリボソームが結合できるプリンリッチな配列からなる領域をいい、一般に３〜９塩基程度からなる。原核細胞で機能するリボソーム結合領域はＳＤ配列とも称される。また、真核細胞で機能するリボソーム結合領域としては、例えばコザック配列（５'−ＡＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ−３'）（配列番号１）、リボソーム内部認識部位（ＩＲＥＳ：Internal Ribosome Entry Site）が挙げられる。また、ウィルス由来のリボソーム結合領域としては、例えばリボソーム内部認識部位（ＩＲＥＳ）が挙げられる。ウィルスのＩＲＥＳはウィルスＲＮＡに含まれる配列であり、宿主のリボソームと結合することによりリボソームの立体構造を変化させて、通常はウィルスタンパク質の翻訳を開始させる。本発明の遺伝子検出用試薬では、ウィルスのＩＲＥＳを使用してレポータータンパク質の翻訳を開始させることができる。

リボソーム結合領域と開始コドンとの間に存在する塩基数には制限はないが、好ましくは３〜１２塩基程度離れていればよい。この範囲であれば、リボソームの結合に始まる翻訳開始が効率良く行われる。

開始コドンは、通常ＡＵＧであるが、開始コドンとして機能する限りＧＵＧなどのその他の配列も使用できる。

レポータータンパク質の種類は特に限定されず、公知のレポータータンパク質を制限無く使用できる。公知のレポーター遺伝子としては、例えばルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ（SEAP）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子等が挙げられる。これらのレポーター遺伝子は酵素タンパク質をコードし、酵素反応を利用してその発現を検出するものであるため、その分検出感度が高くなる。レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子のように、その産物自体の信号を検出するものであってもよい。なお、分泌型アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼは、その基質生成物が可視光を発するものが多いため、簡単に酵素活性を検出できる点で好ましい。

ＲＢＳを含む領域とハイブリダイズできる領域は、この分子中のＲＢＳとハイブリダイズできるか、又はＲＢＳとそれに隣接する領域とからなる領域をハイブリダイズできる領域であればよい。ここで、「ハイブリダイズできる」とは、本試薬の使用条件下でハイブリダイズできることをいい、例えば、原核細胞抽出液中で３７℃でインキュベートした後、同溶液中で３７℃で洗浄した場合に、陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることが挙げられる。

特に、この領域とＲＢＳとが相補的であるのが好ましいが、標的核酸検出方法を実施する温度においてハイブリダイズできる限りミスマッチが存在していてもよい。例えば、この方法の実施温度が３７℃であり、ハイブリダイズ領域が１０塩基以上ある場合には１０％以上のミスマッチの存在が可能である。

ＲＢＳとハイブリダイズできる領域の長さは、５〜３０塩基程度が好ましく、８〜１０塩基程度がより好ましい。標的核酸が存在しなくても、この領域とＲＢＳとはハイブリダイズしたり１本鎖になったりしており、平衡状態にある。この領域の長さが上記範囲であれば、このような標的核酸によらない非特異的な２本鎖の解離が生じにくい。また、前述したように、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域は標的核酸非存在下ではループ構造を採っているが、この領域と標的核酸との２本鎖形成によりループが伸びて、それによりステムを形成しているＲＢＳを含む領域とそれにハイブリダイズできる領域との２本鎖状態の全部又は一部が解消する。従って、ＲＢＳを含む領域とハイブリダイズできる領域の長さが上記範囲であれば、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域の長さが長くなりすぎず、両者間のミスマッチを感度良く検出できるものとなる。

標的核酸配列としては、疾患の遺伝子診断のための検出を行う場合はヒトの疾患に関与する遺伝子中の配列が挙げられる。また、親子鑑定や法医学鑑定のための検出を行う場合は遺伝マーカー近傍の配列が挙げられる。また、ヒトに感染した病原微生物の同定や、食品の微生物汚染を検査するための検出を行う場合は、その微生物に固有の染色体配列が挙げられる。

標的核酸配列とハイブリダイズできる領域は、標的核酸配列の全部又は一部にハイブリダイズできればよい。中でも、標的核酸配列と相補的な領域であることが好ましく、これにより１塩基のミスマッチでも検出できるものとなる。相補的であればよい。その長さは、５〜６０塩基程度が好ましく、１４〜２０塩基程度がより好ましい。前述したようにこの領域は標的核酸非存在下ではループ構造を採っているが、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域の長さが上記範囲であれば、標的核酸との２本鎖形成によりループを伸ばしてＲＢＳの２本鎖状態を容易に解消でき、かつ標的核酸との間のミスマッチの検出感度が高くなる。

いずれにしても、ＲＢＳを含む領域の塩基数に対する、標的核酸とハイブリダイズできる領域の塩基数の比率は、１〜１０程度が好ましく、２〜５程度がより好ましい。上記比率範囲であることにより、標的核酸のループ部分への結合により容易にステムを開放することができ、かつ標的核酸配列とハイブリダイズできる領域の長さが適当になってミスマッチの検出感度が高くなる。

標的核酸配列とハイブリダイズできる領域はＲＢＳに隣接していてもよく、これらの間に１〜５塩基程度の任意の配列が存在していてもよい。同様に、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域はＲＢＳを含む領域とハイブリダイズできる領域に隣接していてもよく、これらの間に１〜５塩基程度の任意の配列が存在していてもよい。

また、開始コドンと、それを含む領域とハイブリダイズできる領域とが２本鎖のステムを形成するような試薬としては、上流より順に、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備え、リボソーム結合領域のさらに上流に、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域を介して、開始コドンを含む領域とハイブリダイズできる領域を備える試薬が挙げられる。

この試薬は、標的核酸の存在により開始コドンが１本鎖状態になって、翻訳開始に必要な因子の結合が可能になり、翻訳が開始される。標的核酸とハイブリダイズできる領域と、開始コドンとハイブリダイズできる領域とは隣接していてもよく、これらの間に１〜５塩基程度の任意の配列が存在していてもよい。その他の構成は、リボソーム結合領域を含むステムを有する試薬と同様である。

本発明の第１の試薬分子の大きさの上限は、細胞抽出液を用いてレポータータンパク質への翻訳を行うことができるものである限り特に限定されないが、通常１０００〜２０００塩基程度とすればよい。

この試薬は、標的核酸とハイブリダイズした場合に、自己ＲＮＡ鎖を切断するリボザイムとして機能する領域を含むものであってもよい。自己切断する位置は、ＲＮＡの切断によりレポーター遺伝子の翻訳を開始させるような位置であればよいが、代表的には、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域内の位置が挙げられる。この場合、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域はＲＮＡからなり、この領域がリボザイムとして機能する領域である。このようなＲＮＡとして、例えば、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域をアロステリックエフェクター核酸配列結合部位とする自己切断型ハンマーヘッド型リボザイムやヘアピン型リボザイムになったものが挙げられる。
ＤＮＡからなる試薬
本発明の第２の遺伝子検出用試薬は、上記説明した第１の試薬であってＲＮＡからなるものに転写され得るＤＮＡを含む試薬である。このＤＮＡは通常２本鎖ＤＮＡである。このＤＮＡは、ＲＢＳを含む領域とハイブリダイズできる領域のさらに上流に、転写に必要なプロモーター領域を備えていればよい。

レポーター遺伝子を含むプラスミドが市販されているが、これには、通常プロモーター領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポーター遺伝子が含まれている。従って、この市販のレポータープラスミドのプロモーター領域とリボソーム結合領域との間に、ＲＢＳ又は開始コドンを含む領域とハイブリダイズできる領域、及び標的核酸配列とハイブリダイズできる領域に転写され得るＤＮＡ配列を挿入すればよい。この配列は化学合成することができる。

本発明の第２の試薬は分解され難いＤＮＡを含むため、保存安定性がよい試薬となる。
（ＩＩ）遺伝子検出用キット
本発明の遺伝子検出用キットは、上記説明した本発明の遺伝子検出用試薬を備えるキットである。

また、リボソーム結合領域が原核細胞で機能するものである場合は、原核細胞抽出液を備えていればよい。通常、被験試料中に転写・翻訳に必要な因子が含まれるため、この細胞抽出液によりレポータータンパク質への翻訳、又は転写及び翻訳が行われる。なお、リボソーム結合領域が真核細胞で機能するものやウィルス由来のものである場合は、真核細胞抽出液を利用すればよい。

細胞抽出液は、Zubay法（Zubay, G. Ann. Rev. Genet. 1978, 7, 267）により作製することができるが、市販品を使用してもよい。

また本発明のキットは、さらに、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断する活性を有するＲＮＡ分解酵素を備えていてよい。このＲＮＡ分解酵素は、ＤＮＡとＲＮＡとが完全に相補的である領域でそのＲＮＡを切断するものであることが好ましい。これにより、試薬ＲＮＡの標的核酸配列とハイブリダイズできる領域が標的核酸であるＤＮＡの対応領域と完全に相補的である場合に２本鎖中のＲＮＡを切断する。ＲＮａｓｅＨは非常に高いミスマッチ認識能を有しており、１塩基多型の検出を確実に行えるようになる。このＲＮＡ分解酵素はエンドヌクレアーゼであることが好ましく、これにより、標的核酸とハイブリダイズした試薬ＲＮＡを効率良く切断して、標的核酸を試薬ＲＮＡから乖離させることができる。このようなＲＮＡ分解酵素として、ＲＮａｓｅＨが挙げられる。
（ＩＩＩ）遺伝子検出方法
本発明の遺伝子検出方法は、被験試料と本発明の遺伝子検出用試薬とを混合する第１工程と、遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量を、被験試料の非存在下での本発明の遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量と比較することにより、被験試料中の標的核酸の有無を判定する第２工程とを含む方法である。

遺伝子検出用試薬のリボソーム結合領域が原核細胞で機能するものである場合は、原核細胞抽出液の存在下でレポータータンパク質の発現を行えばよい。

被験試料としては、それには限定されないが、例えば、口腔内の粘膜細胞のような採取された細胞、血液、唾液、毛髪などが挙げられる。また、細菌感染が疑われる食品なども使用できる。

第１工程において、被験試料は、試料中に核酸が露出している場合はそのまま使用すればよいが、通常は、常法に従い細胞を破砕又は溶解してから使用すればよい。また、細胞破砕液又は細胞溶解液に対して標的核酸配列をＰＣＲで増幅してから用いれば一層感度が向上する。

本発明試薬の使用量は、試薬がＲＮＡを含むものである場合は被験試料に対して、モル比で１〜１０倍程度とすればよく、試薬がＤＮＡの場合はモル比で０．０１〜０．１倍程度とすればよい。また、細胞抽出液の使用量は、１被験試料に対して２．５〜１０μL程度とすればよい。

これらを混合した後、通常２５〜４２℃程度で、１０〜６０分間程度インキュベートすればよい。

第１工程において、被験試料と本発明の遺伝子検出用試薬とを混合する際に、さらにＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に分解するＲＮＡ分解酵素を混合することができる。このＲＮＡ分解酵素はハイブリダイズ前の１本鎖ＲＮＡを分解しないため、これらの混合順序は特に限定されず、例えば、ＲＮＡ分解酵素と遺伝子検出用試薬とを混合したものを被験試料に添加してもよい。

このようなＲＮＡ分解酵素を使用すれば１塩基のミスマッチでも検出できるため、本発明方法は１塩基多型の検出方法となる。この場合、遺伝子検出用試薬中の標的核酸配列とハイブリダイズできる領域は、標的核酸配列の野生型配列又は予想される１塩基変異型配列のいずれかと相補的な配列を有していればよい。

第２工程では、レポータータンパク質の発現をその種類に応じた方法で検出すればよい。これらのタンパク質の発現は以下のような市販のキットを用いて検出及び測定することができる。
例えばルシフェラーゼの発現は、細胞溶解液に発光基質であるルシフェリン（例えば東洋インキ社製）を添加し基質の分解による発光をルミノメーター、液体シンチレーションカウンター又はトップカウンター等を用いて検出・測定すればよい。アルカリフォスファターゼの発現は、例えばLμMi-Phos530（和光純薬社製）を用いて検出・測定できる。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの発現は、FAST CAT Chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kit(和光純薬社製)を用いて検出・測定できる。β-ガラクトシダーゼの発現はAurora Gal-XE（和光純薬社製）を用いて検出・測定できる。

第２工程では、被験試料が存在しない場合、すなわち本発明の試薬を同じ条件でインキュベートした場合と、被験試料が存在する場合との間で、レポータータンパク質の発現量を比較すればよい。タンパク質の発現量は、目視などにより直接比較することもできるが、各場合のタンパク質発現量を測定した上で比較してもよい。

各場合のタンパク質発現量を測定する場合の判定基準は、それには限定されないが、例えば、被験試料の存在によりタンパク質発現量が３倍以上に向上すれば、被験試料中に標的核酸配列が存在していると判定することができる。
（ＩＶ）遺伝子検出用試薬としての使用
本発明の第１の使用は、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備える核酸であって、前記標的核酸とのハイブリダイズにより高次構造変化が誘起され、レポータータンパク質への翻訳が開始される核酸の遺伝子検出用試薬としての使用である。

本発明の第２の使用は、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備えるＲＮＡであり、標的核酸とのハイブリダイズにより誘起される高次構造変化がレポータータンパク質への翻訳を開始させるＲＮＡに転写され得るＤＮＡの遺伝子検出用試薬としての使用である。
実施例
以下、本発明を実施例、及び試験例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（ＭＢ制御されたルシフェラーゼ発現鋳型の構築）
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＧＬ３はプロメガから購入した。ターゲットと相補的な３'末端側部分領域及びＳＤ配列を含むフォワードプライマー（5’-d(GGT CTG AAG GTT TAT TAG AAG GAG ATA TAC CAA TGG AAG ACG CCA AAA ACA TA)-3’：配列番号２）５ｐｍｏｌ及びリバースプライマー（５'-d(TAT TCA TTA CAC GGC GAT CTT TCC G)-3’：配列番号３）５ｐｍｏｌを含む２５μｌの反応混合物を用いて、プラスミドｐＧＬ３を鋳型として第１回目のＰＣＲを行った。第１回目のＰＣＲでは、５ｎｇのｐＧＬ３ベクター、１．２５ＵのＰｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社）、５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰｓ（東洋紡績社）、及び２．５μＬの１０×Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦ反応バッファーを用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３分間、（９５℃で４５秒間、５４℃で４５秒間、７２℃で1分間）のセットを３０サイクル、７２℃で１０分間の条件とした。

ターゲットと相補的な５'末端側部分領域及びＴ７プロモーターを含むユニバーサルプライマー5’-d(GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG GTT TCC CTC TAT CTC CTG GTC TGA AGG TTT A)-3’(配列番号４)５ｐｍｏｌを含む２０μｌの反応混合物を用いて、１回目のPCR反応で生成した２本鎖DNAを鋳型として第２回目のＰＣＲを行った。第２回目のＰＣＲでは、５ｐｍｏｌのリバースプライマー（ 5’-d(TAT TCA TTA CAC GGC GAT CTT TCC G)-3’：配列番号５）、１μＬの１／１００倍希釈した第１回目のＰＣＲと同じＰＣＲ反応溶液、１．２５ＵのＰｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社）、５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰｓ（東洋紡績社）、及び２．５μＬの１０×Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＨＦ反応バッファーを用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３分間、（９５℃で４５秒間、５４℃で４５秒間、７２℃で1分間）を３０サイクル、７２℃で１０分間の条件とした。

これにより、ＭＢ−制御されたルシフェラーゼｍＲＮＡ転写用の２本鎖ＤＮＡが得られた。このＤＮＡの塩基配列を配列番号６に示す。配列番号６において、塩基番号１〜２２がＴ７−プロモーター領域であり、塩基番号７３〜７７の６塩基がＳＤ配列（リボソーム結合配列）であり、塩基番号８６〜１７２２が開始コドンから始まるルシフェラーゼ遺伝子である。また、塩基番号５４〜６９は、ｍＲＮＡに転写された場合にターゲット配列であるＣＣＲ５と相補的な配列を与える配列である。

この２本鎖ＤＮＡより、Ｔ７ ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔキット（アンビオン社）を用いて、ＭＢ制御されたルシフェラーゼｍＲＮＡがＴ７ランオフ転写により得られた。簡単に説明すれば、鋳型ＤＮＡの第２回目のＰＣＲ溶液を３μＬを含むＴ７転写反応混合物（１０μＬ）を３７℃で１２０分間インキュベートした。この反応混合物に１ＵのＤＮａｓｅ Ｉを添加し、混合物をさらに１５分間インキュベートした。

次いで、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐキット（キアゲン社）を用いてｍＲＮＡを精製した。ｍＲＮＡの濃度を２６０ｎｍの吸収を測定することにより決定した。

このようにして得られたＭＢ−ルシフェラーゼｍＲＮＡの構造を図１に示す。このＲＮＡは、レポーター遺伝子対応部分と、その上流に制御ヘアピン構造を有する。ヘアピン構造は、８塩基長さのステムと１９塩基長さのループを有する。ステムには６塩基長さのＲＢＳが含まれる。ループを含む１８塩基がヒトＣＣケモキンレセプター５（ＣＣＲ５）遺伝子の第６２０〜６３５番目の塩基配列（5’-ＡＡＴＡＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣ-３’：配列番号７）に相補的な配列である。
ＣＣＲ５は、ＨＩＶ−１コアレセプターであり、その配列の多様性はＨＩＶ−１感染の促進／遅延のハプロタイプマーカーと考えられる。従って、この配列の選択性は重要である。
実施例２（ルシフェラーゼの翻訳と化学発光解析）
ターゲットのＣＣＲ５オリゴデオキシヌクレオチド（１８ｐｍｏｌ）の存在下又は非存在下で、１．８ｐｍｏｌの実施例１で得た鋳型ＭＢ−ルシフェラーゼｍＲＮＡを含む再構築されたＥ．ｃｏｌｉ翻訳溶液（Ｔ７−トランスクリプション／トランスレーションカップルド、ピュアシステムクラシック１、ポストゲノム研究所社）の中でＩｎ Ｖｉｔｒｏ翻訳を行った。合計容量１０μＬの反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。

ターゲット核酸としては、ＣＣＲ５遺伝子の第６２０〜６３５番目の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（5’-ＣＣＧＴＡＡＡＴＡＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣＡＧＡＧＡ-３’：配列番号８）をフルマッチオリゴデオキシヌクレオチドとして用いた。また、配列番号８において、塩基番号１３のＣをＴに１塩基変異させたもの、及び塩基番号１３のＣをＡに１塩基変異させたものを、それぞれ１塩基ミスマッチオリゴデオキシヌクレオチドとして用いた。さらに、塩基番号１３のＣをＴに変異させるとともに塩基番号１４のＴをＡに変異させたものを、２塩基ミスマッチオリゴデオキシヌクレオチドとして用いた。

各サンプルを翻訳後、２．５μＬを１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ社）と混合した。１０２．５μＬを９６穴プレートに移してＷａｌｌａｃ１４２０システムを用いて化学発光強度を測定した。

結果を図２に示す。図２は、フルマッチオリゴデオキシヌクレオチド、及びミスマッチオリゴデオキシヌクレオチドの存在下での化学発光強度を、これらのターゲットが存在しない場合の化学発光強度に対する相対値で表したグラフである。
ターゲット非存在下に比べて、フルマッチオリゴデオキシヌクレオチド存在下では、約３倍の発光強度が観察された。また、ＣからＴへ変異した１塩基ミスマッチオリゴデオキシヌクレオチド存在下では、ターゲット非存在下の約２倍の発光強度が観察された。また、２塩基ミスマッチオリゴデオキシヌクレオチド存在下、及びＣからＡへ変異した１塩基ミスマッチオリゴデオキシヌクレオチドの存在下では、ターゲット非存在下での発光強度と差が認められなかった。
実施例３（ルシフェラーゼの転写／翻訳と化学発光解析）
１．８ｐｍｏｌの鋳型ＭＢ−ルシフェラーゼｍＲＮＡに代えて、０．２ｐｍｏｌのＭＢ−ルシフェラーゼ発現ｄｓＤＮＡ鋳型を用いた他は、実施例２と同様の操作を行った。

鋳型ＭＢ−ルシフェラーゼｍＲＮＡの１．８ｐｍｏｌに代えてＭＢ−ルシフェラーゼ発現ｄｓＤＮＡの０．２ｐｍｏｌを用いた他は、実施例２と同様にして、ＣＣＲ５遺伝子の部分配列ＤＮＡと、フルマッチオリゴデオキシヌクレオチド、及び３種のミスマッチオリゴデオキシヌクレオチドと作用させた。

結果を図３に示す。ターゲット非存在下に比べて、フルマッチオリゴデオキシヌクレオチド存在下では、約８倍の発光強度が観察された。また、ＣからＴへ変異した１塩基ミスマッチオリゴデオキシヌクレオチド存在下でも、ターゲット非存在下の約５倍の発光強度が観察された。また、２塩基ミスマッチオリゴデオキシヌクレオチド存在下、及びＣからＡへ変異した１塩基ミスマッチオリゴデオキシヌクレオチドの存在下では、ターゲット非存在下に比べて、約２倍の発光強度が観察された。

遺伝子検出用試薬として、ＲＮＡを用いるより２本鎖ＤＮＡを用いる方が、一層高感度で遺伝子変異を検出でき、１塩基の違いも確実に検出できることが分かる。

また、図４に、各反応混合物の１０２．５μＬを２５０μＬエッペンドルフチューブに移して、その化学発光像をＶｅｒｓａｄｏｃ３０００で測定したものを示す。図４から、遺伝子の１塩基の変異でも目視により明確に把握できることが分かる。
実施例４（翻訳段階でのターゲット核酸配列との相互作用の確認）
ＣＣＲ５フルマッチオリゴデオキシヌクレオチド(１８ｐｍｏｌ)の存在下又は非存在下で、０．２ｐｍｏｌの鋳型ＭＢ−ルシフェラーゼＤＮＡを含む再構築されたリボソーム及びtＲＮＡを含まないセルフリーＴ７−転写／翻訳、ピュアシステムクラシック１（ポストゲノム研究所社）の中でＩｎ Ｖｉｔｒｏ転写を行った。詳しくは、合計容量１０μＬの反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。１８ｐｍｏｌのＣＣＲ５フルマッチオリゴデオキシヌクレオチドを用いた。転写反応の効率は、ＣＣＲ５フルマッチオリゴデオキシヌクレオチド存在下における転写ｍＲＮＡの希釈溶液（０，２０，４０，６０，８０,１００％）を内部標準とし、ＣＣＲ５フルマッチオリゴデオキシヌクレオチド非存在下における転写量と比較することによって行った。

図５に、各反応混合物の化学発光像をＡＴＴＯデンシトグラフで測定したものを示す。フルマッチオリゴデオキシヌクレオチドの存在下では、このターゲットヌクレオチドが存在しない場合と同程度の発光強度が観察された。

このことから、転写段階だけでは、ターゲットによる翻訳阻害は実質的に検出できないことが分かる。
実施例５（ターゲット量と発光強度との関係）
実施例２において、ターゲットとしてＣＣＲ５フルマッチオリゴデオキシヌクレオチドの使用量を、０〜２２ｐｍｏｌまで変化させて、化学発光強度を測定した（図６）。ＣＣＲ５フルマッチオリゴデオキシヌクレオチドの７ｐｍｏｌ程度で、化学発光強度はやや飽和するが、それ以下の濃度では、ターゲット量と発光強度はほぼ比例していることが分かる。このことから、直線性の点で、本ルシフェラーゼ発現鋳型は標的核酸配列の検出、定量に好適に使用できることが分かる。
実施例６（ＤＮＡ分解酵素の併用）
＜ＭＢ制御されたルシフェラーゼ発現鋳型の構築＞
ＰＣＲプライマーとして以下のものを用い、プラスミドｐＢＥＳＴｌｕｃ(プロメガ社)を鋳型とした他は実施例１と同様にして、ＭＢ−制御されたルシフェラーゼｍＲＮＡ転写用の２本鎖ＤＮＡを得た。この２本鎖ＤＮＡから転写されるルシフェラーゼｍＲＮＡは、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域として、ＣＣＲ５の第６２０〜６３７番目の塩基配列（5'−ＡＡＴＡＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣＡＧ−3'：配列番号９)に相補的な配列を有する。その他は、実施例１で得た２本鎖ＤＮＡから得られるルシフェラーゼｍＲＮＡと同様である。
第１回目ＰＣＲ
フォワードプライマー（5’-d(GGT CTG AAG GTT TAT TAG AAG GAG ATA TAC CAA TGG AAG ACG CCA AAA ACA TA)-3’：配列番号２）
リバースプライマー（5'-d(TAT TCA TTA CAA TTT GGA CTT TCC GCC)-3’：配列番号１０）
第２回目ＰＣＲ
ユニバーサルプライマー（5’-d(GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG GTT TCC CTC TAT CTC CTG GTC TGA AGG TTT A)-3’：配列番号４)
リバースプライマー（ 5’-d(TAT TCA TTA CAA TTT GGA CTT TCC GCC)-3’：配列番号１０）
このようにして得られた１．８ｐｍｏｌのＭＢ−ルシフェラーゼｍＲＮＡを、ターゲットのＣＣＲ５オリゴデオキシヌクレオチド(１．８ｐｍｏｌ)の存在下又は非存在下で、再構築されたＥ．ｃｏｌｉ翻訳溶液（Ｔ７−トランスクリプション／トランスレーションカップルド、ピュアシステムクラシック１、ポストゲノム研究所社）の中でＩｎ Ｖｉｔｒｏ翻訳を行った。合計容量１０μＬの反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。

また、Ｔｔｈ ＲＮａｓｅＨ（０．１Ｕ；東洋紡績社）を含む反応混合物を用いて上記と同様の操作を行った。

ターゲット核酸としては、ＣＣＲ５遺伝子の第６２０〜６３５番目の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（5’-ＡＡＴＡＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣ-３’：配列番号１１）をフルマッチオリゴデオキシヌクレオチドとして用いた。また、配列番号１１において、塩基番号８のＣをＴに１塩基変異させたものを１塩基ミスマッチオリゴデオキシヌクレオチドとして用いた。
各サンプルを翻訳後、２．５μＬを１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ社）と混合した。１０２．５μＬを９６穴プレートに移してＷａｌｌａｃ１４００システムを用いて化学発光強度を測定した。

結果を図７に示す。図７は、フルマッチオリゴデオキシヌクレオチド、及び１塩基ミスマッチオリゴデオキシヌクレオチドの存在下での化学発光強度を、ターゲット及びＲＮａｓｅＨが存在しない場合の化学発光強度に対する相対値で表したグラフである。また、レーン１〜３はＲＮａｓｅＨ非存在下での結果であり、レーン４〜６はＲＮａｓｅＨ存在下での結果である。

ここで用いた１塩基ミスマッチは、比較的安定な“ゆらぎ塩基対”であるＧＴ塩基対によるものである。鋳型ＭＢ−ルシフェラーゼｍＲＮＡ中のターゲット塩基配列と相補的な領域が１６ｍｅｒと短いため、ＲＮａｓｅＨを使用しない場合は、フルマッチオリゴヌクレオチドとＧＴミスマッチオリゴヌクレオチドとの区別が困難であるが（レーン２，３）、ＲＮａｓｅＨを使用することにより、フルマッチオリゴヌクレオチドとＧＴミスマッチオリゴヌクレオチドとを明確に区別できることが分かる（レーン５，６）。ＧＴ１塩基ミスマッチを検出できるため、その他の１塩基ミスマッチは確実に検出できると考えられる。
実施例７（標的核酸が極少である場合）
＜ルシフェラーゼの翻訳と化学発光解析＞
ターゲットのＣＣＲ５オリゴデオキシヌクレオチド（４５ｆｍｏｌ）の存在下又は非存在下で、０．４５ｐｍｏｌの上記鋳型ＭＢ−ルシフェラーゼｍＲＮＡを含む再構築されたＥ．ｃｏｌｉ翻訳溶液（Ｔ７−トランスクリプション／トランスレーションカップルド、ピュアシステムクラシック１、ポストゲノム研究所社）の中でＩｎ Ｖｉｔｒｏ翻訳を行った。合計容量１０μＬの反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドの使用モル数は、鋳型ＭＢ−ルシフェラーゼｍＲＮＡのモル数の１０００分の１である。

また、Ｔｔｈ ＲＮａｓｅＨ（１Ｕ；東洋紡績社）を含む反応混合物を用いて上記と同様の操作を行った。

ターゲット核酸としては、ＣＣＲ５遺伝子の第６２０〜６３７番目の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（5’-ＣＣＧＴＡＡＡＴＡＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣＡＧＡＧＡ-３’：配列番号８）をフルマッチオリゴデオキシヌクレオチドとして用いた。
各サンプルを翻訳後、２．５μＬを１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ社）と混合した。１０２．５μＬを９６穴プレートに移してＬｕｍａｔＬＢ９５０７を用いて化学発光強度を測定した。

結果を図８に示す。レーン１及び２はＲＮａｓｅＨ存在下での結果であり、レーン３及び４はＲＮａｓｅＨ非存在下での結果である。ターゲットが非常に少ない場合でも、ＲＮａｓｅＨを使用することにより、ターゲットが存在しない場合に比べて非常に強い化学発光が観察された。極少量のターゲットによりルシフェラーゼの転写、翻訳が検出できたことが分かる。
実施例８（β−ガラクトシダーゼを用いた検出）
＜ＭＢ制御されたβ−ガラクトシダーゼ発現鋳型の構築＞
ＰＣＲプライマーとして以下のものを用いた他は実施例１と同様にして、ＭＢ−制御されたβ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡ転写用のｄｓＤＮＡを得た。この２本鎖ＤＮＡから転写されるβ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡは、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡに代えてβ−ガラクトシダーゼをコードするｍＲＮＡを有する。また、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域として、ＣＣＲ５の第６２０〜６３７番目の塩基配列（5'−ＡＡＴＡＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣＡＧ−3'：配列番号９)に相補的な配列を有する。その他は、実施例１で得た２本鎖ＤＮＡから得られるルシフェラーゼｍＲＮＡと同様である。
第１回目ＰＣＲ
フォワードプライマー（5’-d(GGT CTG AAG GTT TAT TAG AAG GAG ATA TAC CAA TGA CCA TGA TTA CGG ATT CAC)-3’：配列番号１２）
リバースプライマー（5'-d(GGA TTA GTT ATT CAT TAT TTT TGA CAC CAG ACC AAC)-3’：配列番号１３）
第２回目ＰＣＲ
フォワードプライマー（5’-d(GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG GTT TCC CTC TAT CTC CTG GTC TGA AGG TTT ATT AG)-3’：配列番号1４)
リバースプライマー（ 5’-d(GGA TTA GTT ATT CAT TAT TTT TGA CAC CAG ACC AAC)-3’：配列番号１３）
＜β−ガラクトシダーゼの翻訳と発色＞
ターゲットのＣＣＲ５オリゴデオキシヌクレオチド（１８ｐｍｏｌ）の存在下又は非存在下で、０．２ｐｍｏｌの上記ＭＢ−β−ガラクトシダーゼｄｓＤＮＡを含む再構築されたＥ．ｃｏｌｉ翻訳溶液（Ｔ７−トランスクリプション／トランスレーションカップルド、ピュアシステムクラシック１、ポストゲノム研究所社）の中でＩｎ Ｖｉｔｒｏ翻訳を行った。合計容量１０μＬの反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。

また、Ｔｔｈ ＲＮａｓｅＨ（１Ｕ；東洋紡績社）を含む反応混合物を用いて上記と同様の操作を行った。

ターゲット核酸としては、ＣＣＲ５遺伝子の第６２０〜６３７番目の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（5’-ＣＣＧＴＡＡＡＴＡＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣＡＧＡＧＡ-３’：配列番号８）をフルマッチオリゴデオキシヌクレオチドとして用いた。

各サンプルを翻訳後、β−ガラクトシダーゼ酵素アッセイシステム（プロメガ社）を用い添付プロトコールに従ってβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。但し、１１μＬの翻訳溶液を、３９μＬの１×レポーター溶解バッファー、及びｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を含む５０μＬのアッセイ２×バッファーと混合した。

結果を図９（Ａ）に示す。レーン１及び２はＲＮａｓｅＨ非存在下での結果であり、レーン３及び４はＲＮａｓｅＨ存在下での結果である。フルマッチターゲットが存在する場合、ターゲットが存在しない場合に比べてニトロフェノールの生成による４０５ｎｍにおける強い吸収が観察された。また、ＲＮａｓｅＨを使用することにより、ターゲットが存在しない場合との区別が一層明確になった。
また、β−ガラクトシダーゼによる発色の様子を図９（Ｂ）に示す。２及び３はＲＮａｓｅＨを使用する場合であり、２はターゲットが存在しない場合、３はフルマッチターゲットが存在する場合である。４及び５はＲＮａｓｅＨを使用しない場合であり、４はターゲットが存在しない場合、５はフルマッチターゲットが存在する場合である。なお、１は４と同じである。１，２は透明であるが、３は強く黄色に発色していた。また４は透明であるが、５は黄色に発色していた。すなわち、フルマッチターゲットの存在によりターゲットが存在しない場合に比べて強い発色が観察された。また、ＲＮａｓｅＨを使用することによりターゲットが存在しない場合との区別が一層明確になった。反応生成物であるニトロフェノールは可視域に吸収を有するため、レポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いれば、特別な装置を用いることなく目視によりターゲットの検出を行える。

Claims (35)

1. 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備える遺伝子検出用試薬であって、前記標的核酸とのハイブリダイズにより高次構造変化が誘起され、レポータータンパク質への翻訳が開始される遺伝子検出用試薬。
2. 少なくとも、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域がＲＮＡである請求項１に記載の遺伝子検出用試薬。
3. リボソーム結合領域にリボソームが結合できない状態にあり、標的核酸とハイブリダイズできる領域と標的核酸とのハイブリダイズにより誘起される高次構造変化がリボソーム結合領域へのリボソームの結合を可能にしてレポータータンパク質への翻訳を開始させるものである請求項２に記載の遺伝子検出用試薬。
4. 上流より順に、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備え、リボソーム結合領域のさらに上流に、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域を介して、リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域を備えるものである請求項３に記載の遺伝子検出用試薬。
5. リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域の塩基数に対する、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域の塩基数の比率が１〜１０である請求項４に記載の遺伝子検出用試薬。
6. リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域が５〜３０塩基からなり、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域が５〜６０塩基からなる請求項４に記載の遺伝子検出用試薬。
7. 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域が、標的核酸配列と相補的な領域である請求項１に記載の遺伝子検出用試薬。
8. 標的核酸とハイブリダイズした場合に自己切断するリボザイムとして機能する領域を含むものである請求項１に記載の遺伝子検出用試薬。
9. レポータータンパク質が酵素である請求項１に記載の遺伝子検出用試薬。
10. 前記酵素が可視光を発生する物質の生産に関与するものである請求項９に記載の遺伝子検出用試薬。
11. 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備え、標的核酸とのハイブリダイズにより誘起される高次構造変化がレポータータンパク質への翻訳を開始させるＲＮＡに転写され得るＤＮＡを含む遺伝子検出用試薬。
12. 前記ＲＮＡが、リボソーム結合領域にリボソームが結合できない状態にあり、標的核酸とハイブリダイズできる領域と標的核酸とのハイブリダイズにより誘起される高次構造変化がリボソーム結合領域へのリボソームの結合を可能にしてレポータータンパク質への翻訳を開始させるものである請求項１１に記載の遺伝子検出用試薬。
13. 前記ＲＮＡが、上流より順に、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備え、リボソーム結合領域のさらに上流に、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域を介して、リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域を備えるものである請求項１２に記載の遺伝子検出用試薬。
14. リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域の塩基数に対する、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域の塩基数の比率が１〜１０である請求項１３に記載の遺伝子検出用試薬。
15. リボソーム結合領域を含む領域とハイブリダイズできる領域が５〜３０塩基からなり、標的核酸配列とハイブリダイズできる領域が５〜６０塩基からなる請求項１３に記載の遺伝子検出用試薬。
16. 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域が、標的核酸配列と相補的な領域である請求項１１に記載の遺伝子検出用試薬。
17. 前記ＲＮＡが、標的核酸とハイブリダイズした場合に自己切断するリボザイムとして機能する領域を含むものである請求項１１に記載の遺伝子検出用試薬。
18. レポータータンパク質が酵素である請求項１１に記載の遺伝子検出用試薬。
19. 前記酵素が可視光を発生する物質の生産に関与するものである請求項１８に記載の遺伝子検出用試薬。
20. 請求項１に記載の遺伝子検出用試薬を備える遺伝子検出用キット。
21. さらに、原核細胞抽出液を備える請求項２０に記載の遺伝子検出用キット。
22. さらに、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素を備える請求項２０に記載の遺伝子検出用キット。
23. 請求項１１に記載の遺伝子検出用試薬を備える遺伝子検出用キット。
24. さらに、原核細胞抽出液を備える請求項２３に記載の遺伝子検出用キット。
25. さらに、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素を備える請求項２３に記載の遺伝子検出用キット。
26. 被験試料と請求項１に記載の遺伝子検出用試薬とを混合する第１工程と、遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量を、被験試料の非存在下での請求項１に記載の遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量と比較することにより、被験試料中の標的核酸の有無を判定する第２工程とを含む遺伝子検出方法。
27. 遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現を原核細胞抽出液の存在下で行う請求項２６に記載の方法。
28. 第１工程において、被験試料と、請求項１に記載の遺伝子検出用試薬と、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素とを混合する工程を含む請求項２６に記載の方法。
29. 被験試料と請求項１１に記載の遺伝子検出用試薬とを混合する第１工程と、遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量を、被験試料の非存在下での請求項１１に記載の遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量と比較することにより、被験試料中の標的核酸の有無を判定する第２工程とを含む遺伝子検出方法。
30. 遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現を原核細胞抽出液の存在下で行う請求項２９に記載の方法。
31. 第１工程において、被験試料と、請求項１に記載の遺伝子検出用試薬と、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素とを混合する工程を含む請求項２９に記載の方法。
32. 被験試料と、請求項１に記載の遺伝子検出用試薬と、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素とを混合する第１工程と、遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量を、被験試料の非存在下での請求項１に記載の遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量と比較することにより、被験試料中の標的核酸の有無を判定する第２工程とを含む１塩基多型の検出方法。
33. 被験試料と、請求項１１に記載の遺伝子検出用試薬と、ＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分解酵素とを混合する第１工程と、遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量を、被験試料の非存在下での請求項１１に記載の遺伝子検出用試薬からのレポータータンパク質の発現量と比較することにより、被験試料中の標的核酸の有無を判定する第２工程とを含む１塩基多型の検出方法。
34. 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備える核酸であって、前記標的核酸とのハイブリダイズにより高次構造変化が誘起され、レポータータンパク質への翻訳が開始される核酸の遺伝子検出用試薬としての使用。
35. 標的核酸配列とハイブリダイズできる領域、リボソーム結合領域、開始コドン、及びレポータータンパク質をコードする領域を備えるＲＮＡであり、標的核酸とのハイブリダイズにより誘起される高次構造変化がレポータータンパク質への翻訳を開始させるＲＮＡに転写され得るＤＮＡの遺伝子検出用試薬としての使用。

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