JP2000510337A

JP2000510337A - 核酸塩基配列の検出方法

Info

Publication number: JP2000510337A
Application number: JP09539623A
Authority: JP
Inventors: ホワイトクーム，デイヴィッド・マーク; リトル，スティーヴン; ブラウニ，ジャニン
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1996-05-04
Filing date: 1997-04-29
Publication date: 2000-08-15
Also published as: GB9609441D0; EP0896630A1; US6270967B1; WO1997042345A1; AU2704997A

Abstract

(57)【要約】試料核酸中の診断用塩基配列の検出方法。診断用プライマーは、本方法に使用するための、タグ領域および検出領域を含む非相補テイル配列を有する。本方法は増幅不応性変異系（ＡＲＭＳ）と組み合わせて、変異した診断用塩基配列を正常な診断用塩基配列のバックグラウンドに対し検出するのに特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】核酸塩基配列の検出方法本発明は、試料核酸中の診断用塩基配列を検出するための新規方法に関する。特に本発明は、そのような方法におけるテイル付きプライマーの使用に関する。本発明は、現在確立されている核酸配列検出方法に対する改良である。核酸配列の検出はたとえば以下の領域で望ましい、必要な方法である；ヒトおよび他の種における遺伝病の原因である対立遺伝子の検出および診断:ヒトおよび他の種における疾病に関与している可能性があるか、または可能性のない遺伝子に会合または結合しているＤＮＡ配列の検出および診断；腫瘍および腫瘍療法効果の検出および診断；種々の病原体（たとえばウイルス、細菌および真菌）の検出および識別；動物の系統および血統の純粋さの判定；法医学におけるヒトおよび動物の種々の試料の識別および同定。たとえば米国特許第4,683,202および4,683,195号に開示されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、特定のＤＮＡ配列を増幅させるために用いられている。しかしＰＣＲ自体は単一塩基変異を検出する方法を提供するわけではない。ＰＣＲと他の技術、たとえば対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプローブによるＰＣＲ増幅生成物の検出を組み合わせる必要があった。本発明者らは、タグ（ｔａｇ）領域および検出領域を有するテイル付き診断用プライマーを用いた、診断用塩基配列の新規なアッセイ系を考案した。適切な条件下では、診断用プライマー延長生成物があれば追加のプライマー（further pr imer）の延長の鋳型として作用する。この場合、タグ領域および検出領域に相補的な配列がこの追加のプライマーの延長生成物中に生じるであろう。この追加のプライマーの延長生成物のタグ領域相補配列にハイブリダイズして延長しうるタグプライマーを供給する。このタグプライマー延長生成物中の検出領域に相補的な配列を参照して、診断用塩基配列が同定される。したがって本発明の第１態様においては、試料に含まれる核酸の診断用塩基配列の検出方法であって、試料をハイブリダイゼーション条件下で、適切なヌクレオシド三リン酸およびその重合化剤の存在下に、診断用塩基配列に対する診断用プライマーと接触させ、この診断用プライマーは、対応する診断用塩基配列が試料中に存在した場合には診断用プライマーの延長生成物が合成され、対応する診断用塩基配列が試料中に存在しない場合には延長生成物が合成されないような、タグ領域および検出領域を含むテイル配列を有し、診断用プライマーの延長生成物があればこれが診断用塩基配列から距離を置いた遺伝子座にハイブリダイズする追加のプライマーの延長のための鋳型として作用し、そして試料を追加のプライマーの延長生成物のタグ配列の相補配列に選択的にハイブリダイズして延長されるタグプライマーと接触させ、そして追加のプライマーの延長生成物中の検出領域を基準として診断用塩基配列の存否を検出することを含む方法が提供される。後続プライマーの延長生成物中の検出領域は多数の方法で検出できる。たとえば追加のプライマーの延長生成物中の検出領域と相互作用すると検出可能な信号を発しうる検出種と試料を接触させ、これによりこの検出可能な信号を基準として診断用塩基配列の存否を検出することができる。標的依存性ハイブリダイゼーションおよび追加のプライマーの延長が起きるまでは検出種は対応する検出領域と会合し得ないことは自明であろう。この系は、均一アッセイおよびリアルタイムまたは終末点分析に好適である。検出種は追加のプライマーの延長生成物中の検出領域と選択的に会合して検出可能な信号を発しうるいかなる種であってもよい。“選択的会合”とは、検出種が試料中の他の核酸配列を排斥して追加のプライマーの延長生成物中の検出領域を同定し、これに結合することを意味するのは自明であろう。このような検出種には、抗体およびハイブリダイゼーションプローブ（１またはそれ以上）を含めることができる。具体的な検出種は、標識ハイブリダイゼーションプローブのような検出プローブである。標識は、ポリメラーゼ仲介によるタグプライマー延長に伴って、たとえばエキソヌクレアーゼの作用で簡便に放出される。以下の詳細な記述において、多数の別系を述べる。これらには、ハイブリダイズした際のプローブの形状変化の検出、相互作用標識をもつ２以上のプローブの使用、たとえば蛍光共鳴エネルギー伝達の利用、シンチレーション近接アッセイ(scintillation proximity assay，ＳＰＡ)の利用、蛍光標識プローブがハイブリダイズした際の蛍光偏光の測定が含まれる。他の系は当業者に自明であろう。これらには、追加のプライマーの延長生成物の検出領域に対する固相捕獲プローブの使用が含まれる。固定化された追加のプライマーの延長生成物の検出に直接および間接標識法をいずれも使用できることは自明であろう。たとえば検出領域以外の領域に対する他の標識プローブを使用できる。あるいはインターカレーションを利用して検出領域／プローブＤＮＡの二本鎖を検出できる。標識ｄＮＴＰを追加のプライマーの延長生成物に取り込ませることもできる。検出プローブの配列はテイルの検出領域の配列と同一である必要はないが、等しいことが好都合である。検出プローブの性能に有意程度に影響を及ぼすことなくその配列をわずかに変更しうることは自明であろう。あるいは検出領域の相補配列は、そのサイズがタグおよび追加のプライマーの全増幅生成物に及ぼす作用を基準として検出される。簡便なサイズ差を利用して、１塩基対の差ですらゲル上で検出できる。しかし一般に少なくとも５、好都合には少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０塩基対のサイズ差を用いる。本発明のこの態様は、ある遺伝子座の２以上の対立遺伝子を単一のアッセイ混合物で検出したい場合に特に有用である。タグプライマーは、追加のプライマーの延長生成物のタグ配列の相補配列にハイブリダイズすることができる。診断用プライマー延長生成物がタグプライマーのハイブリダイゼーション前に追加のプライマーの延長生成物から分離されていることは理解されるであろう。タグプライマーの配列はテイルのタグ領域の配列と等しいことが好都合である。タグプライマーはすべてのタグ配列にハイブリダイズしうる配列を含むことが好ましい。すべてのタグ配列が同一であることが好ましい。この場合も、タグプライマーの性能に有意程度に影響を及ぼすことなくその配列をわずかに変更しうることは自明であろう。共通のタグプライマーおよび共通のテイル配列の採用は、一般のアッセイにとって経費上の著しい利点をもつ。アッセイ効力を低下させないために診断用プライマーテイルは関連ゲノム配列または隣接領域に非相補的であることは理解されるであろう。既知の診断用ＰＣＲ法では各増幅サイクルで、特にたとえば１つの不適正塩基対を検出するため、または特定の配列を関連配列のバックグラウンドに対して検出するためにプライマーを用いる場合に、ミスプライミングが起きる可能性がある。このようなミスプライミングは、１増幅サイクルについては全プライミング事象のごく低い割合で起きるにすぎないかもしれないが、総サイクル数の関数として有意に増加するであろう。本発明は２段階法からなり、第１段階としてタグ領域および検出領域を含む診断用プライマーと試料鋳型との初期相互作用を、最適ハイブリダイゼーション緊縮度で行うことができる。次いでプライマー延長生成物があれば、これが追加のプライマーにより増幅される。したがってやはり最初はミスプライミングが起きる可能性はあるが、全体量を有意に減少させることができる。前記のように、テイル配列は同一でも異なってもよいが、同一または実質的に同じであることが好ましく、したがって単一テイルプライマーを用いることができる。これにより、反応混合物に種々のプライマーを過剰負荷することなく、きわめて多重な反応を実施することができる。本発明者らは、同一タグ配列の使用は種々の増幅反応の効率を平均化するのに有利に利用できることを見出した。本発明者らは、“プライマー二量体”その他のプライマー間アーチファクトの形成を阻止するためにもテイル付きプライマーを利用できることを見出した。たとえば、二本鎖核酸の検出にインターカレーション型色素を用いるのには特別な問題がある。それらは偽陽性信号を生じるのである。たとえばIshiguro et al. ，Anal．Biochem.，1995，229，207-213、特に211-212頁を参照されたい。理論的考察により拘束されたくはないが、プライマー二量体の形成はある程度は、プライマー間の相同性およびそれらを高濃度で使用することによると考えられる。プライマーを慎重に設計することにより、プライマー二量体の形成を少なくすることはできるかもしれない。しかし、たとえばＰＣＲ多重反応において多数のプライマーを高濃度で用いる場合、これはより困難になる。本発明者らは、それらの３’末端はゲノム特異性であるが、それらの５’末端には検出領域および共通延長配列（タグ）を保有する診断用プライマーおよび追加のプライマーの使用をここに開示する。これらは、追加のプライマー（１またはそれ以上）の延長生成物中のタグ配列の相補配列からプライミングしうる共通タグプライマーと組み合わせて用いられる。したがって初期の診断用プライミングに際してはプライマー二量体その他のプライマー間アーチファクトが生じる可能性はあるが、これらがその後のタグ特異性プライミングに際して増幅されることはあり得ない。診断用プライマーはそれらのゲノム鋳型（１またはそれ以上）においては十分にプライミングしうるが、有意のＰＣＲ増幅は行われない濃度で用いるのが好都合であることは自明であろう。共通タグプライマーはゲノム特異性プライマーより高い濃度で用いられる。プライマー二量体その他のアーチファクトを確実に避けるために、対照プライマーを含めて、反応混合物中に存在するすべてのプライマーにつき共通のタグおよび共通のタグプライマーを用いるのが好ましい。本発明者らは、温度切り替えにより診断用プライマープライミングからタグプライマープライミングに切り替えるのが有利であることを見出した。プライマー類を、タグプライマーの融解温度が診断用プライマーのゲノム相補領域のものより高いように選択する。たとえば１回または好都合には２回の診断用プライマープライミング後に温度を高めると、タグプライミングによるプライミングに有利になる。診断用プライマーは対立遺伝子特異性プライマーであってよい。欧州特許出願公開第A-0333465号（ベイラー医科大学）には、わずかに塩基１個異なる診断用塩基配列の検出に２種類の競合プライマーを用いる検出法が記載されている。この方法は、融解温度（Ｔｍ）の慎重な制御に依存し、競合型オリゴヌクレオチドプライミング（ＣＯＰ）として知られている。競合プライマー類を本発明方法に利用でき、これらのプライマーに異なる標識を付与するか、またはたとえば異なるサイズのテイルをこれらのプライマーに用いることにより増幅生成物をサイズに従って分離する。さらに本出願人の欧州特許出願公開第0332435号（その内容が本明細書において援用される）には、わずかに塩基１個異なる鋳型配列の選択的増幅方法を開示し、特許請求している。上記方法は、現在では一般に増幅不応性変異系（Amplif ication Refractory Mutation System、ＡＲＭＳ）と呼ばれている。これは、たとえば診断用塩基配列（１またはそれ以上）が複雑な核酸混合物中に低濃度でしか存在しない場合に特に有用である。したがって好ましい態様の上記検出方法においては、少なくとも１種類の診断用プライマーの末端ヌクレオチドは疑わしい変異ヌクレオチドまたは対応する正常ヌクレオチドのいずれかに対し相補的であり、これにより診断用プライマーの末端ヌクレオチドが診断用塩基配列中の対応するヌクレオチドに相補的である場合はその診断用プライマーの延長生成物が合成され、診断用プライマーの末端ヌクレオチドが診断用塩基配列中の対応するヌクレオチドに相補的でない場合は延長生成物が合成されない。上記態様に用いるための診断用プライマーは、本出願人の欧州特許出願公開第 0332435号を参照して設計するのが好都合である。 “実質的に相補性”とは、プライマーがハイブリダイゼーション条件下でそれらの前記目的を満たしうる限り、プライマー配列が鋳型の厳密な配列を反映する必要はないことを意味する。これは診断用プライマーおよびテイルプライマーに等しく適用される。一般に、ＤＮＡポリメラーゼによる延長速度を変更するために、不適正塩基対をプライマー配列に導入する。しかし一般に前記のように予め定めたプライマー末端に非相補ヌクレオチドが存在する可能性以外は、プライマーは厳密な相補性をもつ。たとえば癌の診断においては、正常細胞のバックグラウンド中に変異細胞の小集団を同定したいという状況の生じる場合があるかもしれない。ＡＲＭＳ系は変異配列が全ＤＮＡのうちごく小さな部分を構成する場合ですら正常配列と変異配列を識別するので、この目的に好適である。理論的考察により拘束されたくはないが、本発明者らは変異ＤＮＡと正常ＤＮＡの比率が１：１００であるＡＲＭＳアッセイの実施に成功し、これより大きな比率も容易に採用できると考える。ＡＲＭＳ反応の感度を最適化するために、単離した、すなわち単一ＡＲＭＳプライマーを用いてこの反応を実施してもよい。二重または多重反応では個々の反応間で競合的相互作用が起きて感度が低下する可能性があるからである。ポリメラーゼ連鎖反応が起きたことを確認するために、対照反応を行うことが望ましい。遺伝的変異を調べる検査では変異体と他のゲノムのコピー数は一般に１：１または１：２であるので、感度を低下させることなく、または系の不均衡を生じることなく、ゲノム対照反応を採用できる。しかし癌の検査では、ゲノム対照反応が検査反応を圧倒して感度を低下させる可能性がある。本発明者らは、テイル配列を含むＡＲＭＳプライマー（１またはそれ以上）はゲノム対照反応を含む２段階増幅法に有利に使用できることを今回見出した。第１段階では、相補的テイル（１またはそれ以上）を含むＡＲＭＳプライマー（１またはそれ以上）を用いて、存在する可能性のある変異配列を増幅させる。ＡＲＭＳ反応のほか、きわめて低い濃度のプライマー類を用いて同一反応器内でゲノム対照反応を実施する。対照反応プライマー類も非相同テイルをもち、これはＡＲＭＳプライマーテイル（１またはそれ以上）と同じ配列であってもよく、そうでなくてもよい。第２段階では、テイル特異性プライマーを添加し、最初のゲノム対照プライマーが機能するのを阻止するために、温度を高める。この第２段階では、変異配列生成物があればこれがさらに増幅され、かつ第１段階からの対照反応生成物も増幅されて、検出可能な生成物を与える。こうして、ＡＲＭＳ反応は最初の試料中に変異配列が存在した場合にのみ起き、対照反応は第１および第２両段階の増幅反応が作動した場合にのみ機能するであろう。他の重要なＡＲＭＳの利用は、同一試料中に２以上の疑わしい変異ヌクレオチドの存否を検出するためである。ＡＲＭＳは予め定めた診断用プライマーのヌクレオチド配列に応じて選択的に配列を増幅しうるので、多数の増幅生成物を簡単かつ正確に、最少のオペレーター手腕で識別でき、したがって単一試料を多数のヌクレオチド変異につきスクリーニングするための強力な技術を提供することができる。同一試料中に２以上の疑わしい変異ヌクレオチドを検出するためにＡＲＭＳを利用することを、簡単に多重ＡＲＭＳ（multiplex ＡＲＭＳ）と呼ぶ。したがって多重ＡＲＭＳは、単一のＤＮＡまたはＲＮＡ試料を一連の遺伝的状態、たとえば各種疾患をもたらす遺伝的障害、素質および体細胞変異につきスクリーニングする際に、特に重要である。このようなＤＮＡまたはＲＮＡは、たとえば Maniatis et al．，Molecular Cloning(1982)，280-281に記載されるような種々の方法で血液や組織材料、たとえば絨毛膜絨毛または羊膜細胞から抽出することができる。さらに、他の遺伝的状態に関する分子的基礎が分かるようになるのに伴い、これら他の状態を本発明のスクリーニング法に簡単に含めることができる。多数の増幅生成物は多様な方法で識別できる。たとえば疑わしい増幅生成物それぞれに対するプローブを用いることができ、各プローブは異なるかつ識別できる信号または信号を発しうる残基を保有する。ＡＲＭＳ増幅生成物間の識別を行うのに、これよりはるかに簡単かつ好ましい方法は、本発明方法で形成される各増幅生成物の長さが異なるように増幅プライマーのヌクレオチド配列を選択することを含む。これに関して、増幅生成物中に存在する塩基対の数は、診断用プライマーおよび増幅プライマーからの距離により支配される。したがって増幅プライマーを、潜在的変異ヌクレオチドそれぞれが長さの異なる潜在的増幅生成物と関連するように設計できる。特定の点変異を診断するＡＲＭＳ反応では、プライマーの配列はその変異に隣接するＤＮＡ配列によっておおはばに制約される。プライマーの３’側塩基は通常は変異により変化した塩基と適正対合し、要求される水準の特異性を得るために余分な脱安定化配列（destabilization）が導入される。“特異性”という用語は、ＡＲＭＳプライマーをその標的配列のプライミングに用いた場合の生成物の収率を非標的配列からのミスプライミング生成物の収率と対比した比率を意味する。多重ＡＲＭＳ反応では、個々のＡＲＭＳ反応が同様な効率で作動して、すべての反応を同時に検出しうることが望ましい。これは、たとえばプライマーの濃度の変更、反応の数／組成の変更、またはＡＲＭＳプライマーに導入する付加的な脱安定化配列の量により達成できる。これらの方法で普通はバランスのとれた多重ＡＲＭＳ反応を達成するのに十分であるが、特定の場合にはテイルまたはタグ配列の使用が有利であろう。これらにより特に、さらに特異的検査が可能となる。たとえば特異性を得るために強力な付加的不適正塩基対を用いる場合、対応する多重反応生成物の収率は低くなる可能性がある。付加的な不適正塩基対の強さを低下させることは、特異性の妥協なしには不可能である。多重反応のバランスをとるためには、テイル特異性プライマーと組み合わせた場合にＤＮＡポリメラーゼに対する良好な基質となるテイル配列を使用できる。既知のプライミング効力をもつ広範なテイル／プライマーの組合わせが得ることができる。たとえば第１増幅工程として、生成物収率に関係なくプライミング／ミスプライミング比を最適にする。次いで第２増幅工程で適切な範囲のテイル／プライマーの組合わせを用いて生成物収率のバランスをとる。本出願人の英国特許第2252407号（ゼネカ）に、核酸試料の２以上の診断用塩基配列の診断用プライマー延長生成物が相補的オーバーラップを含む場合、多重ＡＲＭＳを効果的に実施しうることを開示し、特許請求している。多重ＡＲＭＳに対するこの予想外の改良を、以下ｏｖｅｒＡＲＭＳと呼ぶ。ｏｖｅｒＡＲＭＳは現在、潜在的な変異ヌクレオチドの位置が近接している遺伝性または感染性疾患の検出および分析を容易にしている。ｏｖｅｒＡＲＭＳ反応では、反応生成物のサイズを利用して変異ヌクレオチドの個々の組合わせを同定することができる。生成物をたとえばアガロースゲル上で分離する場合、この方法はゲルの溶解力により制限される可能性がある。たとえば高分離能アガロースゲルにおいて、現在ｏｖｅｒＡＲＭＳは互いに約１０〜１５塩基以内の変異を検出するために採用できる。より大きな生成物を得るために外側ｏｖｅｒＡＲＭＳプライマーのサイズを増大させると、意外にもより小さなｏｖｅｒＡＲＭＳ生成物の収率が有意に低下することを、本発明者らは見出した。理論的考察により拘束されたくはないが、より大きなｏｖｅｒＡＲＭＳプライマーは標的ＤＮＡに優先的に結合し、より小さなｏｖｅｒＡＲＭＳがハイブリダイズするのを阻止してＴｍを高めるため、標的の遮蔽が起きると本発明者らは考える。テイル付きの外側ｏｖｅｒＡＲＭＳプライマーの使用は分離に必要な生成物サイズ増大をもたらすであろうが、それはその５’末端が非相補的であるので、Ｔｍはより小さなプライマーと同様である。ｏｖｅｒＡＲＭＳは、ＨＬＡの型識別、β−サラセミア、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、第８因子および第９因子血液障害、ならびにα− １−抗トリブシン欠乏症の診断に好都合に用いられる。ｏｖｅｒＡＲＭＳの具体的用途は、のう胞性線維症の検出および診断においてである。好都合なのう胞性線維症対立遺伝子は、本出願人の欧州特許出願公開第90309420.9号：B．Kerem e t al．，Science,1989，245，1073-1080；J．R．Riordan et al．，Science，19 89，245，1066-1073；J．M．Rommens et al．，Science，1989，245，1059-106 ；G．R．Cuttings et al．，Nature，346，366-368；M．Dean et al．，Cell，6 1 ，863-870；K．Kobayashi et al．，Am．J．Hum．Genet．，1990，47，611-615 ；B. Kerem et al.，Pro．Natl．Aca．Sci．USA．1990，87，8447；M．Vidaud et al. ，Human Genetics，1990，85,(4),446-449；およびM．B．White et al．,Nature ，344，665-667に開示されている。診断用プライマーおよびタグプライマーを追加の共通プライマーと組み合わせて用いる本発明の２段階増幅法は、３種類すべてのプライマーを同時に用いて、かつ好ましくはテイル特異性および／または追加のプライマー（１またはそれ以上）と診断用プライマー（１またはそれ以上）の比率、少なくとも１：１、たとえば少なくとも２０：１、少なくとも３０：ｌ、少なくとも４０：１、好ましくは少なくとも５０：１を用いて実施するのが好都合である。ＰＣＲ増幅を伴う上記検出法はすべて、均一系アッセイとして提供できる。試料中の核酸は、たとえばウイルス、細菌（ゲノムおよびプラスミド）、バクテリオファージ、真核細胞（核、プラスミドまたは細胞小器官）、ヒト、動物、植物、ヒトその他の細胞中の潜伏ウイルスに由来する核酸であってよい。試料はそれぞれから常法によって簡便に得られる。核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたは逆転写ＲＮＡであってよい。それは天然、フラグメント化、クローン化、分解、細胞からの抽出、または細胞死により放出された直後のいずれであってもよい。本発明方法の他の利点は、単一試験管内遺伝子型識別ＡＲＭＳアッセイ法（si ngle tube genotyping ARMS assay）にある。二倍体生物の多型性遺伝子座には、一般に２つの異なる対立遺伝子（ＡおよびＢ）があるので、３つの遺伝子型（ＡＡ、ＡＢおよびＢＢ）の可能性がある。遺伝子型を判定するための１方法は、２つの別個のＡＲＭＳ反応、すなわち一方は対立遺伝子Ａに対し特異的な反応、他方は対立遺伝子Ｂに対し特異的な反応を実施するものである。Ａ特異性ＡＲＭＳプライマーとＢ特異性ＡＲＭＳプライマーの両方を単一反応物に含有させ、どちらのプライマーが増幅されたかを判定するために差別標識または異なるプライマー長さを用いることもできる。実際には、一方の対立遺伝子特異性プライマーからのＡＲＭＳ反応生成物が他方のプライマーのミスプライミングの標的として作用する可能性があるので、非特異性などの問題がありうる。しかし本発明方法では、初期の延長反応はテイル付きＡＲＭＳプライマーからであるが、追加の増幅はタグプライマーからである。たとえば２回目のＰＣＲ後にはＡＲＭＳプライマーは増幅プロセスにほとんど寄与しないので、非標的反応生成物からの不適正プライミングの確立はおおはばに低下する。タグプライミングを促進するために、たとえば２回のＰＣＲ後に温度シフトプロトコールを採用すると、ミスプライミングの機会はさらに少なくなる。異なる診断用プライマーの生成物の検出は、生成物サイズの差別化または差別標識化による。本発明方法は多数の既知の検出系と組み合わせて利用できる。たとえば本発明は、たとえばHolland et al．，Pro．Natl．Aca．Sci．USA．,1991，88，7276-7 280およびゲルファンドらの米国特許第5210015号に記載のｔａｑｍａｎアッセイ法の改良に利用できる。他のアッセイ法は、ヤマガタらの欧州特許出願公開第A −0 639647号に記載のものである。さらに他のアッセイ法は連鎖置換アッセイ法（ＳＤＡ）である。たとえばWalker et al．，Nucleic Acids Research，1996， 24(2)，348-353、欧州特許出願公開第A-0 678 581号、欧州特許出願公開第A-0 6 78 582号および欧州特許出願公開第A-0 684 315号を参照されたい。本発明を以下にさらに説明するが、本発明は以下の詳細な記述、実施例、表および図面により限定されない。図１〜４は、本発明のＴａｇＭａｎ態様においてマグネシウム濃度が蛍光比ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡに及ぼす影響を示す。図１．Ｙａ試料と無ＤＮＡ試料との差は２．４ｍＭＭｇで最大である。しかしこれらの条件はＡＲＭＳミスプライミングにも好適であり、ＹａとＹｉの差はより小さい；これはＡＲＭＳ依存性事象である。図２〜４．Ｙａおよび無ＤＮＡにつき、３つの異なるＭｇ濃度（図２−１．２ｍＭＭｇ，図３−２．４ｍＭＭｇ，図４−４．４ｍＭＭｇ）につきそれぞれ３回の反復実験を示す。再現性が良好であり、陽性試料と陰性試料の比率が印象的である。図５は、本発明のＴａｇＭａｎアッセイと最適化ＴａｑＭａｎアッセイ（インスリン遺伝子多型に注目）を比較したものを示す。ＴａｇＭａｎは良好な性能を示した。実際、２．４ｍＭＭｇでは、陽性と陰性の差はインスリンアンプリコンのものよりほぼ２倍良好であった。ＴａｇＭａｎプローブは増幅性タグプライマーよりはるかに強くアニールすると考えられる。図６〜８は、種々の対照との比較を示す。得られた信号が最初のプライマーのリポーター部分の導入の結果として生じたことを確認するために、この部分の無いテイル付きプライマーを用いて対照実験を行った（図６−１．２ｍＭＭｇ，図７−２．４ｍＭＭｇ，図８−２．４ｍＭＭｇ）。すべての場合、リポーター領域が無いと陰性対照に匹敵する蛍光比になる。ここで試験した条件下では不適切なプローブ開裂は起きなかった。図９（ａ）は、本発明のテイル付き３相（３^*）プライマーを用いたゲノムプライミングを示す。テイルのタグ領域（ａｂｃ）および検出領域（ｘｙｚ）、ならびにタグプライマー（ａｂｃ）を示す。図９（ｂ）は、追加のプライマー（ｃｂａ）からの相補鎖合成を示す。この時点で、テイル付き３^*プライマーのコピーが作成されている。図１０は、本発明のＴａｇＭａｎ検出態様を示す。図１０（ａ）は、追加のプライマーの延長生成物（ｃｂａおよび矢印およびそれに続く点線）を示す。タグプライマー（ａｂｃ）、および結合した発蛍光団とクエンチャーを含むプローブ（ｘｙｚ）が示されており、コピーされたテイルにこの時点でこれらがアニールできる。図１０（ｂ）は、ポリメラーゼ仲介によるタグプライマーの延長を示す。ハイブリダイズしたプローブにこれが出会い、プローブを効率的に開裂させ、適度な発蛍光団をそのクエンチャーから放出する。これは従来のＴａｑＭａｎと同じである。図１０（ｃ）は、タグプライマー（ａｂｃ）により駆動された連続的な標的領域増幅、およびＴａｑＭａｎ（ｘｙｚ）の効率的開裂を示す。これにより、放出された発蛍光団のリアルタイムまたは終末点検出が可能になる。タグプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは高濃度でＰＣＲに含有されるが、ロングテイル付きプライマーは低濃度で含有され、タグ駆動プライミングを最大限に高める。このプロセスの効率を最大限に高めるために、ＴａｑＭａｎプローブはタグプライマーより強くアニールしなければならない。さもなければ開裂が非効率的になるであろう。これは、プライマー類の融解温度およびそれらの相対濃度を操作することにより達成できる。対立遺伝子識別のためにＴａｑＭａｎを用いる場合、この方法のＡＳＯ要素は、２変異体間の最大差を得る境界線上にプローブアニーリングがあることを要求する。新規系は、プローブおよび駆動要素を利用者が選択でき、すべてのアンプリコンにつき一度で最適化できるので、より容易に最適化できる。図１１は、本発明の分子ビーコン（Molecular Beacon）態様を示す。分子ビーコンは同様な消光効果を利用する。プローブの両端に互いに相補的な５ｂｐの配列がある。プローブの各末端には一対の発蛍光団の員子があり、一方は励起光線を吸収して、他方の発蛍光団により消光されている波長の光を発する。低温ではこのプローブの相補領域のためステム−ループ構造が形成され、２つの発蛍光団相互および増幅した標的を近接させ、次いでこれはハイブリダイズし、ヘアピンが破壊され、第２発蛍光団の消光作用から第１発蛍光団を開放する。図１１（ａ）は、追加のプライマーの延長生成物（ｃｂａおよび矢印およびそれに続く点線）を示す。コピーされたテイルに、この時点でタグプライマー(ａｂｃ)および分子ビーコン(ｘｙｚ)がアニールできる。標的領域の連続増幅がタグプライマーにより駆動され、プライマーの中間部分が繰り返しコピーされる。図１１（ｂ）は、連続増幅により得られる追加のプライマーの延長生成物を示す。消光したビーコンプローブ（ｘｙｚ）はコピーされたタグプライマーの中間セクションにハイブリダイズする。これは伸長し、第２発蛍光団の消光作用から発光性の第１発蛍光団を開放する。分子ビーコン法はアンプリコンの検出には良い方法であるが、対立遺伝子識別にはさほど好適でない。本発明者らの新規系ではＡＲＭＳにより対立遺伝子を識別できるが、より重要なのはハイブリダイゼーションによる伸長効果を最大限にするという考えでプローブ領域を設計できることである。特にプローブ両端の最後の５ｂｐを“はためく（flapping around）”のではなく標的にハイブリダイズするように作成できる。これによって、より短いプローブを用いてより強い信号を与えることができる。新たなアンプリコン毎に新たな高価なプローブを設計および調製する必要がなく、多数の異なる増幅標的につき総括的プローブを使用できる。この系は、プローブおよび導入する標的配列の変更、ならびに調和した異なる対の発蛍光団を用いることにより、多重化できる。図１２は、本発明のＦＲＥＴ検出態様を示す。この様式の基本的方法は、発蛍光団対の員子をそれぞれ保有する２種類のプローブを導入することである。これら２プローブが増幅したそれらの標的（本質的に互いに隣接する）にハイブリダイズすると、第１発蛍光団の励起により吸収されたエネルギーが第２発蛍光団へ伝達され、次いでこれがそれに特徴的な波長で発光する。これを第１発蛍光団の励起および発光波長から大きくシフトさせて、バックグラウンドをきわめて低くすることができる。この様式では、２プローブの間隔がきわめて重要であり、個別に最適化する必要がある。さらに、各アンプリコンに２種類の蛍光プローブを用いるのは経費のかかる扱いにくい経路である。図１２（ａ）は、追加のプライマー（ｃｂａ）と組み合わせたタグプライマー（ａｂｃ）により駆動される、標的領域の連続増幅を示す。プライマーの中間部分（検出領域）が繰り返しコピーされる。それぞれ半分のエネルギー伝達対を保有する２プローブ（ｘ，ｙ；およびｚ）も示す。図１２（ａ）は、増幅後に、コピーされたタグプライマーの中間セクションに２プローブがハイブリダイズすることを示す。これによりプローブ間のエネルギー伝達が可能となり、検出可能な信号が低いバックグラウンドで発せられる。利用者がプローブ部位を決定できることにより、単一プローブ対を設計し、最適化できる。したがってこれはいかなる標的に対して用いるのにも適している。この系は、最初のプライマーの中間部分の変更、および適切なプローブ上に異なる対の発蛍光団を用いるだけで、多重化できる。リアルタイムアッセイに適したこの方法の改良は、導入した標的にハイブリダイズした時点でたとえば熱安定性リガーゼにより互いに連結反応させうる隣接プローブを用い、こうしてそれらの蛍光発光構造を固定するものである。次いでこの連結反応した二重プローブを（ｔａｑ）ポリメラーゼにより置換することができる。連結反応生成物は新たに付け加えられた配列の（ＴａｑＭａｎ）開裂を阻止するように改変できる。図１３は、本発明の捕獲−検出態様を示す。導入された中間セクション（コピー可能になる）を、特定のＰＣＲ生成物を捕獲する配列として利用できる。捕獲後に、検出分子を第２の標的関連プローブにより導入し、検出を適宜行う。こうして、特異な捕獲配列をもつだけで変異アンプリコンと正常アンプリコンを解読できる。図１３（ａ）は、追加のプライマー（ｃｂａ）と組み合わせたタグプライマー（ａｂｃ）により駆動される標的領域の連続増幅を示す。追加のプライマーの延長生成物の中間セクションが繰り返しコピーされる。各アンブリコンは特徴的な捕獲シグネチャーをもつことができる（すなわちｘｙｚが異なってもよい）。図１３（ｂ）は、追加のプライマーの延長生成物の中間部分（ｘ'ｙ'ｚ'）が、固定化されたプローブ（ｘｙｚ）による捕獲の標的となる様式を示す。標識（たとえばビオチン、セイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）を保有する追加のプローブ（１ｍｎ）を、その後の検出のためにアンプリコンにハイブリダイズさせることができる。こうして、変異配列と正常配列を、単一容器、たとえば試験管内で、これら２生成物を識別する異なる捕獲領域を用いて検出できる。図１４は、本発明のランタニド増強遺伝系（Lanthanide Enhaced Genetics S ystem，ＬＥＧＳ）態様を示す。ＬＥＧＳは本出願人の国際特許出願公開第WO-95 -08642号に開示されている。ＬＥＧＳでは、部分ケージしたユーロビウムイオンをプローブに結合させる。ＰＣＲ生成物が一本鎖になり、このプローブにハイブリダイズすると、二本鎖領域が形成される。その混合物中には、二本鎖領域にインターカレートする合成インターカレーター／増感剤（Ｉ／Ｓ）分子も存在する。このインターカレーターは、第２ケージ基を末端とするリンカーアームをも備えている。適切な配座では、Ｉ／Ｓ分子により部分ケージＥｕイオンが完全にケージされた状態になりうる。これは除外し、強い経時的（time-resolved）蛍光効果をもたらす。Ｉ／Ｓ分子は合成するのが困難であり、完全に熱安定性とは限らない。本発明の３相プライマーを用いると、Ｅｕのキレートを保有するプローブが他のケージ基を保有する第２プローブに隣接してハイブリダイズするように中間相を構築することができる。これにより、完全にケージされたＥｕイオンが形成され、次いでこれが蛍光を発する。この系の主な利点は、複雑な有機合成が不必要である点である。さらに、この第２キレート剤はターゲティングした様式で導入できる。既知の方法で、Ｅｕキレートしたプローブおよびケージプローブをいずれも容易に合成できる。図１４（ａ）は、追加のプライマー（ｃｂａ）と組み合わせたタグプライマー（ａｂｃ）により駆動される、標的領域の連続増幅を示す。追加のプライマーの延長生成物の中間セクションが繰り返しコピーされる。この混合物は２プローブ（ｘ，ｙ；およびｚ）をも含有し、その一方はキレートしたランタニドを保有し、他方は第２キレート基を保有する。図１４（ｂ）は、増幅後に、コピーされた追加のプライマーの延長生成物の中間セクションにこれら２プローブがハイブリダイズする様式を示す。これにより、ランタニドイオンが完全にケージされ、効率の高い経時的蛍光が得られる。図１５は、ｔａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性を用いる以外のプローブ開裂検出法を示す。プローブと導入する標的とが塩基１個またはそれ以上異なり、これら２者間に形成される二本鎖を化学的開裂または“開裂”酵素など多数の方法で開裂されやすくしてもよい。他の方法には、プライマーの中間位置に制限部位を導入することが含まれる。ＰＣＲ後に、これを開裂させて、検出用発蛍光団をそれのクエンチャーから放出させることができる。新たに合成されたＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼ耐性であってもよい（たとえばメチル化またはホスホチオエートＮＴＰの使用による）。次いで保護されていないこれらのプローブが標的にアニールしたとき切断される。熱安定性エンドヌクレアーゼを用いると、このアッセイ形式は完全に均一な、かつリアルタイム検出に適したものになる。あるいはある種の酵素は開裂のためにメチル化二本鎖ＤＮＡを必要とし、これらをメチル化プローブと組み合わせると、さらに他の検出系が得られる。図１５（ａ）は、追加のプライマーの延長生成物（ｃｂａおよび矢印およびそれに続く点線）を示す。タグプライマー（ａｂｃ）、および発蛍光団とクエンチャーが結合したプローブ（ｘｙｚ）を示す。これらはコピーされたテイルにアニールできる。図１５（ｂ）は、プローブ（ｘｙｚ）を化学的方法または酵素法で開裂させることを示す。図１６は、結合に基づく他の方法を示す。導入され、コピーされるプライマーの中間セグメントを、生成物の検出に適した多数の特異的結合法の標的として設計することもできる。たとえば三重らせんモチーフを導入して、複合体形成した二本鎖アンプリコンを特異的に検出することができる。他の例は、不適正塩基対を形成したプローブを、不適正塩基対結合性タンパク質により検出するものである。他の配列特異性タンパク質結合事象は、増幅した中間セグメントの検出に適している。最後に、プローブ／標的ハイブリダイゼーションにタンパク質結合を追加することにより、簡単なＦＰプローブを検出および増強することができる。図１６（ａ）は、追加のプライマー（ｃｂａ）と組み合わせたタグプライマー（ａｂｃ）により駆動される、標的領域の連続増幅を示す。追加のプライマーの延長生成物の中間セクションが繰り返しコピーされる。各アンプリコンは特徴的な捕獲シグネチャーををもつことができる（すなわちｘｙｚが異なってもよい）。図１６（ｂ）は、追加のプライマーの延長生成物の中間セクション(ｘ'ｙ'ｚ' )のコピーが、その後の多数の検出分子の結合の標的となる様式を示す。プローブｘ^*ｙ^*ｚ^*を用いて三重らせんが形成されている。図１７は、差別標識した３^*ＡＲＭＳプライマーを用いた単一試験管内遺伝子型識別ＡＲＭＳアッセイ法を示す。図１７（ａ）は、標的配列（対立遺伝子ＡおよびＢ）上の差別標識ＡＲＭＳ３^* プライマー（ａｂｃｘｙｚおよびａｂｃｒｓｔ）の対立遺伝子特異性延長を示す。共通のタグプライマー（ａｂｃ）も示される。図１７（ｂ）は、対立遺伝子Ａ特異性およびＢ特異性ＡＲＭＳ生成物の両方における追加の増幅が共通のタグプライマー（ａｂｃ）から行われることを示す。Ａ特異性ＡＲＭＳプライマーからの生成物はこの時点でリポーター配列ｘｙｚを含み、一方、Ｂ特異性ＡＲＭＳプライマーからの生成物はこの時点でリポーター配列ｒｓｔを含む。差別検出は、サイズによる（ｘｙｚとｒｓｔが異なる長さである）か、または信号検出による（ｘｙｚとｒｓｔのリポーター基が異なる信号を発する）のが簡便である。実施例１材料と方法プライマーおよびプローブＰＣＲ１．インスリンアンプリコン：下記を含有する２５μｌの反応物３ｍＭＭｇＣｌ₂ ２００μＭｄＮＴＰ１０％(v/v)グリセリン各３ｎｇ／ｍｌプライマーＨｐＨｌＦおよびＨｐＨ１Ｒ５０ｎＭＩＮＳ−Ｂ１Ｆプローブ５μｌゲノムＤＮＡ（または陰性対照用の水）０．６２５単位Ｔａｑポリメラーゼ１×Amplitaq緩衝液中これらの反応は２工程サイクルで実施された：４０サイクル×｛９４℃で１分：５８℃で２分｝２．Ｙａ反応物（１５０μｌ）は、１００μＭｄＮＴＰを含む１×ＡＲＭＳ緩衝液を含有していた。プライマー類Ｔ０９９０およびＳ７０３３１０ｎＭ、Ｓ７９７０５００ｎＭ、Ｔ２１２０５０ｍＭ、２２５ｎｇ △Ｆ５０８ホモ接合体ＤＮＡ、および６単位Ｔａｑポリメラーゼ。若干の反応にＭｇを２．４または４．４ｍＭになるまで補充した。Ｙｉ反応物はＹａと同じであったが、標的ＤＮＡはＦ５０８位が正常なホモ接合体であった。他の対照は標的ＤＮＡを含有しなかった。三相プライマーにおけるリポーター配列の対照とするために、Ｐ１２９２（中間部分を含まない）をＴ０９００の代わりに用いた。ＰＣＲサイクル：２×｛９４℃で１分、６２℃で２分、７２℃で１分｝、続いて４０×｛９４℃で１分、６４℃で１分｝分析サイクル終了後、アリコート（１０μｌ）の各反応物をゲル電気泳動により分析して、増幅効率を確認した。残りを１００μｌのキュベット中でフルオロマックス（Fluoromax）蛍光光度計により分析した。必要な場合には（インスリン増幅の場合のように）、複製試料をプールした。励起波長を４８８ｎｍに設定し、発光を５１８ｎｍ（ＦＡＭにつき）および５８２ｎｍ（ＴＡＭＲＡにつき）で読み取った。それぞれの場合につき比率を計算し、適宜プロットした。結果インスリン遺伝子領域に最適な［Ｍｇ］は３ｍＭと確認されている（John Tod d pers.comm.）。実際に、これより低い濃度では蛍光比の変化はほとんど、または全くなかった。これは図１に示したデータに証明された。Ｙａと無ＤＮＡ試料の差は２．４ｍＭＭｇで最大である。しかしこれらの条件はＡＲＭＳミスプライミングにも好適であり、ＹａとＹｉの差はより印象が小さい；これは非ＴａｇＭａｎＡＲＭＳであるためである。３種類の異なるＭｇ濃度につき、Ｙａおよび無ＤＮＡに関するそれぞれ３回の反復実験を示す（図２〜４）。再現性が良好であり、陽性試料と陰性試料の比率が印象的である。最適化ＴａｑＭａｎアッセイ（インスリン遺伝子多型）で得た結果と比較すると、本発明方法は良好な性能を示した（図５）。実際、２．４ｍＭＭｇでは、陽性と陰性の結果の差はインスリンアンプリコンのものよりほぼ２倍良好であった。これは、本発明者らがＴａｇＭａｎプローブを増幅性タグプライマーよりはるかに強くアニールするように設計できたという事実を反映するものであろう。得られた信号が最初のプライマーのリポーター部分の導入の結果として生じたことを確認するために、この部分の無いテイル付きプライマーを用いて対照実験を行った（図６〜８）。すべての場合、リポーター領域が無いと陰性対照に匹敵する蛍光比になる。ここで試験した条件下では不適正なプローブ開裂は起きなかった。この方法の普遍性を証明するために、多数の他のアンプリコンを３^*形式に処理した。それぞれの場合、別個の対立遺伝子特異性反応を効果的に組み合わせて、単一試験管内遺伝子型識別（ＳＴＧ）を実施することができた。一例では（第５因子ライデン（Leiden））、このアッセイ法を臨床試料（独立して異なる方法で臨床研究室で識別された）につき広範に盲検試験した。１．のう胞性線維症デルタＦ５０８プライマー（表１参照）：Ｖ６６３１：タグ２０ａＶ６６３２：共通プライマー、２０ａ配列のテイル付きＶ６６３４：３^*プライマー、変異配列、Ｔ２１２０リポーターＶ６６３４：３^*プライマー、正常配列、Ｔ４０２９リポータープローブ：Ｔ２１２０：ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ標識Ｔ４０２９：ＴＥＴ／ＴＡＭＲＡ標識反応混合物：反応はすべて、最終３．５ｍＭに調整したＭｇＣｌ₂、ならびに最終６０ｎＭのＲＯＸ内標準、および５００ｎＭのタグ２０ａを含む１×ＡＲＭＳ緩衝液中で実施された。反応液５０μｌ当たり２単位のAmplitaq Goldを含有させた。一般に３種類の混合物を用いた：ａ．正常体のみの反応、プライマーＶ６６３５およびＶ６６３２各１０ｎＭ、Ｔ４０２９５０ｎＭを含むｂ．変異体のみの反応、プライマーＶ６６３４およびＶ６６３２各１０ｎＭ、Ｔ２１２０５０ｎＭを含むｃ．ＳＴＧ、３プライマーすべて１０ｎＭ、両プローブ各５０ｎＭを含むサイクル条件： Amplitaq Gold活性化のために９４℃で２０分２サイクル９４℃で４０秒；６２℃で８０秒；７２℃で４０秒（ゲノムプライミング）４０サイクル９４℃で４秒；６２℃で８０秒（タグプライミング）２．ＣＴＬＡ４Ａ多型性プライマー（表１参照）：Ｖ６６３１：タグ２０ａＶ３５６１：共通プライマー、タグ２０ａ配列のテイル付きＶ６５５８：３^*プライマー、変異体特異性、ＴＥＴリポーター領域（Ｔ４０２９）を含むＶ６７１５：３＊プライマー、正常体特異性、ＦＡＭリポーター領域（Ｔ２１２０）を含むプローブ：Ｔ２１２０：ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ標識Ｔ４０２９：ＴＥＴ／ＴＡＭＲＡ標識反応条件：反応はすべて、最終３．５ｍＭに調整したＭｇＣｌ₄、ならびに最終６０ｎＭのＲＯＸ内標準、および５００ｎＭのタグ２０ａを含む１×ＡＲＭＳ緩衝液中で実施された。反応液５０μｌ当たり２単位のAmplitaq Goldを含有させた。一般に３種類の混合物を用いた：ａ．正常体のみの反応、プライマーＶ６７１５およびＶ３５６１各１０ｎＭ、Ｔ２１２０５０ｎＭを含むｂ．変異体のみの反応、プライマーＶ６５５８およびＶ３５６１各１０ｎＭ、Ｔ４０２９５０ｎＭを含むｃ．ＳＴＧ、３プライマーすべて１０ｎＭ)両プローブ各５０ｎＭを含むサイクル条件： AmplitaqGold活性化のために９４℃で２０分３サイクル９４℃で４０秒；６４℃で８０秒；７２℃で４０秒（ゲノムプライミング）４０サイクル９４℃で４秒；６２℃で８０秒（タグプライミング）３．ＢＲＣＡ２ｅｘｏｎ１０多型性プライマー（表１参照）：Ｖ６６３ｌ：タグ２０ａＲ４３２−９６：共通プライマー、タグ２０配列のテイル付きＶ９５９６：３^*プライマー、Ａ変異体特異性、Ｔ４０２９（ＴＥＴ）リボーター配列を含むＷ１９４０：３^*プライマー、Ｃ変異体特異性、Ｔ２１２０（ＦＡＭ）リポーター配列を含むプローブ：Ｔ２１２０：ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ標識Ｔ４０２９：ＴＥＴ／ＴＡＭＲＡ標識反応条件：反応はすべて、最終３．５ｍＭに調整したＭｇＣｌ₂、ならびに最終６０ｎＭのＲＯＸ内標準、および５００ｎＭのタグ２０ａを含む１×ＡＲＭＳ緩衝液中で実施された。反応液５０μｌ当たり２単位のAmplitaq Goldを含有させた。一般に３種類の混合物を用いた：ａ．“Ａ”のみの反応、プライマーＲ４３２−９６およびＶ９５９６各２５ｎＭ、Ｔ４０２９５０ｎＭを含むｂ．“Ｇ”のみの反応、プライマーＲ４３２−９６およびＷ１９４０各２５ｎＭ、Ｔ２１２０５０ｎＭを含むｃ．ＳＴＧ、３プライマーすべて２５ｎＭ)、プローブ各５０ｎＭを含むサイクル条件： Amplitaq Gold活性化のために９４℃で２０分４サイクル９４℃で４０秒；６０℃で８０秒；７２℃で４０秒（ゲノムプライミング）４５サイクル９４℃で４０秒；６４℃で８０秒（タグプライミング）４．第５因子ライデン変異プライマー（表１参照）：Ｖ０６５１：３^*プライマー（野生型配列）、Ｔ２１２０に対応するリポーター領域を含むＶ０６５２：３４プライマー（変異配列）、Ｔ４０２９に対応するリポーター域を含むＷ４０８５：テイル付き共通プライマータグ２０ａ共通プライマーおよび特異的プライマーにみられるドライバープライマープローブ：Ｔ２１２０：ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ標識Ｔ４０２９：ＴＥＴ／ＴＡＭＲＡ標識反応混合物：反応はすべて、最終３．５ｍＭに調整したＭｇＣｌ₂、ならびに最終６０ｎＭのＲＯＸ内標準、および５００ｎＭのタグ２０ａを含む１×ＡＲＭＳ緩衝液中で実施された。反応液５０μｌ当たり２単位のAmplitaq Goldを含有させた。一般に３種類の混合物を用いた：ａ．正常体のみの反応、プライマーＷ４０８５およびＶ０６５１各２５ｎＭ、Ｔ２１２０５０ｎＭを含むｂ．変異体のみの反応、プライマーＷ４０８５およびＶ０６５２各２５ｎＭ、Ｔ４０２９５０ｎＭを含むｃ．ＳＴＧ、３プライマーすべて２５ｎＭ）両プローブ各５０ｎＭを含むサイクル条件： Amplitaq Gold活性化のために９４℃で２０分３サイクル９４℃で４１秒；６０℃で８０秒；７２℃で５１秒（ゲノムプライミング）４５サイクル９４℃で４１秒；６６℃で８０秒（タグプライミング）証明２００以上の臨床試料をＳＴＧ配合物で盲検試験した。それぞれの場合、得られた結果は、同一試料を識別するためにＰＣＲおよび制限消化を用いた臨床共同研究者が得た結果と一致した。表１

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ブラウニ，ジャニンイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．試料に含まれる核酸の診断用塩基配列の検出方法であって、試料をハイブリダイゼーション条件下で、適切なヌクレオシド三リン酸およびその重合化剤の存在下に、診断用塩基配列に対する診断用プライマーと接触させ、この診断用プライマーは、対応する診断用塩基配列が試料中に存在した場合には診断用プライマーの延長生成物が合成され、対応する診断用塩基配列が試料中に存在しない場合には延長生成物が合成されないような、タグ領域および検出領域を含む非相補テイル配列を有し、診断用プライマーの延長生成物があればこれが診断用塩基配列から距離を置いた遺伝子座にハイブリダイズする追加のプライマーの延長のための鋳型として作用し、そして試料を追加のプライマーの延長生成物のタグ配列の相補配列に選択的にハイブリダイズして延長されるタグプライマーと接触させ、そして追加のプライマーの延長生成物中の検出領域を基準として診断用塩基配列の存否を検出することを含む方法。２．追加のプライマーの延長生成物中の検出領域と選択的に会合する検出種を使用する、請求項１記載の方法。３．検出種がタグプライマーのポリメラーゼ仲介延長に際し開裂すると検出可能な信号を発する、請求項２記載の方法。４．検出種が検出領域と選択的に会合すると検出可能な信号を発する、請求項２記載の方法。５．検出種が蛍光標識種であり、検出領域と選択的に会合すると蛍光偏光の変化により検出可能な信号が発せられる、請求項４記載の方法。６．検出種が、それぞれ相互作用性標識を有する２つの種を含み、これらの標識が検出領域と選択的に会合すると相互作用し、検出可能な信号を発する、請求項２記載の方法。７．相互作用性標識の一方がキレートしたランタニドであり、他方が他のキレート性基である、請求項６記載の方法。８．追加のプライマーの延長生成物が、追加のプライマーの延長生成物中の検出領域相補配列と選択的に会合する種を用いて固相に捕獲される、請求項１記載の方法。９．検出種が診断用プライマーのテイル中の検出領域の配列と等しいヌクレオチド配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。１０．タグプライマーが診断用プライマーのテイル中のタグ領域の配列と等しいヌクレオチド配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。１１．追加のプライマーの延長生成物中の検出領域が、追加のプライマー／タグプライマー増幅生成物へのサイズの寄与を基準として同定される、請求項１記載の方法。１２．追加のプライマーが、タグ領域を含む非相補テイル配列を有する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。１３．追加のプライマーが診断用プライマーである、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。１４．タグプライマーの融解温度が診断用プライマーのものより高く、したがって温度上昇により診断用プライマープライミングからタグプライマープライミングに切り替えられる、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。１５．試料中で２種類以上の診断用塩基配列が２種類以上の診断用プライマー、適切な追加のプライマー（１またはそれ以上）およびタグ領域を用いて検出される、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。１６．すべての診断用プライマーおよび／またはすべての追加のプライマーのテイル中に同一のタグ配列を使用する、請求項１５記載の方法。１７．すべての診断用プライマーのテイル中に同一の検出配列を使用する、請求項１５記載の方法。１８．１種類の追加のプライマーを２種類以上の診断用プライマーと共に使用する、請求項１５記載の方法。１９．少なくとも１種類の診断用プライマーの末端ヌクレオチドが、疑わしい変異ヌクレオチドまたは対応する正常ヌクレオチドに相補的である、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。２０．タグ領域および検出領域を含む非相補テイル配列を有する診断用プライマー。２１．疑わしい変異ヌクレオチドもしくは対応する正常ヌクレオチドに相補的である３’末端ヌクレオチドを有し、かつタグ領域および検出領域を含む非相補テイル配列を有する診断用プライマー。２２．請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法または請求項２０もしくは２１記載の診断用プライマーの使用を含む、１種類またはそれ以上の変異した診断用塩基配列を正常な診断用塩基配列のバックグラウンドに対し同定する方法。２３．請求項２０または２１記載の診断用プライマー１種類またはそれ以上を、適切な包装、および請求項１〜１９または２２のいずれか１項記載の方法で使用するための指示書と共に含むキット。