RU2675378C1 - Способ детекции последовательностей нуклеотидов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с универсальным зондом - Google Patents
Способ детекции последовательностей нуклеотидов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с универсальным зондом Download PDFInfo
- Publication number
- RU2675378C1 RU2675378C1 RU2017129209A RU2017129209A RU2675378C1 RU 2675378 C1 RU2675378 C1 RU 2675378C1 RU 2017129209 A RU2017129209 A RU 2017129209A RU 2017129209 A RU2017129209 A RU 2017129209A RU 2675378 C1 RU2675378 C1 RU 2675378C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primer
- region
- complementary
- probe
- sequence
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title abstract description 13
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001075125 Ovis aries Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 241000923571 Sporobolus michauxianus Species 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу детекции последовательности нуклеотидов при проведении полимеразной цепной реакции. Раскрыт способ детекции специфических нуклеотидных последовательностей с помощью ПЦР в реальном времени, включающий приготовление реакционной смеси, при этом прямой праймер имеет в своем составе с 3' конца участок, комплементарный детектируемой нуклеотидной последовательности, следующий за ним участок, имеющий идентичную флуоресцентному зонду последовательность, участок в области 5' конца, представляющий собой две комплементарные друг другу последовательности, разделенные некомплементарным участком и гибридизующиеся во время реакции, за счет чего ампликон, полученный с помощью обратного праймера с матрицы, содержащей в своем составе прямой праймер, получает участок для отжига флуоресцентного зонда, а также две комплементарные друг другу последовательности уже на 3' конце, одна из которых после гибридизации выступает в роли праймера и запускает амплификацию с гидролизом зонда, достраивая последовательность на ампликоне с образованием на его 3' конце участка для отжига обратного праймера, что позволяет уже этому праймеру в последующих циклах запускать амплификацию с гидролизом отжигающихся на ампликоне флуоресцентных зондов, что сопровождается нарастанием флуоресценции, путем оценки которой выполняется детекция наличия специфических нуклеотидных последовательностей. Изобретение позволяет использовать один и тот же зонд для детекции любых последовательностей нуклеотидов. 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение:
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу одновременной детекции нескольких специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных замен с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и может быть использован при выявлении различных возбудителей заболеваний, генотипировании человека и животных, обнаружения генетически модифицированных организмов и т.п.
Уровень техники
Известны несколько способов детекции разных нуклеотидных последовательностей методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с универсальным зондом. Одним из первых сообщений об использовании универсального зонда при постановке ПЦР в реальном времени является статья (D. Whitcombe, J. Brownie, Н.L. Gillard, D. McKechnie, J. Theaker, C.R. Newton, S. Little. (1998). A homogeneous fluorescence assay for PCR amplicons: its application to real-time, single-tube genotyping. Clinical Chemistry 44:5 P. 918-923). В ней описана технология Three-Star, на которую впоследствии был получен патент компанией Zeneca (US 6,270,967 B1 Aug. 7, 2001). Сущность метода состоит в использовании "хвостатых" праймеров к матрице ДНК, содержащих на 5' конце участки, комплементарные последовательностям для отжига еще одного праймера и зонда Taq-Man. Это было сделано для того, чтобы зонд и дополнительный праймер не отжигались на основные праймеры, а могли отжечься только на полученные ампликоны. После получения ампликонов на матрице, появлялись места для отжига зонда и праймера. Дальнейшая ПЦР происходила уже с помощью этого дополнительного праймера, во время достройки которого происходил гидролиз зонда и появлялась флуоресценция. Однако, данный метод имел достаточно низкую эффективность, связанную с необходимостью отжига еще и дополнительного праймера.
В работе (Y. Zhang, D. Zhang, W. Li, J. Chen, Y. Peng, W. Cao. (2003). A novel real-time quantitative PCR method using attached universal template probe. Nucleic Acids Research, Vol. 31, N. 20) описан метод, похожий на Three-Star, однако использующий два праймера, один из которых является «хвостатым» и содержит участок для отжига зонда Taq-Man. Его недостатком является необходимость более высокой концентрации праймеров и зонда (100 мкМ, по сравнению с 10 мкМ в стандартных реакциях). Это связано с постоянным отжигом зонда на праймер, чего нет в предыдущей описанной методике - там зонд отжигается только на полученном от двух праймеров ампликоне. Кроме этого, если для метода Three-Star можно использовать и другие типы зондов (например, Beacon), то в данном случае это только Taq-Man.
Метод ТОСЕ от компании Seegene (Y. Lee, D. Kim, K. Lee & J.-Y. Chun. (2014) Single-channel multiplexing without melting curve analysis in real-time PCR. SCIENTIFIC REPORTS | 4 : 7439 | DOI: 10.1038/srep07439) условно также можно отнести к реакциям с универсальным зондом, так как в ходе амплификации матрицы от «хвостатого» зонда отщепляется 5' участок («питчер»), который служит праймером на заранее синтезированной матрице («кэтчер»). Таким образом, для многих праймеров с одинаковым 5' участком может быть в качестве репортера использован один и тот же «кэтчер». Принципиально реакция оказалась достаточно сложной и в реальных условиях показала низкую эффективность.
Метод генотипирования KASP (Н. Graves, A.L. Rayburn, J.L. Gonzalez-Hernandez, G. Nah, Do-Soon Kim and D.K. Lee. Validating DNA Polymorphisms Using KASP Assay in Prairie Cordgrass (Spartina pectinata Link) Populations in the U.S. Front. Plant Sci., 22 January 2016 | https://doi.org/10.3389/fpls.2015.01271) использует универсальный 5' конец праймера, меченый флуорофором, на котором отжигается зонд с тушителем. За счет переноса энергии такой комплекс не излучает свет. При амплификации на «хвосте» праймера достраивается последовательность, не дающая присоединится зонду с тушителем, и молекула флуоресцирует. Метод хорошо подходит для монореакций. При увеличении количества детектируемых последовательностей начинает возрастать фоновая флуоресценция за счет димеризации праймеров и неспецифического отжига. Кроме этого, метод недостаточно дешев, так как для каждой матрицы необходимо синтезировать меченый праймер.
Некоторые авторы относят к универсальным зонды Amplifluor и Scorpion (Е. Navarro, G. Serrano-Heras, M.J. 
, J. Solera. Real-time PCR detection chemistry. Clinica Chimica Acta 439 (2015) 231-250). Однако, это не совсем верно. Действительно, например, у Amplifluor меченая флуорофорами часть может не отличаться при детекции разных матриц. Но она непосредственно связана с праймером и должна быть синтезирована вместе с ним, что не позволяет расценивать данную реакцию как ПЦР с универсальным зондом. Стоимость такой реакции не является низкой, кроме того такие сложные праймеры склонны к димеризации, что снижает эффективность реакции.
Таким образом, наиболее эффективной и специфичной из перечисленных является технология Three-Star. Положенный в ее основу принцип отжига зонда не на матрицу или праймер, а на полученный в результате работы обоих праймеров ампликон, позволяет добиться минимального расхода зонда в ходе реакции и повышения ее специфичности. Это особенно важно для мультиплексных систем, так как распределение зонда по не использующимся в реакции участкам нуклеотидных последовательностей приводит к уменьшению частоты отжига зонда на том участке, где его гарантированно гидролизует полимераза, и, соответственно снижается эффективность реакции.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является разработка нового метода идентификации амплифицируемых в ходе ПЦР последовательностей нуклеотидов с использованием универсального зонда, позволяющего уменьшить количество используемых (особенно в мультиплексных реакциях) зондов, что в свою очередь существенно сократит время разработки новых тест-систем и уменьшит их стоимость. Метод особенно эффективен при использовании в генотипировании, когда необходимо в одном образце определять большое количество полиморфизмов генов, что требует при традиционном подходе синтеза огромного количества дорогостоящих зондов. Применение предложенного способа расширит сферу использования методов генотипирования человека и животных как в научно-исследовательских, так и в диагностических целях.
Технический результат изобретения достигается тем, что предложена новая конструкция праймеров для проведения ПЦР в реальном времени, использование которой позволяет применять универсальный зонд, конструкция которого не зависит от детектируемой последовательности нуклеотидов. Благодаря этому возможно использование одного и того же зонда для детекции любых последовательностей нуклеотидов.
Краткое описание чертежей и их материалов
На фиг. 1, приведены олигонуклеотиды, использованные в примере 1 для детекции последовательности нуклеотидов в гене миостатина у овец.
На фиг. 2, приведены результаты оценки флюоресценции при проведении ПЦР в реальном времени для детекции последовательности нуклеотидов в гене миостатина у овец.
На фиг. 3, приведены олигонуклеотиды, использованные в примере 2 для детекции однонуклеотидной замены в последовательности нуклеотидов гена миостатина овец.
На фиг. 4, приведены результаты оценки флюоресценции при проведении ПЦР в реальном времени для детекции однонуклеотидной замены в последовательности нуклеотидов гена миостатина овец.
На фиг. 5, приведены результаты оценки амплификации методом электрофореза в агарозном геле при проведении детекции последовательности нуклеотидов в гене миостатина у овец.
На фиг. 6, приведена структура прямого праймера, используемого при проведении ПЦР в реальном времени с универсальным зондом.
На фиг. 7, дан чертеж способа выполнения ПЦР в реальном времени с универсальным зондом.
Сущность способа состоит в том, что при проведении ПЦР в реальном времени используется прямой праймер особой конструкции, обеспечивающей образование в ампликоне последовательности нуклеотидов для отжига флуоресцентного зонда и формирование собственного праймера в виде «шпильки» на 3' конце, запускающего амплификацию и гидролиз зонда. Таким образом достигается возможность применения одного флуоресцентного зонда для детекции любых нуклеотидных последовательностей и повышение эффективности реакции за счет использования прикрепленного к 3' концу собственного праймера.
Строение прямого праймера представлено на фигуре 6. Участок праймера (а) расположен на 3' конце и комплементарен участку на детектируемой последовательности нуклеотидов. По сути, он представляет собой обычный праймер для ПЦР, с которого после гибридизации с детектируемой последовательностью нуклеотидов полимераза начинает достройку второй цепи. «Хвост» праймера, не комплементарный детектируемой последовательности нуклеотидов, содержит четыре участка. Участок (b) представляет собой последовательность нуклеотидов, идентичную структуре флуоресцентного зонда (например, зонда TaqMan). На самом праймере зонд не отжигается, так как имеет идентичную, а не комплементарную последовательность нуклеотидов. Но этот участок служит матрицей для образования на противоположной цепи участка для отжига флуоресцентного зонда. Участки (с) и (е) комплементарны друг другу и при достижении температуры отжига праймеров гибридизуются, образуя «шпильку», включающую промежуточный участок (d). Так как «шпилька» расположена на 5' конце, она не может служить собственный праймером и запускать амплификацию. Однако, она служит матрицей для образования на противоположной цепи «шпильки» с 3' концом нуклеотидной последовательности, которая может стать собственным праймером и запустить амплификацию.
Сущность предлагаемого способа ПЦР в реальном времени с универсальным зондом иллюстрирует фигура 7. Для амплификации детектируемой последовательности (3) используется два праймера: прямой (1) и обратный (2). Они отжигаются на противоположные цепи и запускают амплификацию навстречу друг другу. После амплификации и денатурации образуется два вида ампликонов: первый (4) является результатом достройки прямого праймера (1) и содержит участок для отжига обратного праймера (2); второй является результатом достройки обратного праймера (2) и содержит участок для отжига прямого праймера (1). На следующем цикле ПЦР прямой праймер (1) отжигается на ампликоне, полученном достройкой обратного праймера (2), а праймер (2) отжигается на ампликоне (4), полученном достройкой прямого праймера (1). В результате этого цикла формируется ампликон (5), представляющий собой последовательность нуклеотидов, комплементарную ампликону (4). Особенностью ампликона (5) является то, что в нем имеется участок, комплементарный флуоресцентному зонду (6) и «шпилька» расположена на 3' конце. В течение следующего цикла ПЦР происходит отжиг флуоресцентного зонда на ампликоне (5) и запуск амплификации с собственного праймера в области «шпильки». В результате происходит гидролиз флуоресцентного зонда с освобождением флуорофора (7) и появлением детектируемой прибором для ПЦР в реальном времени флуоресценции в реакционной смеси. После достройки последовательности нуклеотидов на ампликоне (5) образуется новый вид ампликона (8), который почти вдвое длиннее ампликона [5) и содержит участок для отжига обратного праймера (2). Обратный праймер (2) запускает достройку цепи на ампликоне (8), где также отжигается флуоресцентный зонд (6). При достройке цепи на ампликоне (8) происходит гидролиз зонда (6) с освобождением флуорофора (7) и увеличением детектируемой флуоресценции. В последующих цикла ПЦР описанные процессы происходят параллельно, то есть гидролиз флуоресцентных зондов идет на разных видах ампликонов, что повышает эффективность реакции.
Отличием и преимуществом предлагаемого метода над технологией Three-Star является использование всего двух праймеров вместо трех, использование обратного праймера обычной структуры (без «хвоста» для отжига третьего праймера), использование прямого праймера, содержащего «хвост» не с участком для отжига третьего праймера, а «шпильку», работающую в качестве собственного праймера. В результате эффективность предлагаемого метода гораздо выше, чем при использовании отдельного праймера, отжигающегося из реакционной смеси.
Осуществление изобретения.
Была оценена общая эффективность предлагаемого метода ПЦР в реальном времени с универсальным зондом. Примеры конкретного выполнения детекции разных нуклеотидных последовательностей с одним и тем же флуоресцентным зондом.
Пример 1.
Способ осуществляется следующим образом для выявления наличия определенной последовательности нуклеотидов в образце. В данном случае выполняется детекция наличия участка гена миостатина в образце ДНК овцы:
1. Синтезируется набор олигонуклеотидов, состоящий из прямого праймера, обратного праймера и меченого олигонуклеотида (флуоресцентного зонда) (фигура 1). Использовались олигонуклеотиды, синтезированные компаниями «Синтол» и «ГенТерра». Очищены электрофорезом в полиакриламидном геле. Поставлялись в лиофилизированном виде, перед использованием разводились согласно прилагаемым инструкциям.
2. Приготавливается реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл. В качестве основы используется 10 мкл реакционной 2,5х смеси для проведения ПЦР-РВ фирмы «Синтол» с содержанием магния 6,25 мкМ. Готовая для проведения реакции смесь содержит прямой праймер в концентрации 0,8 мкМ, обратный праймер в концентрации 1,2 мкМ, флуоресцентный зонд в концентрации 0,8 мкМ. Смесь готовится в двух пробирках, в одну из которых (№1) добавляют 5 мкл тестового образца в концентрации 0.1 мкМ, состоящего из ДНК овцы, выделенной из клеток крови животного. В пробирку (№2) добавляется такое же количество дистиллированной воды.
3. Выполняется амплификация на амплификаторе «Mini Opticon» (BioRad) в следующем режиме:
1. Инициация денатурации 94°С - 2 минуты
2. Денатурация 94°С - 15 сек.
3. Отжиг праймеров 38°С - 30 сек.
4. Элонгация 72°С - 30 сек.
5. Детекция флуоресценции начиная с 10 цикла.
6. Повторение пунктов 2-4 44 раза.
4. График детекции флуоресценции в пробе и контрольной пробирке представлен на фигуре 2. В пробе, содержащей нуклеотидную последовательность гена миостатина отмечается начало детектируемой прибором флуоресценции на 32 цикле с экспоненциальным подъемом кривой флуоресценции на 32-44 циклах. В контрольной пробирке без образца флуоресценция не наблюдается. Полученный результат указывает на амплификацию участка гена миостатина праймерами, формирование на ампликонах участка для отжига флуоресцентного зонда и гидролиз зонда полимеразой в ходе амплификации.
Пример 2.
Способ осуществляется следующим образом для выявления наличия определенной последовательности нуклеотидов в образце. В данном случае выполняется детекция наличия однонуклеотидной замены на участке гена миостатина в образце ДНК овцы:
1. Синтезируется набор олигонуклеотидов, состоящий из прямого праймера, имеющего на 3' конце последовательность нуклеотидов, комплементарную участку с однонуклеотидной заменой, обратного праймера и меченого олигонуклеотида (флуоресцентного зонда) (фигура 3). Использовались олигонуклеотиды, синтезированные компаниями «Синтол» и «Бигль». Очищены электрофорезом в полиакриламидном геле. Поставлялись в лиофилизированном виде, перед использованием разводились согласно прилагаемым инструкциям.
2. Приготавливается реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл. В качестве основы используется 10 мкл реакционной 2,5х смеси для проведения ПЦР-РВ фирмы «Синтол» с содержанием магния 6,25 мкМ. Готовая для проведения реакции смесь содержит прямой праймер в концентрации 0,8 мкМ, обратный праймер в концентрации 1,2 мкМ, флуоресцентный зонд в концентрации 0,8 мкМ. Смесь готовится в двух пробирках, в одну из которых (№1) добавляют 5 мкл тестового образца в концентрации 0.1 мкМ, состоящего из ДНК овцы, выделенной из клеток крови животного. В пробирку (№2) добавляется такое же количество дистиллированной воды.
3. Выполняется амплификация на амплификаторе «Mini Opticon» (BioRad) в следующем режиме:
1. Инициация денатурации 94°С - 2 минуты
2. Денатурация 94°С - 15 сек.
3. Отжиг праймеров 38°С - 30 сек.
4. Элонгация 72°С - 30 сек.
5. Детекция флуоресценции начиная с 10 цикла.
6. Повторение пунктов 2-4 44 раза.
4. График детекции флуоресценции в пробе и контрольной пробирке представлен на фигуре 4. В пробирке (№1), содержащей нуклеотидную последовательность гена миостатина с наличием однонуклеотидной замены в структуре гена отмечается начало детектируемой прибором флуоресценции на 32 цикле с экспоненциальным подъемом кривой флуоресценции на 32-44 циклах. В пробирке (№2) и контрольной пробирке (№3) без образца флуоресценция не наблюдается. Полученный результат указывает на амплификацию участка гена миостатина с наличием однонуклеотидной замены праймерами, формирование на ампликонах участка для отжига флуоресцентного зонда и гидролиз зонда полимеразой в ходе амплификации.
Пример 3.
Способ осуществляется аналогично описанному в Примере 1. После анализа результатов ПЦР в реальном времени выполняется детекция продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле.
1. Подготавливается агарозный гель в концентрации 2%.
2. На гель наносится раствор, содержащий олигонуклеотиды известной длины (ладер, производство компании «Синтол») в количестве 10 мкл (лунка 1), 10 мкл содержимого пробирки (№1) в дубле (лунки 2 и 3) и 10 мкл содержимого пробирки (№2) в лунку 4.
3. Выполняется электрофорез напряжением 120 вольт в течение 35 минут.
4. Гель помещается в трансиллюминатор и фотографируется.
5. Фотография геля приведена на фигуре 5. Полоса (1) представляет результат разгона в электрическом поле олигонуклеотидов известной длины. Полосы (2) и (3) содержит результаты разгона олигонуклеотидов из пробирки (№1), в которой по данным анализа флуоресценции прошла амплификация участка гена миостатина. Полоса (4) содержит результаты разгона в электрическом поле содержимого контрольной пробирки (№3), в которой амплификация не зафиксирована. Как можно заметить, свечение в полосах (2) и (3) находится на уровне олигонуклеотидов длиной около 200-250 пар оснований в полосе (1), что соответствует длине амплифицируемого участка по данным базы GenBank NCBI. Таким образом, анализ результатов амплификации методом электрофореза в агарозном геле показал, что при использовании предлагаемого метода ПЦР в реальном времени с универсальным зондов происходит амплификация и детекция нужного участка гена миостатина.
Claims (3)
1. Способ детекции специфических нуклеотидных последовательностей с помощью ПЦР в реальном времени, включающий приготовление реакционной смеси, отличающийся тем, что прямой праймер имеет в своем составе с 3' конца участок, комплементарный детектируемой нуклеотидной последовательности, следующий за ним участок, имеющий идентичную флуоресцентному зонду последовательность, участок в области 5' конца, представляющий собой две комплементарные друг другу последовательности, разделенные некомплементарным участком и гибридизующиеся во время реакции, за счет чего ампликон, полученный с помощью обратного праймера с матрицы, содержащей в своем составе прямой праймер, получает участок для отжига флуоресцентного зонда, а также две комплементарные друг другу последовательности уже на 3' конце, одна из которых после гибридизации выступает в роли праймера и запускает амплификацию с гидролизом зонда, достраивая последовательность на ампликоне с образованием на его 3' конце участка для отжига обратного праймера, что позволяет уже этому праймеру в последующих циклах запускать амплификацию с гидролизом отжигающихся на ампликоне флуоресцентных зондов, что сопровождается нарастанием флуоресценции, путем оценки которой выполняется детекция наличия специфических нуклеотидных последовательностей.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на праймере между участком, идентичным последовательности флуоресцентного зонда, и участком, содержащим две комплементарные друг другу последовательности, имеется участок, содержащий не комплементарную другим участкам праймера последовательность.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на праймере между участком, идентичным последовательности флуоресцентного зонда, и участком, комплементарным детектируемой последовательности нуклеотидов, имеется участок, содержащий не комплементарную другим участкам праймера последовательность.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017129209A RU2675378C1 (ru) | 2017-08-15 | 2017-08-15 | Способ детекции последовательностей нуклеотидов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с универсальным зондом |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017129209A RU2675378C1 (ru) | 2017-08-15 | 2017-08-15 | Способ детекции последовательностей нуклеотидов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с универсальным зондом |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2675378C1 true RU2675378C1 (ru) | 2018-12-19 |
Family
ID=64753357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017129209A RU2675378C1 (ru) | 2017-08-15 | 2017-08-15 | Способ детекции последовательностей нуклеотидов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с универсальным зондом |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2675378C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2808846C1 (ru) * | 2023-10-21 | 2023-12-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs8107914 (CT) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6270967B1 (en) * | 1996-05-04 | 2001-08-07 | Zeneca Limited | Method for detecting a nucleic acid base sequence |
| RU2451086C1 (ru) * | 2010-12-03 | 2012-05-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Смоленская государственная медицинская академия федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию | Способ детекции специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных замен с помощью пцр в режиме реального времени с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером |
| WO2017021449A1 (en) * | 2015-08-06 | 2017-02-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Target enrichment by single probe primer extension |
-
2017
- 2017-08-15 RU RU2017129209A patent/RU2675378C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6270967B1 (en) * | 1996-05-04 | 2001-08-07 | Zeneca Limited | Method for detecting a nucleic acid base sequence |
| RU2451086C1 (ru) * | 2010-12-03 | 2012-05-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Смоленская государственная медицинская академия федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию | Способ детекции специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных замен с помощью пцр в режиме реального времени с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером |
| WO2017021449A1 (en) * | 2015-08-06 | 2017-02-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Target enrichment by single probe primer extension |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NAVARRO E. et al. Real-time PCR detection chemistry // Clinica Chimica Acta, 2015, V.439, pp.231-250. * |
| КОНДРАТОВА В.Н. и др. Выявление мутаций в "горячих" участках генома: ампликоны-"шпильки" в методе плавления ДНК // Успехи молекулярной онкологии, 01.03.2017, Т.4, стр.46-52. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2810472C1 (ru) * | 2023-10-19 | 2023-12-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs11666524 (G>A) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
| RU2808846C1 (ru) * | 2023-10-21 | 2023-12-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs8107914 (CT) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
| RU2810474C1 (ru) * | 2023-10-21 | 2023-12-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs2901077 (C>T) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11827923B2 (en) | Method of fluorescent detection of isothermal loop-mediated amplification (LAMP) of a target nucleic acid, oligonucleotides and kits thereof | |
| JP7175326B2 (ja) | 標的核酸増幅方法及び標的核酸増幅用組成物 | |
| JP2010506592A5 (ru) | ||
| WO2004059009A1 (en) | A method of real-time detection of nucleic acid sequences | |
| US20140017692A1 (en) | Method and kit for detecting target nucleic acid | |
| JP2011530296A5 (ru) | ||
| RU2011107993A (ru) | Алгоритм обнаружения для пцр-анализа | |
| JP2004532044A (ja) | 検出システム | |
| Farzan et al. | Novel homo Yin-Yang probes improve sensitivity in RT-qPCR detection of low copy HIV RNA | |
| EP2226395B1 (en) | Method and Kit for the detection of allergens | |
| US20200123598A1 (en) | Molecular fingerprinting methods to detect and genotype dna targets through polymerase chain reaction | |
| JP2007125011A5 (ru) | ||
| JPWO2003100095A1 (ja) | 標的核酸の検出法 | |
| JP2007125011A (ja) | ポリメラーゼ連鎖反応の助けによりｄｎａ又はｒｎａの特定のフラグメントを検出する方法 | |
| RU2675378C1 (ru) | Способ детекции последовательностей нуклеотидов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с универсальным зондом | |
| ES2911458T3 (es) | Procedimiento para la detección de secuencias de ácido nucleico específicas | |
| JP2016534708A (ja) | オーバーラッププライマー及び融解プローブを用いた一塩基多型の検出 | |
| JP6277603B2 (ja) | 百日咳菌の検出方法 | |
| KR20160134982A (ko) | Ｔｍ 값 분석을 이용한 동시다중 실시간 PCR 산물 분석 방법 | |
| KR20100042464A (ko) | 시료 중의 살모넬라 풀로룸 및 살모넬라 갈리나룸 중 하나 이상의 존재를 검출하는 방법 및 키트 | |
| KR101761862B1 (ko) | 표적 핵산에 대한 검출 정확도를 높이기 위한 프로브 세트 및 상기 프로브 세트를 이용하여 표적 핵산을 검출하는 방법 | |
| TW201604284A (zh) | 檢測蛙病毒３型之引子組、檢驗套組及其方法 | |
| KR101753833B1 (ko) | 절단 가능한 프로브를 이용한 만성골수성백혈병 유전자의 멀티플렉스 검출 방법 | |
| ES2923224T3 (es) | Oligonucleótidos y métodos para el control interno de las reacciones de amplificación de ADN eucariota | |
| WO2022215574A1 (ja) | 対立遺伝子の検出方法及び対立遺伝子の検出キット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190816 |