RU2810472C1 - Способ генотипирования полиморфного локуса rs11666524 (G>A) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов - Google Patents
Способ генотипирования полиморфного локуса rs11666524 (G>A) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810472C1 RU2810472C1 RU2023126865A RU2023126865A RU2810472C1 RU 2810472 C1 RU2810472 C1 RU 2810472C1 RU 2023126865 A RU2023126865 A RU 2023126865A RU 2023126865 A RU2023126865 A RU 2023126865A RU 2810472 C1 RU2810472 C1 RU 2810472C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- allele
- c19orf53
- gene
- insdseq
- insdqualifier
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 101150005505 C19orf53 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 31
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 101001009985 Homo sapiens Leydig cell tumor 10 kDa protein homolog Proteins 0.000 description 5
- 102100030939 Leydig cell tumor 10 kDa protein homolog Human genes 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000969327 Homo sapiens Methylthioribose-1-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 101000793153 Homo sapiens Probable splicing factor YJU2B Proteins 0.000 description 1
- 101000802365 Homo sapiens Zinc finger SWIM domain-containing protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100021415 Methylthioribose-1-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102100030966 Probable splicing factor YJU2B Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102100034991 Zinc finger SWIM domain-containing protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001876 chaperonelike Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000007111 proteostasis Effects 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, молекулярно-генетической диагностике и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфного варианта rs11666524 (G>A) гена C19orf53. Предложен способ генотипирования полиморфного локуса rs11666524 (G>A) C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, предусматривающий проведение ПЦР с использованием специально подобранных праймеров (прямого 5′-GCCCCTATTTTGCCCTTAGA-3′ и обратного 5′-GGCTTCTGTGAGAGGACCAG-3′) и зондов c флуорофорами (G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)TCCCACCGGGACCAGTGC(RTQ1)-3′ и A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX) TCCCACCAGGACCAGTGC(BHQ2)-3′) в амплификаторе с детекцией флуоресценции. Изобретение позволяет расширить арсенал способов генотипирования полиморфных вариантов гена C19orf53, отличается простотой и точностью. 1 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs11666524 (G>A) гена C19orf53 молекулярно-генетическим методом исследования.
Уровень техники. C19orf53 впервые был описан в 2020 г. учеными из Японии, которые открыли открыты шапероноподобные свойства C19orf53 и его ключевую роль в восстановлении нативной третичной и четвертичной структуры поврежденных белков, что позволило отнести данный белок к новому классу шаперонов - heat-resistant obscure («термостойкие неясные») [Tsuboyama K. et al. A widespread family of heat-resistant obscure (Hero) proteins protect against protein instability and aggregation //PLoS Biology. - 2020. - Vol. 18. - №. 3. - P. e3000632]. Значительно возросший интерес исследователей к данному белку требует проведения молекулярно-генетических исследований гена C19orf53 в аспекте связи с широким спектром заболеваний человека, характеризующихся нарушением протеостаза.
Ген C19orf53 (Gene ID: 28974) локализован на хромосоме 19p13.13. Согласно SNPinfo Web Server/ LD TAG SNP Selection [https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html] полиморфный вариант rs2901077 гена C19orf53 является таргетным (то есть репрезентативным однонуклеотидным полиморфизмом в геномной области с высокой степенью неравновесия по сцеплению с группами других полиморфных локусов, составляющих гаплотип). Однонуклеотидный полиморфизм rs11666524, позиция chr19:13776364 (GRCh38.p14) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs11666524) локализован в интроне и характеризуется заменой G>A,С. Однако, аллель C встречается с частотой <0.000001 в европейских популяциях и также характеризуется низкой частотой в других популяциях мира, в связи с чем именно замена G>A является актуальной для исследований многофакторных болезней человека. Согласно биоинформатическому ресурсу eQTLGen [https://www.eqtlgen.org/], генетический вариант rs11666524 (G>A) влияет на экспрессию генов C19orf53, MRI1, CCDC130, ZSWIM4. Кроме того, обнаружена значительная связь rs11666524 с модификациями гистонов, маркирующими промоторы и энхансеры в различных тканях [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs11666524]; влияние данного генетического варианта на связывание с транскрипционными факторами [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs11666524 гена C19orf53.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.
За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs11666524 (A/G) C19orf53 (Assay ID C___2994054_10; каталога 4351379) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.
Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs11666524 (G>A) гена C19orf53, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.
Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs11666524 (G>A), локализованного в позиции chr19:13776364 (GRCh38.p14) гена C19orf53 (Gene ID: 28974) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX.
Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs11666524 (G>A) гена C19orf53 осуществляют с использованием прямого праймера rs11666524 5′-GCCCCTATTTTGCCCTTAGA-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs11666524 5′- GGCTTCTGTGAGAGGACCAG -3′ (SEQ ID NO 2), rs11666524 -G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)TCCCACCGGGACCAGTGC(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3),
rs11666524-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX) TCCCACCAGGACCAGTGC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs11666524 гена C19orf53 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs11666524-G/G показаны оранжевыми кругами, генотипы rs11666524-G/A показаны зелеными треугольниками, генотипы rs11666524-A/A показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.
Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:
1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [G/A] rs11666524 C19orf53, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:
прямой общий праймер rs11666524 5′-GCCCCTATTTTGCCCTTAGA-3′ (SEQ ID NO 1),
обратный общий праймер rs11666524 5′-GGCTTCTGTGAGAGGACCAG-3′ (SEQ ID NO 2).
Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена C19orf53 составляет 153 пары нуклеотидов:
2). Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.
На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:
rs11666524-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)TCCCACCGGGACCAGTGC(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3),
rs11666524-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX) TCCCACCAGGACCAGTGC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.
4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 59°C в течение 1 минуты].
5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 95 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs11666524 55 человек (57,89%) оказались гомозиготами по аллелю G (генотип G/G); 38 человек (40,00%) являлись гетерозиготами (генотип G/A), 2 человека (1,11%) индивидуумов оказались гомозиготами по аллелю А (генотип A/A).
6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs11666524 (G>A) гена C19orf53 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).
Осуществление изобретения.
Способ осуществляют следующим образом:
1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.
2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.
3. Анализ полиморфизма rs11666524 (G>A) гена C19orf53 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3),
A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).
ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкM каждого праймера, по 5 мкM каждого зонда, 0.03 мM каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl2; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 59°C в течение 1 минуты].
4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs11666524 (G>A) гена C19orf53 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю G, зонд с красителем ROX - аллелю A (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот G/G. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот A/A. Кластер зеленых треугольников соответствует накоплению уровня флуоресценции по обоим зондам и позволяет идентифицировать гетерозигот G/A.
Резюме.
Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs11666524 (G>A) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена C19orf53, а также в научных целях.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ
генотипирования полиморфного локуса rs11666524 (G A) гена C19orf53 у
человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением
аллель-специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-10-09">
<ApplicantFileReference>1815</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное образовательное учреждение высшего образования
"Курский государственный медицинский университет"
Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical
University</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования
полиморфного локуса rs11666524 (G>A) гена C19orf53 у человека
методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением
аллель-специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcccctattttgcccttaga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggcttctgtgagaggaccag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcccaccgggaccagtgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcccaccaggaccagtgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (1)
- Способ генотипирования полиморфного локуса rs11666524 (G>A) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs11666524 (G>A) гена C19orf53 осуществляют с использованием прямого праймера rs11666524 5′-GCCCCTATTTTGCCCTTAGA-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs11666524 5′-GGCTTCTGTGAGAGGACCAG-3′ (SEQ ID NO 2), rs11666524-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)TCCCACCGGGACCAGTGC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs11666524-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX) TCCCACCAGGACCAGTGC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2810472C1 true RU2810472C1 (ru) | 2023-12-27 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2821905C1 (ru) * | 2024-04-02 | 2024-06-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs706121 (C>T) гена BAG1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9506117B2 (en) * | 2012-02-21 | 2016-11-29 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| RU2675378C1 (ru) * | 2017-08-15 | 2018-12-19 | Александр Юрьевич Криворучко | Способ детекции последовательностей нуклеотидов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с универсальным зондом |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9506117B2 (en) * | 2012-02-21 | 2016-11-29 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| RU2675378C1 (ru) * | 2017-08-15 | 2018-12-19 | Александр Юрьевич Криворучко | Способ детекции последовательностей нуклеотидов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с универсальным зондом |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Бочарова Ю. А. Исследование ассоциаций трѐх полиморфных вариантов гена глутатионсинтазы (GSS) c риском развития ишемического инсульта. Научные результаты биомедицинских исследований. 2020; 6(4): 476-487. Бушуева О. Ю. Роль генов, кодирующих шапероны семейства Hero, в развитии и течении ишемического инсульта, РНФ, 02.04.2022, весь документ, https://rscf.ru/project/22-15-00288/. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2821905C1 (ru) * | 2024-04-02 | 2024-06-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs706121 (C>T) гена BAG1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
| RU2821904C1 (ru) * | 2024-04-18 | 2024-06-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs7949972 (C>T) гена ELF5 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20100222227A1 (en) | Rapid genotyping analysis and the device thereof | |
| CN110484621B (zh) | 一种肝癌早期预警的方法 | |
| US20040077020A1 (en) | Diagnostic microarray for inflammatory bowel disease, crohn's disease and ulcerative colitis | |
| EP2964780B1 (en) | Discrimination of blood type variants | |
| JP4515524B2 (ja) | 正常眼圧緑内障疾患感受性遺伝子及びその利用 | |
| RU2810472C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs11666524 (G>A) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2819835C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs7951676 (GT) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2810474C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs2901077 (C>T) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2819930C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs10832676 (A>G) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2819931C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs11024031 (TC) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2819936C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs3802963 (CG) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме реального времени с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2820349C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs10766342 (GA) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2820348C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs11024032 (CT) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме реального времени с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2819255C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs11024030 (T>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821905C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs706121 (C>T) гена BAG1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2819840C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs6677 (T>G) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2808839C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs346158 (T>C) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821923C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs7155973 (A>G) гена HSP90AA1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2808841C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs346157 (A>G) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2808846C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs8107914 (CT) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821925C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs67579710 (G>A) гена THBS3 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2820347C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821904C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs7949972 (C>T) гена ELF5 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821922C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs12610495 (A>G) гена DPP9 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2807808C1 (ru) | Набор праймеров и зондов для генотипирования полиморфного локуса rs12566098 (CG) гена SERBP1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" |