RU2819255C1 - Способ генотипирования полиморфного локуса rs11024030 (T>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов - Google Patents
Способ генотипирования полиморфного локуса rs11024030 (T>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2819255C1 RU2819255C1 RU2023135614A RU2023135614A RU2819255C1 RU 2819255 C1 RU2819255 C1 RU 2819255C1 RU 2023135614 A RU2023135614 A RU 2023135614A RU 2023135614 A RU2023135614 A RU 2023135614A RU 2819255 C1 RU2819255 C1 RU 2819255C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- c11orf58
- allele
- insdseq
- insdqualifier
- Prior art date
Links
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 29
- 101000615355 Homo sapiens Small acidic protein Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102100021255 Small acidic protein Human genes 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000721642 Homo sapiens Phosphatidylinositol 4-phosphate 3-kinase C2 domain-containing subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001876 chaperonelike Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ генотипирования полиморфного локуса rs11024030 (T>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме реального времени с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов. Идентификацию аллельных вариантов Т/С rs11024030 гена C11orf58 осуществляют с использованием разработанных праймеров. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs11024030 (T>C), локализованного в позиции chr11:16749066 (GRCh38) гена C11orf58 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащих флуорофоры FAM и ROX. 1 ил., 1 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs11024030 (T>C) гена C11orf58 молекулярно-генетическим методом исследования.
Уровень техники.
Ген C11orf58 кодирует белок, открытый в 2020 г. японскими учеными [Tsuboyama K. et al. A widespread family of heat-resistant obscure (Hero) proteins protect against protein instability and aggregation //PLoS Biology. - 2020. - Vol. 18. - №. 3. - P. e3000632]. Данный белок характеризуется высокой устойчивостью к воздействию неблагоприятных физических и химических факторов и способствует восстановлению нативной третичной или четвертичной структуры других белков в условиях стресса, что доказывает его выраженные шапероноподобные свойства. Потенциально значимая роль данного белка в широком спектре заболеваний (нейродегенеративных, атеросклероза и др.) определяет необходимость проведения молекулярно-генетических исследований гена C11orf58 и разработки методик генотипирования полиморфных вариантов данного гена.
Ген C11orf58 (Gene ID: 10944) локализован на хромосоме 11p15.2. Однонуклеотидный полиморфизм rs11024030, позиция chr11:16749066 (GRCh38) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs11024030] локализован в интроне и характеризуется заменой T>C. Согласно биоинформатическим ресурсам, данный генетический вариант характеризуется cis-eQTL-опосредованным влиянием на снижение экспрессии генов C11orf58 и PIK3C2A в периферической крови [https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html], ассоциирован с модификациями гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры в различных тканях [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs11024030]; установлено влияние данного генетического варианта на связывание с транскрипционными факторами в зависимости от носительства референсного/альтернативного аллелей [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это доказывает функциональную значимость данного генетического варианта и создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs11024030 (T>C) гена C11orf58.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 // Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.
За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs11024030 (C/T) гена C11orf58 (C__30817390_10; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.
Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs11024030 (T>C) гена C11orf58, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.
Раскрытие сущности изобретения.
Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs11024030 (T>C), локализованного в позиции chr11:16749066 (GRCh38) гена C11orf58 (Gene ID: 10944) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащих флуорофоры FAM и ROX.
Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs11024030 (T>C) гена C11orf58 осуществляют с использованием прямого праймера rs11024030 5′-TGTCATAGTTGGCATTTGGTTT-3' (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs11024030 5'-CCCAAATTCATTTTCAGTTTTT-3' (SEQ ID NO 2), rs11024030-Т-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)TAAACTAGTTGCAGGGCCTAA(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3),
rs11024030-С-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX) TAAACTAGCTGCAGGGCCTAA(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).
Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs11024030 (T>C) гена C11orf58 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs11024030-Т/Т показаны оранжевыми кругами, генотипы rs11024030 -Т/С показаны зелеными треугольниками, генотипы rs11024030-С/С показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.
Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:
1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран сиквенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [Т/С] rs11024030 C11orf58, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:
прямой общий праймер rs11024030 5'-TGTCATAGTTGGCATTTGGTTT-3' (SEQ ID NO 1),
обратный общий праймер rs11024030 5'-CCCAAATTCATTTTCAGTTTTT-3' (SEQ ID NO 2).
Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена C11orf58 составляет 151 пару нуклеотидов:
TGTCATAGTTGGCATTTGGTTTTGTGTATTCACTAAATTTTGTTTTAAAATCTTTGAAGAATATAAACTAG[T/C]TGCAGGGCCTAAAGAAATAAGCTTTTAAAATAATTTTAGGGAAGAACATTTTTAAATAAAAACTGAAAATGAATTTGGG.
2). Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.
На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:
rs11024030-Т-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-(FAM)TAAACTAGTTGCAGGGCCTAA(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3),
rs11024030-С-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-(ROX) TAAACTAGCTGCAGGGCCTAA(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).
3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.
4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 60°C в течение 1 минуты].
5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs11024030 131 человек (65,5%) оказались гомозиготами по аллелю Т (генотип Т/Т); 61 человек (30,5%) - гетерозиготами (генотип Т/С), 8 человек (4%) индивидуумов были гомозиготами по аллелю С (генотип С/С).
6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs11024030 (T>C) гена C11orf58 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).
Осуществление изобретения.
Способ осуществляют следующим образом:
1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.
2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.
3. Анализ полиморфизма rs11024030 (T>C) гена C11orf58 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: Т-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), С-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).
ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкМ каждого праймера, по 5 мкМ каждого зонда, 0.03 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl2; 1хПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 60°C в течение 1 минуты].
4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs11024030 (T>C) гена C11orf58 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю Т, зонд с красителем ROX - аллелю С (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот Т/Т. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот С/С. Кластер зеленых треугольников характеризует накопление уровня флуоресценции по обоим зондам позволяет идентифицировать гетерозигот Т/С.
Резюме.
Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs11024030 (T>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена C11orf58, а также в научных целях.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ
генотипирования полиморфного локуса rs11024030 (T C) гена C11orf58 у
человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением
аллель-специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-02-05">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2023135614/20(077899)</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-12-27</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>1840</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное образовательное учреждение высшего образования
"Курский государственный медицинский университет"
Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical
University</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования
полиморфного локуса rs11024030 (T>C) гена C11orf58 у человека
методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением
аллель-специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgtcatagttggcatttggttt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cccaaattcattttcagttttt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taaactagttgcagggcctaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taaactagctgcagggcctaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (1)
- Способ генотипирования полиморфного локуса rs11024030 (T>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов Т/С rs11024030 гена C11orf58 осуществляют с использованием прямого праймера rs11024030 5'-TGTCATAGTTGGCATTTGGTTT-3' (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs11024030 5'-CCCAAATTCATTTTCAGTTTTT-3' (SEQ ID NO 2), rs11024030-Т-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)TAAACTAGTTGCAGGGCCTAA(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3), rs11024030-С-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX) TAAACTAGCTGCAGGGCCTAA(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2819255C1 true RU2819255C1 (ru) | 2024-05-16 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2725132C1 (ru) * | 2019-12-19 | 2020-06-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии |
| US11401555B2 (en) * | 2008-02-20 | 2022-08-02 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with stroke, methods of detection and uses thereof |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11401555B2 (en) * | 2008-02-20 | 2022-08-02 | Celera Corporation | Genetic polymorphisms associated with stroke, methods of detection and uses thereof |
| RU2725132C1 (ru) * | 2019-12-19 | 2020-06-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Tsuboyama K., Osaki T. et al. A widespread family of heat-resistant obscure (Hero) proteins protect against protein instability and aggregation. PLoS Biol. 2020;18(3): (найдено в сети Интернет 21.03.2024: https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3000632). * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2551356B1 (en) | Method for detecting target base sequence using competitive primer | |
| US20100222227A1 (en) | Rapid genotyping analysis and the device thereof | |
| JP2010506595A (ja) | 対立遺伝子タイピングの方法 | |
| CN110484621B (zh) | 一种肝癌早期预警的方法 | |
| JP4515524B2 (ja) | 正常眼圧緑内障疾患感受性遺伝子及びその利用 | |
| RU2819255C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs11024030 (T>C) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2819930C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs10832676 (A>G) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2819835C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs7951676 (GT) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2819931C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs11024031 (TC) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2819936C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs3802963 (CG) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме реального времени с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2820348C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs11024032 (CT) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме реального времени с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2820349C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs10766342 (GA) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2819840C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs6677 (T>G) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2810472C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs11666524 (G>A) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2810474C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs2901077 (C>T) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2808839C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs346158 (T>C) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2820347C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821904C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs7949972 (C>T) гена ELF5 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821925C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs67579710 (G>A) гена THBS3 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821922C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs12610495 (A>G) гена DPP9 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821891C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs17713054 (G>A) у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2808841C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs346157 (A>G) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821923C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs7155973 (A>G) гена HSP90AA1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2803522C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs12561767 (GA) гена SERBP1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2808846C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs8107914 (CT) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |