CN105492455A - 利用通用报告物的数字测定 - Google Patents

Abstract

用于测定一组分区中的一个或更多个靶的数字测定系统，包括方法、设备和组合物，所述分区包含靶扩增的通用报告物。数字测定通常依靠检测样品中分析物的单独拷贝的存在或活性的能力。在示例性数字测定中，样品被分离为体积基本相等的一组分区，每个分区包含平均小于约一个拷贝的分析物。

Description

利用通用报告物的数字测定

对优先权申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/789,703以及2013年8月12日提交的美国临时专利申请序列号61/864,792的权益。这两个优先权申请的全部内容为了所有目的通过引用并入本文。

对其他材料的交叉引用

本申请为了所有目的通过引用并入下列材料的全部内容：2006年5月9日发布的美国专利号7,041,481；2010年7月8日公布的美国专利申请公布号2010/0173394A1；2011年9月8日公布的美国专利申请公布号2011/0217712A1；2012年6月21日公布的美国专利申请公布号2012/0152369A1；2013年2月14日公布的美国专利申请公布号2013/0040841A1；2012年8月23日提交的美国临时专利申请序列号61/692,635；2013年8月22日提交的美国专利申请序列号13/973,940；2013年12月6日提交的美国专利申请序列号14/099,750；2014年2月13日提交的美国专利申请序列号14/171,754；2014年2月3日提交的美国专利申请序列号14/171,761；以及JosephR.Lakowicz,PRINCIPLESOFFLUORESCENCESPECTROSCOPY(第二版，1999)。

引言

数字测定通常依靠检测样品中分析物的单独拷贝的存在或活性的能力。在示例性数字测定中，样品被分离为体积基本相等的一组分区，每个分区包含平均小于约一个拷贝的分析物。如果分析物的拷贝随机分布在分区之间，某些分区将不包含拷贝，其他分区仅包含一个拷贝，并且，如果分区的数量足够大，又其他分区将包含两个拷贝、三个拷贝和甚至更多数量的拷贝。基于分区中分析物的给定平均浓度在一个分区中实际发现0个、1个、2个、3个或更多拷贝的概率，通过泊松分布来描述。相反，分区中分析物的浓度(并因此样品中的浓度)可以从发现一个分区中给定数量的拷贝的概率来估算。

没有发现拷贝和发现一个或更多个拷贝的概率的估值可以在数字测定中测量。可以检验每个分区以确定该分区是包含分析物的至少一个拷贝的阳性分区，或是不包含分析物的拷贝的阴性分区。分区中没有发现拷贝的概率可以通过为阴性的被检验分区的分数来估计(“阴性分数”)，以及发现至少一个拷贝的概率通过为阳性的被检验分区的分数来估计(“阳性分数”)。阳性分数或阴性分数随后可以用于确定分区中的分析物的浓度，诸如以泊松统计。

数字测定往往依赖分区中核酸靶的扩增以使得能够检测分析物的单个拷贝。扩增可以经由聚合酶链式反应(PCR)来进行以实现数字PCR测定。靶的扩增可以从包含在反应中的荧光探针进行光学检测。具体地，探针可以包括荧光团，其提供指示靶是否已被扩增的荧光信号。

数字PCR测定可以被多重化以允许在相同组的分区中检测两个或更多个不同靶的存在。靶的扩增可以通过利用靶特异性的探针来区分。不过，此类探针可能是昂贵的，并且可能需要定制合成，这进一步增加了成本。

概述

本公开内容提供用于测定一组分区中的一个或更多个靶的数字测定系统，包括方法、设备和组合物，所述分区包含靶扩增的通用报告物。

附图简述

图1是根据本公开内容的各方面，执行相同组分区中的至少两个靶的多重数字测定的示例性方法的流程图，每个分区包含用于靶的引物和扩增的通用报告物。

图2是根据本公开内容的各方面，经配置以执行图1的方法的选定方面的示例性系统。

图3是根据本公开内容的各方面，示出经执行以测定包含通用报告物的分区中的一对靶(靶A和B)的图1方法的选择的示例性方面的示意图，用于扩增分区中的靶和用通用报告物检测的策略在可从其形成分区的示例性整体相(bulkphase)中展示(扩增箭头和扩增子以虚线示出)。

图4是根据本公开内容的各方面的示例性数据的图，该数据包括可以从对如图3中的靶A和B的测定的不同组的分区(通道1-5)中收集的荧光幅值(例如，荧光强度(int..))，每个组中存在靶B引物(F_B和R_B)的不同浓度，并且在该图中标识了每个条带的分区。

图5是根据本公开内容的各方面的分区中的扩增子大小与从该分区测量的荧光强度(int.)之间的示例性关系的图。

图6是根据本公开内容的各方面的示例性数据的图，该数据包括可以从如对图3中的靶A和B的测定的不同组的分区(通道1-5)中收集的荧光幅值(例如，荧光强度)，生成对每个组中的靶B的不同扩增子大小，并且在该图中标识了每个条带的分区。

图7是根据本公开内容的各方面的对如在图4中收集和呈现的示例性数据的图，但是极大数量的分区对两个靶是阳性的。

图8是根据本公开内容的各方面，示出经执行以测定具有相同通用报告物的分区中的一对靶(靶A和B)的图1的方法的选择的示例性方面的另一示意图，该图基本如图3所示构建，并且示出了使用具有不同解链温度的引物以生成该靶对的相同长度的扩增子，但是以不同的效率产生不同的扩增子产量。

图9是根据本公开内容的各方面示例性数据的图，该数据包括可以从根据图8的相同反应混合物形成的不同组的分区(通道1-5)中收集的荧光幅值，靶的扩增单一退火温度下在孔中执行，该孔包含优化到这一退火温度的引物组以及未优化到这一退火温度但是仍然能够以较低的效率扩增的一个引物组，且图中的每个条带的分区根据靶含量标识。

图10是大体根据在图4和7中描述的策略，从液滴收集的荧光幅值数据的曲线图。

图11是大体根据在图5和6中描述的策略，从液滴收集的荧光幅值数据的曲线图。

图12是大体根据在图8和9中描述的策略，从液滴收集的荧光幅值数据的曲线图。

图13A到13D是根据本公开内容的各方面，在扩增液滴的β-葡糖醛酸酶(GUSB)靶的剪接形式和未剪接形式后，在来自包含样品(分别是A到D)的不同稀释度的液滴的一对波长方案(通道1和通道2)中收集的扩增数据的散点图，每个液滴包含相同的通用报告物(染料)，并且液滴的每个簇根据靶含量来标识(分别是剪接/未剪接)。

图14是根据本公开内容的各方面，从图13A到13D(样品A到D)的数据计算的GUSB靶的剪接形式和未剪接形式的浓度以及每个样品的计算的靶浓度的比率(剪接：未剪接)的图。

图15是根据本公开内容的各方面，从在具有通用报告物的液滴中执行的三个不同的靶基因(cDNA)测定收集的扩增数据的图，每个靶基因(cDNA)测定检测来自靶基因的不同剪接形式的cDNA(CAMTA1、TPM3或ABLIM1)。

图16是根据本公开内容的各方面，通过在来自图15的靶基因测定的液滴中生成的扩增子的毛细管电泳获得的扩增数据的曲线图。

图17是根据本公开内容的各方面，使用来自如在图15中执行的ABLIM1测定的扩增数据，在包含通用报告物和测定的脑RNA样品的不同的浓度的液滴中对长的选择性剪接形式的和短的选择性剪接形式的ABLIM1cDNA计算的浓度的图解。

图18是根据本公开内容的各方面，从在具有通用报告物的液滴中执行的三种不同的选择性剪接测定(ABLIM1、TPM3和CAMTA1)收集的扩增数据的一系列散点图，每种不同的剪接测定使用从三种不同组织源(脑、心脏和骨骼肌)获得的RNA/cDNA，并且每个曲线中的液滴的每个簇根据选择性剪接的靶的靶含量(短形式(S)/长形式(L))来标识。

图19是根据本公开内容的各方面，从在具有通用报告物和从多种指示的组织源之一获得的RNA/cDNA的液滴中进行的三种不同选择性剪接测定(ABLIM1、CAMTA1和TPM3)计算的浓度数据(长形式(L)百分比)的图解。

图20是根据本公开内容的各方面，示出可以从包含通用报告物的分区获得的扩增数据的示意图，随着时间推移出现阳性分区的检测的信号幅值的衰减(左侧)，或通过热调节稳定的信号幅值(右侧)。

图21是根据本公开内容的各方面，示出可以从通过通用报告物进行的三种不同的靶(A、B和C)的单重测定和多重测定获得的扩增数据的示意图，对于每个靶的扩增策略在对应的数据部分的上方示意性地示出。

图22是根据本公开内容的各方面，对从模板和各种引物二聚体扩增的靶的示意性比较，该引物二聚体可以与仅通过一个靶和通用报告物执行的图1的数字测定中的靶区分开。

图23是根据本公开内容的各方面，可以在具有图22中的引物和模板的数字测定中收集的示例性发光数据的曲线图，至少一个副产物(引物二聚体)只在液滴的子集(阴性靶液滴)中被扩增。

详述

本公开内容提供用于测定一组分区中的一个或更多个靶的数字测定系统，包括方法、设备和组合物，所述分区包括靶扩增的通用报告物。

提供一种执行数字测定的示例性方法。在该方法中，可以形成分区，每个分区包括相同混合物的一部分。混合物可以包含第一靶和第二靶，并且还可以包含对任一靶的扩增灵敏的通用报告物。只有一个子集的分区各自可以包含第一靶的至少一个拷贝，以及只有一个不同子集的分区各自可以包含第二靶的至少一个拷贝。第一靶和第二靶可以在分区中扩增。扩增数据可以从用于多个分区的通用报告物收集。分区中第一靶的扩增可以与第二靶的扩增区分开。可以确定每个靶的水平。

提供执行数字测定的另一种示例性方法。在该方法中，可以形成分区，每个分区包括相同混合物的一部分。混合物可以包含靶并且还可以包含对靶的扩增灵敏的通用报告物。只有一个子集的分区各自可以包含靶的至少一个拷贝。靶和至少一种副产物可以在分区中扩增。扩增数据可以从用于多个分区的通用报告物收集。靶和副产物在分区中的扩增可以在数据中彼此区分开，或靶和副产物在分区中的扩增都不可以在数据中彼此区分开。可以确定靶的水平。

提供执行数字测定的又一种示例性方法。在该方法中，可以形成分区，每个分区包括相同混合物的一部分。混合物可以包含靶以及对靶的扩增灵敏的通用报告物。只有一个子集的分区各自可以包含靶的至少一个拷贝。分区可以经热循环以扩增靶。来自热循环的分区的待检测的信号可以通过将分区冷却到室温以下、将分区加热到80摄氏度以上并将分区再次冷却到室温以下来稳定。可以从用于多个分区的通用报告物收集扩增数据。可以确定靶的水平。

提供执行多重数字测定的又另一种方法。在该方法中，可以选择引物及其浓度用于第一和第二靶的扩增，以生成可用通用报告物区分开的对应的第一和第二扩增子。可以形成分区，每个分区包含通用报告物和在选择的浓度的引物。用于每个靶的模板可以局部占有存在于分区中。第一靶和第二靶可以在分区中扩增。由通用报告物发射的光可以从单个分区检测。每个靶的水平可以基于检测的光来确定。

提供用于执行多重测定的组合物。组合物可以包含多个液滴，每个液滴包含足以扩增第一靶和第二靶的扩增试剂，并且还包含对任一靶的扩增灵敏的通用报告物。只有液滴的子集各自可以包含第一靶的至少一个拷贝，以及只有液滴的不同子集各自可以包含第二靶的至少一个拷贝。连续相可以围绕每个液滴。

聚合酶链式反应(PCR)是在生物医学研究、临床诊断和法医学等等中普遍存在的技术。受过技术训练的人员熟悉各种形式的多重PCR，包括端点多重PCR、多重基于探针的定量PCR和基于染料的多重化。这些方法中的每种方法有优点和缺点。端点PCR可以支持高水平的多重化，但是通常需要消耗时间的凝胶电泳以检测扩增的产物。多重基于探针的定量PCR是动力学(“实时”)测定，该测定不像端点PCR，不需要PCR后的处理用于检测，但是扩增子检测受仪器性能限制。可商购的实时PCR仪器可以支持使用多达四个荧光团并因此支持使用四个探针，多重化受四个扩增子限制(每个探针一个扩增子)。最后，基于染料的多重化是便宜的，因为它不需要标记的探针并且较不耗时。不过，该方法依赖熔融曲线分析来检测各种PCR产物，并且不允许产物的直接定量。而且，熔融曲线分析可能不具有区分具有类似解链温度的扩增子的分辨率。目前没有方法可用于仅使用DNA嵌入染料作为扩增报告物直接检测和定量在单管中扩增的多个DNA靶。

本公开内容提供用于分区诸如乳滴中的多重PCR以及用DNA嵌入染料对其检测的新颖方法。该方法包括多个DNA靶的扩增、检测和定量。靶扩增可以在具有DNA嵌入染料例如染料以及若干引物对诸如用于每个靶的一引物对的标准PCR混合物中完成。可以以操纵每个靶的扩增子产率的方式将不同浓度的引物对组合在各种混合物中。基于产率，扩增的产物可以根据从嵌入染料检测到的信号幅值被区分开。

该策略的要素可以是通过改变引物浓度操纵荧光输出的能力。引物浓度直接影响产率并且间接影响扩增子结合的染料的荧光。用于多重反应中每个靶的引物浓度可以进行调节以对多个扩增的靶中的每个产生不同信号幅值。扩增的靶可以通过数据中的相应的扩增簇的位置来标识和通过在每个簇中存在的分区的数量来定量。

本文公开的方法可以允许只使用DNA结合染料作为报告物检测和定量在单孔中扩增的相同或不同大小的多个扩增子。这种方法比常规的端点PCR多重化具有优点。例如，该方法节约时间：不需要PCR产物的进一步处理，例如凝胶电泳和成像以检测扩增子。可选地或另外地，该方法可以提供扩增子大小的独立性：类似(例如，相等)或不同长度的扩增子可以从相同的多重反应检测到。与之相比，类似长度的扩增子通常不能被凝胶电泳分辨，限制了在常规端点PCR中多重化类似大小扩增子的能力。本文公开的方法不同于多重基于探针的定量PCR，因为该方法可以不使用序列特异性探针来执行，序列特异性探针比嵌入染料明显更贵。本文公开的方法不同于使用实时仪器的基于染料的多重话。例如，扩增子可以在没有熔融曲线分析的情况下区分开。

本公开内容的进一步方面在下列章节中展示：(I)以通用报告物的多重数字测定的综述以及(II)实施例。

I.以通用报告物的多重数字测定的综述

本节提供用通用报告物执行的多重数字测定的综述；参见图1-9。

图1是用通用报告物执行多重数字测定的示例性方法50的流程图。对方法50呈现的步骤可以以任何合适的顺序和以任何合适的组合来执行。此外，所述步骤可以与本公开内容的任何其他合适步骤、方面和/或特征组合和/或被任何其他合适步骤、方面和/或特征更改，所述其他合适步骤、方面和/或特征包括在上面交叉引用中列出的通过引用并入本文的专利文献中描述的那些。

在52指示，可以选择引物及其浓度以生成用在分区中的通用报告物可区分开的至少一对扩增子。当通用报告物结合到扩增子时，相对于未结合或结合到单链核酸，通用报告物可以更明亮地发荧光。每个扩增子(可互换地称为扩增靶)可以是双链的并且可以对应于被扩增的不同靶。扩增子可以在分区中彼此区分开，因为每个扩增子用不同的特征产率生成(所述特征产率可以使用任何合适的量度，例如扩增子的质量、总组合长度等来描述)。结果是结合到分区中的每个扩增子的通用报告物的特征、不同量以及从结合的报告物检测到的荧光的可区分幅值。可以生成扩增子对的质量的不同产率，因为扩增子对为不同长度和/或被复制至不同的最终拷贝数和/或质量。

扩增子对可以是被扩增到单个分区中的相同拷贝数的更长扩增子和更短扩增子。在这种情况下，更长扩增子通常比更短扩增子结合更多的报告物拷贝并且给出更强的荧光信号。在其他情况下，在其他事物相等的情况下，更长扩增子可以被扩增到比更短扩增子更少的拷贝数。

扩增子对可以在长度方面类似或等同并且被扩增到不同的拷贝数。在这种情况下，更丰富的扩增子通常比较不丰富的扩增子结合更多的报告物拷贝并且给出更强的信号。

通过改变参与靶扩增以产生扩增子的一个或更多个引物的浓度，可以改变在分区中产生的给定扩增子的拷贝数。因此，可以选择用于每个靶的一个或更多个引物的浓度以对相应的扩增子产生合适拷贝数，使得扩增子的报告物信号是可区分的。

多重测定的每个靶可以通过至少一个引物或引物对等等扩增。在某些情况下，相同的引物可参与两个或更多个靶的扩增。例如，第一靶可以通过正向引物和反向引物扩增，以及第二靶可以通过相同的正向引物和不同的反向引物或不同的正向引物和相同的反向引物扩增。在其他情况下，每个靶可以用不同的正向引物和不同的反向引物扩增。

引物及其浓度可以基于在不同组分区中执行的检验来选择，所述检验用至少一个引物的可变浓度和/或长度和/或解链温度和/或至少一个扩增子的可变长度。在某些实例中，用于靶的仅一个引物的浓度可以被改变或用于靶的每对引物的浓度可以被一起改变。在某些实例中，用于靶的两个或更多个正向引物和/或两个或更多个不同的反向引物可以用定义不同的扩增子端点并因此产生不同扩增子大小的每个不同的引物来检验。在某些情况下，可以选择用于扩增每个靶的不同引物浓度和/或产生靶的不同扩增子大小的引物，而不需要任何初步检验来优化分区群体在数据中的分离。例如，引物浓度和/或扩增子长度可以基于引物浓度(和/或扩增子长度)与对应扩增子信号的幅值之间的预期或假设关系来选择。

通用报告物(可互换地称为非特异性报告物)对反应产物(例如，扩增子)基本无特异性地结合，使得与该产物相同类的其他结构不同的物质(例如，无关序列的其他扩增子)也可以被报告物结合。非特异性结合可不依赖于报告物以及产物(例如，靶和/或扩增子)中的一个或两者的原子布局的独特特征。通用报告物的多个拷贝可能能够结合到反应产物的单个拷贝，例如，结合的拷贝的数量与反应产物的量或长度直接相关诸如成正比。例如，通用报告物可以是相对非特异性结合核酸的光致发光染料。染料可以不附接于赋予基本序列结合特异性的寡核苷酸。染料可以是大沟结合剂、小沟结合剂、嵌入剂或外部结合剂等等。染料可以相对于单链核酸优先结合到双链核酸和/或当可以表现出结合到双链时，相对于单链核酸光致发光特性(例如，发射强度)的更大变化。可以合适的示例性染料包括发光花菁、菲啶、吖啶、吲哚、咪唑等，诸如DAPI、33258染料、吖啶橙等。可以合适的示例性嵌入染料包括溴化乙锭、碘化丙啶、染料、绿色染料、金染料和7氨基放线菌素D(7-AAD)等等。

样品制备.样品可以经制备用于测定。样品的制备可以包括样品的任何合适操纵，诸如收集、稀释、浓缩、纯化、冻干、冷冻、提取、限制性内切酶消化、剪切、与一种或更多种测定试剂组合形成混合物(也称为含有样品的混合物、整体相或反应混合物)、进行至少一个预备反应以制备样品用于测定中的一个或更多个反应、或其组合等等。制备可以隔离分析物的类别诸如包括一种或更多种核酸靶的拷贝的核酸，和/或可以更改和/或破裂分析物。样品的制备可以包括使得样品胜任随后进行一个或更多个反应诸如一个或更多个酶催化反应和/或结合反应。

在某些实施方案中，样品的制备可以包括组合样品和试剂以产生用于对每个靶执行反应(诸如扩增反应)和报告每个反应的程度(例如，反应是否在阈值水平之上或范围内发生)的包含样品的混合物。用于扩增的试剂可以包括用于靶的引物、dNTP和/或NTP、至少一种酶(例如，聚合酶、连接酶、逆转录酶、限制性酶或其组合等等，每种酶可以是或可以不是热稳定的)、和/或类似物的任何组合。因此，混合物可以具有用于(即，可胜任于)在合适环境条件(例如，在高温培养或温度调节(诸如通过热循环)下扩增每个靶的试剂的完整组。混合物可以能够扩增样品(或其分区)中的一个或更多个靶中的每个靶(如果存在的话)。用于报告的试剂可以包括至少一个通用报告物。可使用单个通用报告物，其对每个靶的扩增灵敏并且可以具有根据给定靶是否已发生扩增而改变的发光。混合物的制备可以使得样品能够基于逐个靶报告或被分析是否已发生反应诸如扩增以及任选地任何此类反应的程度。

在某些实施方案中，样品的制备可以包括组合样品和用于进行至少两种测定诸如两种扩增测定的试剂。因此，试剂可以包括用于扩增的引物和报告是否已发生扩增的一个或更多个可检测报告物。用于扩增的试剂可以包括引物、dNTP和/或NTP、至少一种酶(例如，聚合酶、连接酶、逆转录酶、限制性酶或其组合，每种酶可以是或可以不是热稳定的)、和/或类似物的任何组合。因此，样品的制备可以使得样品(或其分区)能够扩增样品(或其分区)中的每个靶(如果存在的话)。用于报告的试剂可以包括或可以不包括用于每个感兴趣靶的不同报告物。因此，制备样品用于报告可以使得样品能够基于逐个靶报告或被分析是否已发生扩增以及任选地任何此类扩增的程度。相同的通用报告物可以报告每个靶的扩增。通用报告物可以是单个化合物或化合物的混合物。

术语“发光”意指不能仅归因于发光体的温度的光的发射。发光的示例性形式包括光致发光、化学发光、电致发光等。“发光体”是能够发光的任何原子或原子的关联组。光致发光是响应于激发光的发射所产生的任何发光并且包括荧光、磷光等。因此，发光体可以是荧光团或磷光体等等。

靶可互换地可以称为分析物、物质(species)，或在某些情况下，可以称为模板。

分区形成.在54指示，可以形成包括通用报告物和在选定浓度的引物。相同的包含样品的混合物的各部分可以被布置在分区中以形成用于测定至少一个靶或至少一对靶的分区。靶可以是从相同模板诸如从模板的单个拷贝扩增的连接的靶，或可以是从样品的不同模板扩增的未连接的靶。

每个分区可以包括相同混合物的一部分。在某些情况下，该部分可以构成整个分区。混合物可以包含每个靶(例如，由相同模板提供的)、通用报告物和/或一种或更多种扩增试剂(例如，用于扩增每个靶的完整组试剂)。因此，分区可以共同地包含多个靶并且每个分区可以包含相同的通用报告物。

当形成分区时，各靶可以彼此关联或彼此不关联。关联的靶可以被连接即彼此共价附接和/或通过碱基配对来连接。在其他情况下，关联的靶可以被保持在相同的隔室(例如，相同的生物细胞)中。“关联的”靶在样品中具有彼此显著连接，诸如在形成分区前即刻和/或在形成分区期间具有样品中至少约10％、25％、50％、80％、90％或约100％的关联(例如，键合)程度。可以设想或预计靶的关联程度。关联程度指示连接的靶以不依赖于浓度的方式一起分布到相同分区的频率。占据相同分区的靶可以描述为共同定位在该分区中或一致，无论由于各靶彼此关联或随机地。具有高关联(例如，键合)度的靶以对应的高频共定位在相同分区中，无论该靶在样品是丰富还是稀有的。例如，具有90％键合的靶将共同定位在包含所述靶之一的分区中的至少90％中。与之相比，不具有键合的靶将根据在给定分区中发现每个靶的概率乘积来共定位，所述概率乘积随着靶的浓度增加。

当提供时(例如，当形成时)，分区可以包含在“局部占有”的每个靶，这意味着只有分区的子集的每个分区包含要被测定的每个靶(和/或模板)的至少一个拷贝。例如，以对第一靶和第二靶进行的多重测定，只有分区的第一子集包含第一靶，以及只有分区的第二子集包含第二靶。当形成分区时，如果第一靶和第二靶彼此完全关联，则分区的第一子集和第二子集可以是相同子集。可选地，当形成分区时，如果第一靶和第二靶彼此不完全关联，则分区的第一子集和第二子集可以是不同的。在某些情况下，如果各靶不完全关联，分区的不同第三子集的每个分区可以包含每个靶的至少一个拷贝。因此，以局部占有，一个或一个以上(例如，多个)分区不包含第一靶的拷贝，一个或一个以上(例如，多个)分区可以包含第一靶的单个拷贝(只有一个拷贝)，以及任选地，又一个或一个以上分区(例如，分区的剩余部分)可以包含第一靶的两个或更多个拷贝。同样，以局部占有，一个或一个以上(例如，多个)分区不包含第二靶的拷贝，一个或一个以上(例如，多个)分区可以包含第二靶的单个拷贝(只有一个拷贝)，以及任选地，又一个或一个以上分区(例如，分区的剩余部分)可以包含第二靶的两个或更多个拷贝。

术语“局部占有”并不局限于任何分区中有感兴趣的特定模板/靶的不超过一个拷贝的情况。当提供或形成分区时，包含在局部占有的模板/靶的分区可以例如包含每个分区的模板/靶的平均多于或少于、约一个拷贝、两个拷贝或三个拷贝等等。模板(和/或靶)的拷贝可以具有在分区之间的随机分布，该随机分布可以描述为泊松分布。在某些情况下，显著量的分区(例如，分区的至少约1％、2％、5％、10％或20％等等)可以包含至少两个靶的每个的拷贝，和/或多个分区各自可以包含所有靶的至少一个拷贝。

分区形成可以包括将包含样品的整体相的部分分布或分离为分区。包括高达全部整体相的任何合适的分数可以被分布到分区中。每个分区可以是与其他分区的流体体积隔离的流体体积和/或包括所述流体体积。分区可以通过流态/液态相诸如连续乳液相、通过固相诸如容器的至少一个壁或二者的组合等等来彼此隔离。在某些实施方案中，分区可以是以连续相布置的液滴，使得液滴和连续相共同地形成乳液。

分区可以通过任何合适的程序、以任何合适的方式形成并具有任何合适的特性。例如，分区可以用流体分配器诸如移液管、用具有小孔并在该小孔形成液滴的至少一个液滴发生器、通过样品的搅拌(例如，摇动、搅动、超声处理)等等来形成。因此，分区可以连续地、平行或成批形成。分区可以具有任何合适的一种或更多种体积。分区可以具有基本一致的体积或可以具有不同的体积。具有基本相同体积的示例性分区是单分散液滴。分区的示例性体积包括小于约100、10或1μL，小于约100、10或1nL，或小于约100、10或1pL等等的平均体积。

胜任每个靶的扩增的分区可以从包含模板的整体相直接形成或可以以多个步骤形成。在某些情况下，形成分区的步骤可以包括将整体相划分为包含在局部占有的靶的隔离流体体积(诸如，液滴)。流体体积可以自身是分区或可以分布到分区。例如，流体体积可以是第一组流体体积，以及形成分区的步骤可以包括将第一组的单独流体体积与第二组的单独流体体积组合。第二组可以包括用于扩增一个或更多个靶的一个或更多个试剂，诸如用于扩增至少一个靶的至少一个引物、用于一对靶的引物等。组合的步骤可以包括单独融合第一组的流体体积与第二组的流体体积，诸如融合包含靶的液滴与包含用于扩增一个或更多个靶的引物的液滴。

在56指示，靶可以在分区中扩增以形成扩增子。每个靶的扩增可以只在分区的子集中选择性地发生，所述分区子集诸如分区的小于约四分之三、一半、四分之一或十分之一等等。每个靶的扩增可以在包含靶的至少一个拷贝(即，包含对应于靶的模板的至少一个拷贝)的分区中选择性地发生。扩增可以是直链或指数的，等等。

扩增可以等温或可以不等温执行。在某些情况下，在分区中的扩增可以通过加热分区和/或在室温以上的温度诸如在变性温度、退火温度和/或延伸温度培养分区一个或多个循环来激励。在某些实例中，分区可以被热循环以促进聚合酶链式反应和/或连接酶链式反应。可能合适的示例性等温扩增方法包括基于核酸序列的扩增、转录介导扩增、多重置换扩增、链置换扩增、滚环扩增、DNA的环介导扩增、解旋酶依赖性扩增和单引物扩增等等。

数据收集.在58指示，可以收集扩增数据。数据可以通过检测来自单个分区的光，诸如检测由存在于单个分区中的通用报告物发射的光来收集。光可以响应于用激发光照射分区来发射。可以在一个波段(一个光通道)、一对波段(两个光通道)等收集来自分区的光发射的数据。

R个靶可以在多重测定中进行测定，并且数据可以在少于R个光通道(例如，以不同的波长机制)中收集。换句话说，被测定的靶的数量(R)可以大于用于检测靶特异性反应的光通道的数量。在某些情况下，数据可以只在一个或两个光通道或在至少两个、三个或更多的光通道等等中收集。在某些情况下，数据可以从与测定中的靶相同数量的光通道收集。光通道可互换地可以称为检测通道。

光通道可以代表生成和检测发射光的特定检测机制。检测机制可以由用于检测发射光的光谱成分(即，波长机制)来表征。如果脉冲式激发光用于检测机制以诱发发射光，则该检测机制可以由用于以激发光照明的光谱成分(波长或波段)和/或检测关于每个光脉冲的光发射的时间间隔来表征。因此，彼此不同的光通道可以关于激发光的光谱成分(波长/波段)、关于被检测的发射光的光谱成分(波长/波段)和/或关于相对于对每个激发光的脉冲检测光发射的时间间隔等等而不同。

数据收集可以包括生成代表从单个分区检测到的光的一个或更多个信号。信号可以代表光的方面，诸如强度、寿命、极化等。信号任选地可以包括来自相同和/或不同靶的报告物的在两个或更多个不同光通道(例如，在不同的波长范围(波段)和/或颜色机制)收集的数据。从每个报告物检测到的光可以是从发光体(例如，荧光团)发射的光。可以检测在给定通道中检测到的光，使得来自结合到不同扩增子的报告物的光被累计或累加而不归因于特定扩增子。因此，给定通道的信号可以代表两个、三个、四个或更多个测定并因此代表两个、三个、四个或更多个靶。在其他情况下，用于两个或更多个靶的信号可以在不同的光通道中检测。

信号可以基于从分区中的通用报告物检测到的光来生成。报告物可以报告由信号代表的两个或更多个特定扩增反应中的至少一个是否已在分区中发生，并因此在分区中是否存在对应于两个或更多个特定扩增反应的两个或更多个特定靶中的至少一个的至少一个拷贝。可以分析对应于报告物的信号的水平或幅值以确定特定扩增反应中的至少一个是否已发生并且是否存在特定靶中的一个的至少一个拷贝。信号的水平或幅值可以根据特定扩增反应中的至少一个是否已发生或未发生并且每个分区中存在或不存在特定靶中的至少一个而在分区之间改变。例如，对于特定靶被分类为阳性的分区可以产生在给定阈值之上和/或给定范围之内的信号值。可以对分区进行分析并在任何合适时间生成信号。示例性时间包括当反应已运行完成并且数据不再改变时，测定结束(端点测定)的时间和某些较早的时间，只要数据被充分且可靠地分离。

在任何合适的条件下，数据可以从多个分区(即，仅分区的子集或全部分区)收集。所有数据可以在多个分区的大约相同温度、在低于每个扩增子的解链温度、低于用在用于扩增的热循环中的退火温度和/或低于约50或45摄氏度的温度等等收集。扩增数据可以在每个靶已达到扩增端点之后收集。

群体鉴定.对两个靶均是阴性的、对所述靶中只有一个是阳性的(单个阳性)以及对靶的组合是阳性的(双阳性，等)分区群体(可互换地称为簇或条带)可以从数据鉴定。鉴定可以使用算法(例如，鉴定数据中的图案(例如，分区簇)的算法)通过数据处理器、通过用户或二者的组合来执行。在某些情况下，数据处理器可以产生和输出(例如，展示)收集数据的曲线图(例如，2-D散点图或柱状图)。用户随后可以基于曲线图定义每个群体的界限，例如通过图形用户界面以定义群体界限，和/或通过输入值(例如，代表幅值阈值/范围)来定义每个群体的界限。每个群体界限可以通过值的一个或更多个范围、围绕群体的几何形状(例如，多边形、椭圆形等)等等来定义。

分区群体的鉴定可以包括将每个分区指定到多个预先界定的隔室(bin)中的一个，每个隔室对应于不同的分区群体。预先界定的隔室可以代表对靶的阴性和对靶的阳性的所有可能组合。

本文公开的任何测定的反应组分和/或条件可以进行调节以改善数据中的不同分区群体的分辨率。通过改变多重测定内特定测定的浓度，可以影响对特定靶的反应效率，这可以产生信号水平的差异，其允许用相同报告物检测的群体彼此区分开。通过改变反应组分/条件，另外的靶可以在相同多重测定中检测到。在某些情况下，靶的信号幅值可以通过改变用于该靶的一个引物或两个引物的浓度来调节。改变引物浓度而不改变报告物的浓度在相同通用报告物用于检测两个或更多个靶的测定中可能是有用的，但是两个靶中的每个用至少一个不同的引物来扩增。在某些情况下，用于一个或更多个靶的信号幅值可以通过改变用于热循环的退火温度、dNTP的总浓度、单个dNTP相对于彼此的量(例如，如果二个靶具有基本上不同的基本组成)、一个或更多个引物的解链温度(例如，通过改变引物长度和/或GC含量)、通用报告物的浓度或它们的任何组合等等来调节。

对每个靶(或反应副产物)阳性的分区可以在收集的扩增数据中具有不同的(并且可区分的)标志(signature)。该标志可以是来自包含靶的分区的一类或更多类信号(例如，在一个或更多个光通道中收集的)的特征性平均值或范围。

获得分区计数.可以获得用于每个分区群体/簇的分区计数。分区计数可以是代表构成特定分区群体/簇的分区的数量的值。

确定靶水平.在60指示，每个靶的水平可以基于收集的数据来确定。确定靶水平可以(或可以不)基于在分区之间具有泊松分布的每个靶。每个水平可以是例如代表对靶阳性的分区的总数量的值，或浓度值，诸如代表每分区的靶的平均拷贝数的值。通过使用任何合适的算法，分区数据还可以用于(例如，直接和/或作为浓度数据)估算拷贝数(CN)和拷贝数波动(CNV)。

每个靶的水平(例如，浓度)可以用泊松统计学来确定。浓度可以关于分区或单位体积和/或关于提供靶的样品等等来表示。通过假设靶的拷贝(在扩增前)在分区之间具有泊松分布，分区中靶的浓度可以从对于靶是阳性的分区的分数(或等效地，对于靶是阴性的分区的分数)来计算。利用这个假设，具有k个靶拷贝的分区的分数f(k)通过下列方程式给出：

$f\left(k\right)=\frac{c^k}{k!}{e}^{-c}---\left(1\right)$

此处，C是靶在分区中的浓度，其表示为每分区中靶拷贝的平均数(扩增前)。简化的泊松方程式可以从上面的更通用方程式导出，并且可以用于从阳性分区的分数确定靶浓度。可以使用的示例性泊松方程式如下：

$C=-ln(1-\frac{N_{+}}{N_{tot}})---\left(2\right)$

其中，N₊是对于给定靶是阳性的分区的数量(即，分区计数)，并且其中，N_tot是对于靶是阳性的或阴性的分区的总数。N_tot等于(a)靶的N₊和(b)对于靶是阴性的分区数或N_–的总和。N₊/N_tot(或N₊/(N₊+N_–))等于f₊，其是对于靶是阳性的分区的分数(即，f₊＝f(1)+f(2)+f(3)+…)(参见方程式1)，并且是分区具有靶的至少一个拷贝的概率的测量估值。可以使用的另一示例性泊松方程式如下：

$C=-\ln \left(\frac{N_{-}}{N_{tot}}\right)---\left(3\right)$

其中，N_–和N_tot如上所述定义。N_–/N_tot等于f_–，其是阴性分区的分数(或1–f₊)，是分区不具有靶的拷贝的概率的测量估值，以及C是如上所述的靶浓度。

上面的方程式2和3可以再排列以产生下列方程式：

C＝ln(N_tot)-ln(N_tot-N₊)(4)

C＝ln(N_tot)-ln(N_-)(5)

多重测定中的每个靶的浓度可以使用对每个靶所获得的N_tot和N_–或N₊的值(即，分区计数)，例如用方程式2至5中的任一个来确定。在某些情况下，用于N_tot(总的分区计数)的值可以对于每个靶是相同的。在其他情况下，诸如由于群体重叠，如果某些群体从总计数排除，则用于N_tot的值可改变。在某些实施方案中，N_tot可以相当于所有群体的组合，即，用于所有鉴定的群体的分区计数的总和。

对N_–或N₊使用的值对于每个靶通常是不同的，并且可以从来自多个分区群体的计数总和产生，每个分区群体包含在多重测定中检验的靶的不同组合。例如，对于在方程式2或4中使用，对于多重测定中的三个靶(A、B和C)，对于靶A是阳性的分区的数量N_+A可以计算为来自单个(只有A)、双重(AB和AC)以及三重(ABC)阳性群体的计数的总和。等效地，对于在方程式3或5中使用，对靶A是阴性的分区数N_-A可以计算为N_tot和N_+A之间的差值。可选地，对于A是阴性的分区数可以计算为对于靶A是阴性的每个群体的计数的总和，即，在这个实例中，一个三重阴性(“空”)群体、两个单阳性群体(B和C)以及一个双重阳性群体(BC)。对于其他靶中的每个，可以使用来自群体的适当子集的分区计数重复相同的过程。

在某些实施方案中，靶的水平(例如，浓度)的估值可以从阳性分数直接获得，而不使用泊松统计学。具体地，随着浓度减少，阳性分数和浓度(每分区的拷贝)收敛。例如，利用阳性分数为0.1，浓度用方程式2确定为约0.105，差值只有5％；利用阳性分数为0.01，浓度确定为约0.01005，差值小十倍，只有0.5％。然而，使用泊松统计学可以提供浓度的更精确估值，尤其是以相对更高的阳性分数，因为方程式考虑每分区多个靶拷贝的发生率。

图2示出用于执行图1的数字测定的示例性系统80。系统80可以包括分区组件，诸如液滴发生器82(“DG”)，热孵化组件，诸如热循环仪84(“TC”)，检测组件(检测器)86(“DET”)，以及数据处理组件(数据处理器)88(“PROC”)，或它们的任何组合等等。数据处理组件可以是控制器或可以包括在控制器中，该控制器与组件的任何合适组合通信并控制组件的任何合适组合的操作。组件之间的箭头指示组件之间的材料诸如流体(例如，乳液的连续相)和/或分区(例如，液滴)或信号/数据的运动或传递。组件的任何合适组合可以可操作地彼此连接，和/或一个或更多个组件可以与其他组件断开，使得例如材料/数据手动传递。

检测器86可以提供数据能够在其中收集的多个光通道。检测器可以具有用于每个光通道的不同传感器或检测单元。

系统80可以操作如下。液滴发生器82可以形成以连续相布置的液滴。液滴可以用热循环仪84来热循环以促进靶在液滴中的扩增。信号可以用检测器86从液滴检测到。信号可以由处理器88处理以确定液滴计数(液滴的数量)和/或靶水平等等。系统还可以包括任选地驻留在计算机可读存储介质上的程序，其用于控制执行数字测定的方法的任何合适方面。例如，计算机程序可以包括指令，该指令用于促使液滴发生器形成液滴、热循环仪促进靶扩增、检测器收集数据、处理器处理收集的数据或它们的任何组合等等。

适合用于本公开内容的系统的样品制备、测定设计、分区形成、数据收集、群体鉴定、获得群体计数和靶水平确定等等的进一步方面在本公开内容的其他地方以及在以上交叉引用中认定的参考文献中描述，所述参考文献通过引用并入本文。

图3示出说明图1的方法的选择的示例性方面的示意图，该方法经执行以测定包含通用报告物的分区中的一对靶(靶A和B)。至少一个整体相102(或两个或更多个整体相)可以划分为直接(或组合)形成分区诸如液滴的流体体积。整体相102包含以局部占有分布在分区的至少一个模板(例如，核酸模板)诸如模板104、106的拷贝。在此处绘制的模板以不同线宽来区分，以指示它们在序列上是彼此不同的。在其他情况下，两个靶可以从相同模板或模板的相关版本扩增(例如，代表不同等位基因的模板)。模板可以是双链或单链的，等等。每个模板可以在长度上是一致或可变的。

用于扩增靶A和B以形成各自扩增子108、110的策略在整体相102中表示，尽管这个过程通常主要或排他地在形成分区之后发生。因此，扩增及其产物在整体相102中以虚线示出。

每个扩增子108、110的大小可以通过用于扩增的至少一个引物来定义。例如，在此处，用于扩增靶A的一对引物，即正向引物(F_A)和反向引物(R_A)确定被扩增的模板104的区域，以定义靶的端点和扩增子108。同样，一对引物用于扩增靶B，即正向引物(F_B)和反向引物(R_B)，以确定被扩增的模板106的区域，以定义靶的端点和扩增子110。两个靶的扩增可以通过通用报告物112来报告。通用报告物在此处示出相对于模板选择性结合扩增子。然而，通用报告物可能(或可能不)以相等的亲合力结合二者。

使用相同的引物浓度，图3的测定配置形成相等大小的扩增子108、110并且具有相同的产率。因此，基于从通用报告物112检测到的信号的幅值，扩增子是不可区分的。

图4示出包括可以从对靶A和B连续测定的单独组的分区(通道1-5)收集的包括信号幅值(例如，荧光强度(int.))的示例性数据的图解。图4的测定通常根据图3的策略进行，利用液滴作为分区和利用在每组分区中存在的靶B引物(F_B和R_B)的可变浓度。液滴的每个条带(可互换地称为分区/液滴的簇或群体)根据靶含量即对于两个靶为阴性(-)、对于A靶为阳性(A)和对于B靶为阳性(B)的靶含量在图解中标识。对于两个靶为阳性(AB)的分区(如果有的话)未在此处示出，将在下面解决。荧光强度和时间的单位是任意的。然而，在某些实施方案中，时间的单位可以是秒或分钟等等，以及由用于图解中每组数据代表的分区的数量可以是至少10²、10³、10⁴或10⁵等等。

存在于每组分区中的靶B引物的浓度在图解的上方示出，并且指示引物相对于靶A引物的浓度。因此，通道3具有用于两个靶的引物的相等浓度(1X)并且代表在图3中示出的配置。在此情况下，包含扩增的靶A或扩增的靶B的分区的条带重叠并且不允许单独地准确确定靶A和B的分区计数。相比之下，使用更少(一半浓度)(通道2)或更多(两倍浓度)(通道3和4)的靶B引物将阳性B条带与阳性A条带分离，这允许每个靶的水平基于每个分辨的条带的分区计数单独确定(例如，使用上述的方程式5用于每个靶)。此处仅示出两个靶，但是在相同分区中也可测定一个或更多个另外的靶。

图5示出分区中的扩增子大小/长度与可以从分区测量的荧光强度(int.)之间的示例性关系的图解。该图解可以基于用于不同大小的扩增子的引物具有相同解链温度(Tm)用于结合到模板的假设。荧光强度以任意单位给出，以及扩增子大小是以碱基对(bp)的单位给出。用于生成各种扩增子大小的引物的浓度可以保持恒定。

荧光强度可以与用于更短扩增子的扩增子大小正相关。例如，此处示出线性关系，200bp的扩增子生成100bp的扩增子的荧光强度的两倍。随着扩增子的大小进一步增加，扩增效率可能与扩增子大小直接相关地开始降低，如曲线斜率从正到负的变化所示。因此，如此处所示，荧光强度可以与在第一阈值长度下面的扩增子长度正(直接)相关，并且可以与在第二阈值长度上面的更长扩增子的扩增子大小负(逆)相关。而且，如果两个靶存在于相同分区中，产生更长扩增子的更长靶的扩增可以被产生更短的扩增子的更短靶的扩增掩蔽。用于解决靶掩蔽的方法的进一步方面在2013年2月1日提交的美国临时专利申请序列号61/759,772中公开，该专利申请通过引用并入本文。在任何情况下，引物并因此一个或更多个扩增子的长度可以基于扩增子大小和荧光强度之间的预期或假设关系，诸如基于在图5中示出的关系的任何合适方面来为一个或更多个靶选择。

引物还可以或可选地可以基于用于结合到模板的引物的预计(例如，预测或测量的)解链温度来选择。例如，可以选择具有较低(或较高)解链温度的引物以降低(或增加)扩增效率并因此减少(或增加)给定靶的检测信号的幅值。解链温度可以基于引物的长度、引物的GC含量、非标准核苷酸(例如，肌苷)和/或核苷酸类似物的使用或它们的组合等等来选择或调节。在某些情况下，解链温度可以基于由引物与模板(和/或从其形成的扩增子)形成的碱基对的数量、AT碱基对的数量、GC碱基对的数量或它们的任何组合来预测。

在某些实施方案中，可以选择或改变用于热循环的退火温度以建立或增加用于不同靶的信号之间的幅值的差值。例如，用在较低温度熔融的引物扩增的靶可以比用在较高温度熔融的引物扩增的另一靶对退火温度升高更灵敏。

图6示出可以从如图3和4中对靶A和B测定的独立组液滴(通道1-5)收集的包括信号幅值(例如，荧光强度)的示例性数据的图解，但每组中对靶B生成不同扩增子大小。引物并因此一个或更多个扩增子长度可以基于用不同引物和扩增子长度执行的检验来对一个或更多个靶，如图6所示。

图7示出如在图4中收集和呈现的示例性数据的图解，但是显著量的分区对两个靶是阳性的(AB)。可以选择一个或更多个引物的浓度和/或一个或更多个扩增子的长度以将双重阳性分区从一个或更多个单阳性分区分辨出。例如，在通道5中，双重阳性AB条带从只有A的条带和只有B的条带分辨出，只有A的条带和只有B的条带转而彼此分辨出。因此，当有显著分数的双重阳性分区时，通道5的测定条件允许确定靶A和B的水平。在其他情况下，可以降低模板浓度(例如，样品的量)以将双重阳性分区的发生率减到最小，这可以允许忽略此类双重阳性分区(如果有的话)，而不会不可接受地降低测定的精度。

图8示出说明图1的方法的另外选择的示例性方面的另一示意图，该方法经执行以定量包含通用报告物的分区中的一对靶(靶A和B)。图8的示意图使用与图3相同的惯例。至少一个整体相102(或两个或更多个整体相)可以划分为直接(或组合)形成分区诸如液滴的流体体积。整体相102包含可以以局部占有分布在分区的至少一个模板(例如，核酸模板)诸如模板104、106的拷贝。在此处绘制的模板以不同线宽来区分，以指示它们在序列上是彼此不同的。在其他情况下，两个靶可以从相同模板或模板的相关版本(例如，代表不同等位基因的模板)扩增。模板可以是双链或单链的，等等。每个模板可以在长度上是一致或可变的。

用于扩增靶A和B以形成各自扩增子108和110的策略在整体相102中展示，即使这个过程通常主要或排他地在形成分区之后发生。扩增及其产物在整体相102中以虚线示出。在包含所述模板的一个的拷贝的平均分区中生成的扩增子108和110的拷贝的相对数量示意指示。更具体地，在所示实施方案中，靶A的扩增比靶B更有效，即使扩增子108和110可以具有大约(或实际)相同的长度。结果是，靶A的更有效扩增在阳性分区中产生扩增子108的拷贝的数量比靶B的较低效扩增在阳性分区中产生的扩增子110的拷贝数量更大。因此，对靶A阳性的分区比对靶B阳性的分区具有更强的平均信号(例如，更大的发光幅值)，因为相对于B阳性分区，更大量的报告物结合到A阳性分区中的扩增子。此处示出的策略可以延伸以执行任何合适数量的靶诸如相同组的分区中的三个或更多个靶的多重测定。

可以选择(例如，设计和/或合成)用于扩增靶的引物以具有不同的解链温度(T_m)。以不同的解链温度，在用于促进扩增的热条件下(例如，退火温度)，用在端点产生的不同信号幅值，用于靶的靶扩增效率可以可检测地不同。当结合到用于各自靶的模板/扩增子时，可以选择用于一个靶(在这个情况下，用于靶A)的引物具有比用于其他靶(在这个情况下，用于靶B)的引物更高的解链温度。引物可以具有不同的长度和/或不同的碱基含量(例如，不同百分比的A+T或G+C)。例如，用于一个靶的引物可以具有比用于其他靶的引物更大的最小长度(和/或平均长度)。在所示实施方案中，用于靶B的引物F_B和R_B各自比用于靶A的引物F_A和R_A更短。

给定引物对的扩增效率可以至少主要由该对的较低效率的引物决定。因此，可以设计引物使得用于所述靶中的一个靶(例如，靶B)的仅一个引物具有比用于其他靶(例如，靶A)的两个引物更低的解链温度。例如，用于靶B的正向(或反向)引物可以比靶A的两个引物更短(和/或可以具有更低的T_m)，如图所示，以及用于靶B的反向(或正向)引物可以具有与靶A的两个引物相同的长度(或可以更长)，与靶A的两个引物的解链温度相同或甚至比靶A的两个引物的解链温度更高。

任何合适的算法可以用于设计相同或不同长度、具有不同解链温度的引物。算法可以用任何合适的参数来运算，诸如长度(核苷酸的数量)、碱基含量、反应混合物的盐浓度和/或离子强度、pH、和/或类似参数。可以使用的示例性解链温度算法如下面的方程式所示：

T_m＝(wA+xT)*2+(yG+zC)*4(6)

其中，wA、xT、yG和zC分别是碱基A、T、G和C在引物序列中的数量。可以使用的另一示例性解链温度算法如下面的方程式所示：

T_m＝64.9+41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)(7)

其中，wA、xT、yG和zC如上所述定义。考虑反应混合物的盐浓度的又一示例性解链温度算法如下面的方程式所示：

$\begin{array}{c}{T}_m=\\ 100.5+(41*\frac{yG+zC}{(wA+xT+yG+zC)})-\left(\frac{820}{wA+xT+yG+zC}\right)+16.6*{\log }_{10}(\[{\mathrm{Na}}^{+}\])\end{array}---\left(8\right)$

图9示出可以从用作为时间(任意单位)的函数的检测器连续检测的单独组的分区(通道1-5)收集的包括荧光幅值(任意单位)的示例性数据的图解。时间差分离每组分区。分区可以用根据图8的相同反应混合物形成。在图解中的分区的每个条带或簇根据靶含量来标识。每组分区的扩增可以通过在用于该组的不同解链温度的热循环来执行，如图所示，这可以便于鉴定合适的解链温度，所述合适的解链温度给出代表一个靶的存在(A或B)或两个靶的不存在(-)的条带的可接受或最佳分辨率。

所指示的各种退火温度可以产生每组的不同条带的分辨率和锐度的实质差异。通道1示出靶B阳性分区与靶A阳性分区之间的很小或无区别的分辨率。通道2和3示出，增加退火温度可以分辨出靶A阳性分区和靶B阳性分区，60度的退火温度给出更好的分离。通道4示出，进一步增加退火温度可以促使阳性靶条带中的一个或两个增加大小(例如，向下拖曳)和/或向阴性分区的条带向下移位。通道5示出，又进一步增加退火温度可导致靶B的扩增变得不可检测，由于其引物具有较低的解链温度。

II.实施例

下面的实施例描述用通用报告物的多重数字测定的精选方面。这些实施例仅旨在说明且不应限制本公开内容的整个范围。

实施例1.从具有通用报告物的液滴收集的示例性多重数据

这个实施例描述从包含通用报告物的液滴收集的示例性数据，并且支持图4-9的策略；参见图10-12。

图10示出来自在具有通用报告物(染料)以及用于RPP30和MRGPRX1的不同浓度引物的液滴中执行的多重测定收集的数据。更具体地，RPP30引物组以50nM的最终浓度添加，而MRGPRX1引物组以150nM的最终浓度添加。RPP30/MRGPRX1按从最低荧光幅值到最高荧光幅值的顺序很好地示出了不包含扩增子、只包含MRGPRX1扩增子、只包含RPP30扩增子以及包含对于RPP30和MRGPRX1两者的扩增子的液滴的三个不同的扩增阳性群体。数据使用图4和7中描述的策略生成。

图11示出来自在具有通用报告物(染料)以及用于RPP30和ACTB的产生不同长度的扩增子的引物的液滴中执行的多重测定收集的数据。更具体地，用于RPP30的引物生成62个碱基对的扩增子，而用于ACTB的引物生成147个碱基对的扩增子。RPP30/ACTB按从最低荧光幅值到最高荧光幅值的顺序很好地示出了不包含扩增子、只包含RPP30扩增子、只包含ACTB扩增子以及包含对于RPP30和ACTB两者的扩增子的液滴的三个不同的扩增阳性群体。数据使用图5和6中描述的策略生成。

图12示出来自在具有通用报告物(染料)以及用于PRS1和PRS2的以此处所检验的不同效率产生相同长度的扩增子的引物的液滴中执行的多重测定收集的数据。使用63℃的退火温度。PRS1用退火温度优化为63℃的引物组来扩增。PRS2用退火温度优化为59℃的引物组来扩增。示出了液滴的三个阳性群体。由于使用了未优化的退火温度，PRS2以较低的效率扩增。PRS1以优化的PCR效率扩增。双重阳性(PRS1/PRS2)液滴具有两个扩增的靶。数据使用图8和9中描述的策略生成。

■实施例2.以不同引物浓度的示例性多重化

这个实施例描述利用通用报告物的多重数字测定的进一步方面。

用于两个或更多个靶的多重测定可以在具有染料作为用于测定每个靶的报告物的液滴中执行。来自具有相同浓度引物对的双重反应的扩增靶(扩增子)可以在重叠荧光幅值下进行检测，产生阳性靶液滴的混合群体/簇，使得难以区分每个特定靶的阳性分区的子集。用不同浓度的两个靶的引物对执行的样品双重反应可以在液滴中产生扩增靶的两个不同和独立的群体，使得能鉴定和定量每个靶。双重反应中两个阳性靶群体的幅值可以和各自单重反应中的那些匹配，暗示每个群体中的大多数液滴包含相同靶的扩增子。

不同的扩增子群体存在于包含对于两个靶的引物浓度的两倍差异和对应于两个靶的模板的不同浓度的十倍范围的双重反应中。

可以增加多重化的程度(例如，增加到三个靶)。单重和三重PCR反应可以用DNA模板的较大片段化形式来执行。DNA模板可以初始包含彼此连接的所有三个靶，但是可以在形成液滴前被消化，以在它们自身的各自的模板片段上分离靶，这允许三重反应中的每个液滴只包含一个靶。靶可以局部占有被布置在液滴中并随后被扩增。扩增的靶可以基于与每个扩增子复合的染料的不同荧光强度来区分。增加扩增子的量可以产生更亮的信号，因为更多的扩增子DNA可用于被染料结合。调节引物浓度以影响扩增子产率和荧光输出可以创建靶群体的分离。更高程度的多重化可以使用这种方法实现来产生每个靶的单独荧光条带或簇。

■实施例3.用于选择性剪接的β葡糖苷酸酶(GUSB)的分析

这个实施例描述用章节I的数字测定系统获得的示例性数据，以区分通过选择性剪接所产生的长链形式和短链形式的GUSBRNA；参见图13A-D和14。

图13A到13D示出在液滴的一对波长机制(通道1(例如，FAM染料通道)和通道2(例如，VIC染料通道))中收集的扩增数据(光致发光强度)的散点图。液滴包含不同稀释度的cDNA样品(A到D，分别在图13A到13D中)。扩增用分别结合到GUSB的外显子7和外显子8的正向引物和反向引物来执行。GUSB的选择性剪接生成GUSBRNA/cDNA的外显子7/8区域的更短剪接形式和更长未剪接形式。每种形式的扩增通过液滴中包含的染料的光致发光来检测。染料的光致发光在两个光通道中是可检测的。

每个曲线图中的液滴的每个簇根据靶含量(分别地，剪接形式/未剪接形式)来标识。对于两个靶(短的和长的)为阴性的液滴被标识为(-/-)；只对短形式为阳性的液滴被标识为(+/-)；只对长形式为阳性的液滴被标识为(-/+)；以及对于短形式和长形式均为阳性的液滴被标识为(+/+)。双重阳性(+/+)液滴在通道1中具有最类似于短形式阳性液滴的幅值，但是在通道2中具有最类似于长形式阳性液滴的幅值。换句话说，包含短靶和长靶的拷贝的液滴是离轴的，因为它们不落在连接其他液滴簇的大致对角线(roughlydiagonalline)上。从两个光通道绘制数据允许双重阳性簇与每个单重阳性簇区分开。所有四个不同的群体是可区分的。在其他情况下，四个群体可以通过使用仅用单个光通道获得的数据区分。在某些实施方案中，所述群体中的至少两个可以重叠，但是浓度仍然可以如在2014年2月3日提交的美国专利申请序列号14/171,754中所述的来计算，该专利申请通过引用并入本文。

■实施例4.用于选择性剪接的CAMTA1、TPM3和ABLIM1的分析

这个实施例描述通过章节I的数字测定系统获得的示例性数据，以区分通过选择性剪接所产生的钙调蛋白结合转录激活子1(CAMTA1)、原肌球蛋白3(TPM3)和肌动蛋白结合LIM蛋白1(ABLIM1)RNA的长形式和短形式；参见图15-19。

选择正向和反向引物以在相对侧面与每个基因的选择性剪接的区域相接。预测引物产生用于CAMTA1的57bp和88bp的扩增子，用于ABLIM1的113bp和218bp的扩增子，以及用于TPM3的88bp、167bp和1415bp的扩增子。TPM3的最长扩增子(1415bp)在测定中是不可检测的。因此，对于每个基因，两个靶即短靶和长靶被扩增和检测。

图15示出连续地从液滴收集的扩增数据(荧光幅值)的图解，每个液滴的检测在事件序列中为编号的事件。每个液滴包含通用报告物并且根据被扩增的靶分组为三组(CAMTA1、TPM3和ABLIM1)。液滴的每个簇或条带对于两个靶被标识为阴性的(-)，或标识为包含在括号中指示的大小的靶。每个基因中对于短靶为阳性的液滴和对于长靶为阳性的液滴彼此容易分辨出。双重阳性液滴在图15中是不可见的，但是，如果存在的话，可以具有或可以不具有比两类单重阳性液滴更高的幅值。

图16示出通过在来自图15的靶基因测定的液滴中生成的扩增子的毛细管电泳获得的扩增数据的曲线图。DNA通过破坏液滴分散在其中的乳液从每个多重测定的液滴中提取。DNA通过毛细管电泳分辨出并通过与一组大小标记物比较来区分大小，每个标记物的大小以bp指示。每个多重测定产生预测大小的更短扩增子和更长扩增子。

图17示出对ABLIM1cDNA的长(218bp)和短(113bp)选择性剪接区域计算的浓度的图解。浓度用从如在图15中的在包含通用报告物、具有不同的稀释度的脑RNA/cDNA样品的液滴中执行的ABLIM1测定收集的扩增数据计算。

图18示出来自对图15所述的三个不同选择性剪接测定(ABLIM1、TPM3和CAMTA1)的两个不同光通道(CH1和CH2)中作为荧光(FL)收集的扩增数据的一系列散点图。测定在包含通用报告物的液滴中执行。每个不同的选择性剪接测定检验从三个不同的组织源(脑部、心脏和骨骼肌)获得的RNA/cDNA。液滴的每个簇根据选择性剪接靶的靶含量(短形式(S)/长形式(L))在每个曲线图中标识。从每个曲线图的数据计算的短形式[S]和长形式[L]的浓度在每个曲线图的左上角列出。

图19示出从如对图15所述执行的三个不同选择性剪接测定(ABLIM1、TPM3和CAMTA1)计算的浓度数据(长形式(L)百分比)的图解。测定在具有通用报告物以及从各个指示的组织源之一获得的RNA/cDNA的液滴中执行。每个组织的长形式百分比计算为[L]/([S]+[L])。

■实施例5.用于信号稳定化的扩增后热调节

这个实施例描述可以在用通用报告物执行的测定中观察到的示例性信号衰减，以及可以产生信号稳定化的热调节过程；参见图20。

图20示出可以从包含通用报告物的分区获得的扩增数据的示意图。分区可以通过加热和冷却的多个循环来热循环以产生变性以及随后退火和延伸。例如，分区可以加热到至少约85或90摄氏度的温度，并随后冷却到约55到75摄氏度的温度，持续多次循环(诸如至少10个、15个或20个循环)。荧光可以从分区连续地测量，如图所示。阳性靶(+)分区形成更高信号幅值的条带，以及阴性靶(-)分区形成更低信号幅值的条带。

在左边的分区组表现出可变的信号强度，随着时间推移的显著信号衰减，尤其是用于阳性分区的显著信号衰减。信号的这种时间依赖性的变化可以在所计算的靶浓度中引入误差，可能使阳性靶群体的鉴定复杂化，并且可能导致不同的群体重叠，尤其是在多重测定中。信号衰减可以是数字测定中通用报告物特有的。

在右边的分区组可以在热循环后进行热调节，以稳定来自分区的可检测的信号。热调节可以包括(a)、(b)和(c)的任何组合，其中，(a)将分区冷却到小于约20、10或5摄氏度的温度，(b)将分区加热到至少约80、85或90摄氏度的温度，以及(c)将分区冷却到小于约20、10或5摄氏度的温度。步骤(a)到(c)可以按顺序执行。分区可以在每个调节温度保持任何合适的时间长度，诸如至少约10秒或30秒，或至少约1、2或5分钟等等。分区可以无限期地保持在最终调节温度，并且在分区已经热调节后，信号可以无限期稳定。在示例性实施方案中，分区可以在4摄氏度冷却5分钟，在90摄氏度加热5分钟，再在4摄氏度冷却并随后在该温度无限期保留，直到用户准备好测量来自分区的信号。

■实施例6.通过长度和扩增效率来区分靶

这个实施例描述可以用通用报告物和至少三个靶执行的示例性多重测定，分区中的靶通过靶扩增后，从分区中的通用报告物测量的光致发光的幅值是可区分的；参见图21。

图21示出用通用报告物执行的三个不同靶(A、B和C)的单重测定和多重测定可获得的扩增数据的示意图。用于三个单个靶测定(“单重”)的数据在左边示出，以及用于多重测定(3重，所有三个靶)的数据在右边示出。

用于每个靶的扩增策略在用于单重测定的数据的对应部分上方示意示出。三个靶可以(或可以不)用彼此不同的引物扩增。引物可以(或可以不)以相同的浓度存在。三个靶可以具有相同的长度或可以是不同的长度。此处，靶A比靶B和C更长，靶B和C具有彼此几乎相同的大小。由于长度差异，A阳性分区的信号强度可以大于(或小于)B和C阳性分区的信号强度，如此处所示。B阳性和C阳性分区的信号强度可以是几乎相同的，也如此处所示。

可以从相同组的分区中的三个靶扩增收集的数据在左侧的3重列中示出，引物浓度与单重测定中的相同。A阳性分区可从其他分区分辨出，但是B阳性和C分阳性区彼此不能分辨出。

可以在减少用于C靶的引物浓度后，从相同组的分区中的三个靶扩增收集的数据在右侧的3重列中示出。A阳性、B阳性和C阳性分区可以彼此分辨出并且可与阴性靶分区(-)分辨出。

实施例7.用通用报告物区分靶和副产物

这个实施例描述章节I的数字测定系统的使用，具有通用报告物以区分靶的扩增和至少一个扩增副产物；参见图22和23。

图22示出包含靶的模板220和引物二聚体222-226，该引物二聚体可以与图2的数字测定中的靶区分。所述靶和每个引物二聚体可以用相同的引物对228、230扩增。因此，所示的一个或更多个引物二聚体可以通过生成假阳性的液滴，尤其是用通用报告物来增加背景。不过，如果靶具有与被扩增的每个副产物不同的长度和/或扩增效率，包含扩增的靶的分区可以基于可区分的标志(例如，从每个分区检测出的光致发光的不同幅值)与具有扩增的引物二聚体的分区区分开。

图23示出描绘可以在包含图22的靶模板和引物的液滴中执行的图1的数字测定中收集的示例性发光数据的图解。包含扩增的靶的液滴的光致发光强度可区分地比包含扩增的引物二聚体(或无可检测的扩增(NEG))的液滴的更高。在此处，引物二聚体扩增随机发生，就是说，仅在阴性对照的液滴的子集中发生。在其他情况下，引物二聚体扩增可以在缺少靶的至少一个拷贝的基本每个液滴中发生。在任何情况下，靶的扩增可以超过和/或抑制阳性靶液滴中的引物二聚体的扩增。靶的水平可以从对于靶是阳性扩增(或阴性扩增)的液滴的数量计算。对于扩增副产物是阳性的液滴可以分类为对于靶是阴性的扩增并且可以贡献于用于计算靶水平的总计数(阳性靶加上阴性靶)。

阳性引物二聚体液滴的强度水平的测量可以用于设定对于期望靶是阳性的液滴的合适强度阈值。具体地，由阴性对照测定中的阳性引物二聚体液滴产生的信号幅值可以用于选择在该幅值之上的阈值，如图23右边所示，以鉴定对于靶是阴性的阳性引物二聚体液滴。

■实施例8.精选的实施方案I

这个实施例将本公开内容的精选的实施方案展示为一系列编号的段落。

1.一种执行多重数字测定的方法，所述方法包括：(A)选择用于扩增第一和第二靶的引物及其浓度，以生成可用通用报告物区分的对应的第一和第二扩增子；(B)形成分区，每个分区包含通用报告物和所选择的浓度下的引物，其中，用于每个靶的模板以局部占有存在于所述分区中；(C)扩增所述分区中的第一靶和第二靶；(D)检测来自单个分区的由通用报告物发射的光；以及(E)基于所检测到的光确定每个靶的水平。

2.根据段落1所述的方法，其中，所述通用报告物包括嵌入染料。

3.根据段落1或2所述的方法，其中，选择步骤包括选择用于扩增第一靶的第一引物对和用于扩增第二靶的第二引物对的步骤。

4.根据段落3所述的方法，其中，所述第一引物对和第二引物对中的每一对包括是两对的成员的相同引物和仅是所述对中的一对的成员的不同引物。

5.根据段落3所述的方法，其中，所述第一对的引物不是第二对的成员。

6.根据段落3所述的方法，其中，所述第一引物对和第二引物对被选择为使得第一扩增子比第二扩增子长至少20％。

7.根据段落1-6中的任一项所述的方法，所述方法还包括在不同组的分区中用不同浓度的引物扩增所述靶中的至少一个后，通过检测由通用报告物发射的光的强度来检验至少一个所述引物的不同浓度的步骤，其中，选择步骤基于检验步骤。

8.根据段落7所述的方法，其中，所述检验步骤包括改变用于不同组的分区中的第一靶的引物的浓度同时保持用于所述分区中的第二靶的引物的浓度恒定的步骤。

9.根据段落8所述的方法，其中，所述检验步骤包括改变分区中用于第一靶的引物对的浓度同时保持用于第二靶的引物对的浓度恒定的步骤。

10.根据段落1所述的方法，所述方法还包括在不同组的分区中用不同的第一靶引物对扩增不同形式的第一靶后，通过检测由通用报告物发射的光来检验第一扩增子的不同扩增子长度的步骤，其中，选择步骤基于检验步骤。

11.根据段落10所述的方法，其中，检验步骤包括扩增在不同组的分区中的第二扩增子。

12.根据段落11所述的方法，其中，第二扩增子的长度在不同组的分区中是恒定的。

13.根据前述段落中的任一项所述的方法，所述方法还包括在不同组的分区中用不同浓度的通用报告物扩增至少一个所述靶后，通过检测由通用报告物发射的光来检验所述通用报告物在不同组的分区中的不同浓度的步骤，其中，选择步骤基于检验步骤。

14.根据前述段落中的任一项所述的方法，其中，选择引物的步骤包括根据分区中的扩增子长度与对于所述分区的从通用报告物测量的信号幅值之间的预期或假设关系来选择一个或更多个引物的步骤。

15.根据前述段落中的任一项所述的方法，其中，选择引物的步骤包括选择用于扩增第一靶的一个或更多个引物的第一浓度和用于扩增第二靶的一个或更多个引物的第二浓度的步骤，并且其中，所述第一浓度不同于所述第二浓度。

16.根据段落15所述的方法，其中，第一浓度比第二浓度大至少约50％。

17.根据段落16所述的方法，其中，第一浓度是第二浓度的至少约两倍。

18.根据前述段落中的任一项所述的方法，其中，用于扩增第二靶的至少一个引物具有比用于扩增第一靶的每个引物低的解链温度。

19.根据段落18所述的方法，其中，用于第一靶的每个引物具有比用于第二靶的每个引物高的解链温度。

20.根据前述段落中的任一项所述的方法，其中，用于第二靶的至少一个引物比用于第一靶的每个引物短。

21.根据段落20所述的方法，其中，用于第二靶的每个引物比用于第一靶的每个引物短。

22.根据段落18所述的方法，所述方法还包括基于解链温度算法设计至少一个引物的步骤。

23.根据段落22所述的方法，其中，设计所述至少一个引物的步骤包括基于解链温度算法设计每个引物的步骤。

24.根据前述段落中的任一项所述的方法，所述方法还包括对于包含相同反应混合物的不同组的分区的扩增步骤检验不同退火温度的步骤。

25.根据段落24所述的方法，所述方法还包括基于所述检验步骤选择退火温度的步骤，其中，确定每个靶的水平的步骤基于在所选择的退火温度下执行的扩增步骤执行。

■实施例9.精选的实施方案II

这个实施例将本公开内容的精选的实施方案展示为一系列编号的段落。

1.一种执行多重数字测定的方法，所述方法包括：(A)形成分区，每个分区包括相同混合物的一部分，所述混合物包含第一靶和第二靶并且还包含对扩增任一靶灵敏的通用报告物，其中，只有一个子集的分区各自包含第一靶的至少一个拷贝以及只有一个不同子集的分区各自包含第二靶的至少一个拷贝；(B)扩增所述分区中的第一靶和第二靶；(C)收集来自用于多个分区的通用报告物的扩增数据，其中第一靶在分区中的扩增与第二靶的扩增是可区分的；以及(D)确定每个靶的水平。

2.根据段落1所述的方法，其中，所述扩增数据在大约相同的温度从多个分区收集。

3.根据段落1或2所述的方法，其中，收集扩增数据的步骤在扩增步骤已完成后执行。

4.根据段落1-3中的任一项所述的方法，其中在扩增步骤期间，用于第二靶的引物比用于第一靶的引物更高效地引发。

5.根据段落4所述的方法，其中，用于第一靶的至少一个引物以比用于第二靶的所述引物低的浓度存在。

6.根据段落4或5所述的方法，其中，用于第一靶的至少一个引物具有比用于第二靶的所述引物低的解链温度。

7.根据段落4-6中的任一项所述的方法，其中，用于第一靶的至少一个引物比用于第二靶的每个引物短。

8.根据段落1-7中的任一项所述的方法，其中，仅由于所述靶中的任一个相对于彼此的长度差异，所述数据中对分区中的第一靶的扩增不能与对分区中第二靶的扩增区分。

9.根据段落1-8中的任一项所述的方法，其中，扩增步骤用用于第一靶的第一引物对和用于第二靶的第二引物对来执行，并且其中，第一对中的至少一个引物在所述分区中的浓度小于第二对中的每个引物的浓度。

10.根据段落9所述的方法，其中，第一对中的每个引物在每个分区中的浓度小于第二对中的每个引物的浓度。

11.根据段落1-10中的任一项所述的方法，其中，扩增步骤用用于第一靶的第一引物对和用于第二靶的第二引物对来执行，并且其中，第一对中的至少一个引物具有比第二对中的每个引物低的解链温度。

12.根据段落11所述的方法，其中，第一对中的每个引物具有比第二对中的每个引物低的解链温度。

13.根据段落11或12所述的方法，其中，所述第一对中的至少一个引物比第二对中的每个引物短。

14.根据段落13所述的方法，其中，所述第一对中的每个引物比第二对中的每个引物短。

15.根据段落1-14中的任一项所述的方法，其中，扩增步骤以多个热循环和第一引物对以及第二引物对来执行，所述第一引物对用于生成对应于第一靶的第一扩增子，且所述第二引物对用于生成对应于第二靶的第二扩增子，并且其中，每个热循环的退火温度允许所述第二引物对比第一引物对更有效结合。

16.根据段落1-15中的任一项所述的方法，其中，扩增步骤包括扩增第一靶以形成第一扩增子和扩增第二靶以形成第二扩增子的步骤，并且其中，第一扩增子具有与第二扩增子不同的长度。

17.根据段落16所述的方法，其中，扩增的步骤包括用相同的引物对扩增第一靶和第二靶的步骤。

18.根据段落1-17中的任一项所述的方法，其中，收集扩增数据的步骤包括收集来自通用报告物的光致发光数据的步骤。

19.根据段落1-18中的任一项所述的方法，其中，扩增步骤以用于第一靶的第一引物对和用于第二靶的第二引物对来进行，其中，(a)第一对中的至少一个引物在分区中的浓度小于第二对中的每个引物的浓度，(b)第一对中的至少一个引物被构造为具有比第二对中的每个引物低的解链温度，(c)第一对中的至少一个引物比第二对中的每个引物短，或(d)(a)到(c)的任意组合，并且其中，第一靶的扩增在所述数据中产生比第二靶的扩增弱的平均信号。

20.一种执行多重数字测定的方法，所述方法包括：(A)形成分区，每个分区包括相同混合物的一部分，所述混合物包含靶并且还包含对扩增所述靶灵敏的通用报告物，其中，只有一个子集的分区各自包含所述靶的至少一个拷贝；(B)扩增所述分区中的靶和至少一种副产物；(C)收集来自用于多个分区的通用报告物的扩增数据，其中，所述靶、所述副产物在分区中的扩增在数据中是可彼此区分的，或所述靶和所述副产物在分区中的扩增在数据中是不可彼此区分的；和(D)确定靶的水平。

21.根据段落20所述的方法，其中，所述副产物包括引物二聚体。

22.根据段落20或21所述的方法，其中，副产物的可检测的扩增在所述分区中随机发生。

23.根据段落20-22中的任一项所述的方法，其中，所述靶在分区中的扩增抑制副产物的扩增。

24.根据段落20-23中的任一项所述的方法，所述方法还包括基于至少一个阈值将分区指定为对于所述靶是阳性的或阴性的步骤，所述至少一个阈值选择性纳入对于所述靶是阳性的分区并选择性排除对于所述副产物是阳性的分区和对于靶和副产物都不是阳性的分区。

25.根据段落20-24中的任一项所述的方法，其中，对于所述靶是阳性的分区具有比对于所述副产物是阳性的分区更强的来自通用报告物的信号。

26.根据段落20-25中的任一项所述的方法，其中，确定所述靶的水平的步骤包括基于对于所述靶是阳性的多个分区的分数或基于对于所述靶是阴性的多个分区的分数计算浓度的步骤。

27.一种执行多重数字测定的方法，所述方法包括：(A)形成分区，每个分区包括相同混合物的一部分，所述混合物包含靶和对扩增所述靶灵敏的通用报告物，其中，只有一个子集的所述分区各自包含所述靶的至少一个拷贝；(B)对所述分区热循环以扩增所述靶；(C)通过将所述分区冷却到低于室温、将所述分区加热到高于80摄氏度并将所述分区再次冷却到低于室温来稳定来自所述热循环的分区的待检测的信号；(D)收集来自用于多个分区的通用报告物的扩增数据；以及(E)确定所述靶的水平。

28.一种执行多重数字测定的方法，所述方法包括：(A)选择用于扩增第一和第二靶的引物及其浓度以生成可用通用报告物区分的对应的第一和第二扩增子；(B)形成分区，每个分区包含通用报告物和所选择的浓度下的引物，其中，用于每个靶的模板以局部占有存在于所述分区中；(C)扩增所述分区中的第一靶和第二靶；(D)检测来自单个分区的由通用报告物发射的光；以及(E)基于所检测到的光确定每个靶的水平。

29.根据段落28所述的方法，其中，所述通用报告物包括嵌入染料。

30.根据段落28或29所述的方法，其中，选择步骤包括选择用于扩增第一靶的第一引物对和用于扩增第二靶的第二引物对的步骤。

31.根据段落30所述的方法，其中，所述第一引物对和第二引物对中的每一对包括是两对的成员的相同引物和仅是所述对中的一对的成员的不同引物。

32.根据段落30所述的方法，其中，所述第一对的引物不是第二对的成员。

33.根据段落30-32中的任一项所述的方法，其中，所述第一对和第二对引物被选择为使得第一扩增子比第二扩增子长至少20％。

34.根据段落33所述的方法，所述方法还包括在不同组的分区中用不同浓度的引物扩增所述靶中的至少一个后，通过检测由通用报告物发射的光的强度来检验至少一个所述引物的不同浓度的步骤，其中，选择步骤基于检验步骤。

35.根据段落34所述的方法，其中，所述检验步骤包括改变用于不同组的分区中的第一靶的引物的浓度同时保持用于所述分区中的第二靶的引物的浓度恒定的步骤。

36.根据段落35所述的方法，其中，所述检验步骤包括改变分区中用于第一靶的引物对的浓度同时保持用于第二靶的引物对的浓度恒定的步骤。

37.根据段落28-36中的任一项所述的方法，所述方法还包括在不同组的分区中用不同的第一靶引物对扩增不同形式的第一靶后，通过检测由通用报告物发射的光来检验第一扩增子的不同扩增子长度的步骤，其中，选择步骤基于检验步骤。

38.根据段落37所述的方法，其中，检验步骤包括扩增在不同组的分区中的第二扩增子。

39.根据段落38所述的方法，其中，第二扩增子的长度在不同组的分区中是恒定的。

40.根据段落28-39中的任一项所述的方法，所述方法还包括在不同组的分区中用不同浓度的通用报告物扩增至少一个所述靶后，通过检测由通用报告物发射的光来检验所述通用报告物在不同组的分区中的不同浓度的步骤，其中，选择步骤基于检验步骤。

41.根据段落28-40中的任一项所述的方法，其中，选择引物的步骤包括根据分区中的扩增子长度与对于所述分区的从通用报告物测量的信号幅值之间的预期或假设关系来选择一个或更多个引物的步骤。

42.根据段落28-41中的任一项所述的方法，其中，选择引物的步骤包括选择用于扩增第一靶的一个或更多个引物的第一浓度和用于扩增第二靶的一个或更多个引物的第二浓度的步骤，并且其中，所述第一浓度不同于所述第二浓度。

43.根据段落42所述的方法，其中，第二浓度比第一浓度大至少约50％。

44.根据段落42所述的方法，其中，第二浓度是第一浓度的至少约两倍。

45.根据段落28-44中的任一项所述的方法，其中，用于扩增第一靶的至少一个引物具有比用于扩增第二靶的每个引物低的解链温度。

46.根据段落45所述的方法，其中，用于第二靶的每个引物具有比用于第一靶的每个引物高的解链温度。

47.根据段落28-46中的任一项所述的方法，其中，用于第一靶的至少一个引物比用于第二靶的每个引物短。

48.根据段落47所述的方法，其中，用于第一靶的每个引物比用于第二靶的每个引物短。

49.根据段落28-48中的任一项所述的方法，所述方法还包括基于解链温度算法设计至少一个引物的步骤。

50.根据段落49所述的方法，其中，设计所述至少一个引物的步骤包括基于解链温度算法设计每个引物的步骤。

51.根据段落28-50中的任一项所述的方法，所述方法还包括对于包含相同反应混合物的不同组的分区的扩增步骤检验不同退火温度的步骤。

52.根据段落51所述的方法，所述方法还包括基于所述检验步骤选择退火温度的步骤，其中，确定每个靶的水平的步骤基于在所选择的退火温度下执行的扩增步骤执行。

53.一种组合物，所述组合物用于执行多重测定，所述组合物包含：(A)多个液滴，每个液滴包含足以扩增第一靶和第二靶的扩增试剂并且还包含对扩增任一靶灵敏的通用报告物，其中，只有一个子集的液滴各自包含第一靶的至少一个拷贝，并且只有一个不同子集的液滴各自包含第二靶的至少一个拷贝；和(B)围绕每个所述液滴的连续相。

54.根据段落53所述的组合物，其中，所述连续相包括油。

55.根据段落53或54所述的组合物，其中，所述连续相包括表面活性剂。

56.根据段落53-55中的任一项所述的组合物，其中，所述扩增试剂包括用于扩增每个靶的至少一个不同引物。

57.根据段落56所述的组合物，其中，所述扩增试剂包括用于扩增第一靶的第一引物对和用于扩增第二靶的第二引物对，并且其中，第一对中的每个引物不同于第二对中的每个引物。

58.根据段落53-57中的任一项所述的组合物，其中，第一靶的扩增形成第一扩增子，其中，第二靶的扩增形成第二扩增子，并且其中，第一扩增子具有与第二扩增子不同的长度。

59.根据段落53-58中的任一项所述的组合物，其中，第一子集的液滴各自包含第一靶的至少一个拷贝，其中，不同的第二子集的液滴各自包含第二靶的至少一个拷贝，并且其中，不同的第三子集的液滴的各自包含第一靶的至少一个拷贝和第二靶的至少一个拷贝。

60.根据段落53-59中的任一项所述的组合物，其中，所述通用报告物结合双链核酸。

61.根据段落53-60中的任一项所述的组合物，其中，所述通用报告物包括光致发光嵌入染料。

62.根据段落53-61中的任一项所述的组合物，其中，所述扩增试剂包括用于扩增第一靶的第一引物对和用于扩增第二靶的第二引物对，并且其中，相对于第二对中的每个引物，第一对中的至少一个引物以更低的浓度存在。

63.根据段落62所述的组合物，其中，相对于第二对中的每个引物，第一对中的每个引物以更低的浓度存在。

64.根据段落53-63中的任一项所述的组合物，其中，所述扩增试剂包括用于扩增第一靶的第一引物对和用于扩增第二靶的第二引物对，并且其中，第一对中的至少一个引物具有比第二对中的每个引物更低的解链温度。

65.根据段落64所述的组合物，其中，第一对中的每个引物具有比第二对中的每个引物低的解链温度。

66.根据段落53-65中的任一项所述的组合物，其中，所述扩增试剂包括用于扩增第一靶的第一引物对和用于扩增第二靶的第二引物对，并且其中，第一对中的至少一个引物比第二对中的每个引物短。

67.根据段落66所述的组合物，其中，所述第一对中的每个引物比第二对中的每个引物短。

68.根据段落53-67中的任一项所述的组合物，其中，第一靶的扩增形成第一扩增子，其中，第二靶的扩增形成第二扩增子，并且其中，相比于结合第二扩增子的拷贝，通用报告物更多地结合第一扩增子的拷贝。

上面阐述的本公开内容可以包含具有独立效用的多个不同发明。虽然这些发明中的每个发明已经以优选形式公开，但是如本文公开和示出的其具体实施方案不应认为具有限制意义，因为其很多变化是可能的。本发明的主题包括本文公开的各种要素、特征、功能和/或属性的所有新颖和非显而易见的明显组合以及子组合。以下权利要求特别指出了被视为新颖和非显而易见的某些组合和子组合。以特征、功能、要素和/或属性的其他组合和子组合实施的发明可以在要求本申请或相关申请的优先权的申请中要求保护。此类权利要求，无论针对不同的发明还是相同的发明，以及无论其对于初始权利要求的范围是更广、更窄、等同或不同，都应当视为包括在本公开内容的发明主题内。此外，顺序指示符诸如对于提到的要素的第一、第二或第三用于区分要素，并不表示此类要素的特定位置或顺序，除非另外特别说明。

Claims (68)

1.一种执行多重数字测定的方法，所述方法包括：

形成分区，每个所述分区包括相同混合物的一部分，所述混合物包含第一靶和第二靶并且还包含对扩增任一靶灵敏的通用报告物，其中，只有一个子集的分区各自包含所述第一靶的至少一个拷贝，并且只有一个不同子集的分区各自包含所述第二靶的至少一个拷贝；

扩增所述分区中的所述第一靶和所述第二靶；

收集来自用于多个分区的通用报告物的扩增数据，其中，对分区中所述第一靶的扩增能够与所述第二靶的扩增区分；和

确定每个靶的水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增数据在大约相同的温度从所述多个分区收集。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，收集扩增数据的步骤在所述扩增步骤已完成后执行。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述扩增步骤期间，用于所述第二靶的引物比用于所述第一靶的引物更高效地引发。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，用于所述第一靶的至少一个引物以比用于所述第二靶的所述引物低的浓度存在。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，用于所述第一靶的至少一个引物具有比用于所述第二靶的所述引物低的解链温度。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，用于所述第一靶的所述至少一个引物比用于所述第二靶的每个引物短。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，仅由于所述靶中的任一个相对于彼此的长度差异，所述数据中对分区中所述第一靶的扩增不能与对分区中所述第二靶的扩增区分。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增步骤用用于所述第一靶的第一引物对和用于所述第二靶的第二引物对来执行，并且其中，所述第一对中的至少一个引物在所述分区中的浓度小于所述第二对中的每个引物的浓度。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第一对中的每个引物在每个分区中的浓度小于所述第二对中的每个引物的浓度。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增步骤用用于所述第一靶的第一引物对和用于所述第二靶的第二引物对来执行，并且其中，所述第一对中的至少一个引物具有比所述第二对中的每个引物低的解链温度。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述第一对中的每个引物具有比所述第二对中的每个引物低的解链温度。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述第一对中的至少一个引物比所述第二对中的每个引物短。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述第一对中的每个引物比所述第二对中的每个引物短。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增步骤以多个热循环和第一引物对以及第二引物对来执行，所述第一引物对用于生成对应于所述第一靶的第一扩增子，且所述第二引物对用于生成对应于所述第二靶的第二扩增子，并且其中，每个热循环的退火温度允许所述第二引物对比所述第一引物对更有效结合。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增步骤包括扩增所述第一靶以形成第一扩增子和扩增所述第二靶以形成第二扩增子的步骤，并且其中，所述第一扩增子具有与所述第二扩增子不同的长度。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述扩增步骤包括用相同的引物对扩增所述第一靶和所述第二靶的步骤。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述收集扩增数据的步骤包括收集来自通用报告物的光致发光数据的步骤。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增步骤以用于所述第一靶的第一引物对和用于所述第二靶的第二引物对进行，其中

(a)所述第一对中的至少一个引物在所述分区中的浓度小于所述第二对中的每个引物的浓度，

(b)所述第一对中的至少一个引物被构造为具有比所述第二对中的每个引物低的解链温度，

(c)所述第一对中的至少一个引物比所述第二对中的每个引物短，或

(d)(a)-(c)的任意组合，并且

其中，所述第一靶的扩增在所述数据中产生比所述第二靶的扩增弱的平均信号。

20.一种执行数字测定的方法，所述方法包括：

形成分区，每个所述分区包括相同混合物的一部分，所述混合物包含靶并且还包含对扩增所述靶灵敏的通用报告物，其中，只有一个子集的分区各自包含所述靶的至少一个拷贝；

扩增所述分区中的所述靶和至少一种副产物；

收集来自用于多个分区的通用报告物的扩增数据，其中，所述靶、所述副产物在分区中的扩增在所述数据中是可彼此区分的，或所述靶和所述副产物在分区中的扩增在所述数据中是不可彼此区分的；和

确定所述靶的水平。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述副产物包括引物二聚体。

22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述副产物的可检测的扩增在所述分区中随机发生。

23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述靶在分区中的扩增抑制所述副产物的扩增。

24.根据权利要求20所述的方法，所述方法还包括基于至少一个阈值将分区指定为对于所述靶是阳性的或阴性的步骤，所述至少一个阈值选择性纳入对于所述靶是阳性的分区并选择性排除对于所述副产物是阳性的分区和对于所述靶和所述副产物都不是阳性的分区。

25.根据权利要求20所述的方法，其中，对于所述靶是阳性的分区具有比对于所述副产物是阳性的分区更强的来自所述通用报告物的信号。

26.根据权利要求20所述的方法，其中，确定所述靶的水平的步骤包括基于对于所述靶是阳性的多个分区的分数或基于对于所述靶是阴性的多个分区的分数计算浓度的步骤。

27.一种执行多重数字测定的方法，所述方法包括：

形成分区，每个所述分区包括相同混合物的一部分，所述混合物包含靶以及对扩增所述靶灵敏的通用报告物，其中，只有一个子集的分区各自包含所述靶的至少一个拷贝；

对所述分区热循环以扩增所述靶；

通过将所述分区冷却到室温以下、将所述分区加热到80摄氏度以上并将所述分区再次冷却到室温以下，稳定来自所述热循环的分区的待检测的信号；

收集来自用于多个分区的通用报告物的扩增数据；和

确定所述靶的水平。

28.一种执行多重数字测定的方法，所述方法包括：

选择用于扩增第一靶和第二靶的引物及其浓度，以生成能够用通用报告物区分开的对应的第一扩增子和第二扩增子；

形成分区，每个所述分区包含所述通用报告物和在所选择的浓度下的引物，其中，用于每个靶的模板以局部占有存在于所述分区中；

扩增所述分区中的所述第一靶和所述第二靶；

检测来自单个分区的由所述通用报告物发射的光；和

基于检测到的光确定每个靶的水平。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述通用报告物包括嵌入染料。

30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述选择步骤包括选择用于扩增所述第一靶的第一引物对和用于扩增所述第二靶的第二引物对的步骤。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述第一引物对和第二引物对中的每一对包括是两对的成员的相同引物和仅是所述对中的一对的成员的不同引物。

32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述第一对的引物不是所述第二对的成员。

33.根据权利要求30所述的方法，其中，所述第一引物对和所述第二引物对被选择为使得所述第一扩增子比所述第二扩增子长至少20％。

34.根据权利要求33所述的方法，所述方法还包括在不同组的分区中用不同浓度的引物扩增所述靶中的至少一个后，通过检测由通用报告物发射的光的强度来检验至少一个所述引物的不同浓度的步骤，其中，所述选择步骤基于所述检验步骤。

35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述检验步骤包括改变用于不同组的分区中的所述第一靶的引物的浓度同时保持用于所述分区中的所述第二靶的引物的浓度恒定的步骤。

36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述检验步骤包括改变所述分区中用于所述第一靶的引物对的浓度同时保持用于所述第二靶的引物对的浓度恒定的步骤。

37.根据权利要求28所述的方法，所述方法还包括在不同组的分区中用不同的第一靶引物对扩增不同形式的第一靶后，通过检测由所述通用报告物发射的光来检验所述第一扩增子的不同扩增子长度的步骤，其中，所述选择步骤基于所述检验步骤。

38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述检验步骤包括扩增在不同组的分区中的第二扩增子。

39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述第二扩增子的长度在不同组的分区中是恒定的。

40.根据权利要求28所述的方法，所述方法还包括在不同组的分区中用不同浓度的通用报告物扩增至少一个所述靶后，通过检测由所述通用报告物发射的光来检验所述通用报告物在不同组的分区中的不同浓度的步骤，其中，所述选择步骤基于检验步骤。

41.根据权利要求28所述的方法，其中，选择引物的步骤包括根据分区中的扩增子长度与对于所述分区的从通用报告物测量的信号幅值之间的预期或假设关系来选择一个或更多个引物的步骤。

42.根据权利要求28所述的方法，其中，选择引物的步骤包括选择用于扩增所述第一靶的一个或更多个引物的第一浓度和用于扩增所述第二靶的一个或更多个引物的第二浓度的步骤，并且其中，所述第一浓度不同于所述第二浓度。

43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述第二浓度比所述第一浓度大至少约50％。

44.根据权利要求42所述的方法，其中，所述第二浓度是所述第一浓度的至少约两倍。

45.根据权利要求28所述的方法，其中，用于扩增所述第一靶的至少一个引物具有比用于扩增所述第二靶的每个引物低的解链温度。

46.根据权利要求45所述的方法，其中，用于所述第二靶的每个引物具有比用于所述第一靶的每个引物高的解链温度。

47.根据权利要求28所述的方法，其中，用于所述第一靶的至少一个引物比用于所述第二靶的每个引物短。

48.根据权利要求47所述的方法，其中，用于所述第一靶的每个引物比用于所述第二靶的每个引物短。

49.根据权利要求28所述的方法，所述方法还包括基于解链温度算法设计至少一个引物的步骤。

50.根据权利要求49所述的方法，其中，设计所述至少一个引物的步骤包括基于解链温度算法设计每个引物的步骤。

51.根据权利要求28所述的方法，所述方法还包括对于包含相同反应混合物的不同组的分区的扩增步骤检验不同退火温度的步骤。

52.根据权利要求51所述的方法，所述方法还包括基于所述检验步骤选择退火温度的步骤，其中，确定每个靶的水平的步骤基于在所选择的退火温度下执行的扩增步骤执行。

53.一种组合物，所述组合物用于执行多重测定，所述组合物包含：

多个液滴，每个所述液滴包含足以扩增第一靶和第二靶的扩增试剂并且还包含对扩增任一靶灵敏的通用报告物，其中，只有一个子集的液滴各自包含所述第一靶的至少一个拷贝，并且只有一个不同子集的液滴各自包含所述第二靶的至少一个拷贝；和

围绕每个所述液滴的连续相。

54.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述连续相包括油。

55.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述连续相包括表面活性剂。

56.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述扩增试剂包括用于扩增每个靶的至少一个不同引物。

57.根据权利要求56所述的组合物，其中，所述扩增试剂包括用于扩增所述第一靶的第一引物对和用于扩增所述第二靶的第二引物对，并且其中，所述第一对中的每个引物不同于所述第二对中的每个引物。

58.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述第一靶的扩增形成第一扩增子，其中，所述第二靶的扩增形成第二扩增子，并且其中，所述第一扩增子具有与所述第二扩增子不同的长度。

59.根据权利要求53所述的组合物，其中，第一子集的液滴各自包含所述第一靶的至少一个拷贝，其中，不同的第二子集的液滴各自包含所述第二靶的至少一个拷贝，并且其中，不同的第三子集的液滴各自包含所述第一靶的至少一个拷贝和所述第二靶的至少一个拷贝。

60.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述通用报告物结合双链核酸。

61.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述通用报告物包括光致发光嵌入染料。

62.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述扩增试剂包括用于扩增所述第一靶的第一引物对和用于扩增所述第二靶的第二引物对，并且其中，相对于所述第二对中的每个引物，所述第一对中的至少一个引物以更低的浓度存在。

63.根据权利要求62所述的组合物，其中，相对于所述第二对中的每个引物，所述第一对中的每个引物以更低的浓度存在。

64.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述扩增试剂包括用于扩增所述第一靶的第一引物对和用于扩增所述第二靶的第二引物对，并且其中，所述第一对中的至少一个引物具有比所述第二对中的每个引物低的解链温度。

65.根据权利要求64所述的组合物，其中，所述第一对中的每个引物具有比所述第二对中的每个引物低的解链温度。

66.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述扩增试剂包括用于扩增所述第一靶的第一引物对和用于扩增所述第二靶的第二引物对，并且其中，所述第一对中的至少一个引物比所述第二对中的每个引物短。

67.根据权利要求66所述的组合物，其中，所述第一对中的每个引物比所述第二对中的每个引物短。

68.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述第一靶的扩增形成第一扩增子，其中，所述第二靶的扩增形成第二扩增子，并且其中，相比于结合所述第二扩增子的拷贝，通用报告物更多地结合所述第一扩增子的拷贝。