CN105164274A - 用于提高pcr准确度的试剂 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于提高PCR准确度的试剂。

Description

用于提高 PCR 准确度的试剂

与相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年1月23日提交的美国临时申请61/755,872的优先权，该临时申请通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本文提供了用于提高PCR准确度的试剂。

发明背景

我们实验室已经描述了当加入PCR扩增中时提高引物特异性的两个不同的试剂家族。一个试剂家族，在国际专利申请WO 2006/044995中描述，为3’和5’末端均经修饰以使茎的末端相对于DNA-DNA杂交体稳定的发夹形单链寡核苷酸，例如通过添加dabcyl部分、通过添加Black Hole Quencher^TM部分或通过在茎末端包含2’ O-甲基核苷酸。该茎-环寡核苷酸具有3-22个核苷酸的环和具有50-85℃的计算Tm的茎。这种试剂的一个实例为dabcyl-CATTATAATGAAATTATAGTA-dabcyl (SEQ ID No. 1)，其中9个核苷酸长的茎的互补核苷酸被加上下划线。在WO 2006/044995所报道的检验了活性的分子中包括在茎的3’和5’末端均具有荧光FAM部分的发夹形分子。这些分子在抑制错误引发中无活性，甚至在1000 nM时。得出结论“添加一对FAM荧光团(不认为其在茎-稳定方式中彼此相互作用)是失稳的，如同添加单个5’ Dabcyl。” (WO 2006/044995第31页，第17-19行)。

第二个用于抑制错误引发的试剂家族，在国际专利申请WO 2010/105074中描述，为一对互补或部分互补的形成6-50个核苷酸长的杂交体的寡核苷酸，其中所述核苷酸在一个或两个末端通过添加不含庞大的非平面部分的多环部分例如，dabcyl部分进行修饰。庞大的非平面基团，例如荧光素(FAM)，经检验和鉴定不可用作PCR添加物中的修饰基团(WO 2010/10507第[0114]段)。

发明概述

本发明包含在一类完全新的试剂添加物(后文称为“试剂”)的存在下实施的显示至少一个聚合酶选择性增加现象的PCR方法，如下文所定义。优选的试剂取得选择性的提高而不显著浓度-依赖性抑制酶的引物-不依赖性5’核酸外切酶活性或酶的DNA合成活性或两者。本发明进一步包括包含一种或多种这样的试剂添加物的PCR反应混合物和PCR试剂盒。

“PCR”，如本文所使用的，指众所周知的被称为聚合酶链反应的核酸扩增方法。本发明广泛适用于PCR方法，包括，例如，对称PCR方法和非-对称PCR方法如不对称PCR和LATE-PCR。若靶为RNA，反转录可包括在内(RT-PCR)。PCR方法可包括扩增产物的检测，例如，通过与双链(ds)DNA接触时发荧光的dsDNA结合染料例如SYBR Green，和与扩增的靶杂交产生可检测信号如荧光信号的寡核苷酸探针。

如本文所使用的，“非-对称PCR”意指其中PCR引物对中的一个引物(限制引物)以限制的量包含在扩增反应混合物中以便在扩增反应期间被耗尽的PCR扩增，其继续利用仅有的另一个引物(过剩引物)，产生单链扩增产物，或“扩增子”。非-对称PCR方法包括不对称PCR和LATE-PCR，在不对称PCR中将对称PCR引物对中一个引物的浓度降低通常至少5倍。如本文所使用的，“LATE-PCR”意指使用PCR过程的非-对称DNA扩增，所述PCR过程利用相对于另一个引物(“限制引物”)至少5倍过量的一个寡核苷酸引物(“过剩引物”)，限制引物本身以低浓度利用，至多200 nM，以便在大致足够产生可检测的双链扩增子的PCR循环中被耗尽，其中扩增开始时限制引物与其完全互补序列的浓度-调整的解链温度等于或高于过剩引物的浓度-调整的解链温度，优选至少同样高并且更优选高出3-10℃；其中限制引物耗尽后热循环持续多个循环以产生单链产物，即，过剩引物的延伸产物，有时被称为“过剩引物链”。利用非-对称PCR方法的扩增和检测测定可采用“低温”探针，其中过剩引物相对于限制引物至少5倍过量，并且检测探针的Tm至少比限制引物的Tm低5度。

本发明试剂，以及引物和探针，在本文中通过其解链温度(Tm)描述。Tm为50%的寡核苷酸以双链形式存在并且50%以单链形式存在时的温度。在本申请中引物的Tm为使用软件程序Visual OMP (DNA Software, Ann Arbor, MI)针对互补或错配核苷酸序列计算的浓度-调整的值，该软件程序使用“最近邻”方法的专有修改(Santa Lucia, J. (1998), PNAS (USA) 95: 1460-1465;以及Allawi, H.T.和Santa Lucia, J. (1997), Biochem. 36: 10581-10594)，盐浓度通常设置为50 mM一价阳离子和3 mM二价阳离子。对于试剂和探针，Tm最初通过该方法计算，忽略共价结合部分和二级结构。由于试剂和探针包含共价结合部分例如荧光团和猝灭剂，应理解由于这些部分的作用实际Tm可能与计算值有轻微不同。若对包含试剂的扩增反应混合物进行熔解分析(或退火分析)，获得试剂在该反应混合物中的实际或“观察”Tm。标记探针的实际Tm一般可通过经验确定，包括结构探针例如分子信标探针。

涉及选择性。“选择性”一般指当满足某些条件时DNA合成过程期间DNA聚合酶延伸凹陷3’末端的偏好性。与此理解一致，一种类型的选择性为当凹陷3’末端的3’端区域，特别地包括末端的3’核苷酸，完美互补，即，无错配杂交时DNA聚合酶延伸杂交体的凹陷3’末端的偏好性。换种方式说明，此种选择性为不利于未与其靶完美匹配的3’端引发序列的选择性。不利于3’端-区域错配的选择性适用于引物-靶杂交体，其中这意味着聚合酶对在引物3’末端完美互补的引物-靶杂交体超过在例如3’端核苷酸处具有错配的引物-靶杂交体的偏好性。对错配引物的歧视的提高有时被称为聚合酶选择性的提高或引物特异性的提高。不利于3’端-区域错配的选择性还更普遍地适用于扩增反应混合物中任何两个DNA链形成的具有凹陷的、可延伸的3’末端的杂交体，例如可在一个扩增子链与另一个扩增子链杂交(即，在另一个扩增子链上引发)时发生。前述类型选择性的量度为非-优选杂交体(例如引物与错配靶形成的杂交体)的扩增信号的循环阈值(C_T)与优选杂交体(例如引物与匹配靶形成的杂交体)的扩增信号的C_T之间的差异(△C_T)。使用添加物(例如本文所述的试剂)引起的选择性提高为从用添加物得到的△C_T减去无任何添加物的△C_T获得的净C_T差异(△△C_T)。换言之，完美匹配引物与其模板链的循环阈值C_T的值总是比错配引物与模板链的C_T值小，添加物的包含可增加这些C_T值之间的差异。

增加的聚合酶选择性通过下列方式中的至少一种表现：1) 错误引发抑制；2) 偏好完美互补引物-靶杂交体而不利于具有未完美互补的凹陷3’端序列的杂交体的引物特异性增加；3) 偏好具有富含GC的凹陷3’端序列的引物-靶杂交体而不利于具有富含AT的凹陷3’端序列的杂交体的聚合酶选择性增加；4) 产物进化抑制；5) 重复反应之间的分散减少。

涉及聚合酶效率。“效率”意指聚合酶活性的速率，经由引物-不依赖性5’外切核酸酶活性的探查切割的量化动力学或经由聚合酶活性的产物扩增的量化动力学。引物-不依赖性探查切割的动力学表现为切割片段产生曲线的斜率。试剂或其它添加物的作用通过斜率的变化(通常为减小)来证明。聚合酶活性的动力学表现为扩增反应的C_T。试剂或其它添加物的作用通过含有试剂或其它添加物的完美匹配靶扩增与不含试剂或其它添加物的完美匹配靶扩增之间的C_T变化(通常为增加)来证明。我们有时称负动力学作用为“抑制”。抑制还通过扩增产物产生减少证明，这可通过SYBR或探针信号强度的降低或通过一阶导数曲线中峰和谷幅度的减小显示。

本发明方法、反应混合物和试剂盒中可用的试剂，以及引物和探针，为广义的寡核苷酸，这是指其可为DNA、RNA、DNA与RNA的混合物，并且其可包含非-天然核苷酸(例如2’O-甲基核糖核苷酸和连接的核苷酸)、非-天然核苷酸间连接(例如，硫代磷酸连接)和DNA模拟物(例如，PNA)。引物和探针二者均通过在反应混合物中与目的序列杂交发挥部分功能。在下文的实施例中我们采用为DNA的引物、探针和试剂，这是我们所优选的。

本发明一些实施方案的PCR反应混合物、方法和试剂盒中的试剂包含形成双链杂交体的两个互补寡核苷酸。在某些实施方案中，所述试剂具有下列特征中的一个或多个：

长度：两个寡核苷酸链形成至少6个核苷酸长、优选6-50个核苷酸长的杂交体。

Tm：所述试剂具有至少32℃的计算Tm。更优选的试剂具有比RCR反应引物延伸温度低不超过5℃的计算Tm，这通常是指在含有60度的组合退火和延伸步骤的2-步PCR中至少55℃的计算Tm，或在包含72℃延伸步骤的3-步PCR中至少67℃的计算Tm。优选的试剂可具有比RCR反应引物延伸温度高的计算Tm，这通常是指在2-步PCR中60℃以上，或在3-步PCR中72℃以上，或在一些情况下75℃以上或甚至78℃以上的计算Tm。在某些优选的实施方案中，优选的试剂具有比最高的探针Tm高的计算Tm。

杂交结构：当其为双链时在PCR反应中所述试剂发挥作用提高聚合酶选择性。所述试剂的两条链均不充当反应中所扩增的模板链的探针，这是因为两条链均不与反应中扩增的任何模板链互补。两条链均不充当反应中扩增的模板链的引物，这是因为所述试剂的3’末端均不能被聚合酶延伸或因为所述试剂的3’末端均不可与扩增模板接触或因为两条链均不与反应中扩增的任何模板链互补。

标记：杂交体的一个末端包含相互作用的标记，即，当所述试剂为双链时相互作用以猝灭或修饰其荧光的标记。在双链形式的试剂中杂交体一个末端的核苷酸，优选杂交体末端三个核苷酸内的核苷酸，更优选末端核苷酸并且甚至更优选5’-末端核苷酸，具有共价连接的庞大的非平面荧光部分，优选荧光团；而互补链上的核苷酸，优选杂交体末端的三个核苷酸内的核苷酸，更优选末端核苷酸，甚至更优选3’-末端核苷酸，具有另一个共价连接的庞大的非平面部分，例如荧光团，或共价连接的非-庞大的平面猝灭剂部分，优选吸收光能但以热量释放能量的非-荧光部分(非-荧光猝灭剂或，简称，“猝灭剂”)。所述双链形式的试剂的5’和3’末端上共价连接的标记经定位以使这些标记相互作用。相互作用优选通过接触发生(提供，例如，接触猝灭)，在优选的双链杂交体中此种接触通过使标记末端以平端结束增强。当使用两个相互作用的荧光部分时，优选其为可区别的颜色。

链的相对浓度：在包含荧光团和猝灭剂的优选实施方案中，猝灭剂-标记的链以等于或大于互补链浓度的浓度加入，优选是互补链浓度的1.5-10倍，甚至更优选是互补链浓度的2-5倍。

在本发明方法、反应混合物或试剂盒中，单一试剂可为单独的选择性-增强组分。作为备选，可包含两种试剂，优选其中一种的Tm比另一种的Tm高至少5℃。两种试剂可包含四条链或，通过共享一条共有链，仅包含三条链。作为第二个备选，还可与所述试剂一起包含多重-dabcyl化的双链试剂，其中dabcyl化的试剂形成6-50个核苷酸长的杂交体，不能被聚合酶延伸，并且含有三个或四个末端dabcyl部分。所述试剂和dabcyl化的试剂可包含四条链或，若其共享一条共有链，仅包含三条链。作为又一个备选，可与前述的任一种一起包含热启动聚合酶或热启动酶作为额外的选择性-增强组分。

在本发明方法中，所述试剂以足以增加聚合酶选择性而使正确产物达到其C_T所需的热循环数目增加不超过10个循环，优选不超过5个循环，最优选不超过3个循环或更少的浓度加入到起始PCR反应混合物中。试剂通常以25-800 nM范围内，优选50-800 nM范围内，更优选50-300 nM范围内，并且甚至更优选50-200 nM范围内的浓度加入到PCR反应混合物中。在本发明某些方法中，单个反应中可加入一种以上试剂(“试剂”一般表示一种或多种试剂)，在这种情况下上文所举的浓度范围为所述加入试剂的总浓度。

本发明方法包括包含RT-PCR反应在内的产生一种或多种扩增产物的PCR扩增反应，其中扩增反应混合物包含提高聚合酶选择性的试剂。优选的方法进一步包括扩增产物的荧光检测。对于双链产物的检测，反应混合物可包含DNA染料，例如SYBR Green染料，其在双链DNA存在时发荧光，即dsDNA染料。所述试剂的荧光团可在染料的发射波长处发射，如荧光素在SYBR Green染料的发射波长处发射。或者，当将试剂的链分离时试剂的荧光团可在染料的发射波长处发射，并且当试剂的链为双链时可猝灭SYBR Green染料波长处的荧光。在那种情况下，具有染料发射信号的双链产物(扩增子)的检测也将不仅检测双链试剂(若存在)发出的未猝灭的SYBR发射，还检测来自试剂的荧光团发射，在该试剂至少部分上为单链的温度下包括未猝灭的荧光团发射。将理解，随着反应混合物的温度升高，由于扩增子的解链，染料发射将减少，但由于试剂的解链，荧光团发射将增加。若扩增子与试剂的解链温度(Tm)为可发觉地不同，熔解曲线的一阶导数将包含指示它们温度-依赖性的双链(染料结合)分子和单链(染料未结合)分子状态的分离的峰和/或谷。或者，所述试剂可用在dsDNA染料的发射波长处不发射的荧光团标记，例如SYBR Green染料与Cal Red荧光团的组合。在那种情况下，SYBR(或荧光素)通道的检测将检出来自与双链形式的扩增子结合的染料的发射，并且将检出来自双链形式的试剂的SYBR猝灭。此外，试剂的链的温度-依赖性杂交和分离的检测在例如Cal Red通道中将为可能的。

所述试剂还可与一种或多种当与其靶杂交时发射可检测信号的荧光标记探针组合使用。尽管dsDNA染料用信号报告已经形成一些双链产物，例如，引物二聚体，但靶-特异性杂交探针用信号报告特定产物，即，预期产物的产生。反应中的一种或多种试剂可用与一个或多个探针相同的一种或多种荧光团标记，或所述试剂可包含光谱不同的一种或多种荧光团。这里再次，若所述试剂与扩增子的Tm不同，熔解曲线的一阶导数将包含指示它们的温度依赖性的双链分子和单链分子状态的分离的峰和谷。

本发明的试剂在已知温度时在特定的条件下产生荧光信号，作为一阶导数荧光曲线中的熔解(或退火)谷(即，负峰)被最好地观察到，后文称为“温度标志”。为此所述试剂可用作每个反应的内部温度标准。温度标志显示反应之间的变更和差异。这样的温度标志具有三个独立的值：1) 其“谷”的深度为加入反应中的所述试剂的量的特征；2) 其“谷”达到最低值时的温度为该试剂的观测、经验Tm；3) “一半深度”处的谷宽为该试剂的双链/单链形成和熔解的温度-依赖性过程的量度。

上述每个温度标志性质均预期为相应试剂在相同的重复反应中的恒定性质。这种情况是因为所述试剂在反应过程中不扩增或降解。因此，重复反应中一个或多个温度标志性质的差异提供了重复之间非均一性的证据。这些温度标志性质还可用于数学上校正重复反应之间的非均一性，以及用于相对于非-扩增试剂的温度标志，定量反应中的扩增产物。

本领域技术人员将理解的是，在PCR扩增反应中采用两种不同的试剂也是可能的，两种不同试剂的双链具有非-交叉-杂交寡核苷酸序列，具有显著不同的Tm，例如试剂2具有71℃的Tm，试剂3具有~50℃的Tm。所述非-交叉-杂交试剂可以以相同颜色或不同颜色标记。优选将两种试剂标记为相同的颜色，例如FAM，以便不存在任何其它探针/靶杂交体时二者在同一颜色通道中检测并在同一曲线上呈现。在这些情况下当表述为一阶导数时宽温度范围的熔解曲线具有两个谷并且这两个谷的最低点之间的距离，在该实例中，为21℃(71-50)。构建两个截然不同的温度标志是有利的，这是因为两个标志之间的距离是预先知道的，并且可用于保证每个反应横跨相同的温度范围。

任何数目的期需热循环后，可构建荧光强度比率：样品信号/温度标志信号。由于温度标志信号在重复的反应中相同，因此上述比率的计算提供所选择数目的热循环后累积产物的量的定量测量。而且，若首先使用扩增开始时已知数目的靶拷贝构建了比值的标准集，从实验样品观察到的比率可用于确立原始样品中的靶拷贝数目。

附图简述

图1A显示其中什么也没有停靠的Taq聚合酶的晶体结构。

图1B显示其中聚合位点与5’exo位点二者均被dabcyl填满的结构的计算机模型。

图2A-2C为实施例2的引物-不依赖性振荡-温度测定获得的Fam荧光对循环数目的曲线图，分别为无添加试剂、含有已知的试剂和含有本发明试剂。

图3A-3O为实施例3的引物-特异性测定得到的SYBR Green荧光对循环数目的曲线图，使用无试剂添加物或不同浓度的试剂A、试剂C、试剂或试剂1’。

图4为实施例4的测定得到的SYBR Green荧光对循环数目的曲线图，使用试剂1和试剂2。

图5A-B为试剂1和试剂2在不同浓度的熔解曲线。

图6A-F为实施例6的多重测定以不同浓度的试剂1获得的熔解曲线，荧光对温度的导数。

图7A呈现在实施例7的测定中对于两个靶的每一个与一定量的试剂1或试剂2，SYBR Green荧光对循环数目的曲线图；加上来自该测定的探针荧光的熔解曲线。

图7B呈现图7A的SYBR Green荧光曲线的导数曲线。

图7C呈现实施例7的测定中试剂1和试剂2荧光的导数曲线。

图8A为实施例8的测定中无试剂的样品和含试剂2的样品的实时SYBR Green荧光曲线图。

图8B和8C分别为图8A的含有试剂2和无试剂的样品的SYBR Green荧光的导数曲线。

图9为呈现在实施例9对于一系列与用于扩增的限制引物不同错配的靶的测定中包含给定浓度的试剂1所引起的循环阈值的延迟的图表。

图10呈现实施例10的添加现有技术的添加物或试剂1的多重测定中多个ON/OFF探针的熔解曲线。

图11A-B分别呈现实施例11的无添加物、含热启动抗体和含热启动抗体加试剂1的三重测定的ON/OFF探针颜色和试剂1的颜色的熔解曲线。

图12A呈现实施例12的扩增反应期间不同点的试剂1的熔解曲线。

图12B呈现实施例12的测定中探针和试剂1的扩增后熔解曲线。

图13A呈现经历60个PCR循环的24个重复中的试剂1的熔解曲线。

图13B-D分别呈现实施例13所述的多重测定中正常和突变体样品的不同靶探针颜色，即，FAM、Cal Orange和Cal Red的熔解曲线。

图13E呈现Cal Orange的熔解曲线，显示两种突变体样品(其中一个不扩增)之间试剂1的解链温度的改变。

图13F呈现实施例11所述测定中含有试剂1的样品和含有热启动抗体加试剂1的样品的试剂1的熔解曲线。

图14A-F呈现实施例14所述测定中含不同量模板DNA和常规Taq聚合酶或抗体-Taq聚合酶以及无试剂、dabcyl化的双链添加物或含dabcyl化的双链添加物和试剂1的样品的熔解曲线。

图15A-C分别呈现实施例15所述测定中包含热启动Taq聚合酶且不含试剂或含试剂2的样品、包含热启动Taq聚合酶与抗体的样品以及包含常规Taq聚合酶与试剂2的样品的探针荧光实时曲线。

图16呈现PCR反应混合物中试剂4或试剂3与试剂4的组合的熔解曲线。

图17A-C呈现可从三个重复样品获得的试剂熔解曲线，其中每个符合高斯曲线。

图17D显示可从调整前和调整后的样品获得的荧光信号。

图17E显示可从调整后的样品获得的荧光信号，作为标准化的荧光和作为二阶导数曲线呈现。

图18为显示各种猝灭部分的化学结构的图表。

图19为显示各种荧光团的化学结构的图表。

图20A显示扩增反应开始前的第一次熔解时重复的荧光信号，线(201)为不包含聚合酶的重复，而线(202)为包含聚合酶的重复。

图20B显示一旦给予聚合酶机会延伸缩短的荧光团标记链，扩增反应后第二次熔解时的重复的荧光信号。

图21A显示扩增反应开始前的第一次熔解时每个菌株和无模板对照的重复的平均Quasar 670荧光信号。

图21B显示完成60个热循环后第二次熔解的重复的平均Quasar 670荧光信号。

图21C显示使用每个菌株和无模板对照的平均Cal Red 610荧光信号的靶embB和inhA的熔解曲线。

发明详述

DNA为由相反的反向平行方向，即3’到5’和5’到3’延伸的两条核苷酸链组成的右手双螺旋。当DNA复制时此两条链被作为III型DNA聚合酶复合体的一部分的DNA拓扑异构酶和DNA解旋酶暂时解开。得到的单链充当合成新碱基对互补链的模板。复制过程中掺入新DNA链的核苷酸前体始终以3’到5’的方向掺入，这是因为复制过程在添加每个新核苷酸期间通过从三磷酸前体切割5’焦磷酸获得能量。鉴于这些事实，一条新链，前导链，经由DNA聚合酶III作用连续增长至复制叉，而另一条链，后随链，不连续地合成。不连续合成从引发酶合成RNA引物开始。RNA引物然后通过聚合酶III的作用用脱氧核苷酸延伸。III型DNA聚合酶为二聚体酶。一旦得到的冈崎片段毗邻临近RNA引物的5’末端，该引物通过I型DNA聚合酶的作用消化，I型DNA聚合酶还起作用以延伸上游片段的3’末端。所得到的后随链的DNA片段之间的缺口通过DNA连接酶的作用闭合。

PCR扩增中使用的Taq聚合酶和其它热稳定DNA聚合酶为I型聚合酶。除了3’到5’DNA合成聚合酶活性，它们还具有5’到3’外切核酸酶活性。Taq聚合酶的X射线晶体学研究显示该酶为由三个不相同的结构域组成的单体分子，大体在图1A中示出。该酶的聚合酶结构域被描述为具有手指102和拇指103的右手手掌101形状。复制DNA模板的双链部分横跨该手掌，从而将引物链的3’末端放置在聚合酶-结构域的催化位点104。DNA分子的结合导致手指和催化位点更接近添加新核苷酸的3’末端移动。延伸的5’模板链在手指与拇指之间滑动(至图1A页面的平面中)。5’外切核酸酶结构域的催化位点105位于图1A中所见结构域的背侧。

所述酶显示引物-依赖性和引物-不依赖性5’外切核酸酶活性二者，但由于该酶仅与双链DNA结合，这两种5’外切核酸酶活性的存在提示当从任一方向接近这样的结构时其可切割单链的5’末端。认为该酶的5’外切核酸酶结构域如图1A中所示延伸至聚合酶结构域手掌的下方，或向上旋转以将5’外切核酸酶的活性位点带至手掌顶部靠近聚合酶催化位点。

如上文中所概述的，国际专利申请WO2010/105074描述了一类在1-4个末端核苷酸上具有1-4个非-庞大的平面部分(优选dabcyl部分，见图18)的化学修饰的寡核苷酸，当以高浓度加入PCR扩增反应中时其可抑制酶的聚合酶活性。然而，当以较低浓度添加所述试剂时，其抑制5’外切核酸酶活性并且还增加聚合酶选择性。增加的聚合酶选择性通过下列方式中的至少一种表现：1) 错误引发抑制；2) 偏好完美互补引物-靶杂交体而不利于具有未完美互补的凹陷3’端序列的杂交体的引物特异性增加；3) 偏好具有富含GC的凹陷3’端序列的引物-靶杂交体而不利于具有富含AT的凹陷3’端序列的杂交体的聚合酶选择性增加；4) 产物进化抑制；5) 重复反应之间的分散减少。因此加入的试剂优先与酶的5’外切核酸酶位点结合从而通过聚合酶位点形状的变构变化改变聚合酶选择性似乎是合理的。进一步似乎合理的是所述试剂结合酶的聚合酶位点，但仅在较高的浓度时。

目前上面的推理得到对寡核苷酸3’或5’末端上的dabcyl部分可结合Taq聚合酶5’外切核酸酶催化位点和聚合酶催化位点的任一个或二者的概率的物理化学计算的支持。实施例1描述了用于进行这些计算的计算机程序。这样的测试的结果被称为“glide分数”。glide分数越负，所调查化学部分实际上与蛋白上提议的结合位点结合的机会越有可能。实施例1的结果产生下列glide分数：对于聚合酶位点：5’dabcyl相互作用=glide分数-4.84，3’dabcyl相互作用= -8.08；对于5’外切核酸酶位点：5’dabcyl相互作用=glide分数-5.33，3’dabcyl相互作用=glide分数-10.03。这些结果表明5’外切核酸酶位点与3’dabcyl的相互作用特别有可能，并且用蛋白表面检查修饰寡核苷酸的空间充填模型证实了该位点处的良好配合。dabcyl基团与聚合酶位点相互作用的证据并不如与外切核酸酶的那么好，这是因为dabcyl基团通过手指与拇指之间的洞进入手掌中。综上所述，上述证据提示了这样的模型，其中Taq单体的5’外切核酸酶位点优先与dabcyl化的寡核苷酸结合，较高浓度时第二个dabcyl化的寡核苷酸与聚合酶位点结合。该模型假设寡核苷酸在5’外切核酸酶位点的结合变构地改变聚合酶位点的形状，使其更具有选择性。

根据上文所讨论的证据，意外地发现一类完全新的试剂，后文称为“试剂”(试剂1、试剂2，以此类推)。当加入PCR反应中时，本发明试剂显示至少一种聚合酶选择性增加的现象，如上文所定义的，而不显著浓度-依赖性抑制酶的引物-不依赖性5’外切核酸酶活性，或不显著浓度-依赖性抑制聚合酶活性。同样令人惊讶地，这些试剂由两个互补的寡核苷酸组成，至少其中一个与国际专利申请WO 2010/105074中所教导的相反，具有本身为庞大的非平面部分或包含庞大的非平面部分的部分。这样的部分优选为荧光团，在末端核苷酸，优选5’核苷酸上，并且其中互补链的末端3’核苷酸用另一个这样的庞大部分或优选无庞大部分的平面部分，例如，dabcyl或Black Hole猝灭剂(二者均在图18中描绘)修饰，我们称为“猝灭剂”是因为，它们不是作为光发射吸收的能量，而是作为热发射吸收的能量。图19示出了与本文试剂组合使用的庞大荧光团的结构，但如本领域技术人员将理解的，这些特别的荧光团仅为许多已知的容易地连接到寡核苷酸链的荧光团和相似的非-荧光部分中的少数。

在采用猝灭剂的优选实施方案中，负荷猝灭剂部分的链以足以通过杂交猝灭将荧光标记链的荧光强度降低至可接受水平的浓度加入。通常，该浓度至少约等于荧光标记链的浓度。在优选的实施方案中猝灭剂-标记链以等于或大于互补链浓度、优选互补链浓度的1.5-10倍、最优选互补链浓度的2-5倍的浓度加入。这确保随着温度逐渐降低所有用共价连接的荧光部分标记的链均将与猝灭剂-标记链杂交，因此，荧光将被消灭至其最低可能水平。

下文所述实施例中采用了本发明试剂的5个不同实施方案(试剂1、试剂1’、试剂2、试剂3和试剂4)。它们的寡核苷酸序列和标记在表1中概括。在表1中“F”表示连接的荧光部分，优选荧光团(见图19)；“Q”表示猝灭剂部分，优选非-荧光猝灭剂，并且更优选Black Hole猝灭剂(见图18)；“D”表示非-荧光猝灭剂dabcyl (见图18)；“C₃”表示三碳接头。

表1

试剂1由两条完美互补的链(每条30个核苷酸长)加上共价连接的部分：一条链的5’-端荧光部分和另一条链的3’-端猝灭剂组成，所得解链温度大约为79℃。试剂1’由与试剂1相同的两条寡核苷酸链组成，但3’-端猝灭剂被荧光部分代替。试剂2为22个碱基对长的双链寡核苷酸加共价连接的部分，再次为一条链上的5’-端荧光部分和另一条链上的3’-端猝灭剂，所得Tm大约为71℃。试剂3为22个碱基对长的双链寡核苷酸加共价连接部分：一条链上的5’-端荧光部分和3’-端dabcyl，以及另一条链上的3’-端猝灭剂和5’-端dabcyl，所得Tm大约为70℃。试剂4为22个碱基对长的双链寡核苷酸加如试剂3的共价连接部分，Tm大约为50℃。表1还呈现了试剂A的结构，其仅包含试剂1的两条寡核苷酸链，两个3’末端均被三个碳原子(C₃)加帽。表1还呈现了试剂B的结构，其仅包含试剂2的两条寡核苷酸链，两个3’末端均被碳原子(C₃)加帽。此外，表1概括了试剂C，其包含试剂1的两条寡核苷酸链，其中一条在其3’末端被碳原子(C₃)加帽并且还在其5’末端用dabcyl部分标记，另一条在其3’末端用dabcyl部分标记。因此，双链的试剂C在一个末端含有两个dabcyl基团。表1还描绘了试剂D，其由试剂2的两条寡核苷酸链组成，其中一条在其3’末端被碳原子(C₃)加帽并且还在其5’末端用dabcyl部分标记，另一条在其3’末端用dabcyl部分标记。如本领域技术人员将理解的，表1中所示寡核苷酸的核苷酸序列和长度可容易地改变以达到用于特定PCR扩增反应的试剂所期需或需要的任何长度和解链温度。

尽管用于试剂1和试剂2的互补链的长度和序列(表1)截然不同，但这些试剂的结构在下面的程度上是相似的：它们由天然脱氧核苷酸组成，具有完全互补的链并且含有3’末端的Black Hole猝灭剂以及互补链5’末端上的荧光团，互补链的3’末端被3-碳链加帽。

本领域技术人员可理解，所述试剂的组成可以以多种方式改变，每种变化均可使用上述测定法容易地检验其增强聚合酶选择性的能力。可用于改变所述试剂的结构的可能结构变化的部分列表包括：

1. 使用两个荧光团而不是一个猝灭剂和一个荧光团，如实施例3、图3中针对试剂1’所描述的。该设计的变体显示较少的聚合酶选择性增强，但在两种不同颜色中产生相同Tm的温度标志。

2. 一种以上颜色中相同Tm和具有稳健的聚合酶选择性的温度标志也可通过混合过量的用猝灭剂标记的一条链与用一个以上荧光团标记的互补链取得。

3. 不同Tm和以一种或多种颜色标记并且保持稳健的聚合酶选择性的温度标志可通过混合过量的用猝灭剂标记的一条链与两条不同的互补链取得，互补链中的一条比另一条短并且用相同或不同的荧光团标记(参考实施例10中的添加物EP042)。

4. 使用一条或两条由核糖核苷而非脱氧核糖核苷组成的寡核苷酸链，或使用LNA，或PNA，或非-天然碱基等。

5. 使用各种各样的共价结合猝灭剂、荧光团和其它性质，只要所得双链寡核苷酸显示本文所述试剂的性质。

6. 将所述试剂的性质与表1中所示试剂C或试剂D的性质组合是可能的。在这种情况下双链寡核苷酸的一个末端用荧光团和猝灭剂标记，而寡核苷酸的另一个末端用3’dabcyl部分和5’dabcyl部分标记。如下文所讨论的，此设计的试剂产生一个温度标志并且还抑制5’外切核酸酶活性，和在较高浓度下抑制聚合酶活性。表1提供了所述试剂的两个实例，试剂3和试剂4。

7. 制备共享至少一条寡核苷酸链的多个试剂的集合是可能的，例如：a) 在一个末端用猝灭剂残基标记的第一条长寡核苷酸；b) 与所述第一条寡核苷酸完全互补并且在前述猝灭剂对面含有一个荧光团的第二条同样长的寡核苷酸；比所述第二条寡核苷酸短、在其未标记的3’ (或5’)末端截短的第三条寡核苷酸；逐渐比前一条短并且每个均从未标记的3’ (或5’)末端以逐步的方式截短的第四条、第五条等核苷酸。前述清单的寡核苷酸可用于构建具有逐步缩短的双链区并且所有均用相同的猝灭剂-荧光团组合标记的试剂集合。随着包含更短的寡核苷酸此种集合的试剂将具有越来越低的温度标志。

8. 由两种具有可测量地不同的Tm和截然不同的、非-交叉杂交序列的不同试剂组成的试剂集合，其中所述试剂的荧光标记可为相同或不同颜色。此种设计的试剂集合将产生两个不同特征的温度标志，反应互补链对的两个不同Tm。这种方式标记的熔解曲线可用于构建用于凭经验比较和标准化温度标志之间的度数的标准化“尺”。

9. 又一种试剂变体类型使用一条含有3’荧光团或，优选地，猝灭剂的长寡核苷酸链(例如30个核苷酸长)和一条与长链的3’末端互补并且在其5’末端用荧光团修饰但不在其3’端加帽的短寡核苷酸链(例如15个核苷酸长)。长链以超过短链的量使用以保证短链的所有分子均杂交。此两条链形成的杂交体将具有最初的相对低的Tm。如果PCR扩增反应混合物中包含这样的变体，聚合酶将延伸较短链的3’末端直至较长链5’末端。因此，该试剂的Tm将显著增加。这样设计的变体提供简便的方式证明反应存在活性聚合酶。这对于使用前长时间储存的试剂的质量控制非常重要。这种原位构建最终试剂的方法仅用于其中荧光标记链(在其原始短结构和其后来延伸的结构上二者)在反应混合物中不引发任何靶序列的测定。

10. 所述试剂的又一种变体使用完全互补的两条长链(例如30个核苷酸长)，并且一条链以比另一条高的浓度存在，其中比较丰富的链在其3’末端用猝灭剂，优选Black Hole猝灭剂标记，并且其中不太丰富的链在其5’末端用可与猝灭剂部分形成近接触的庞大部分标记，但其中所述庞大部分在扩增和分析使用的装置可检测的波长内不发荧光。此种设计的试剂因此从聚合酶选择性的增强中分离出了试剂的Tm标志功能。此种设计的试剂可用于设计具有增加的聚合酶选择性的反应、测定或检验，而不显示所述试剂的存在情况。

本发明试剂的功能性受使用该试剂的PCR方法，特别是热循环使用的温度影响。因此，设计者将考虑计划中的方法。在方法的细节留有余地的情况下，设计者将考虑备选方案。作为改变所述试剂的Tm或浓度以取得期需的试剂功能的备选方案，有时可改变热循环概况。例如，当以50 nM的浓度加入反应混合物中时考虑具有68℃ Tm的试剂，和包括在72℃延伸步骤的热循环概况。所述试剂在延伸温度时将仅为部分双链的，因此延伸步骤期间其有效浓度将小于50 nM。若50 nM的有效浓度是期需的，可进行下列三件事中的任一：a) 改变所述试剂的结构以使其Tm上升至使得其在72℃为双链的水平；b) 增加所述试剂的浓度使得，当在72℃为部分单链时，其在72℃的有效浓度为50 nM；或c) 将PCR延伸温度降低几度以至于所述试剂在较低的延伸温度下为双链的(或几乎双链的)。还考虑50 nM浓度的具有50℃ Tm的试剂，和包含50℃的引物-退火温度的热循环概况。所述试剂在50℃将为部分(按照定义，一半)双链的。如果所述试剂仅用作在低温样品制备期间而非温度循环期间防止错误引发的热-启动添加物是期需的，可改变试剂的结构以降低其Tm，或者，可将引物-退火温度升高至所述试剂为单链(或几乎单链)的水平。

实施例2显示一组测试中探针经由引物-不依赖性5’外切核酸酶活性切割的量化动力学，包括振荡反应混合物的温度以引发探针切割、比较不添加试剂或添加逐渐增加的浓度的试剂1或等同量的试剂A试剂C的反应混合物。结果在图2A-2C中呈现，为荧光(由探针切割产生)对温度振荡循环的曲线图。结果显示：1) 靶不存在的情况下探针不被切割(曲线201)；2) 当仅与其靶一起存在时探针被最大程度切割(曲线202)；3) 加入逐渐增加的浓度(50 (曲线203)、100 (曲线204)、150 (曲线205) nM)的试剂A仅轻微抑制探针的切割；4) 加入50 mM或更多的试剂C严重抑制探针的切割(曲线206、207、208)；5) 加入50 (曲线209)、100 (曲线210)、150 (曲线211) nM的试剂1不比加入相同浓度的试剂A更抑制探针的切割。例如，无试剂添加物的斜率为约35度，45个循环后达到约3800荧光；50 nM试剂A的斜率为约25度，45个循环后达到约3300荧光；50 nM试剂1的斜率为约20度，45个循环后达到约3100荧光单位；但50 nM试剂C的斜率仅为约10度，45个循环后仅达到约2100荧光单位。该意外的结果清楚地将试剂1与试剂C区分开来，并且表明，与试剂C不同，试剂1不与酶的5’外切核酸酶结构域结合。

LATE-PCR和对称PCR扩增二者均产生双链DNA扩增子，扩增子累积动力学可通过用SYBR Green，一种荧光嵌入染料染色后实时读数观察。图3A-3O的数据，获自实施例3中所述的LATE-PCR反应，为用SYBR Green染色的双链DNA的原始荧光图。从图3A-C中可以看到接受逐渐增加的浓度的试剂A的反应甚至在扩增之前就具有高SYBR Green染色背景水平，这是因为试剂A的DNA与SYBR Green结合并发出荧光。相反，接受用Cal Orange (图3G-I)或Quasar (图3J-L)标记的试剂1的反应具有大大降低的背景荧光水平。较低的背景荧光水平是由于试剂1的共价连接的荧光团加上共价连接的Black Hole猝灭剂，此二者均吸收嵌入的SYBR Green染料的一些能量。较低的背景荧光水平是期需的，这是因为其增加双链DNA产物扩增得到的信号-背景比。

实施例3中的数据还显示与等同浓度的试剂A，未标记的双链寡核苷酸相比，试剂1的两个版本均增加引物特异性。此引物特异性的增加随着两个等摩尔靶扩增的实时荧光曲线之间的分离而明显，一个与其引物完美匹配(奇数编号的曲线)，而另一个由于与引物3’末端互补的碱基的单核苷酸变化而与同一引物错配(偶数编号的曲线)。该测定测量了每次初始模板被用于开始扩增时的引物特异性。从两条靶链制得的扩增子为相同的，这是因为引物被引入了所有的拷贝中；它们具有相同的序列，与引物完美配对。结果(图3G、3J)清楚地显示仅50 nM的试剂1，用Cal Orange或Quasar标记，就足以取得引物特异性，△ △C_T的显著增加，并且非常少地降低通过匹配靶与无-试剂对照相比的C_T的延迟(△C_T)测量的扩增效率(图3，环301)。相反，50 nM的用两个dabcyl部分标记的试剂C (图3D，环309)导致约20个循环的增加，并且更高的浓度有效抑制匹配靶和错配靶二者的扩增(图3E-F)。这一结果还指出了这些试剂作为一类分子的独特性质。

图3M-O显示采用试剂1的变体，即试剂1’ (见表1)的实施例3的反应的结果。该变体无Black Hole猝灭剂但在双链寡核苷酸的互补末端含有两个庞大的荧光团，3’Cal Orange 560和5’Quasar 670。图3M-O结果与图3G-I和J-L结果的比较显示图3M-O中SYBR荧光的背景水平略高于图3G-I和J-L中的，与两个共价连接的荧光团吸收的SYBR能量比一个共价连接的荧光团和一个共价连接的Black Hole猝灭剂吸收的少这一事实一致。该结果还显示试剂1’造成的聚合酶选择性的增加(△ △C_T)比试剂1的任一版本所造成的少得多。此外，试剂1’造成的扩增效率降低并不比试剂A更多(图3A-C)。该差异很可能是由于试剂1’用两个庞大的荧光团而不是试剂1中的一个荧光团和一个Black Hole猝灭剂修饰。已知Black Hole猝灭剂与荧光团通过接触猝灭相互作用(Johansson MK. Choosing reporter- quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers (选择报告基因-猝灭剂对以通过形成分子内二聚体有效猝灭). Methods Mol Biol. 2006; 335:17-29)。

参考表1，试剂1由30个碱基对长的双链寡核苷酸组成。其具有79℃的Tm。试剂2由22个碱基对长的双链寡核苷酸组成。其具有71℃的Tm。实施例4比较了当扩增已经在实施例3中描述的完美匹配的靶/引物对和错配的靶/引物对时试剂1和试剂2增加聚合酶选择性的能力。该实施例中引物延伸在72℃进行。结果证明试剂2，如同试剂1，增加与错配靶/引物相比对匹配的靶/引物的聚合酶选择性(△ △C_T)，但提高的程度不如等同浓度的试剂1是所观察到的大。

此外，在实施例4的测定中，试剂2增强聚合酶选择性的另一个现象——由于LATE-PCR扩增线性期期间产生的单链扩增子的3’末端与反应中一些其它的单链分子之间的意外相互作用而发生的产物进化的抑制，不如试剂1有效。存在多种方式观察产物进化。实施例4中的产物进化在图4中示出，其中可以看到反应达到假定双链DNA停止累积的平台期后SYBR Green染色的双链DNA的增加。该结果显示试剂2对产物进化的抑制不如试剂1有效。对这一差异的可能解释为与约95%的试剂1分子相比，在72℃的延伸温度下仅约45%的试剂2分子为双链的。

实施例5说明了试剂1和试剂2的又一个性质。尽管此两种试剂的寡核苷酸具有不同的序列，但它们二者均具有用3’ Black Hole猝灭剂标记的一条链和用5’荧光团，具有560 nm的发射最大值的Cal Orange标记的互补链。在每种情况下荧光团-标记链的荧光信号均为在90℃时高并保持高水平直至反应温度降低至所述试剂的双链寡核苷酸的Tm以上约5℃。在低于此水平的温度下互补链彼此杂交。荧光信号显著降低，这是因为比荧光团标记链过量存在的猝灭剂标记链保证了所有的荧光团标记链均变成双链的，这继而将荧光团带至猝灭剂旁。从信号强度方面来看，随着温度下降，链的杂交作为从最大信号到最小信号的S形降低被观察到(未示出)。从信号强度的一阶导数来看，如图5A-B中所示，链的杂交作为在高于链退火的温度下斜率为零并且低于链退火完成的温度下斜率为零的曲线的负谷被观察到。每个负谷最低点的温度为反应混合物中所述试剂的测量Tm，在该温度下50%的荧光团标记链为双链的。与它们计算的浓度-调整的Tm一致，试剂1的经验Tm为约79℃ (图5A)，试剂2的经验Tm为约71℃ (图5B)。经验Tm为所述试剂在反应混合物中在其规定浓度下的功能Tm。但是，结果显示两种试剂的Tm均随荧光标记链浓度增加而增加几度(检验范围50 nM-150 nM)。Tm的这一浓度-依赖性增加与使用最近邻公式计算的Tm包含对杂交寡核苷酸浓度的校正(c)这一事实一致。实施例5形象化地证实了实施例4所取得的72℃时仅约45%的试剂2荧光团标记分子为双链的，而在该温度下约95%的试剂1分子为双链的这一结论。

所述试剂在提高聚合酶选择性中的功能性部分地取决于PCR扩增产物(扩增子)的解链温度、试剂本身的解链温度和用于PCR热循环中特定步骤的特定温度。例如，如果反应的延伸温度在72℃进行，具有79℃的解链温度的试剂在72℃将为约95%双链的。相反，等同量的具有71℃的解链温度的试剂在72℃将仅为约45%双链的。由于Taq聚合酶和相关的酶仅在聚合酶位点结合双链分子，因此具有较低解链温度的试剂的“有效浓度”在72℃下将比高解链温度的试剂的有效浓度低。如果引物对其各自模板链的Tm比试剂的解链温度高，所述试剂在引物退火和延伸期间的有效浓度也将减少。

实施例6说明了这样的情况。其中扩增为具有在75℃下的组合退火-延伸步骤的两步PCR。该实施例中使用的限制引物具有约80℃的初始的、浓度-调整的Tm，而过剩引物具有约78℃的初始的、浓度-调整的Tm。试剂1具有约79℃的Tm，如上所述。由于引物的Tm相对于试剂1的Tm如此高，随着每个热循环期间反应温度从95℃降至75℃，引物在试剂1变得完全有效前就开始在其模板链上退火和延伸。试剂1在75℃ (该实验中引物延伸使用的温度)为约80%双链的。因此当在实施例6的PCR引物退火和引物延伸期间发挥功能时试剂1的“有效浓度”低于其规定的浓度。

可以说在这些情况下加入实施例6的试剂无益处产生，但由于下列原因其并非如此：1) 所述试剂仍可用作温度标志(见下文)以确立重复反应间的重现性程度，并可用作数学上校正重复反应间差异的基础(见下文)；2) 所述试剂在其Tm处的信号振幅仍用作任何扩增产物产生的任何信号的内部定量比较的基础；3) 所述试剂在低于所有分子均为双链的温度(即，在试剂1的情况下低于约72℃)的所有温度下仍具有完全有效的浓度和增加聚合酶选择性的能力。这是有用的，因为其使，例如，降低任何循环的反应温度以测量探针对靶的杂交并且然后，若需要，重新开始扩增变得可能。就这点而言，将试剂1的浓度从50 nM (图6A)增加至100 nM (图6B)获得rpoB基因从约50℃到约75℃温度的荧光信号之间的分散减少，如环604-606的曲线与环601-602的曲线相比所示。这在不显著抑制聚合酶活性下达到，如约68和56℃处的相对峰/谷高度所示。同样，将试剂1的浓度从50 nM (图6D)增加至100 nM (图6E)获得katG和gyrA基因从约60℃到75℃温度的荧光信号之间的分散减少，如环616-618的曲线与环613-615的曲线相比所示。这也在不显著抑制聚合酶活性下达到，如约66 (katG)和55℃ (gyrA)处的相对峰/谷高度所示。进一步将试剂1的浓度增加至200 nM增强了对聚合酶活性的抑制(比较图6C中的峰/谷高度与图6B中的那些，并比较图6F中的峰/谷高度与图6E中的那些)但不额外减少分散，因此我们断定100 nM的浓度为三个检验浓度中最佳的。

实施例6，图6A-6C，环603、606、609的曲线说明了所述试剂作为温度标志的用途。试剂1含有与On探针相同的荧光团，但其具有比rpoB基因的荧光信号中峰和谷的温度范围高的Tm。因此，所述试剂的熔解不影响荧光信号。温度标志及其用途在与实施例16和17有关的下文中更充分地讨论。

Taq聚合酶和其它热稳定聚合酶的功能性还将取决于该酶本身的温度-依赖性性质。因此，具有不同性质的两种不同的酶将被同种试剂在相同温度下不同地影响。一般而言，当使用较低热耐受性的酶时特定试剂的“有效浓度”将较高，这是因为这样的酶通常使用较低的循环温度。实施例7描述了试剂1和试剂2二者在其中使用Tfi (exo-)聚合酶而非Taq聚合酶扩增的测定中的用途。Tfi (exo-)聚合酶是来自丝状栖热菌(Thermus filiformis)的热耐受性聚合酶，其具有聚合酶结构域和5’外切核酸酶结构域二者，但已经被基因工程改造为无5’外切核酸酶活性。使用Tfi (exo-)的反应最好使用68-72℃的延伸温度，这是因为聚合酶活性在75℃时失活。用Taq DNA聚合酶，我们常常使用更高的延伸温度，例如75-81℃。

实施例7的结果显示加入逐渐增加的浓度的试剂2 (100 nM至150 nM至200 nM)导致扩增效率的适度降低，但聚合酶选择性非常显著的增加。加入100 nM试剂1取得聚合酶选择性的相似增加，但略大的扩增效率降低。由所述试剂引起的聚合酶选择性提高在实施例7中以两种方式观察到。第一，加入所述试剂增加每次使用初始模板开始扩增时的引物特异性，这是因为引物掺入任一初始模板后两条靶链变得相同。基于此原因，引物与模板链后来所有的拷贝均完美匹配。在实施例7中错配的靶与引物在两个位置不互补，即引物3’末端相对的核苷酸和从引物3’末端数第9位相对的核苷酸。引物3’末端的错配主导引物特异性。第二，加入所述试剂抑制产物进化，否则当产物链浓度积累时，产物进化向反应结束发生。LATE-PCR中的产物进化使用至少三个不同的衡量标准是明显的：1) LATE-PCR扩增指数期结束时双链DNA的累积已经开始达到平稳期后SYBR Green荧光的意外增加；2) LATE-PCR扩增的线性期结束时存在的双链DNA产物的解链温度的增加，使用SYBR Green染色可视化；和3) LATE-PCR扩增线性期结束时存在的单链DNA产物的量的减少，通过与序列特异性的探针杂交可视化。LATE-PCR中的产物进化还增加扩增线性期期间复制反应之间的分散。如图7A子图1中所显示的，实施例7中产物进化在不存在任何试剂下扩增的匹配靶/引物对的四个重复的三个中观察到。在100-200 nM试剂2或100 nM试剂1存在下扩增两个靶的所有重复中产物进化均受到抑制。产物进化还被50 nM试剂1抑制(结果未示出)。

从上述讨论中可以明显看出，聚合酶选择性的最佳化需要扩增开始时引物特异性的增加和向扩增结束的产物进化的抑制。上述试剂的一个特征为单个分子可完成这两个任务。最佳化反应的标志为高水平的重现性，即，重复反应之间低分散。实施例7的数据显示200 nM的试剂2和100 nM的试剂1二者均显示LATE-RCR指数期期间重复之间分散的显著降低，如通过积累双链DNA的SYBR Green图所判断的(图7A，子图4和5)。这些相同的两个样品还显示在LATE-PCR扩增线性期期间所产生单链DNA分子水平几乎没有分散，如通过使用荧光探针的熔解曲线分析所判断的(图7A，子图9和10)。荧光探针还显示在几乎每个接受200 nM试剂2或100 nM试剂1的样品中均不存在错配的靶的分子。用100 nM试剂1的重复甚至比用200 nM试剂2的那些更精确。

重复之间的最小分散为聚合酶选择性的量度，并且意味着一个群体中的所有分子以相同的方式作用。不希望被任何理论束缚，很可能在本文所描述的情况下“以相同方式作用”意指所有的聚合酶分子在比其结合和延伸任何错配的3’末端高的温度下结合所述试剂。由于错配引物的Tm总是比同一引物对其完美互补的靶的Tm低，并且产物链3’末端对另一条链中一些其它序列的Tm也通常比用于扩增的引物的Tm低(如果这不是产物进化将不是罕见事件的情况)，因此重复之间的最小分散可最好通过确保所述双链试剂的浓度足以在略低于限制引物的Tm的温度下结合反应中的所有聚合酶分子来实现。在实施例7中此条件通过加入100 nM试剂1满足。由于试剂1具有79℃的Tm，在72℃ (限制引物对其完美匹配靶的Tm)，其为约95%双链的。需要略多于200 nM的试剂2，这是因为其Tm为约71℃，意味着在72℃仅约45%的该分子为双链的。

重复之间的分散也为对称PCR扩增中当接近反应的平台期时众所周知的现象[R.G. Rutledge, Nucl. Acids Res. (2004) 32 (22): e178. doi: 10.1093/nar/gnh177 ]。实施例8和图8A说明了在不存在任何添加试剂的情况下使用一对用于扩增导致Tay Sachs疾病的基因的一部分的引物的对称PCR扩增的重复反应之间的分散[J.E. Rice等(2002) Prenatal Diagn. 22:1130-1134]，不存在任何添加的试剂的情况下(图8A，环801的曲线)一组12个中的几个样品在比大部分样品更高或更低的水平达到平稳期。相反，加入100 nM试剂2(图8A，环802的曲线)显著降低所有重复之间的分散水平。试剂2为22个核苷酸长，Tm为68℃。使用染色双链DNA的SYBR Green实时分析了两组反应。向每个反应加入约5个拷贝的人基因组DNA，平均33-35个热循环后出现SYBR Green信号。40或45个循环后达到平稳期，取决于是否添加试剂2。所有无试剂2孵育的样品均在用试剂2孵育的那些之前扩增和达到平稳期，符合不包含试剂2的反应由预期的双链扩增子和额外的非-特异性双链DNA二者组成这一可能性。所有样品的熔解曲线分析在60个循环后进行。这些结果，图8B和图8C，证实用试剂2孵育的样品非常相似，并且无非-特异性双链DNA。相反，无试剂2扩增的所有样品含有一定水平的较高熔解的非-特异性双链DNA。在试剂2不存在的情况下扩增的重复仅在它们接近平稳期水平时彼此发散。这证明发散为浓度-依赖性的现象，换言之，其依赖于相对高水平的累积产物链。在包含试剂2的样品中未观察到重复之间的发散，尽管这些样品中双链DNA的浓度比不存在试剂2下发散的那些高。我们从这些结果断定，试剂2在对称PCR中增加聚合酶选择性并因此防止与其它产物链相互作用的产物链的错配3’末端延伸，即，产物进化。该结果与早期LATE-PCR扩增所显示的那些一致。我们注意到产物进化在LATE-PCR中更容易观察到，这是因为其导致单链扩增子变成双链的。相反，在对称PCR中双链扩增子仅变为更大的双链分子。

实施例9证明所述试剂增加引物特异性的能力取决于引物与靶之间错配的程度。错配程度随限制引物与各个靶之间错配的核苷酸的数目、同一性和位置而不同。错配程度使用引物与靶基于最近邻公式计算的浓度-调整的Tm判断。我们一贯使用Visual OMP (DNA Software)估算反应的寡核苷酸浓度和盐浓度下的Tm。荧光标记寡核苷酸的Tm可同样计算，但优选通过经验确定。实施例9中使用Taq聚合酶，试剂1以50 nM加入，引物退火设置为70℃，引物延伸设置为75℃。所有的LATE-PCR扩增反应使用相同的限制引物和相同的过剩引物。这些靶之间的序列差异位于限制引物的互补区内。对限制引物错配的几个靶中的核苷酸在图9中被加以下划线。在此类使用相同的限制引物扩增具有不同序列的靶的反应中，限制引物可与组内的一个靶匹配，或其可为与所有靶均不完美匹配的通用引物。在任一种情况下，每个靶在其与限制引物互补的序列内均含有其自己的一组匹配或错配碱基，并且每个不完美匹配的靶均以比使用与其自身序列完美互补的限制序列所将达到的低的效率扩增。用SYBR Green染料实时检测的结果，C_T值，在图9中呈现。C_T值显示加入50 nM试剂1增加所有情况下的初始引物特异性。(在后面的扩增循环中所有靶以相同的效率扩增)。假定靶为等浓度的，每个靶因此显示其自己的特征扩增延迟，这取决于与同一限制引物错配的碱基对的数目、位置和类型。这些组合的化学性质可用于鉴定相关的靶变体。

通过加入所述试剂取得的聚合酶选择性增加的又一个现象为多重扩增，即，在同一反应中使用多对引物的多个产物的平衡扩增的增强。实施例10呈现了来自人线粒体基因组的三个靶的三重反应的两组数据。一组数据在包含公布的国际专利申请WO 2010/104074中所述三链版本的dabcyl化试剂的三重反应中产生。第二组数据在包含50 nM试剂1的三重反应中产生。Cal Orange版本的试剂1的存在作为79℃时Cal Orange通道中的一个深谷被观察到。(在接受dabcyl化试剂的反应中未观察到这样的谷，因为该试剂不发荧光。)每个基因靶作为由一组用Quasar 670 (HV2靶)、Cal Red 590 (CO2靶)或Cal Orange 560 (ND1靶)标记的靶特异性的Lights-On/Lights-Off探针的结合产生的“荧光信号”被观察到(参见J. E. Rice等, Fluorescent signatures for variable DNA sequences (多变DNA序列的荧光信号), Nucleic Acids Research Advance Access, 2012, 1-10 doi: 10.1093/nar/gks731)。六个三重反应的荧光信号在图10，子图1-6中呈现。由于试剂1而产生的多重扩增的增强作为子图2、4和6中三个荧光信号的每个的峰和谷的振幅的显著增加被观察到。Cal Orange通道(子图6)，特别地，显示ND1基因靶的荧光信号的显著增加，这是因为该基因靶在试剂1或dabcyl化试剂不存在的情况下很少产生(未示出)。Dabcyl化试剂仅部分克服该问题(子图5)。然而，由于试剂1而产生的聚合酶选择性提高并不限于ND1基因产物，并且，由于该试剂一般性地提高聚合酶选择性，另外两个基因靶也观察到聚合酶选择性的提高(子图2和4)。靶扩增的这一总体提高是由于引物之间错误引发的减少。因此，引物产生较高水平的预期双链和单链基因-特异性扩增子。

图10，子图6，说明了在约79℃包含谷的荧光信号曲线，试剂1在探针信号之上的温度熔解。所述试剂的Tm可用于标准化样品之间的信号曲线。

实施例11也说明了由于加入50 nM试剂1产生的多重反应提高。在该情况下反应为包含三对引物和探针的单管反转录/LATE-PCR (RT-LATE-PCR)扩增。两个不同的RNA靶和一个对照RNA在实施例11所呈现的反应中多重扩增。对照从细菌噬菌体MS2中的序列衍生。当用Cal Orange探针探查时所得的单链DNA扩增子在50℃产生一个峰(图11B)。

作为测定对象的靶从人流感病毒的神经氨酸酶基因衍生。经RT-LATE-PCR中产生的扩增的单链产物用三个探针探查，所述三个探针包括产生Cal Red 610峰并且最大值在55℃的Lights-On/Lights-Off对，以及同样在Cal Red产生第二个峰并且最大值在约42℃的另一个Lights-On探针09N1-Os探针(图11A)。当在单重反应中检查时两个峰的相对高度恒定，55℃的峰略高于42℃的峰，但当在多重扩增中检查时随着越来越多的不同引物被加入42℃峰的相对高度逐渐减少，当存在七对引物时减少至消失的地步。由于55℃的峰在多重反应中总是存在，扩增子必然已被合成。得出结论，在不存在任何聚合酶选择性增强的多重反应中，必然还产生了干扰低-Tm Cal Red探针杂交的非-特异产物。

由于反应混合物包含反转录酶和Taq聚合酶二者，向该反应混合物中加入热启动抗体以确立在扩增之前的反转录步骤期间阻断Taq聚合酶活性是否抑制错误引发并从而增加低-Tm信号。抗体的添加(图11A，曲线111)未增加低-Tm信号的相对强度。但，添加50 nM试剂1加上该抗体(图11A，曲线112)确实提高了低-Tm峰相对于高-Tm峰高的高度。该结果提供了通过所述试剂取得提高的多重扩增的额外证据。在这种情况下聚合酶选择性的提高在Cal Red通道被看到，而如预期的，加入的试剂1作为Cal Orange通道的尖锐负峰被观察到，其特征Tm为79℃。

本领域技术人员将理解的是，上述讨论假定所有的重复反应为均一、闭管和可完美重现的。均一意指检测不需要从未结合的引物或探针分离结合的(与靶杂交的)荧光标记引物或探针。闭管尤其意指，反应容器不在PCR扩增过程中不经历蒸发，这是因为蒸发将增加非挥发性离子的浓度。可完美重现尤其意指，所有的重复反应在反应母混合物中具有相同的单价和二价离子组成，以及相同水平的其它小分子。理想地，可重现的反应条件尤其意指，在多孔装置中的所有位置存在相同的加热和冷却条件。

实际上，一些反应在多室装置中进行，包括允许在反应过程期间改变化学组成的微流体装置。一些闭管反应容器泄漏或允许蒸发发生。许多反应经常有意或无意地使用不同浓度的盐、缓冲剂和其它化学组分制备。并且实际上，不是多容器装置中的所有位置均为相同的，即使在旋转的装置中。上述所有变更均改变酶功能并从而改变反应动力学。

本发明试剂在已知的温度下产生荧光信号，作为一阶导数荧光曲线中的熔解(或退火)谷(负峰)被最好地观察到，后文中称为“温度标志”。为此所述试剂可用作每个反应的内部温度标准。温度标志显示反应之间的变更和差异。这样的温度标志具有三个独立的值：1) 其“谷”深度为加入反应中的所述试剂的量的特征；2) 其“谷”达到最低值的温度为所述试剂的经验Tm；3) “一半深度”处的谷宽为所述试剂双链/单链形成和熔解的温度-依赖性过程的量度。

上述每个温度标志性质均预期为相应试剂在相同的重复反应中的恒定性质。该情况是因为所述试剂在反应过程中不扩增或降解。因此，重复反应中一个或多个温度标志性质的差异提供了重复之间非均一性的证据。这些温度标志性质还可用于数学上校正于重复反应之间的非均一性，以及用于相对于非-扩增试剂的温度标志定量反应中的扩增产物。

本领域技术人员将理解的是，在PCR扩增反应中采用两种不同的试剂也是可能的，两种试剂的双链具有非-交叉-杂交寡核苷酸序列，其具有显著不同的Tm，例如试剂2具有71℃的Tm，试剂3具有~50℃的Tm。所述非-交叉-杂交试剂可以以相同颜色或不同颜色标记。优选将两种试剂标记为相同的颜色，例如FAM，以便不存在任何其它探针/靶杂交体时二者为同一颜色。在这些情况下当表述为一阶导数时宽温度范围的熔解曲线具有两个谷并且这两个谷的最低点之间的距离，在该实施例中，为21℃(71-50)。构建两个截然不同的温度标志是有利的，这是因为两个标志之间的距离是预先知道的，并且可用于保证每个反应横跨相同的温度范围。

任何数目的期需热循环后，可构建荧光强度比率：样品信号/温度标志信号。由于温度标志信号在重复的反应中相同，上述比率的计算提供所选择数目的热循环后累积产物的量的定量测量。而且，若首先使用扩增开始时已知数目的靶拷贝构建比值的标准集，从实验样品观察到的比率可用于确立原始样品中的靶拷贝数目。

试剂的Tm为该试剂的性质，并且通常是已知的。可将所述试剂在实验样品中的观察Tm与其在其它样品中的Tm以及与该试剂的预期Tm相比。一组样品的Tm之间的差异提供了系统中样品之间变更的证据。一组中所有样品的Tm与试剂的预期Tm之间的一致差异表明反应混合物的组成导致该系统杂交条件的全面改变。

在同一时间或不同时间以尽可能相同的方式进行的重复测定有时仍然观察到为非-相同的。即使当制备大批特定母混合物，等分并作为重复检测时也是此种情况。同种母混合物不同批次的制备物也可为非-相同的，并且具有不同配方的母混合物不可避免地会显示差异。特别地，单价和二价阳离子的浓度，以及某些极性分子，在不同的母混合物中往往不同。重复之间的差异还由于机器和管误差而产生。例如，并非一个板或转子中的所有孔均可被相同地加热和冷却并且并非一组中的所有管均可被密封。重复的加热和冷却循环中样品的部分蒸发增加“闭管”反应中所有非-挥发性化学物质的浓度。此外，在反应混合物中包含蛋白，例如热启动抗体，往往与其一起携带未知量的离子和其它专有化学物质。

实施例12中呈现的数据说明扩增反应过程期间试剂的温度标志可重复测量，例如在开始、中间和结束时。该结果显示温度标志为高度可重现的，0、30和60个热循环后保持相同。

实施例13提供了我们使用至少一种试剂的温度标志所观察到的重复之间的变更的一组非-详尽的原因。在大多数情况下重复之间的变更作为温度标志向更高或更低的温度超过0.5℃的量的移动被观察到。这些移动与反应混合物中的离子强度差异一致。一般而言，较高的离子强度稳定杂交链并且因此增加温度标志的Tm。如关于实施例5和图5A-B的上文中所讨论的，所述试剂浓度的2-3倍差异对该试剂温度标志的改变符合用于在反应开始前计算Tm值的最近邻公式，但该性质的改变通常为故意的。相反，对重复反应的已知组成的试剂的量的非故意轻微差异导致固定温度时信号振幅的轻微变更。

热启动聚合酶，其中常规聚合酶被例如抗体、烷化基团或修饰的三核苷酸修饰的组合物，与所有形式的PCR联合使用。热启动修饰在第一个热循环的第一个熔解步骤之前阻断或抑制聚合酶活性。它们因此防止在制备反应混合物以及引物在远低于其Tm的温度下与聚合酶一起存在的时候错误引发。所有类型的热启动试剂在PCR热循环的开始一个或开始几个(在一些修饰的三核苷酸的情况下)链熔解步骤期间被有意地不可逆灭活。由于所述试剂如上所述增强聚合酶选择性和引物特异性，因此该试剂可用作常规热启动试剂的替代物。在此能力上所述试剂(或试剂的组合)不在扩增开始后被有意地不可逆灭活。相反地，对应于其为双链的程度，以温度依赖性方式活化或灭活。此外，当以该能力使用时，所述试剂(或试剂的组合)不以与传统热启动试剂相同的方式抑制聚合酶活性。相反地，所述试剂(或试剂的组合)抑制5’外切核酸酶活性并因此严重迫使聚合酶活性延伸完美匹配的引物/靶相互作用，从而保证在第一个热循环的第一个熔解步骤之前不开始非特异产物的合成。

使用单个所述试剂作为热启动的替代物可通过加入100-500 nM如先前在公布的国际专利申请WO 2010/105074中所描述的在其末端核苷酸的3-4个上dabcyl化的双链寡核苷酸予以支撑。这样的多-dabcyl化分子的两条互补链序列设计为不与反应中的任何引物或试剂交叉杂交。所述多-dabcyl化试剂的解链温度设置为足够低，优选至少30℃但低于引物Tm并且更优选低于熔解温度，以保证其不抑制引物结合和正确匹配的引物/靶对的延伸。实施例14说明了这种情况，其中试剂1与500 nM 22个核苷酸长、被4个末端dabcyl基团修饰并且具有67℃的Tm (比引物Tm低并且比退火/延伸温度低8℃)的双链寡核苷酸组合使用。如果证实各种添加物不能防止错误引发，该扩增反应包含10、100或1,000种结核分枝杆菌(M. tuberculosis)基因组DNA以及20,000个人基因组DNA拷贝以增加错误引发的可能性。使用结核分枝杆菌中rpoB基因靶的一对引物，连同两对Lights-On/Lights-Off探针，用于扩增。

实施例14、图14 A-C的结果为其中每25 µl使用1单位Taq聚合酶并且无热启动抗体的重复反应的产物。相反，图14 D-F含有添加的热启动抗体。35个扩增循环后分析图14A与图14D相比在重复反应之间具有更多的变异性(参见箭头1和1’、2和2’的区域)。该变异性是由于不存在抗体时扩增开始之前的错误引发错误所致。图14B和E包含500 nM用4个dabcyl基团修饰的22 bp寡核苷酸但无试剂1。图14B与A以及图14E与D的比较说明修饰的寡核苷酸的存在改变探针/靶杂交体的荧光模式(特别是在箭头2和2’的区域)。这显示修饰的寡核苷酸发挥功能防止扩增之前和期间的错误引发。图14C和F包含500 nM用4个dabcyl基团修饰的22 bp寡核苷酸，加75 nM试剂1。图14B与C以及图14E与F的比较说明试剂1进一步减少了重复反应之间的分散。此外，图14F与C的比较说明热启动抗体不显著提高三个靶水平：10、100和1000个结核分枝杆菌基因组DNA拷贝中每个的重复反应相似性。总的来说这些结果证明所述试剂与具有多个dabcyl并且Tm低于引物Tm的双链寡核苷酸组合，显示提高的引物选择性以及热启动样活性两者。

实施例14进一步说明了35个热循环后将500 nM用4个dabcyl基团修饰的22 bp寡核苷酸与75 nM试剂1组合的益处。图14C与B以及图14F与E的比较说明该两种试剂一起工作以进一步提高扩增的准确度。同样，试剂1产生的约80度的温度标志，图14C和F，可用于标准化所有其它点的荧光信号。

实施例15说明试剂2与热启动抗体组合使用，与单独的抗体相比提高重复反应的重现性。实施例15还说明单独使用试剂2与单独使用抗体一样好地达到错误引发的热启动抑制。

实施例16说明了具有不同Tm的两种试剂的使用。该两种试剂以相同的荧光颜色标记，反应一式三份进行。结果通过绘制作为温度函数的荧光的一阶导数产生，并在同一荧光颜色显示两个温度标志。较低温度标志的经验Tm为约52℃，较高温度标志的经验Tm为约66℃。本领域技术人员将理解的是，这两个标志之间的℃数可通过改变相应试剂的碱基对组成而增加(或降低)。例如，较低的温度标志可维持在52℃并且可通过使用试剂1将较高的温度标志移动至79℃。本领域技术人员将进一步理解的是，可向这样的两-标志绘图中加入一种或多种额外的荧光信号。例如，可以以相同的颜色探查扩增靶，并且探针/靶杂交体可设计为在两种非-扩增试剂的温度标志之间产生正的一阶导数峰。在这种情况下所述扩增靶的峰相对于两种非-扩增试剂的谷的不变深度的振幅将与扩增产物的量成比例增加。在LATE-PCR测定的情况中该信号将作为所产生的单链扩增子的量的函数增加。与一种或多种所述试剂提供的内部非-扩增对照相比，这样的信号可包含在反应中作为内部扩增对照。

热启动样活性还可使用两种试剂取得，在这种情况下全温度范围内还产生两个不同的温度标志。例如对于包含1.25单位Taq聚合酶的25 µl反应，第一种组合可由试剂3 (表1)与试剂4 (表1)混合组成以提供约67℃的第一个温度标志和约52℃的第二个温度标志，取决于每种试剂在50-300 nM范围内的浓度。优选试剂3和试剂4用相同的荧光团例如FAM标记，如实施例16中所说明的。试剂3与试剂4的组合可以以例如，75℃的退火/延伸温度使用。第二个有用的试剂组合由试剂2 (表1)与试剂4组成。该试剂组合可以以，例如，约60-65℃的退火温度和72℃的延伸温度使用。较低温度的所述试剂设计为具有比反应退火温度低5℃或更多的功能Tm并且将因此仅在退火温度之下变成双链的。其将有助于增加聚合酶选择性和引物特异性，以及抑制低温度时的5’外切核酸酶活性，包括扩增之前和扩增过程任何循环中低温度荧光采集期间(例如，低Tm探针的检测或熔解分析)或在扩增结束时使用的那些。所述两种试剂产生的两个温度标志还可用于确立用于扩增的热循环仪的重现性，如下文所解释的。

单个或双重温度标志不仅提供直观调整样品的荧光标记以与已知样品的曲线文库比较的方法，并且他们还提供单个样品所有颜色的熔解/退火曲线的数学分析的起始点。可将使用多个Lights On/Lights-Off探针从扩增样品获得的荧光信号与获自已知样品的曲线的文库进行手动比较，如公布的国际专利申请WO 2011/050173中所公开的。当采用手动比较时，参考曲线与包含相同靶的样品的曲线之间的峰和谷的Tm变更可容易地通过将一条曲线向左或向右滑动直到它们匹配来克服。对于计算机数学分析，手动滑动曲线是不可能。因此，数学分析使用实施例17和图17 A-C中说明的一组算法。分析步骤设计为达到以下：1) 证实温度标志“峰”或“谷”(取决于符号)的形状符合与所述试剂的预设性质一致的高斯或倾斜的高斯曲线；2) 确立高斯曲线的计算温度标志，此处计算温度标志指特定样品经验测量的热标志的“观察Tm”，OTM；3) 产生一个温度-调整-值，TAV，其将每个样品的OTM校正到该试剂预设的标准OTM (TAV可基于单个试剂的OTM，或两种试剂OTM的高/低温度对)；4) 使用样品的TAV将每个经验测量的温度度数调整至校正的温度；5) 标准化所有用于检测探针荧光的通道上的荧光信号使其在0和1之间，分别使用最低温度和最高温度值作为0值和1值，以便我们可检查熔解曲线的形状而不需考虑物质的丰度；6) 计算一阶和二阶导数以突出lights ON/lights OFF结合相关的一种或多种信号模式；7) 为评估未知的样品，我们计算未知样品的一阶或二级导数(标准化的熔解曲线)与已知样品的数据库之间的温度-平均误差(例如方差)；我们认为最低误差的已知样品与未知样品最好地匹配。

实验

在下列实施例中，试剂和所述试剂的浓度有时通过单个数字，例如，50nM表征。当这样做时，浓度数字指正向链(意指表1中上方链)的浓度。如上文所解释的，互补链(表1中下方的链)常常以更高的浓度添加，特别是当，如试剂1中，正向链用荧光团标记并且下方的链用猝灭剂标记时。当反向链浓度较大时，双链的浓度由较小浓度的正向链确定。

实施例 1

Dabcyl/Taq相互作用的分子模拟

方法

X-射线晶体学为理解试剂B (无dabcyl)或试剂D (两个dabcyl) (二者均在表1中示出)与Taq聚合酶相互作用的方法选择。沿这些线路的实验尚未获得晶体。在这期间，我们选择了使用已知的Taq聚合酶晶体结构和对接程序计算3’和5’ dabcyl部分如何最好地与Taq的聚合酶结构域部分(聚合酶催化位点，或“聚合位点”，图1A中的105)和5’外切核酸酶结构域部分(5’外切核酸酶催化位点，或“5’外切位点”，图1A中的105)配合。用于产生GLIDE分数的方案为来自Schrodinger的程序包：被称为Maestro的用户界面，用于对接的专用程序为GLIDE (Grid-based Ligand Docking with Energetics (基于格点的配体对接能量学))。Glide分数(G分数)通过下式给出：

G分数= a*vdW + Coul +Lipo +HBond = Metal + BuryP + RotB + Site,

其中

vdW = 范德华能

Coul = 库伦能

Lipo = 亲脂接触分量(Lipophilic contact term)

HBond = 氢键合分量(Hydrogen-bonding term)

Metal = 金属结合分量(Metal-binding term)

BuryP = 掩埋的极性基团的罚分

RotB = 冻结的可旋转键的罚分

Site = 活性位点的极性相互作用

以及vdW和Coul的系数为：

a = 0.065，b = 0.130 fpr Standard Precision (SP) Glide

GLIDE软件基本上考虑对接分子(dabcyl)与蛋白分子(Taq聚合酶)之间所有的相互作用，并计算具有最低相互作用能的最佳相互作用。蛋白与小分子的相互作用在三维对接空间中定义，并且该程序基于这些相互作用计算GLIDE分数。GLIDE分数越负，Taq与该分子之间的相互作用越好。不幸地，在程序GLIDE中，小分子的大小受限。因此我们将我们的分析限制在与相应dabcyl部分连接的3’或5’核苷酸磷酸。产生了四个最佳相互作用的GLIDE分数：在聚合位点的3’ dabcyl C磷酸，在聚合位点的5’ dabcyl G磷酸，在5’外切位点的3’ dabcyl C磷酸和在5’外切位点的5’ dabcyl G磷酸。

结果

在聚合位点的 3’ dabcyl C 磷酸

3’ dabcyl C磷酸以-8.08的对接分数对接入Taq的聚合酶位点，这指示良好的配合。3’ dabcyl插入催化位点，而C磷酸保留在该位点入口附近。其还接近聚合酶的拇指部分。

在聚合位点的 5’ dabcyl G 磷酸

5’ dabcyl G磷酸以-4.84的GLIDE分数对接入聚合酶位点，指示适度的结合。5’ dabcyl插入该位点，而G磷酸保留在聚合位点入口附近。其接近聚合酶的手指部分。

在 5’ 外切位点的 3’ dabcyl C 磷酸

3’ dabcyl C磷酸以10.03的GLIDE分数对接入5’外切位点，指示紧密结合。3’ dabcyl插入该位点，而C磷酸保留在5’外切位点入口附近。该分子与位于聚合酶5’外切部分下面(图1A)的单链通道内配合。

在 5’ 外切位点的 5’ dabcyl G 磷酸

5’ dabcyl G磷酸以-5.33的GLIDE分数对接入5’外切位点，指示适度结合。5’ dabcyl插入该位点，而G磷酸保留在5’外切位点入口附近。该分子与位于聚合酶5’外切部分下面(图1A)的单链通道内配合。

关于5’ dabcyl G与Taq聚合酶5’外切位点之间的空间关系，5’ dabcyl G磷酸与空间充填结构中的通道完美地吻合。关于5’外切位点的空间充填结构，每次仅5’ dabcyl G磷酸和3’ dabcyl C磷酸中的一个可结合到5’单链外切通道。

讨论

对接程序GLIDE的结果显示5’ dabcyl G磷酸和3’ dabcyl C磷酸二者对Taq聚合酶的聚合和5’外切位点二者均具有合理的结合GLIDE相互作用分数。图1A显示无任何与其对接的Taq聚合酶的结构。我们注意到存在具有3’ dabcyl C磷酸和5’ dabcyl G磷酸二者与多聚位点对接的Taq聚合酶结构，这是因为二者能够同时装配入双链位点，因此完全封闭该位点。这将在存在非常高浓度试剂B或试剂D时发生，从而关闭聚合酶功能。图1B显示充满3’ dabcyl C磷酸或5’ dabcyl G磷酸的聚合催化位点104和5’外切催化位点105二者。二者均与5’外切通道很好地配合。所有的对接结果显示在某些dabcyl浓度下5’外切位点将被3’ dabcyl C磷酸或5’ dabcyl G磷酸封闭，这意味着低浓度的试剂B或试剂D将抑制5’外切核酸酶活性。

实施例 2

用于评估对 5’ 外切核酸酶活性的抑制的引物 - 依赖性振荡 - 温度测定

Taq DNA聚合酶具有切割与其靶链杂交的寡核苷酸探针5’末端的荧光标记核苷酸的能力。该5’外切核酸酶切割甚至发生在不存在上游引物延伸的等温条件下。因此与在标准5’核酸酶扩增反应中发生的引物-依赖性切割相反，其为引物-不依赖性切割。我们发现通过在探针/靶杂交体Tm以上和以下的有限温度范围内振荡反应混合物的温度增加引物-不依赖性5’外切核酸酶切割的速率。

振荡反应以由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3 mM MgCl₂、200 nM dNTPs、1.25单位Taq DNA聚合酶 (Invitrogen, Carlsbad, CA)、200nM具有5’FAM和3’ Black Hole猝灭剂1 (BHQ1)的探针和100nM互补的41-核苷酸长的完美互补的靶组成的25 µl体积进行。该反应混合物与无任何试剂添加物、含不同浓度(50 nM、100 nM、150 nM)的表1中确定的某些试剂一起使用。关于表1，试剂添加物为：试剂A、试剂C和试剂1，其中荧光团F为Cal Orange 560 (图19)，猝灭剂Q为Black Hole猝灭剂2 (图18)。每种添加的试剂均为双链的并且具有相同的正向和反向互补核苷酸序列。如表1中所示，试剂A仅均有3’-碳接头(C3)。在该版本的试剂A中，反向链具有150 nM、300 nM和450 nM的浓度。如表1中所示，试剂C具有并列的末端dabcyl基团。在该版本的试剂C中反向链具有150 nM、300 nM和450 nM的浓度。如表1中所示，试剂1在反向链上含有末端猝灭剂，其与正向链上的5’末端荧光团，一个庞大的部分，相对。本实施例采用其中荧光部分F为荧光团Quasar 670并且猝灭剂部分Q为Black Hole猝灭剂2的试剂1版本。在该版本的试剂1中，反向链具有150 nM、300 nM和450 nM的浓度。以探针作为反应混合物中仅有的寡核苷酸运行了对照反应。使用下列热概况来振荡反应混合物：45℃/20s，60℃/10s达45个循环。FAM荧光在热概况的45℃区段采集。结果在图2 A-C中呈现，其为FAM荧光强度对振荡循环数目的曲线图。

探针和靶的序列为：

探针：5’ FAM- CCATGATACAAGCTTCC-BHQ1　(SEQ ID NO. 11)

靶：5’ ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAG AACCT (SEQ ID NO. 12)

5’外切核酸酶切割活性将探针的荧光团从探针分离，因此导致荧光(FAM)增加。图2A-C中报告的结果为三个重复的平均，将仅探针反应调整到探针加靶反应时间零点的最低荧光值。在图2A中，仅探针反应的曲线201显示在靶不存在时，探针不被切割。包含探针和靶但无试剂的反应的曲线202显示最高的探针切割。分别含有50、100和150 nM试剂A的反应的曲线203、204和205显示5’外切核酸酶活性以浓度依赖的方式逐步降低。图2B显示用试剂C (dabcyl/dabcyl)的结果，其显著抑制5’外切核酸酶活性。曲线206、207和208为50、100和150 nM的试剂。对于试剂1 (CO560/BHQ2)，结果在图2C中示出，其中曲线210、211和212分别为50、100和150 nM浓度。该试剂显示与5’和3’末端无部分的试剂A相比，几乎没有至没有5’外切核酸酶抑制的增加。

实施例 3

使用无试剂添加物、试剂 A 、试剂 C 、试剂 1 或试剂 1’ 的引物特异性测定

我们进行了LATE-PCR测定，其中我们扩增了与两个引物互补的靶(匹配靶)，并且其中我们单独扩增了与过剩引物互补但包含与限制引物3’末端核苷酸的单个错配的靶。我们使用SYBR Green (与双链DNA结合的染料)，实时，即在每个PCR循环的引物延伸部分期间，检测双链产物。引物和单链靶的序列如下：

限制引物：5’CGTAAGATTACAATGGCAGGCTCCAGT　(SEQ ID NO. 13)

过剩引物：5’GCCCAAGTTTTATCGTTCTTCTCA　(SEQ ID NO. 14)

匹配靶(A)：5’ CGTAAGATTACAATGGCAGGCTCCAG A AGGT TCTAAGTGCCATGATACAAGCTTCCCAATTACTAAGTATGCTGAGAA GAACGATAAAACTTGGG　(SEQ ID No. 15)

错配靶(T)：5’CGTAAGATTACAATGGCAGGCTCCAG T AGGT TCTAAGTGCCATGATACAAGCTTCCCAATTACTAAGTATGCTGAGAAGAACGATAAAACTTGGGCAA　(SEQ ID No. 16)

加下划线和粗体的核苷酸为在过剩引物链中的互补将与限制引物3’末端核苷酸匹配或错配的核苷酸。

对于该包含两个靶的测定，我们使用与两个靶均完美互补的过剩引物和也与两个靶完美互补的对照限制引物运行对照扩增，以确保两个靶的起始拷贝数相同，在起始拷贝数相同的情况下两个靶的C_T相同(<0.5 C_T)。

LATE-PCR扩增以由1X Invitrogen PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3 mM MgCl₂、200 nM dNTPs、50 nM限制引物、1000nM过剩引物、0.24X SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA)、1.25单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)以及约1000单链靶A (匹配的)或T (错配的)组成的25 µl体积一式三份(三个重复测定)进行。一个例外为试剂B，其进行了两个重复测定。反应额外地包含无添加试剂、或不同量(50 nM、100 nM或150 nM)的试剂A、试剂C、具有Cal Orange 560荧光团和Black Hole猝灭剂2的试剂1、具有Quasar 670荧光团和Black Hole猝灭剂2的试剂1或具有Quasar 670荧光团和Cal Orange 560荧光团的试剂1’。对于试剂A反向链的浓度为150 nM、300 nM和450 nM。对于试剂C反向链的浓度为150 nM、300 nM和450 nM。对于两个版本的试剂1反向链的浓度为150 nM、300 nM和450 nM。对于试剂1’反向链的浓度为150 nM、300 nM和450 nM。这些反应的热概况条件为：95℃ 3分钟，接着95℃/5s-62℃/20s-72℃/33s 60个循环。这之后为从35℃开始，每隔33 s增加1℃直至95℃的熔解(见下文实施例5)，同时在每度采集Fam、Cal Orange 560和Quasar 670荧光。

图3A-O显示SYBR Green染料的实时荧光曲线，其在设备的FAM通道读取，因此记录为“FAM荧光”。每张图均包含含匹配靶且无添加物的反应的曲线301和含错配靶且无添加物的反应的曲线302。图3 A-C为分别含有50 nM、100 nM和150 nM浓度的试剂A的反应。曲线303、305和307为匹配靶，曲线304、306和308为错配靶。图3 D-F为分别含有50 nM、100 nM和150 nM浓度的试剂C的反应。曲线309、311和313为匹配靶，曲线310、312和314为错配靶。图3 G-I为含有第一个版本试剂1的反应，其中荧光部分F为Cal Orange 560并且猝灭剂部分Q为Black Hole猝灭剂2。图3 G-I中该版本的试剂1的浓度分别为50 nM、100 nM和150 nM。曲线315、317和319为匹配靶，曲线316、318和320为错配靶。图3 J-L为含有第二个版本的试剂1的反应，其中荧光部分F为Quasar 670并且猝灭剂部分Q为Black Hole猝灭剂2。图3 J-L中该第二个版本的试剂1的浓度分别为50 nM、100 nM和150 nM。曲线321、323和325为匹配靶，曲线322、324和326为错配靶。图3 M-O为含有一个版本的试剂1’的反应，其中5’F为Quasar 670并且3’F为Cal Orange 560。该版本的试剂1’的浓度分别为50 nM、100 nM和150 nM。曲线327、329和331为匹配靶，曲线328、330和332为错配靶。

相对于3’末端错配靶/引物偏好匹配靶/引物的引物延伸为错配靶扩增信号的循环阈值(C_T)与匹配靶扩增信号C_T之间的差异(△ C_T)。运行重复的扩增反应，如上所述。C_T差异使用重复的平均值计算。一个测定无任何添加试剂或本发明试剂进行。SYBR Green信号实时，即，在所有PCR循环的引物延伸部分期间检测。作为扩增循环数目的函数读出的荧光强度显示该酶对匹配靶具有适度的固有选择性。获得了匹配和错配靶序列之间的C_T差异(参见图3A，环301、302)。具有相同限制引物的两个模板的该△ C_T为2.1。试剂或本发明试剂增加引物特异性的效率为含有试剂或本发明试剂的PCR反应中观察到的C_T差异(△ C_T)减去无任何试剂或本发明试剂的△ C_T。因此，对于每种试剂或本发明试剂，首先测定△ C_T，然后通过减去2.1计算△ △C_T。

结果在表2中报告，其中使用试剂或本发明试剂相对无试剂产生的△C_T差异的提高(或，若为负数，降低)为标题为△△C_T的栏。

表2

N/A – 结果显著延迟因此不可用，见图3D。

实施例 4

II型错误引发和聚合酶选择性

我们进行了这样的LATE-PCR测定，其中我们扩增了与两个引物均互补的靶(匹配靶)，并且其中我们单独扩增了与过剩引物互补但包含与限制引物3’末端核苷酸的单个错配的靶。我们通过DNA染料，在该情况下为SYBR Green，实时，即在每个PCR循环的引物延伸部分期间，检测双链产物。在存在任何浓度的试剂的情况下对3’末端错配的选择性为错配靶扩增信号循环阈值(C_T)与匹配靶扩增信号C_T之间的差异(△C_T)。扩增反应一式三份运行。C_T差异使用三个重复的平均值计算。试剂提高DNA聚合酶选择性的效率为含有该试剂的C_T差异△C_T，减去无任何试剂的C_T差异△C_T，即△△C_T。在本实施例的标题“选择性”下，我们报告了使用试剂引起的C_T差异的提高△△C_T。

引物和单链靶的序列与实施例3中的相同。对于试剂A，正向链的浓度为50、100和150 nM；反向链的浓度分别为150、300和450 nM。对于试剂1，其中正向链上的荧光部分F为Cal Orange 560并且反向链上的猝灭部分Q为Black Hole猝灭剂2，正向链的浓度为50、100和150 nM；反向链的浓度分别为150、300和450 nM。对于试剂2，正向链上的荧光部分F为Cal Red 610并且反向链上的猝灭部分Q为Black Hole猝灭剂2，正向链的浓度为50、100和150 nM；反向链的浓度分别为150、300和450 nM。

LATE-PCR扩增以由1X Invitrogen PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3 mM MgCl₂、200 nM dNTPs、50 nM限制引物、1000 nM过剩引物、0.24X SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA)、1.25单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)与约10,000单链靶A (匹配的)或T (错配的)组成的25 ul体积一式三份进行。这些反应的热概况条件为：95℃ 3分钟，接着95℃/5s-62℃/20s-72℃/33s 60循环，在每个循环的72℃步骤采集荧光。这之后为从35℃开始每隔30 s增加1℃直至95℃的熔解，同时在每度采集Fam、Cal Red 610和Quasar 670荧光。对于该包含两个靶的测定，我们使用与两个靶均完美互补的过剩引物和也与两个靶完美互补的对照限制引物运行了对照扩增，以确保两个靶的起始拷贝数相同，在起始拷贝数相同的情况下两个靶的C_T相同(<0.5 C_T)。结果在表3中呈现，其中△C_T为匹配与错配靶C_T之间的差异，△△C_T为含有与不含试剂的△C_T之间的差异。

表3

当在本测定中检测含有试剂或本发明试剂的样品时，同样也包含无试剂对照，从该试剂的匹配与错配靶序列之间的C_T差异中减去无试剂对照的匹配和错配靶序列之间的C_T差异，通常为约2 C_T循环，以取得表3中呈现的选择性提高数(△△ C_T)。

两个样品的实时SYBR Green荧光曲线在图4中示出，其中环401指示含有150 nM试剂2和匹配靶的三个重复反应，环402指示含有150 nM试剂1和匹配靶的三个重复反应。环401的曲线之一显示产物进化，由达到平稳期后荧光的晚期升高证明。这样的产物进化证据未在环402的任何曲线中见到。

实施例 5

试剂 1 和试剂 2 作为温度标志

LATE-PCR扩增如实施例3中所述进行，添加不同量(50 nM、100 nM或150 nM)的试剂1或更短的试剂2，其中在各试剂中荧光部分F为Cal Orange 560或Cal Red 610并且猝灭部分Q为Black Hole猝灭剂2。对于两种试剂反向链均以正向链浓度的三倍浓度添加。扩增反应之后为从35℃开始每隔33 s增加1℃直至95℃的熔解，同时在每度采集荧光团的荧光。荧光强度的一阶导数在图5A-B中示出。图5A中的三组曲线为不同浓度的试剂1，图5B中的三组曲线为不同浓度的试剂2。两种试剂的浓度均为50 nM/150 nM (荧光团链/猝灭剂链)，曲线501和504。曲线502和505为100 nM/300 nM (荧光团链/猝灭剂链)，而曲线503和506为150 nM/450 nM (荧光团链/猝灭剂链)。图5A-B显示试剂在反应混合物中的熔解，试剂1具有比试剂2高的Tm，如所预期的。该结果显示Tm温度(最低点值，或负峰)随试剂浓度增加轻微向上移动。这是由于杂交的浓度-依赖性质所致。

实施例 6

两个结核杆菌菌株的基因 rpoB 、 katG 和 gyrA 的多重药物抗性检测以及作为试剂 1 浓度的函数的荧光谷的深度

使用多重LATE-PCR测定产生包含赋予两个结核杆菌菌株对下列抗生素(及其靶基因)药物敏感性或药物抗性的序列的多个单链靶核酸：利福平(rpoB)、异烟肼(katG)和氟喹诺酮(gyrA)。在本实施例中，杂交通过使用如国际专利申请WO 2011/050173中所描述的On/Off探针组分析熔解概况来表征。采用了两个版本的试剂1。第一个版本的正向链用Cal Orange 560标记。第二个版本的正向链用Quasar 670标记。两个版本的反向链均用Black Hole猝灭剂2标记。反应中的其它寡核苷酸如下：

用于rpoB基因靶扩增的引物

限制引物：5’ CTCCAGCCAGGCACGCTCACGTGACAGACCG (SEQ ID No. 17)

过剩引物：5’ACGTGGAGGCGATCACACCGCAGACGTT (SEQ ID No. 18)

限制引物序列中的下划线指示核苷酸序列的蓄意改变，以防止二级发夹结构的形成。

rpoB靶：菌株24609

CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCTGGCTGGAG (SEQ ID No. 19)

rpoB靶：菌株4557

CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCGACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCTGGCTGGAG (SEQ ID No. 20)

rpoB探针1 Off：5’- BHQ2-CTGGTTGGTGCAGAAG-C₃ (SEQ ID No. 21)

rpoB探针1 On：5’- BHQ2-TCAGGTCCATGAATTGGCTCAGA-Quasar 670 (SEQ ID No. 22)

rpoB探针2 Off：5’- BHQ2-CAGCGGGTTGTT-C₃ (SEQ ID No. 23)

rpoB探针2 On: 5’-BHQ2-ATGCGCTTGTGGATCAACCCCGAT-Quasar 670　(SEQ ID No. 24)

rpoB探针3 On：5’-Quasar 670-AAGCCCCAGCGCCGACAGTC GTTBHQ2 (SEQ ID No. 25)

rpoB探针3 Off：5’-ACAGACCGCCGG BHQ2 (SEQ ID No. 26)

用于katG基因靶扩增的引物：

限制引物：5’-AGCGCCCACTCGTAGCCGTACAGGATCT CGAGGAAAC　(SEQ ID No. 27)

过剩引物：5’ TCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCAC (SEQ ID No. 28)

katG靶：菌株24609

5’

GCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCT (SEQ ID No. 29)

katG靶：菌株4557

5’

GCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCACCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCT (SEQ ID No. 30)

katG探针On：5’ Cal Orange 560-AAGTGATCGCGTCCTTACCT T-BHQ2 (SEQ ID No. 31)

katG探针Off：5’ GACCTCGATGCAGCTG-BHQ2 (SEQ ID No. 32)

用于gyrA基因靶扩增的引物：

限制引物：5’ AGCCGAAGTTGTTCTGGTCGTCCACCAGCGGG TAGCGCA　(SEQ ID No. 33)

过剩引物：5’ TTGCCGAGACCATGGGCAACTACCACCCGC (SEQ ID No. 34)

gyrA靶：菌株4557

5’

TTGCCGAGACCATGGGCAACTACCACCCGCACGGCGACGCGTCGATCTACGACAGCCTGGTGCGCATGGCCCAGCCCTGGTCGCTGCGCTACCCGCTGGTGGACGGCCAGGGCAACTTCGGCT (SEQ ID No. 35)

gyrA靶：菌株24609

无可用序列

gyrA探针On：5’ Cal Orange 560-TTGCTGCCGTAGATTGT GAGGTCGCCGTAA-BHQ1　(SEQ ID No. 36)

gyrA探针Off：5’ GGCTATGAGCACACCAG-BHQ1 (SEQ ID No. 37)

三碳接头用C₃指示，而Black Hole猝灭剂2用BHQ2 (Biosearch Technologies, Novato CA)指示。每条序列中的下划线指示与药物敏感结核杆菌序列相比核苷酸变化的位置。

一式三份的LATE-PCR扩增以由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、0.24x SYBR Green、2 mM MgCl2、300 nM dNTPs、每组引物50 nM限制引物和1000 nM过剩引物、1.5单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、500 nM Off探针、200 nM On探针、500 nM试剂1反向(猝灭剂)链以及约10,000任一靶菌株的基因组组成的25 µl体积进行。将该反应混合物再分为9个包含不同量试剂1正向链的亚混合物，试剂1正向链为用Cal Orange 560标记的版本或用Quasar 670标记的版本，或二者，如下：1) 亚混合物1包含50 nM Cal Orange 560荧光团链；2) 亚混合物2包含25 nM Cal Orange 560荧光团链和25 nM Quasar 670荧光团链；3) 亚混合物3包含50 nM Quasar 670荧光团链；4) 亚混合物4包含100 nM Cal Orange 560荧光团链；5) 亚混合物5包含50 nM Cal Orange 560荧光团链和50 nM Quasar 670荧光团链；6) 亚混合物6包含100 nM Quasar 670荧光团链；7) 亚混合物7包含200 nM Cal Orange 560荧光团链；8) 亚混合物8包含100 nM Cal Orange 560荧光团链和100 nM Quasar 670荧光团链；和9) 亚混合物9包含200 nM Quasar 670荧光团链。此外，所有扩增反应包含约20,000人基因组DNA的基因组(Promega, Madison, WI)。

扩增反应的热概况如下：95℃/3min 1循环，接着98℃/10s-75℃/42s 60循环，接着为75℃ 10分钟的单个循环，接着25℃ 10分钟。这之后为从25℃开始每隔42 s增加1℃直至97℃的熔解。

探针-靶杂交通过使用每个荧光团单独的25℃-95℃之间温度的一阶导数的熔解曲线分析进行分析。

图6A-C中的结果显示敏感菌株24609对于利福平(rpoB)与不同浓度和荧光团链组合的试剂1的Quasar 670荧光信号。图6D-F显示抗性菌株4557对于异烟肼(katG)和氟喹诺酮(gyrA)的Cal Orange 560信号。试剂1在这些熔解导数中作为81℃处不同高的温度谷可见。

图6A显示亚混合物1、2和3的Quasar荧光的一阶导数曲线，亚混合物的每个包含总共50 nM的试剂1荧光团链。存在两个Quasar荧光源：试剂1和rpoB基因On探针。亚混合物1 (环601指示的重复曲线)不包含Quasar荧光团(仅Cal Orange 560荧光团)链；因此，在81℃未见到可辨别的谷。亚混合物2 (环602)仅包含25 nM Quasar 670链，显示适度的峰，而亚混合物3 (环603)，含有50 nM Quasar 670荧光团链，具有最深的谷。图6B的结果为亚混合物4 (环604)、5 (线605)和6 (线606)，其每个含有总共100 nM的试剂1的荧光团链。显示的结果与图6A中那些相似。最高荧光团链浓度(200 nM)的结果在包含亚混合物7 (环607)、亚混合物8 (环608)和亚混合物9 (环609)的图6C中示出。将图6C 75℃以下的峰和谷的幅度与图6A相比，结果显示两种荧光团组合的试剂1，亚混合物8 (环608)，抑制rpoB靶的扩增，而具有每个单独荧光团的试剂1 (环607、609)降低荧光的总体水平。

图6D显示使用亚混合物1、2和3在Cal Orange通道的gyrA (57℃的峰)和katG (66℃的峰)的熔解导数结果。亚混合物3 (环610)中的试剂1仅包含Quasar 670荧光团链，因此，在81℃未见到可辨别的峰。亚混合物2 (环611)，包含25 nM试剂1 Cal Orange链，显示适度的谷，而亚混合物1 (环612)，含有50 nM试剂1 Cal Orange链，具有最深的谷。图6E中的结果为亚混合物6 (环613)、5 (环614)和亚混合物4 (环615)，其每个含有总共100 nM的试剂1荧光团链。所显示的结果与图6D中那些相似。最高荧光团链浓度(200 nM)的结果在包含亚混合物9 (环616)、亚混合物8 (环617)和亚混合物7 (环618)的图6F中显示。该结果显示荧光团的组合，亚混合物8，抑制katG靶的扩增，而单个荧光团降低荧光的总体水平。

实施例 7

与限制引物 3’ 末端错配的那些相比，试剂 1 和试剂 2 提高完全匹配靶的扩增的引物特异性

本实施例比较了具有类似于丙型肝炎病毒(HCV)基因型1b和2b的5’非编码区段的序列的两个DNA靶的LATE-PCR扩增和检测测定，使用与HCV 1b靶完全互补但在引物的3’末端含有与HCV2b靶的失稳错配(以及从限制引物3’末端起第九个核苷酸的额外的错配)的限制引物。双链DNA靶用1,000 nM 过剩引物、50 nM 限制引物和公布的RT-PCR方案(Pierce KE, Mistry R, Reid SM, Bharya S, Dukes JP, Hartshorn C, King DP, Wangh LJ: Design and optimization of a novel reverse transcription linear-after-the-exponential PCR for the detection of foot-and-mouth disease virus (用于检测口蹄疫病毒的新型反转录指数后线性PCR的设计和优化). J Appl Microbiol 2010, 109: 180-189.)从HCV1b和HCV2b Armored RNA (Asuragen, Austin, TX, USA)产生。扩增在31个循环后停止，以确保大多数产物为双链的。

对于因此而产生的DNA靶区域随后的扩增，以及在扩增和检测测定中使用双重标记的(F/Q)探针的检测，DNA靶有义链序列、引物序列和探针序列为：

HCV 1b靶：5’- TGACTGGGTC CTTTCTTGGA TCAACCCGCT CAATGCCTGG AGATTTGGGC GTGCCCCCGC GAGACTGCTA GCCGAGTAGT GTTGGGTCGC GAAAGGCCTT GTGGTACTGC CTGATAGGGT GCTT-3’ (SEQ ID No. 38)

HCV 2b靶：5’-TGACTGGGTC CTTTCTTGGA TAAACCCACT CTATGTCCGG TCATTTGGGC GTGCCCCCGC AAGACTGCTA GCCGAGTAG C GTTGGGTTGC GAAAGGCCTT GTGGTACTGC CTGATAGGGT GCTT-3’ (SEQ ID No. 39)

限制引物：5’- CCACAAGGCCTTTCGCGACCCAACA-3’ (SEQ ID No. 40)

过剩引物：5’-TGACTGGGTCCTTTCTTGGA-3’ (SEQ ID No. 41)

探针：5’-Cal Red 610- TCGGCTAGTAGTCTTGTGG-BHQ2-3’ (SEQ ID No. 42)

在靶序列中，限制引物的结合序列为加粗的。在HCV 2b (错配)靶中，引物结合序列中两个错配的核苷酸为加下划线的。

本实施例中使用的试剂1版本具有为荧光团Cal Orange 560的荧光部分F，并且具有为Black Hole猝灭剂2的猝灭剂部分Q。本实施例中使用的试剂2版本具有为荧光团Cal Red 610的荧光部分F，并且具有为Black Hole猝灭剂2的猝灭剂部分Q。

在试剂1、试剂2或无试剂存在下扩增和检测HCV lb和HCV 2b DNA靶。限制引物与靶的内部区域(在上文中以黑体显示，核酸80-104)杂交。其与HCV 1b靶的有义链完全互补。其与HCV 2b靶的相同区域部分互补，但含有在引物3’末端的一个强失稳的错配(C与A)和从引物3’末端起第九个核苷酸的一个弱失稳的错配(G与T)。基于我们先前无试剂的经验，G与T的错配对荧光在背景上变得可辨别的PCR循环，循环阈值(C_T)的作用最小。本领域技术人员将理解的是错配越失稳引物3’末端的错配位置将对起始扩增效率和所得的C_T值具有越大的作用。所有的样品均包含1X Platinum Tfi反应缓冲液(Invitrogen)、3 mM MgCl₂、0.4 mM的每种dNTP、0.24X SYBR Green、400 nM探针、1000 nM过剩引物、50 nM限制引物、约1,000拷贝的一个靶类型和2单位Platinum Tfi exo (-) DNA聚合酶(Invitrogen)，终体积25微升。

每个靶在4个无试剂的重复反应、4个含100 nM试剂1的重复、4个含100 nM试剂2的重复、4个含150 nM试剂2的重复样品、4个含200 nM试剂2的重复中检测。在每种情况下，所述浓度为荧光标记链的浓度，猝灭剂标记链以该浓度的三倍使用。使用Stratagene Mx30005P实时热循环仪。PCR热循环方案包括95℃起始变性1分钟，接着95℃ 10秒、64℃ 10秒和72℃ 60秒50个循环，在72℃步骤的终点检测荧光。然后将温度以每30秒1℃的步幅从72℃降至40℃，保持10分钟，然后以每30秒1℃的步幅升高至最终温度95℃，每步检测荧光。SYBR Green荧光的实时C_T值使用Stratagene软件适应性基线设置获得。基于66℃的荧光将从PCR后熔解获得的探针荧光值标准化。荧光信号强度通过减去平均无模板对照(NTC)计算。

SYBR Green荧光对PCR循环数目的实时扩增绘图在图7A的左侧显示，其中子图1为无试剂，子图2为100 nM试剂2，子图3为150 nM试剂2，子图4为200 nM试剂2，子图5为100 nM试剂1。实线(环701、704、707、710和713指示的曲线)为完美匹配靶，虚线(环702、705、708、711和714指示的曲线)为错配靶，点线(环703、706、709、712和715指示的曲线)为无靶对照。重复的平均C_T值与靶在表4中呈现。

表4

表4报告了含有或不含试剂的不同样品类型的SYBR Green荧光的循环阈值。表4还报告了每个样品类型匹配靶HCV 1b与错配靶HCV 2b之间的C_T差异“△C_T”。如所预期的，对于无试剂的样品，与错配HCV 2b靶(见图7A，子图1，环702)相比在完全互补的HCV 1b靶(见图7A，子图1，环701)中较早观察到实时荧光增加。平均C_T值的差异(△C_T)为4.1个循环(表4)。表4还报告了每个样品类型的选择性提高，即含试剂的△C_T减去4.1 (无试剂的△C_T)。最后，表4还报告了每个样品类型含试剂的匹配靶C_T与24.6 (无试剂的C_T)之间的差异“延迟(△C_T)”，其为聚合酶活性抑制的量度。

如从子图1环701的曲线中可见，无试剂的HCV 1b靶的四个重复中的三个显示荧光在紧接着达到典型平稳期值后的二次上升，表明产物进化。(还要注意的是无靶对照的荧光上升(环703)。)为了调查产物进化，使无试剂样品经受熔解分析，连同无模板对照。图7B呈现了作为温度的函数的SYBR Green强度的一阶导数曲线。曲线730为不显示二次上升的样品。曲线731为显示二次上升的三个样品。曲线732为无模板对照。产物进化通过SYBR Green-测量的解链温度高于特异性产物约2度证实。HCV 2b样品(图7A，子图1)无一具有可检测的产物进化。匹配靶的产物进化在100 nM试剂2时大大受到抑制(仅环704指示的一个样品在最后几个循环显示小幅二次荧光上升)并且在任何含有更高浓度的试剂2或100 nM试剂1的样品中均未被检测到。这里再次，含有试剂的HCV 2b样品(环705、708、711、714)无一具有可检测的产物进化。

包含HCV 1b (匹配)靶和试剂2的样品显示小“延迟”(作为相对于无试剂匹配靶的C_T值增加测量的抑制)。如表4中所示，添加100 nM试剂2的平均C_T值增加0.7个循环，添加150 nM试剂2增加1.6个循环，添加200 nM试剂2增加3.5个循环。包含100 nM试剂1的HCV 1b样品的平均C_T值增加略微更多，4.8个循环。有可能这些增加的部分是由于与无试剂扩增相比非特异性扩增减少，因为特异性和非特异性产物均被SYBR Green染料检出。不含试剂的无靶对照样品中观察到引物二聚体扩增引起的荧光增加(图7A，环703，通过熔解分析证实，图7B，环732)。含有试剂1 (环715)或试剂2 (环706、709、712)的无靶样品中荧光增加的缺乏提供了这些试剂抑制非特异性扩增的进一步证据。

如表4中所显示的，与不包含试剂的样品相比，包含错配HCV 2b靶与试剂1或试剂2的样品对比包含匹配HCV 1b靶与试剂1或试剂2的样品更大的C_T延迟(△ C_T)后检测到扩增。匹配靶与错配靶样品之间的平均C_T值差异随试剂2浓度增加而增加，从100 nM的6.6个循环(子图2，环705、704)上升，至150 nM的9.1个循环(子图3，环708、707)，至200 nM的12.2个循环(子图4，环711、710)。100 nM试剂1 (子图5，环714、713)的差异为13.4个循环。每种情况下对无试剂样品的选择性提高(△△ C_T)为减少4.1个循环(无试剂的△C_T)。

SYBR Green的C_T值测量组合的特异性和非特异性扩增。Cal Red-标记的杂交探针的荧光信号测量特异性扩增。那些信号证实了来自错配靶的特异性产物的量的减少。表4中报告了Cal Red探针(CR-I)的最大强度。图7A子图6-10呈现了在试剂Tm以下的温度处作为温度的函数的探针荧光的一阶导数。子图6为无试剂，子图7为100 nM试剂2，子图8为150 nM试剂2，子图9为200 nM试剂2，子图10为100 nM试剂1。实线(环716、718、720、722和724)为完美匹配靶，虚线(环717、719、721、723和725)为错配靶。特异性产物仅在四个含错配HCV 2b靶(子图9，环723)和200 nM试剂2的样品中的一个中可在背景上检测到，并且在任何含错配HCV 2b靶和100 nM试剂1的样品中(子图10)均未检测到。参照子图6，环716，可以看到特异性荧光在不显示产物进化的单个匹配靶HCV 1b样品中高，如其在约55℃的峰较大的强度所显示的。同样，比较子图6环717的曲线与子图7环719的曲线和子图8环721的曲线，可以看到与含有100 nM或150 nM试剂2的重复相比，无试剂的重复对于匹配靶HCV 1b具有更高的变异性，但对于错配HCV 2b靶具有更低的变异性。参照表4，可以看到平均荧光信号(CR-I)随试剂2浓度增加而下降，但匹配与不匹配样品的平均信号之间的比率增加。本领域技术人员将认识到，通过这些试剂取得的较大选择性可用于鉴定不同菌株或生物种类之间的特异性基因突变或核苷酸变更。

试剂1和试剂2两条链的熔解提供了关于两种试剂作用的可能差异的一些见解。随着温度增加，荧光标记链(试剂1 Cal Orange，试剂2 Cal Red)与其含有Black Hole猝灭剂的互补链分离，荧光增加。荧光强度对温度的导数绘图在图7C中示出。环740指示100 nM试剂1的曲线。环741指示100 nM试剂2的曲线。环742指示150 nM试剂2的曲线。环743指示200 nM试剂2的曲线。图7C上的垂直线指出的为几个参考温度，包括退火和延伸温度、过剩引物的计算Tm (表示为XP Tm)、限制引物与靶HCV1b的Tm (表示为LP Tm具有：HCV1b)和限制引物与靶HCV2b的Tm (表示为LP Tm具有：HCV2b)。试剂2具有约71℃的Tm (随浓度轻微不同)，这略低于限制引物与匹配的HCV1b靶的预测Tm和72℃的延伸温度，但在引物与错配的HCV2b靶的预测Tm之上。试剂1具有约78℃的Tm。因此尽管两种试剂在选择的浓度均显示选择性扩增，但试剂2在100 nM浓度时显示较低的抑制(通过与子图10环724的峰高相比，子图7环718的峰高显示)，可能是由于引物-HCV1b杂交体比该试剂更有效竞争可用的聚合酶的能力，特别是在延伸步骤期间。本领域技术人员将认识到匹配与错配靶之间选择性的进一步增加可通过更改热循环步骤的温度或持续时间(例如，降低退火温度以提供更高浓度的在该步骤期间将为双链的试剂2，即，增加其有效浓度)取得。

实施例 8

试剂 2 发挥功能抑制对称 PCR 扩增中重复之间的分散

重复之间的分散也为对称PCR扩增中当接近反应的平台期时众所周知的现象[R.G. Rutledge, Nucl. Acids Res. (2004) 32 (22): e178. doi: 10.1093/nar/gnh177 ]。实施例8说明了使用一对用于扩增导致Tay Sachs疾病的基因的一部分的引物的对称PCR扩增的重复反应之间的分散[J.E. Rice等 (2002) Prenatal Diagn. 22:1130-1134]。本实施例中使用的试剂2版本(见表1)具有Cal Red 610作为荧光部分F，以及Black Hole猝灭剂2作为猝灭剂Q。引物和靶序列如下：

用于TSD基因靶扩增的引物：

正向：5’ CCTTCTCTCTGCCCCCTGGT (SEQ ID No. 43)

反向：5’ AGGGGTTCCACTACGTAGAA (SEQ ID No. 44)

TSD靶：

5’

AGGGGTTCCACTATGTAGAAATCCTTCCAGTCAGGGCCATAGGATATACGGTTCAGGTACCAGGGGGCAGAGAGAAGG (SEQ ID No. 45)

对称扩增以由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、0.24x SYBER Green (Invitrogen)、3.0 mM MgCl₂、0.3 mM的每种dNTP、300 nM的每种引物和1.25单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)和约5个人基因组DNA拷贝组成的25 µl体积一式三份进行。比较的重复不包含加入的试剂。其它重复包含试剂2。试剂2以100 nM正向的荧光团-包含链与300 nM反向的猝灭剂-包含链添加。扩增和荧光检测在Stratagene MxP 3005P中进行。

扩增反应的热概况如下：95℃/3min 1个循环，接着95℃/10s、65℃/30s和72℃/15s 10个循环，接着95℃/10s，55℃ /30s和72℃/30s 50个循环，72℃步骤期间采集荧光。这之后为从43℃开始每隔30s增加1℃直至97℃的熔解。

图8A呈现了在仪器的FAM通道测量的SYBR Green荧光强度对PCR循环数目的实时曲线。图8B呈现了包含试剂2样品的作为温度的函数的SYBR Green荧光的导数曲线。图8C呈现了无试剂样品的作为温度的函数的SYBR Green强度的导数曲线。

参照图8A，未添加试剂的12个重复用环801指示，含有100 nM试剂2的12个重复用环802指示。不存在任何添加的试剂的情况下(环801)一组12个中的几个样品在比大部分样品更高或更低的水平达到平稳期。相反，添加100 nM试剂2 (环802)显著降低所有重复之间的分散水平。SYBR Green信号在平均33-35个热循环后出现。40或45个循环后达到平稳期，取决于是否添加试剂2。所有无试剂2孵育的样品均在用试剂2孵育的那些之前扩增和达到平稳期，符合不包含试剂2的反应由预期的双链扩增子和额外的非特异性双链DNA二者组成这一可能性。所有样品的熔解曲线分析在扩增60个循环后进行。这些结果证实用试剂2孵育的样品(图8B)非常相似，并且无非特异性双链DNA。相反，无试剂2扩增的所有样品(图BC)含有一定水平的较高熔解的非-特异性双链DNA。在试剂2不存在的情况下扩增的重复仅在它们接近平稳期水平时彼此偏离(图8A)。这证明发散为浓度-依赖性的现象。换言之，其依赖于相对高水平的累积产物链。在包含试剂2的样品中未观察到重复之间的发散，尽管这些样品中双链DNA的浓度比不存在试剂2下发散的那些高。我们从这些结果断定试剂2在对称PCR中增加聚合酶选择性并因此防止与其它产物链相互作用的产物链的错配3’末端延伸，即，产物进化。该结果与先前LATE-PCR扩增的实施例中所显示的那些一致。产物进化在LATE-PCR中更容易观察到，这是因为其导致单链扩增子变成双链的。相反，在对称PCR中双链扩增子仅变为更大的双链分子。

实施例 9 ：试剂 1 对含有与限制引物完全或部分互补的口蹄疫病毒 (FMDV) 序列的合成 DNA 靶扩增的作用

本实施例比较了在试剂1存在或不存在的情况下单个限制引物靶向的FMDV 1D基因的不同序列变体的扩增。试剂1的Cal-Orange-修饰链(表1)以50 nM使用，Black Hole猝灭剂2-修饰链以150 nM使用。使用单一的限制引物和单一的过剩引物通过LATE-PCR扩增几个合成的单链DNA寡核苷酸中每一个。限制引物，5’-ACCATCACTGAGCTGTTGATCCGCATGAAACG-3’ (SEQ ID No. )为与FMDV分离物IND 339-96的正链RNA类似的DNA序列并且在50 nM时具有与下述PCR试剂混合物中完全互补的靶的74.9℃的预测Tm。过剩引物，5’- AGGGCCCAGGGTTGGACTC-3’ (SEQ ID No. )在1,000 nM时具有与互补靶的73.7℃的预测Tm。探针，5’-Cal Red 610-ATAGCTCTTGACACCACTCAT-Black Hole猝灭剂2 -3’ (SEQ ID No. )在所有的扩增中用于证实特异性靶扩增并且具有与每个靶的61.9℃的预测Tm。Tm使用Visual OMP (DNA软件)预测。一个靶(在下文和图9中示出)包含105个与Asia1血清型分离物IND 339-96的FMDV 1D-2A/B基因的正链RNA区段互补的核苷酸。未包含FMDV序列的部分以便简化寡核苷酸合成。

5’

AGAAGAAGGGCCCAGGGTTGGACTCTGAGTGGTGTCAAGAGCTAGCAAAGGCCTGGGGCAGTATGTCTCCGCGCGTTTCATGCGGATCAACAGCTCAGTGATGGT-3’.(SEQ ID No. 46)

在上述靶序列中，与过剩引物序列相同的区域为加下划线的，与限制引物杂交的部分被加粗。其它靶，序列也在图9中给出，包含相同的序列，除了限制引物杂交区域(在上文中以粗体显示)的变更。其它靶的该区域包含与不同FMDV Asia1血清型分离物互补的核苷酸并且在图9中示出。(靶IND 324-98和IND 82-96的每个在3’末端含有3个额外的核苷酸GTC，其包括在内用于使用互补引物的初次试验，但那些核苷酸对于上述限制引物的杂交具有最小的作用。)与限制引物错配的靶核苷酸在图9中为阴影的。

样品包含1X Platinum Taq反应缓冲液(Invitrogen)、3 mM MgCl₂、0.4 mM的每种dNTP、250 nM探针、0.24X SYBR 1000 nM过剩引物、50 nM限制引物、约10,000拷贝的一个靶类型、1.5单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)以及无试剂或50 nM浓度的试剂1，终体积25微升。每个靶与试剂1一起或没有试剂1使用Stratagene Mx3005P热循环仪一式三份检验，该热循环仪编程为加热至95℃ 1分钟，接着95℃ 10秒、70℃ 30秒和伴随荧光检测的75度20秒，60个循环。每个的温度以30秒0.5℃的步幅从75℃降低至40℃ (以使探针能够与PCR产物杂交)，然后以30秒0.5℃的步幅从40℃升高至96℃，同时每步检测荧光。

图9呈现了每个靶的来自SYBR Green检测的荧光数据，即，无试剂反应的循环阈值C_T，含有50 nM试剂1的反应的循环阈值C_T，以及反应混合物中包含试剂1引起的延迟△ C_T。实时SYBR Green检测证实包含与引物错配的靶的样品中扩增被延迟。如图9中所示，无试剂反应的平均C_T 随错配数目增加，从完美匹配靶的24.1增加至含有4个错配的靶的32.0。当试剂1存在时C_T在所有情况中均延迟，但延迟的幅度△ C_T随错配核苷酸的数目增加。对于靶IND 339-96 (零错配核苷酸)延迟仅为1.2个循环；对于靶IND 116-90 (一个错配核苷酸)延迟增加至1.7个循环；对于靶IND 224-98、IND 82-96和IND 23-95 (两个错配核苷酸)延迟随错配的同一性和位置而变化，但平均为4.2个循环；对于靶BR/Myanmar 001 (四个错配)，延迟增加至9.3个循环。靶BR.Myanmar 001与试剂1的C_T，41.3，比匹配靶IND 339-96与试剂1的C_T，25.2，高了整整16个循环，证明了试剂1延迟错配靶扩增从而提高Taq 聚合酶对完全互补靶的选择性的能力。

实施例 10

试剂 1 增强多重 PCR 扩增的用途

根据国际专利申请WO 2011/050173，使用LATE-PCR反应在单个反应混合物中同时从人线粒体基因组扩增HV2、CO2和ND1序列，利用三对引物和Lights No/Lights Off探针以产生每个靶的荧光信号。扩增产物使用横跨每个扩增子长度的独特颜色的Lights-On/Lights-Off探针组的荧光信号鉴定。反应在存在试剂1或WO 2010/104074 [0164]段描述的添加物(其中其被称为“添加物EP042”)的情况下进行。添加物EP042为各自具有三个末端dabcyl基团的两个双链试剂的混合物。混合物中的两个双链通过在两种试剂中包含一条共有链(称为“中间链”)减少至仅3条链。添加物EP042的3条寡核苷酸链的序列如下：

上链：3’ Dabcyl CCTCGTCTGATCGTGACTCCAT Dabcyl 5’

中间链：5' GGAGCAGACTAGCACTGAGGTA Dabcyl 3’

下链：3’ Dabcyl CCTGGTCTGATTGTGSCTCCAT Dabcyl 5’　(SEQ ID No. 54)

添加物EP042如下添加到反应混合物中：下链和中链每个525 nM，上链25 nM。此处使用的试剂1版本具有Cal Orange 560作为荧光部分F，以及Black Hole猝灭剂2作为猝灭部分Q。试剂1以50 nM (荧光团-包含的寡核苷酸)以及150 nM猝灭剂-包含的寡核苷酸的浓度添加到反应混合物中。

用于扩增的引物序列如下(限制引物中加下划线的碱基为与标准靶序列错配的核苷酸)：

HV2 -限制引物：5’-AAAGCGGTGTGTGTGTGCTGGGTAGGAT - 3’　(SEQ ID No. 55)

HV2 -过剩引物：5’- ACTTCAGGGTCATAAAGCCTAAATAGC- 3’　(SEQ ID No. 56)

CO2 -限制引物：5’-AATAGAGGGGGTAGAGGGGGTGCTATA GGGT - 3’　(SEQ ID No. 57)

CO2 -过剩引物：5’-TCCTTATCTGCTTCCTAGTCCTGTATGC- 3’　(SEQ ID No. 58)

ND1 -限制引物：5’- AACATAAGAACAGGGAGGTTAGAAGTA

GGGTCTTGGT- 3’　(SEQ ID No. 59)

ND1 -过剩引物：5’- CGCCCCGACCTTAGCTCT- 3’ (SEQ ID No. 60)

使用的Lights-On/Lights Off探针组如下(探针中加下划线的碱基为与标准靶序列错配的核苷酸)：

HV2 Lights-On探针：

Quasar 670 5’ TGGTTAGGGTTCTTTATTTTGGGGTTCA - 3’ BHQ-2 (SEQ ID No. 61)

BHQ-2 5’ AATGGCAGAGATGTCTTTAAGTGCTGTTT - 3’ Quasar 670 (SEQ ID No. 62)

BHQ-2 - 5’ AAATGTAATCGCGTTCATATCACCCAGTT - 3’ Quasar 670　(SEQ ID No. 63)

Quasar 670 - 5’ TAATTGAACATAGGTACGATAAATAATTA - 3’ BHQ-2　(SEQ ID No. 64)

Quasar 670 - 5’ AACTGGGTGAAAAGTGACTATGCGGACTT - 3’ BHQ-2　(SEQ ID No. 65)

HV2 Lights-Off探针：

5’ AATGTGAAATCTGCTTGGGCTGGT - 3’ BHQ - 2 (SEQ ID No. 66)

BHQ-2 - 5’ GGCTAGGAGTTGGGGAGGGCGGGTT-C₃ - 3’　(SEQ ID No. 67)

BHQ-2 - 5’ ACGAGAGTACCCAACGCATGGAGAG –C₃ 3’　(SEQ ID No. 68)

5’ TTTAGTAAATGTGTTCACCTGTAAT - 3’ BHQ- 2　(SEQ ID No. 69)

5’ TGGGGGAAGTTTTTTCTTATTATGT - 3’ BHQ-2　(SEQ ID No. 70)

CO2 Lights-On探针：

BHQ-2 - 5’ AAACTACTCGATTATCAACGTCAAGGATT - 3’ CAL Red 610　(SEQ ID No, 71)

BHQ-2 - 5’ AAAATGGGGGAAGTTTGTATGAGTTGATT- 3’ Cal Red 610　(SEQ ID No. 72)

Cal Red 610 - 5’ AAACGATTGGGGACTTTAATTGGGAGTTT - 3’ BHQ-2　(SEQ ID No. 73)

Cal Red 610 - 5’ TTTGTAAAGAATGCGTAGAGATAGGAGAA - 3’ BHQ-2　(SEQ ID No, 74)

BHQ-2 - 5’ TTTTTATACGTACGGCAATTACATCTGAA - 3’ Cal Red 610　(SEQ ID No. 75)

BHQ-2 - 5 ’AGTGACCATAATATACCTCCGGCT - 3’ Cal Red 610　(SEQ ID No. 76)

CO2 Lights-Off探针：

BHQ-2 - 5’ GTCGCAGGACGCCTAGTTTTAGGAA –C₃ 3’　(SEQ ID No. 77)

BHQ-2 - 5’ AGATAAGTTCGCTGTATTCGGTGT –C₃ 3’　(SEQ ID No. 78)

5’ AGACGTCTTATGTTGTAATTAT - 3’ BHQ-2　(SEQ ID No. 79)

5’ GAGGCATTGTTCACGTCGTTTGTTA - 3’ BHQ-2　(SEQ ID No. 80)

5’ BHQ2-TTTTTAAATTTAATATGGGGATAGC C₃ 3’　(SEQ ID No. 81)

5’ BHQ2-TCGTATAGTGGTCAATGTGGTATGG –C₃ 3’　(SEQ ID No. 82)

ND1 Lights-On探针：

Cal Orange 560 - 5’ AAGTTCGGTTGGTTTTTGCTGGTGTGGTT - 3’ BHQ-1　(SEQ ID No. 83)

BHQ-1 - 5’ AATATGAAGAATAGAGCGAAGAGGCCTTT - 3 ‘Cal Orange 560　(SEQ ID No. 84)

BHQ-1 - 5’ TTAAGGTTGTAGTGATGGGGGTGTTTAAA - 3 ‘Cal Orange 560　SEQ ID No. 85)

BHQ-1 - 5’ AATTGATCAAGGGGTTTGGTATAGGGATT - 3 ‘Cal Orange 560　(SEQ ID No. 86)

BHQ-1 - 5’ TTAGATAAACCATAGTATGTCCGAGGGAA - 3 ‘Cal Orange 560　(SEQ ID No. 87)

ND1 Lights-Off探针：

5’ TTCGGCAATGTCGAGGGGG - 3’ BHQ-1 (SEQ ID No. 88) (53℃)

BHQ-1 - 5’ GCGGCCTATTCCATGTTGACGCCTG C₃ 3’ (SEQ ID No. 89)

BHQ-1 - 5’ TTATAATAATCTTTGTGTTTTCGGC –C₃ 3’ (SEQ ID No. 90)

BHQ-1 - 5’ GGGAGGTTTATAGTAAAAGAGAGAT –C₃ 3’(SEQ ID No. 91)

BHQ-1 - 5’ TCATGATTGCAGTAGTGGTAAGAGG –C₃ 3’ (SEQ ID No. 92)

LATE-PCR扩增以25 μl体积进行。反应混合物由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3 mM MgCl₂、250 nM dNTPs、50 nM HV2限制引物、1000 nM HV2过剩引物、100 nM CO2限制引物、1000 nM CO2过剩引物、50 nM ND1限制引物、1500 nM ND1过剩引物、2.5单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、50 nM的每种Lights-On探针、150 nM的每种Lights-Off探针，加如上所指出的试剂EP042或试剂1组成。所有的扩增均在Strategene MX3005P (Agilent Technologies, CA)中进行。所有扩增的热循环概况为：95℃ 3分钟；然后95℃ 5秒、65℃ 45秒和72℃ 90秒，75个循环；然后75℃ 10分钟；然后25℃ 10分钟。随着温度以45秒的步调每步1℃从25逐渐上升至80℃，通过探针荧光信号监测扩增后DNA熔解。熔解数据作为荧光探针信号相对于温度的负一阶导数(荧光信号)显示和分析。图10呈现了获得的荧光信号。图10子图1为使用添加物EP042的HV2序列Quasar探针组的信号。子图2为使用试剂1的HV2序列的Quasar探针组的信号。子图3为使用添加物EP042的CO2序列的Cal Red探针组的信号。子图4为使用试剂1的CO2序列的Cal Red探针组的信号。子图5为使用添加物EP042的ND1序列的Cal Orange探针组的信号。子图6为使用试剂1的ND1序列的Cal Orange探针组的信号。

在dabcyl化试剂，添加物EP042存在的情况下ND1的荧光信号几乎不可辨别(图10，子图5)。相反，用试剂1代替dabcyl化试剂导致强ND1荧光信号(图10，子图6)。试剂1 (此处用Cal Orange荧光团标记)的熔解，显示子图6中ND1靶的信号曲线的上升。在子图6中，试剂1作为ND1荧光信号中最右边79℃处的谷可见。使用试剂1也增加HV2和CO2荧光信号的强度(比较子图2与子图1，以及比较子图4与子图3)。不存在dabcyl化试剂或试剂1时不产生荧光信号(数据未显示)。

实施例 11

试剂 1 对人流感序列的多重 RT-LATE-PCR 的错误引发预防作用

提出在高度多重RT-LATE-PCR测定中采用大流行性2009流感(09N1)的神经氨酸酶基因的序列。为了开发目的，体外转录合成了人流感序列的RNA并用作靶。还包含可市售获得的纯化的MS2噬菌体基因组RNA作为RT-PCR效率的对照。

在本测定方案中，通过总共3个探针检测大流行性2009流感(09N1)的神经氨酸酶基因。其中两个探针(ON探针)在5’末端缀合CAL Red 610荧光团并且在3’末端缀合Black Hole猝灭剂2 (BHQ2)，一个探针(OFF探针)仅在3’末端缀合BHQ2。(探针序列参见三重RT-LATE-PCR测定部分。)这三个探针设计为与它们的靶序列具有不同的浓度-调整的解链温度(Tm)，如下：9N1-Zan ON Tm> 09N1-Zan OFF Tm> 09N1-Os探针Tm。

当LATE-PCR扩增结束时在一定温度范围内分析探针结合时，CAL Red 610-09N1探针组产生如图11A中所示的组合荧光轮廓。随着温度从95℃降低，09N1-Zan ON探针在65℃开始与靶杂交并在55℃时达到最大荧光；更低低温度下的09N1-Zan OFF探针的结合然后降低荧光强度，这是因为该探针位于与ON探针连续的位置。因此，09N1-Zan ON + Zan OFF探针对在55℃形成特征峰。当温度更进一步降低时，09N1-Os探针与靶结合，并且CAL Red 荧光再次增加，在约40℃达到峰值。(低温时荧光的下降可能是由于干扰探针杂交的靶和/或探针的二级结构的增加)。

发现该双相性CAL Red 610“荧光信号”在包含用于扩增09N1靶的单对引物的反应中非常一致。然而，观察到随着更多引物对加入到反应中，CAL Red 荧光在40℃的肩稳定降低，而55℃的峰总是显著存在。55℃峰的存在证明扩增子甚至在存在数对引物时产生。假设引物之间的相互作用产生非-特异性产物，其防止09N1-Os探针与靶有效结合，甚至当靶存在时。实施例11所报告的工作中调查了试剂1减少该问题的功效。

选择三重RT-LATE-PCR测定作为研究试剂1对探针与09N1扩增子结合的作用的简便模型。测定混合物包含09N1靶的引物和探针、血凝素09H1靶和RT-PCR对照MS2靶。除了RNA靶外，反应混合物还包含16 mM Tris-HCl缓冲液 pH 8.5、3.9 mM MgCl₂、50 mM KCl、0.52 mM dNTPs、0.5 µl/测定的Quanta Biosciences的qScript反转录酶(浓度未公开)、2.5单位/测定的珠上冻干的Taq (illustra pure Taq Ready-To-Go PCR Beads, GE Healthcare)、100 nM的各个限制引物和1 µM的各个过剩引物。各个过剩引物还引发各自RNA的反转录。测定混合物还包含100 nM的各个探针，除了09N1-ZanOFF探针，其以300 nM的浓度使用。测定以反应混合物中无添加试剂、添加1.5单位/测定的Platinum Taq抗体(Invitrogen Life Technologies)以及添加50 nM试剂1加相同量的该抗体一式三份地运行。试剂1以50 nM荧光团-包含链和150 nM猝灭剂-包含链的浓度包含在内。本测定中使用的试剂1版本包含Cal Orange 560作为荧光部分F，以及Black Hole猝灭剂2作为猝灭剂部分Q。09N1和09H1 RNA靶在所有测定中以标准贮存物1:1000的稀释度包含在内，MS2对照RNA (Roche Diagnostics)以100,000拷贝/测定包含在内。

尽管反应包含血凝素09H1的引物和探针，该靶的检测不是本实验的主题。至于09N1和MS2，其检测为本实验的主题，用于本实验的寡核苷酸序列为：

09N1-限制引物：

5’ CACACACATGTGATTTCACTAGAATCAGGATAACAG (SEQ ID No. 93)

09N1-过剩引物：5’ CCATTCATATCATGCTCCCCCTT (SEQ ID No. 94)

09N1-ZanON探针：5’ CALRed 610-CTGCCCCTTGAGTCAAGA G-BHQ2 (SEQ ID No. 95)

09N1-ZanOFF探针：5’ GTCATTTAGCAAG―BHQ2 (SEQ ID No. 96)

09N1-Os探针：5’ CALRed 610―CTCTCATAGTGATAATTAA G―BHQ2 (SEQ ID No. 97)

09N1靶/扩增子:

5’

CCATTCATATCATGCTCCCCCTTGGAATGCAGAACCTTCTTCTTGACTCAAGGGGCCTTGCTAAATGACAAACATTCCAATGGAACCATTAAAGACAGGAGCCCATATCGAACCCTAATGAGCTGTCCTATTGGTGAAGTTCCCTCTCCATACAACTCAAGATTTGAGTCAGTCGCTTGGTCAGCAAGTGCTTGTCATGATGGCATCAATTGGCTAACAATTGGAATTTCTGGCCCAGACAATGGGGCAGTGGCTGTGTTAAAGTACAACGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGAAACAATATATTGAGAACACAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAATGGTTCTTGCTTTACTGTAATGACCGATGGACCAAGTAATGGACAGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATAGAAAAGGGAAAGATAGTCAAATCAGTCGAAATGAATGCCCCTAATTATCACTATGAGGAATGCTCCTGTTATCCTGATTCTAGTGAAATCACATGTGTGTG　3’

(SEQ ID No. 98)

MS2-限制引物：5’ CCGACCTGACGTACGGCTCTCATAGGA　(SEQ ID No. 99)

MS2-过剩引物：5’ TGGTTGGAGTTGCAGTTCG (SEQ ID No. 100)

MS2-探针：5’ CALOrange 560-CAGTAAGCATCTCTTATGCAT G-BHQ1 (SEQ ID No. 101)

MS2-扩增子：

5’

TGGTTGGAGTTGCAGTTCGGTTGGTTACCACTAATGAGTGATATCCAGGGTGCATATGAGATGCTTACGAAGGTTCACCTTCAAGAGTTTCTTCCTATGAGAGCCGTACGTCAGGTCGG 3’ (SEQ ID No. 102)

为了增强RT-引发，RNA模板与过剩引物的初始预孵育以10 µl/测定的终体积在Tris-HCl (10 mM, pH 8.3)中室温进行5分钟。随后加入所有其它试剂至终体积25 µl/测定，并在iQ™5实时PCR检测系统(Bio-Rad)中实施RT-LATE-PCR。RT-LATE-PCR热概况为：50℃ 10分钟(RT)；89℃ 3分钟；由下列三个步骤组成的50个循环：95℃ 5秒，62℃ 15秒和72℃ 30秒。扩增之后为退火/熔解：95℃ 3分钟；以1℃/30秒间隔从95℃至25℃退火；以1℃/30秒间隔从25℃至95℃熔解。在退火和熔解步骤期间在终点采集探针荧光。

图11A，显示Cal Red荧光的一阶导数，即，09N1-Zan ON + Zan OFF和09N1-Os探针从三重RT-LATE-PCR测定中产生的09N1扩增子的熔解曲线。Cal Red荧光如下标准化：首先，从相应的测定组减去平均无模板对照(NTC)的背景荧光。然后将每条曲线的所有荧光读数除以同一曲线55℃处的荧光读数，因此赋予所有曲线55℃峰1.0的标准化荧光值。该策略允许直接分析不同实验条件下40℃处荧光相对于55℃峰振幅的波动。在图11A中，环110指示无添加试剂的重复的标准化曲线，环111指示包含抗体(热启动)的反应混合物的重复，环112指示包含抗体和试剂1的重复。图11A中的结果显示不存在“热启动”的情况下(曲线110)或仅存在抗体时(曲线111) 40℃的CAL Red 610荧光大大低于55℃的荧光，如两个温度处的相对峰高所示。然而，在还包含试剂1的测定中(曲线112)，与55℃的荧光相比40℃的荧光大大增加。这一差异显示试剂1抑制错误引发并允许09N1-Os探针与靶在45和25℃之间的温度空间更有效结合。

图11B呈现了图11A中所示同一测定组在扩增后退火/熔解期间CAL Orange 560荧光的负一阶导数。环113指示无添加试剂的重复的曲线，环114指示包含抗体的反应混合物的曲线，环115指示包含抗体和试剂1的重复的曲线。图11B中的垂直参考线指示数个相关温度。线116，50℃处，为反转录的温度；线117，62℃处，为PCR退火温度；线118，66℃处，为扩增开始时MS2过剩引物的浓度-调整的解链温度；线119，72℃处，为PCR延伸温度和扩增开始时MS2限制引物的浓度-调整的解链温度二者。曲线115在约80℃处的谷指示试剂1的解链温度，而50℃处的正峰对应于MS2探针与其靶的解链温度。(结果在50℃标准化，以使所有样品的正峰具有值1.0。)两个峰相对的方向通过当有义链不与反义链结合时试剂1发荧光，而当与其靶杂交时MS2探针发荧光这一事实解释。

实施例 12

试剂 1 在 PCR 期间提供稳定和一致的标志，不受扩增子产生影响

本实验使用的LATE-PCR混合物包含，在25 µl/测定的终体积中，2.5单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen Life Technologies)和1X终浓度的制造商提供的缓冲液。其还包含3 mM MgCl₂、0.2 mM dNTPs、50 nM浓度的荧光标记链和150 nM猝灭剂标记链的试剂1、50 nM HV2-限制引物、1 µM HV2-过剩引物、100 nM HV2-探针以及这些引物和探针的靶：1000拷贝的人基因组DNA (Promega Human DNA)。据估计1000人基因组包含约10,000线粒体基因组(HV2序列位于其中)。本实施例中使用的试剂1的变体包含Cal Orange 560作为荧光部分F，以及Black Hole猝灭剂2作为猝灭部分Q。探针用光谱不同的荧光团Quasar 670标记。

本实验中使用的引物、探针和靶的序列在下面列出。

HV2-限制引物：5’ AAAGCGGTGTGTGTGTGCTGGGTAGGAT 3’　　(SEQ ID No. 103)

HV2-过剩引物：5’ ACTTCAGGGTCATAAAGCCTAAATAGC 3’

　　(SEQ ID No. 104)

HV2-探针： 5’ BHQ2-AATGGCAGAGATGTCTTTAAGTGCTGT TT-Quasar 670 3’　　(SEQ ID No. 105)

HV2扩增子：

5’

GCTCGCCACACACACACGACCCATCCTACCCGCCCCCAACATAACTACTCTAATCATCATACCCTCACCCTCCCCTTTTATTACACAATCAACCCCCCACTGACAATTTTCACGTATGGCGGTTTTCTATTTTAAACTTTAGACCAATCCGACCACAATCCCAAGAAACAAAAACCCCAAACCGTCTCTACACAAATTCACGACACCGGTCTTCGCCCCCTCCCCCCCAAACCACCTTTAAAAAACAATACTACAGACACACCTTTCACCGACACGTCTGTAAGTTAACAATAATAATACAGGATGTTCGTAATTAATTAATTGTGTGAAATCATTCATACAAGCGGACATTATAACTTGCATCCACGCTATTTATTATCCTACTCCGTCCTTAGTTTCTGTCTATGACGCTGTATCCCACGAGGCCGAGGTCGCAGAGCGTTACGATAGCGCACGTATGGGGGGTCTGCTTTTATGGTTTACGTACCTCTCGAGGGCACTCACCAATTATCCCACTATCTGGACACTAGGTAGCACTACAGAATAAATTCCCCTTGCACACCCGATAAATCCGAAATACTGGGACTTCA 3’　(SEQ ID No. 106)

LATE-PCR在Mx3005P热循环仪(Stratagene, Agilent Technologies)中进行。LATE-PCR热概况为：95℃ 3分钟；16个循环以1℃/30秒间隔从70至85℃的微熔解(对于数据分析该阶段被命名为“时间0”)；30个由下列三个步骤组成的PCR循环：95℃ 5秒，62℃ 20秒和75℃ 45秒；95℃ 30秒；16个循环以1℃/30秒间隔从70至85℃的微熔解；30个由下列三个步骤组成的PCR循环：95℃ 5秒，62℃ 20秒和75℃ 45秒；95℃ 30秒；16个循环以1℃/30秒间隔从70至85℃的微熔解；66个循环以1℃/30秒间隔从25至90℃的最终完全熔解。荧光在所有熔解期间的每个熔解步骤在CAL Orange 560 (试剂1)和Quasar 670 (探针)两个通道采集。

图12A显示实验过程中不同时间点Cal Orange 560荧光的负一阶导数，表明试剂1的熔解。环121指示三个重复测定在时间0的曲线；环122指示三个重复在30个扩增循环之后的曲线；环123指示三个重复在60个扩增循环之后的曲线。垂直线124通过曲线中谷的最小值绘制，指示试剂1的Tm。图12B显示扩增后熔解期间荧光的负一阶导数。曲线125为来自探针的Quasar 670荧光；曲线126为来自试剂1的Cal Orange 560荧光。参照图12A，试剂1的Tm在PCR开始前(时间0)、30个LATE-PCR循环后以及60个LATE-PCR循环后保持完全一样。此外，试剂1的Tm不受PCR过程中HV2扩增子的逐步积累影响。扩增子在时间0不存在，因为扩增尚未开始，但其在60个LATE-PCR循环后清楚地存在，如图12B中的Quasar 670峰所示。该峰代表终点采集的Quasar 670荧光的负导数并且表明HV2探针与PCR过程中产生的其预期靶杂交。还发现试剂1的Tm在与图中所示那些平行运行的一系列“无模板对照”测定中完全一样，无论是否有HV2扩增子的引物和探针(未示出)。

实施例 13 部分 I ：使用试剂 1 鉴定“闭管”反应中重复的加热和冷却循环期间样品的部分蒸发

部分蒸发检验以由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、3.0 mM MgCl₂、试剂1 (50 nM荧光团包含链以及150 nM猝灭剂链)组成的25 µl体积使用24个管进行。热概况如下：95℃/3min 1个循环，接着98℃/10s-75℃/40s 60个循环。这之后为从45℃开始以27 s间隔1℃的增量至97℃的熔解。图13A中示出的一阶导数结果为对最低荧光值标准化的。重复的绝大多数(23/24)显示无蒸发(环131)，而单个重复(曲线132)具有指示改变的温度上移。

实施例 13 部分 II

使用试剂 1 鉴定样品蒸发或样品离子强度变化引起的荧光信号的温度漂移

图13B-E说明了使用试剂1鉴定在使用单管多重LATE-PCR测定和Lights-On/Lights-Off探针的突变体分析期间产生假阳性的假象。这些特别的实施例显示了来自两个肺癌活检的表皮生长因子受体(EGFR)基因的外显子18-21的突变分析。这些外显子的突变限定了病人对用抗-EGFR酪氨酸激酶抑制剂的癌症治疗的响应。对于这些分析的每个，作为两个独立的单管多重反应平行扩增了来自癌症活检和来自正常参考样品的EGFR外显子18-21。然后在扩增结束时使用横跨各个扩增子的全长并且各个外显子用不同颜色标记(外显子18 FAM，外显子19 Red610，外显子20 Quasar 670以及外显子21 Cal Orange 560)的Lights-On/Lights-Off探针组在同一闭管中询问这些反应的每个的单独扩增子。外显子21的探针组包含还用Cal Orange 560标记的试剂1。然后将所得的荧光数据绘制为作为温度函数的荧光信号的负一阶导数，以产生荧光信号。随后比较来自正常参考和癌症样品的各个外显子的荧光信号以鉴定指示突变的温度漂移。

本实施例中使用的试剂1版本包含Cal Orange 560作为荧光部分F，和Black Hole猝灭剂2作为猝灭剂部分Q。

用于扩增的引物如下：

外显子18 - 限制引物：5’ CCCAGAGGCCTGTGCCAGGGACCT TAC 3’　(SEQ ID No. 107)

外显子18 - 过剩引物： 5’ CTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCC 3’　(SEQ ID No. 108)

外显子19 - 限制引物：5’ CCATGGACCCCCACACAGCAAAGC AGAAACTCAC 3’　(SEQ ID No. 109)

外显子19 - 过剩引物：5’ GCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCT CTGTCATA 3’　(SEQ ID No. 110)

外显子20 - 限制引物：5’ TGGGAGCCAATATTGTCTTTGTG TTCCCGGACATAGT 3’　(SEQ ID No. 111)

外显子20 - 过剩引物：5’ GTGCCTCTCCCTCCCTCCAG 3’ (SEQ ID No. 112)

外显子21 - 限制引物：5’ AGGAAAATGCTGGCTGACCTAA AGCCACCTCCTTAC 3’　(SEQ ID No. 113)

外显子21 - 过剩引物：5’ CTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTT TCAG 3’　(SEQ ID No. 114)

使用的Lights-On/Lights-Off探针组如下：

外显子18 Lights-On探针：

FAM - 5’ GGTTGATCTTTTTGAATTCAGTTTCCTTCAAGATCC TCCC 3’ BHQ1　　(SEQ ID No. 115)

BHQ1 - 5’ CAAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCTTTG - 3’ FAM (SEQ ID No. 116)

BHQ1 - 5’ GGCTCCACTGGGTGTAAGCC - 3’ FAM (SEQ ID .No, 117)

外显子18 Lights-Off探针：

BHQ1 - 5’ CGGAGCCCAGCACT - 3’ BHQ1 (SEQ ID No. 118)

BHQ1 - 5’ AGGCTCCACAAGCTG-C₃ - 3’ (SEQ ID No. 119)

外显子19 Lights-On探针：

CAL Red 610 - 5’ GGACCTTCTGGGATCCAGAGTCCCCC - 3’ BHQ2　　(SEQ ID No. 120)

BHQ1 - 5’ CCGCTTTCGGAGATGTTGCTTGG - 3’ CAL Red 610 (SEQ ID No. 121)

BHQ2 - 5’ TTATCGAGGATTTCCTTGTTGGAA - 3’ CAL Red 610 (SEQ ID No. 122)

外显子19 Lights-Off探针：

5’ ACGGGAATTTTAACTTTCTC - 3’ BHQ2 (SEQ ID No. 123)

BHQ2 - 5’ CTCTTAATTTCTTGATAGCG - 3’ BHQ2 (SEQ ID No. 124)

外显子20 Lights-On探针：

Quasar 670 - 5’ GCAGATACCCAGTAGGCGG - 3’ BHQ2 (SEQ ID No. 125)

BHQ2 - 5’ CCAGGGGGCAGCCGAAGG - 3’ Quasar 670 (SEQ ID No. 126)

外显子20 Lights-Off探针：

BHQ2 - 5’ CTGCATGGTGAAGGTGAG - 3’ BHQ2 (SEQ ID No. 127)

BHQ2 - 5’ GCATGAGCCGCGTGATGAG - 3’ BHQ2 (SEQ ID No. 128)

外显子21 Lights-On探针：

CAL Orange 560 - 5’ CCACGGTCCCCCAAGTAGTTTATGCCGG - 3’ BHQ1　　(SEQ ID No. 129)

CAL Orange 560 - 5’ TTAAAATCTGTGATCTTGGCATGCTGCG GTGAA - 3’ BHQ-1　　(SEQ ID No. 130)

BHQ1 - 5’ TTTTTGTCTCCCCCTGCATGGTATTCTTAA - 3’ CAL Orange 560　　(SEQ ID No. 131)

BHQ1 - 5’ CCCACCAGTATGTTCCTGGTTGGG - 3’ CAL Orange 560　　(SEQ ID No. 132)

外显子21 Lights-Off探针：

BHQ1 - 5’ CCAGCATTATGGCTCGCCC C₃ 3’ (SEQ ID No. 133)

BHQ1 - 5’ TCTCTTCTGTACCC -C₃ 3’ (SEQ ID No. 134)

BHQ1 - 5’ CTAGGTCTTGGTGGATTGAGCG - 3’ BHQ1 (SEQ ID No. 135)

在前述序列中，BHQ1为Black Hole猝灭剂1，BHQ2为Black Hole猝灭剂2，C₃指示三碳接头。

多重LATE-PCR扩增在25 µl反应中进行，并且由1X Platinum Taq缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3 mM MgCl₂、400 µM三磷酸脱氧核苷酸、50 nM的各限制引物、1 µM的各过剩引物、100 nM的各Lights-On探针、300 nM的各Lights-Off探针、2.5单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、1-1000拷贝基因组DNA和50 nM试剂1 (其中猝灭剂链以150 nM添加)组成。扩增在Stratagene MX3500P (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)中进行60-70个热循环。每个热循环由99℃变性10秒、72℃引物退火15秒以及75℃引物延伸30秒组成。扩增结束时存在一个75℃ 3分钟的最终延伸步骤。对于终点分析将反应以每30秒1℃的减幅从85℃缓慢冷却至35℃以允许Lights-On/Lights-Off探针杂交。35℃孵育10分钟以允许结合探针平衡后，将反应以每30秒1℃的增幅从35℃加热至85℃，同时每度采集荧光。荧光信号标记通过绘制作为温度函数的原始荧光信号相对于温度的负一阶导数(-dF/dT)获得。突变作为所检验样品的荧光信号相对于对应EGFR外显子的正常基因组的参考荧光信号的温度漂移来检测。

图13B显示正常参考(曲线133)与一个癌症样品(曲线134)在外显子18的FAM荧光通道中的荧光信号之间的温度右移。这些结果提示该癌症样品在外显子18中含有突变，其提供了对用于询问该外显子的Lights-On/Lights-Off探针的更好匹配(在该特别的测定中Lights-On/Lights-Off探针含有与其正常靶序列的核苷酸错配并且对某些突变可具有更好的互补性)。然而，对同一反应的Cal Orange 560通道的试剂1的荧光信号的分析，在图13C中示出，显示相似的温度右移(分别见图13C，曲线135和136中相应荧光信号的最右的谷)。这一发现证明癌症与正常参考样品之间的荧光信号的相对变化不是突变的结果而是样品进化或癌症与正常参考DNA样品的相对盐浓度差异所导致的技术假象的结果(这些DNA样品从两个不同的机构制备并且贡献了几乎一半的反应体积，见下文详细说明)。

图13D显示了正常参考(曲线137)与另一个癌症活检样品(曲线138)的外显子19的Cal Red荧光信号之间温度左移的例子。再次，试剂1的荧光信号中相似的温度左移的存在(分别为图13E，曲线139和140)证明荧光信号的相对变化不是失稳突变的结果而是技术假象的结果。这样的荧光信号左移仅可通过所检验癌症DNA中较低的离子强度解释。在本实施例中，癌症样品的外显子21几乎没有扩增产物(曲线140)。

实施例 13 部分 III

试剂 1 对 PCR 混合物中小变化的敏感性

实施例本部分所说明的结果在实施例11中所描述的实验过程中以平行组测定获得。因此，RT-LATE-PCR期间使用的所有的实验条件、序列和试剂以及热概况与实施例11中所描述的相同。

如实施例11中所报告的，两组测定均包含50 nM有义链和150 nM反义链的浓度的试剂1。一组测定，而非另一组，还包含1.5单位的Platinum Taq抗体(Invitrogen Life Technologies)。在RT-PCR混合物中包含该量的抗体意味着添加相应量的储存缓冲液。因此，包含抗体的各个测定中还加入了下列额外试剂：0.24 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.48 mM NaCl、24 mM磷酸钠、1.2 mM EDTA、12 mM DTT、0.6% (v/v)甘油和稳定剂(制造商未公开浓度和性质)。热概况包括反转录结束并且LATE-PCR开始前的89℃ 3分钟的时期，意在使抗体变性并使其从Taq DNA聚合酶释放；此步骤后，抗体因此在每个测定中作为变性蛋白存在。

如上文所详述的，包含抗体的测定中所存在的额外试剂的浓度非常低。这样的添加甚至通常被本领域技术人员忽略或忽视。一般假定抗体的存在除阻断DNA聚合酶直至PCR在热循环仪中开始的作用外不影响PCR。然而，本实施例的结果表明测定中存在的核酸序列的Tm也产生微弱变化。这一变化由试剂1揭示，当反应混合物的组成中存在轻微的测定与测定差异时试剂1提供非常有用的数据标准化工具。

图13F显示本实验结束时在试剂1与其反义链退火并产生荧光下降的温度窗口中Cal Orange 560荧光的负导数。试剂1在图表中示出所有结果的六个测定中均存在。测定中的三个(环142指示的曲线)加入抗体而其它三个(环141指示的曲线)未添加。所得的试剂1的Tm用垂直线143(无抗体)和144(有抗体)指示。在其储存缓冲液中的抗体的添加轻微但清楚地降低试剂1的Tm。该转变可由数个因素引起，包括甘油的存在和EDTA螯合镁的能力，已知此二者均在PCR期间降低核酸的Tm。

实施例 14

试剂 1 用作通过添加在其四个末端核苷酸上 dabcyl 化的双链寡核苷酸支持的热启动的替代物

实施rpoB基因的LATE-PCR测定，与实施例6中描述的基因的测定相似。本实施例中使用的试剂1版本具有Quasar 670作为荧光部分F，和Black Hole猝灭剂2作为猝灭部分Q。结核杆菌rpoB引物序列和六个On/Off探针序列中的四个，即探针2 Off、探针2 On、探针3 Off和探针3 On，与实施例6中所列的那些相同，除了过剩引物序列被修饰以使该引物对非-结核杆菌分枝杆菌低特异性：

rpoB修饰的过剩引物：

5’-CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAG- 3’ (SEQ. ID No. 136)

由下列互补链组成的Dabcyl-修饰的添加物：

5’ Dabcyl - GGAGCAGACTAGCACTGAGGTA - Dabcyl 3’

3’ Dabcyl – CCTCGTCTGATCGTGACTCCAT – Dabcyl 5’ (SEQ ID No. 137)

Dabcyl-修饰的寡核苷酸具有引物Tm以下的Tm以使引物延伸的任何干扰最小化。

LATE-PCR扩增在包含1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3 mM MgCl₂、250 nM dNTPs、50 nM rpoB限制引物、1000 nM rpoB过剩引物、各50 nM的两种Lights-On探针、各150 nM的两种Lights-Off探针的25 μl反应中进行。一组反应含有1单位Platinum Taq DNA聚合酶，一种伴随抗体的热启动聚合酶，下文称为“抗体Taq”(Invitrogen, Carlsbad, CA)。另一组含有1单位重组Taq DNA聚合酶，一种无抗体的非-热启动聚合酶，下文称为“常规Taq”(Invitrogen, Carlsbad, CA)。这些反应组中每个的第一个亚组无添加组分，第二个亚组补充500 nM用四个末端dabcyl修饰的22 bp寡核苷酸(Tm=67℃)，第三个亚组补充75 nM试剂1 (75 nM荧光团-包含寡核苷酸和225 nM试剂1猝灭剂寡核苷酸)加500 nM用四个末端dabcyl修饰的22 bp寡核苷酸。加入前首先将各个寡核苷酸包括试剂1与dabcyl化双链体以其终浓度组合并在冰上孵育5分钟。反应在20,000拷贝人基因组DNA (Promega, Madison, WI)存在下从10、100或1000拷贝结核杆菌基因组DNA开始。扩增在Strategene MX3005P (Agilent Technologies, CA)中进行。热循环概况由98℃ 10秒、75℃ 40秒 30个循环组成，接着为以30秒间隔每步1℃从30至85℃的DNA熔解，同时采集Quasar 670-标记On探针的荧光。然后每五个循环进行同样的热循环曲线和随后同样的DNA熔解，总计进行60个循环。

图14A-F呈现了60-循环扩增反应的35个循环后的探针熔解结果(Quasar 670通道)。熔解数据作为荧光信号相对于温度的负一阶导数(荧光标记)显示。图14A来自含有常规Taq并且无添加物的反应，其中环1401指示10拷贝模板DNA的复制曲线，环1402指示100拷贝模板DNA的曲线，环1403指示1000拷贝模板DNA的曲线。图14B来自含有常规Taq加dabcyl化添加物的反应，其中环1404指示10拷贝模板DNA的复制曲线，环1405指示100拷贝的曲线，环1406指示1000拷贝的曲线。图14C来自含有常规Taq加dabcyl化添加物和试剂1二者的反应，其中环1407指示10拷贝模板DNA的复制曲线，环1408指示100拷贝的曲线，环1409指示1000拷贝的曲线。图14D来自含有抗体Taq并且无添加物的反应，其中环1410指示10拷贝模板DNA的复制曲线，环1411指示100拷贝的曲线，环1412指示1000拷贝的曲线。图14E来自含有抗体Taq加dabcyl化添加物的反应，其中环1413指示10拷贝模板DNA的复制曲线，环1414指示100拷贝的曲线，环1415指示1000拷贝的曲线。图14F来自含有抗体Taq加dabcyl化添加物和试剂1二者的反应，其中环1416指示10拷贝模板DNA的复制曲线，环1417指示100拷贝的曲线，环1418指示1000拷贝的曲线。图14C和图14F的荧光信号按照80℃采集的试剂1双链体的最低信号标准化。

实施例14说明了用75 nM试剂1加150 nM用4个dabcyl基团修饰的22bp寡核苷酸(图14C)代替热启动抗体(图14D)相对于单独的500 nM用4个dabcyl基团修饰的22 bp寡核苷酸(图14B)的优势。

图14A和D显示不存在或存在热启动抗体时无添加物的反应。该数据说明无抗体的重复之间由于扩增开始前的错误引发误差导致的变异性增加(参见箭头1和1’、2和2’的区域)。图14B和E的反应包含500 nM用4个dabcyl基团修饰的22 bp寡核苷酸。图14B与图14A的比较，以及图14E与图14D的比较显示单独添加修饰寡核苷酸由于抑制扩增前和扩增期间的错误引发而改变探针/靶杂交体的模式(特别是在箭头2和2’的区域)。图14C和F的反应包含500 nM用4个dabcyl基团修饰的22 bp寡核苷酸加75 nM试剂1。图14C与图14B的比较，以及图14F与E的比较显示试剂1进一步减少重复反应之间的分散。图14F与图14C的比较显示，当试剂1存在时，热启动抗体不显著改善三个起始靶水平(10、100、1000拷贝结核杆菌基因组DNA)中任何的重复反应相似性。这些结果证明试剂1与含多个dabcyl并且Tm低于引物Tm的双链寡核苷酸组合改善引物选择性并有效替代热启动抗体。

实施例 15

试剂 2 对囊性纤维化基因 (CFTR) 的对称扩增的作用；终点信号差异的减少以及用作 PCR 热启动

本实施例比较了试剂2存在和不存时CFTR基因外显子10区段的对称PCR闭管扩增和检测。本实施例中使用的试剂2版本具有Cal Red 610作为荧光部分F，和Black Hole猝灭剂II作为猝灭剂部分Q。样品包含终体积25微升的1X Platinum Taq反应缓冲液(Invitrogen)、3 mM MgCl₂、0.2 mM各dNTP、0.24X SYBR Green、300 nM的各引物、300 nM探针、约1,000拷贝人基因组DNA和1.25单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)。正义引物，5’- GGATTATGCCTGGCACCAT -3’ (SEQ ID No, 138)在300 nM具有66.2℃的预测Tm，反义引物，5’- GCTTTGATGACGCTTCTGTATCTA -3’ (SEQ ID No. 139)在300 nM具有65.8℃的预测Tm。探针，5’-Quasar 670- TCATCTTTGGTGTTTCCTATGA -Black Hole猝灭剂2 -3’ (SEQ ID No. 140)在所有的扩增中用以证实特异性靶扩增并且在探针和扩增子浓度各自为300 nM时具有64.1℃的预测Tm。Tm使用Visual OMP (DNA软件)预测。反应混合物不包含添加物或包含200 nM试剂2 (猝灭剂链600 nM)。扩增在Stratagene Mx3005P热循环仪中进行，编程为加热至95℃ 2分钟，接着95℃ 10秒、60℃ 15秒和75℃ 30秒 60个循环。Quasar-标记探针的荧光检测在60℃进行，SYBR Green的荧光检测在75℃进行。

探针荧光的实时扩增绘图在图15A中示出，其中环151指示不包含添加试剂的重复测定(4个)的曲线，环152指示包含200 nM试剂2的重复测定的曲线，环153为无模板对照。含试剂2的样品与无试剂2的那些相比显示荧光增加的较小延迟(0.5个循环的平均C_T值差异)。无试剂2的样品中观察到荧光增加的小变更。事实上在含试剂2的样品中直至循环45均未检测到荧光变更，并且在循环60末尾仍保持较低。尽管起始延迟，含试剂2样品的终点平均荧光高于无试剂2的样品。同样，无试剂2的样品用SYBR Green (检测所有双链DNA)产生比含试剂2那些早1.3个循环的平均C_T值(绘图未示出)，指示前者中较高的非特异性扩增水平。总之，这些结果提示试剂2减少可增加变更和减少预定靶的总体扩增的非特异性扩增。试剂2的一致性可能可用于实时检测不可能时的终点定量。其还可能改善低靶浓度的检测灵敏度并为测序反应提供改善的产物纯度。

进行了单独的实验以检验试剂2为CFTR的对称扩增提供热启动的能力。样品如上所述制备，除了含200 nM试剂2的样品包含1.25单位缺乏Platinum Taq中存在的聚合酶的抗体的Taq DNA聚合酶。(两种酶均为Invitrogen制造的重组Taq聚合酶。)热循环前将所有样品在室温孵育45分钟以为各个热启动方法提供更大的激发。

图15B显示含抗体重复样品的实时探针荧光绘图，环154，和无模板对照的实时探针荧光绘图，环155。图15C显示含试剂2的重复样品的实时探针荧光绘图，环156，和无模板对照的实时探针荧光绘图，环157。这些组产生可比的C_T值 (试剂2的延迟为0.4个循环)。两组的最终荧光相似，抗体组达到7426 ± 387的平均值，试剂2组达到7174 ± 490的平均值。

实施例 16

使用试剂 3 和试剂 4 产生用于荧光信号标准化的高温和低温标志

本实施例中试剂3和试剂4的版本(表1)具有FAM作为荧光部分F，和Black Hole猝灭剂1作为猝灭剂部分Q，以及每种试剂中两个dabcyl标记。在典型的PCR反应混合物中补充100 nM试剂3荧光团-标记寡核苷酸和300 nM试剂3猝灭剂-标记寡核苷酸，加上，50 nM试剂4荧光团-标记寡核苷酸和150 nM试剂4猝灭剂-标记寡核苷酸。图16说明了FAM通道中试剂3和试剂4的荧光信号，其中环161指示试剂3与试剂4组合的曲线，环162指示150 nM试剂4的曲线。这些荧光信号产生用于标准化FAM通道或反应中其它荧光通道的探针/靶杂交体的荧光探针信号的高温和低温标志两者。这些温度标志通过在PCR试剂混合物中补充较高浓度的试剂3双链体产生，校正FAM荧光信号的温度-依赖性并产生其深度与试剂4的荧光信号谷匹配的荧光信号。与本申请其它实施例中试剂1的荧光信号相比，荧光谷信号的更大宽度是连接到试剂3和试剂4的额外dabcyl部分之间已知的相互作用所致。这样的相互作用稳定这些试剂中的荧光-猝灭剂寡核苷酸双链体并导致熔解曲线分析期间较宽的温度过渡。

实施例 17

用于使用一个或多个温度标志来标准化使用 Lights-On/Lights-Off 探针的 LATE-PCR 测定的荧光数据的数学方法

利用多重Lights-On/Lights-Off探针的PCR测定，特别地包括LATE-PCR测定，被用于产生“荧光信号”，其与已知样品的荧光信号库比较，如已公布的国际专利申请WO 2011/050173中所描述的。单一或双重温度标志提供单个样品中所有颜色的熔解/退火曲线的数学分析起点。数学分析使用一系列数学程序或算法完成，其使用和输出在本实施例七个步骤中说明。不同的步骤依赖先前确定的标准：第一，在结果正被调查的测定中使用的各种试剂的标准Tm，第二，已知样品的荧光信号库，这可以以适合比较目的的形式存储在计算机数据库中，例如，各不同探针颜色的荧光对温度的标准化一阶导数的几个或许多温度下的一系列值。

第一个任务为确定被调查的样品中各试剂的Tm是否与先前确定的该试剂的标准Tm不同以及有何不同。图17A显示用于两步(此处命名为步骤1和步骤2)确定该Tm的方法。在步骤1中，热标志“谷”的数据(试剂荧光团的-dF/dT)被倒转为“山”并绘制为作为温度函数的一组数据点。图17A-C显示三个重复反应的数据点的绘图(空心圆)。各重复样品的各个山单独处理并在步骤2中使其拟合为稍微倾斜的高斯曲线(图17A-C中的实线)。每个样品的拟合曲线的峰(箭头)为样品中所述试剂的温度标志的观察Tm (OTM)。

然后，使用试剂的标准Tm进行校正以对齐各个样品曲线与曲线文库。这分两步进行，命名为步骤3和步骤4。图17D呈现了两组曲线。上图显示样品的重复的导数曲线，环1702，其中向下的箭头指示OTM，垂直线1703指示试剂的标准Tm。步骤3为确定OTM与标准Tm之间的差异。我们把该差异称为温度-调整-值，TAV。如环1702的曲线所显示的，OTM与先前确立的该试剂的标准OTM有一些不同，该差异即为TAV。如果使用各自具有不同Tm的两种试剂，可产生两个独立的TAV，一个为高温试剂的，一个为低温试剂的。在实施例14中，例如，仅存在一种试剂，因此一个TAV。TAV可用于将各个样品的OTM校准至该试剂的预定标准OTM。这样的调整可基于单个TAV，但优选TAV基于两种试剂的OTM的高/低温对。在步骤4中使用各个样品的TAV调整样品曲线(见图17D，下图，环1704)显示这样调整的曲线1702。在这种情况下从每个温度度数减去TAV，从而向左移动OTM至其“理论峰位置”并且也相同量移动所有其它温度。然而，本领域技术人员将理解的是，恒定移动并不是使用OTM的唯一方式。其可，例如，用于将OTM移动至理论峰位置，然后进一步用于通过与离开OTM的度数成比例的定标因子校正理论峰之上或之下的所有温度。

尚待比较样品曲线(环1704)与作为足以区别可能靶的若干温度下的一系列值预先输入电脑存储器中的可能靶的文库。由于我们利用标准化曲线构建文库，同样也为了样品曲线可与文库相比。步骤5涉及所有通道的荧光信号的标准化以使其在0与1之间，将询问范围最低温度(在图17的说明中30℃)处的荧光值设为0并将询问范围最高温度(在图17的说明中75℃)处的荧光值设为1。图17E，上图，环1705，显示在与图17D有关的上文所述调整后原始荧光数据的标准化曲线。标准化允许检查熔解曲线的形状而不考虑物质的丰度。步骤6涉及计算标准化原始荧光曲线的一阶和二阶导数以突出作为温度函数的与荧光信号模式有关的信号。图17E，下图，说明这样的二阶导数曲线，环1706。

步骤7涉及评估未知样品。在该步骤中我们计算了未知样品的标准化熔解曲线的一阶或二阶导数与已知样品数据库的相同导数之间的温度-平均误差(例如方差)。我们认为最低误差的已知样品为该未知样品的最佳匹配。由于计算机进行计算非常迅速，可将各个数据集以所述成比例方式移动和/或换算，并然后非常迅速地与不同相关靶的已知荧光信号模式比较。最佳吻合的靶可鉴定为具有规定量以下的总差异的那个，或如果经鉴定无最佳吻合靶，计算机可进行不同比例的调整并再次比较荧光信号的经验模式与所有可能荧光信号的文库。

实施例 18

聚合酶可延伸试剂的聚合酶依赖性

实施例18提供了如本申请详述部分中描述为变体9的聚合酶可延伸试剂的概念的证据。本实施例中我们使用具有未加帽子的3’末端和5’末端荧光标记的缩短版本(19个核苷酸长)试剂进行测定。该较短的链以完美互补性与3’末端用猝灭剂标记的30个核苷酸长的链的3’部分杂交。当温度降低至足以允许两条链杂交时，在荧光信号的一阶导数中观察到谷。活性聚合酶存在时19个核苷酸长的链未加帽子的3’末端在30个核苷酸长的模板链上延伸，导致两条链的Tm增加。因此该试剂变体用作温度标志和Taq聚合酶活性的内部控制二者。反应组分和条件如下：

缩短的未加帽子荧光团标记链：

Quasar 670 IC19：5’ Quasar 670- CAGCTGCACTGGGAAGGGT (SEQ ID No.)

全长互补猝灭剂标记链：

5’ GGTCAGACTGCACCCTTCCCAGTGCAGCTG-BHQ2 (SEQ ID No.)

反应以由1X Invitrogen PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3 mM MgCl₂、300 nM dNTPs、100nM荧光链和300 nM猝灭剂链组成的25 µl体积一式三份(三个技术重复)进行。将该混合物分成两个亚混合物，含有或不含1.25单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)。

反应开始之前进行从69℃开始以15 s间隔1℃的增幅至94℃并每度采集Quasar 670荧光的第一次熔解。该熔解之后这些反应的热概况条件为：95℃ 3分钟，接着95℃/5s-72℃/20s 10个循环，每个循环在72℃步骤采集荧光。这之后为从60℃开始以15 s间隔1℃的增幅至90℃并每度采集Quasar 670荧光的第二次熔解。

图20A的结果显示反应开始前第一次熔解时重复的荧光信号，线(201)为不包含聚合酶的重复，线(202)为包含聚合酶的重复。聚合酶的存在增加谷的深度而非温度。该谷的双底为Quasar 670的假象并且不指示聚合酶活性(参见图20B中的线203)。图20B显示一旦给予聚合酶机会延伸缩短的荧光团标记链，反应后第二次熔解的重复的荧光信号结果。线(203)为不包含聚合酶的重复，不显示Tm的增加。线204为包含聚合酶的重复，显示Tm的增加。

实施例 19

二重 LATE-PCR 反应中的聚合酶可延伸试剂

实施例19提供了聚合酶可延伸试剂与PCR测定中一种或多种产物的扩增相容的证明。使用二重LATE-PCR测定产生两个独立的包含在不同结核杆菌菌株中赋予对下列抗生素(和靶基因)的药物敏感性或药物耐受性的序列的单链扩增子：乙胺丁醇(embB)、异烟肼(inhA)。在本实施例中，杂交通过使用熔解概况分析表征。反应组分和条件如下：

聚合酶可延伸试剂：

缩短的未加帽子的荧光团标记链：

见实施例18

反向互补全长猝灭剂标记链：

见实施例18

引物：

inhA限制引物

TTCCGGTAACCAGGACTGAACGGGATACGAATGGGGGTTTGG (SEQ ID NO: 5)

inhA过剩引物

TCGCAGCCACGTTACGCTCGTGGACATAC (SEQ ID NO: 6)

embB限制引物

ATCCTCCGGGCTGCCGAACCAGCGGA (SEQ ID NO: )

embB过剩引物

TGCTCTGGCATGTCATCGGCGCGAATTCGT (SEQ ID NO: )

探针

inhA_ON

Cal Red 610-TTACAACCTATCGTCTCGCCGCAA-BHQ2 (SEQ ID NO: )

inhA_OFF

GCAGTCACCCCG-BHQ2 (SEQ ID NO: )

embB ON

BHQ2-AACGGCGTGGTCGGCTT-CalRed 610 (SEQ ID NO: )

embB ON

BHQ2-GACTCGGGCCGTGCGCAG-C3 (SEQ ID NO: )

Primesafe

Primesafe正义链

Dabcyl-GGATCAGATTAGCACTGATGTA-Dabcyl (SEQ ID NO: 56)

Primesafe反义链

Dabcyl-TACATCAGTGCTAATCTGATCC-Dabcyl (SEQ ID NO: 57)

靶序列

embB靶：菌株H37Rv

CTGCTCTGGCATGTCATCGGCGCGAATTCGTCGGACGACGGCTACATCCTGGGCATGGCCCGAGTCGCCGACCACGCCGGCTACATGTCCAACTATTTCCGCTGGTTCGGCAGCCCGGAGGAT

inhA靶：菌株H37Rv

TCGCAGCCACGTTACGCTCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACTGCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGGAGGAA

embB靶：菌株18640

与菌株H37Rv的序列相同

inhA靶：菌株18640

与菌株H37Rv的序列相同

embB靶：菌株8600

CTGCTCTGGCATGTCATCGGCGCGAATTCGTCGGACGACGGCTACATCCTGGGCAAGGCCCGAGTCGCCGACCACGCCGGCTACATGTCCAACTATTTCCGCTGGTTCGGCAGCCCGGAGGAT

inhA靶：菌株8600

与菌株H37Rv的序列相同

三碳接头用C3表示，而Black Hole猝灭剂2用BHQ2表示(Biosearch Technologies, Novato CA)。各序列中的下划线指示相比药物敏感性结核杆菌序列的核苷酸变化的位置。

LATE-PCR扩增以由1X PCR缓冲液 (Invitrogen, Carlsbad, CA)、3 mM MgCl₂、300 nM dNTPs、每组引物50 nM限制引物和1000 nM过剩引物、1.25单位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、300 nM Off探针和100 nM On探针、600nM Primesafe的各链以及可延伸试剂(变体9)的100 nM荧光链和300 nM猝灭剂链组成的25 µl体积一式三份进行。

反应开始之前进行从60℃开始以21 s间隔1℃的增幅至90℃并每度采集Quasar 670荧光的第一次熔解。该熔解之后这些反应的热概况条件为：95℃ 3分钟，接着95℃/10s-75℃/40s 60个循环，接着为75℃ 10分钟的单个循环，接着25℃ 10分钟。这之后为从25℃开始以30 s间隔1℃的增幅至90℃并每度采集Quasar 670、Cal Red 610和Cal Orange 560荧光的第二次熔解。

探针-靶杂交通过使用25℃至90℃之间的温度下每种荧光单独的一阶导数的熔解曲线分析进行分析。

图21A的结果显示每个菌株的三个重复以及无模板对照在反应开始前第一次熔解的平均Quasar 670荧光信号。所有菌株加无模板对照显示相同的Tm熔解概况，并且最低荧光谷在71℃与72℃之间，表明缩短的未加帽子的荧光链未延伸。菌株8600 (线210)、菌株H37Rv (线211)、无模板对照(线212)和菌株18460 (线213)显示几乎完全相同的曲线。图21B显示60个热循环完成后第二次熔解的重复的平均Quasar 670荧光信号的结果。再次，所有样品显示具有最低荧光谷温度移动至80℃-81℃的相同信号，显示可延伸的试剂链被延伸产生比反应开始前高的Tm。菌株8600 (线214)、菌株H37Rv (线215)、无模板对照(线216)和菌株18460 (线217)。图21C显示各个菌株和无模板对照使用平均Cal Red 610荧光信号的靶embB和inhA的熔解概况。无模板对照(线218)无荧光信号，这是因为未发生扩增。embB靶的信号在50℃与67℃之间，而inhA靶的信号落在67℃以上。菌株H37Rv (线219)和菌株18460 (线220)显示相同的荧光信号。而菌株8600 (线221)的embB靶具有不同的信号，因此抗乙胺丁醇。

Claims (33)

1.一种聚合酶链反应(PCR)扩增反应混合物，除了在PCR反应缓冲液中的至少一条包含至少一个靶序列的核酸链、至少一对引物、DNA聚合酶和dNTP’s外，其还包含

至少一种由至少一对能够形成50-800 nM浓度的6-50个碱基对长、解链温度(Tm)至少32℃的双链杂交体的互补寡核苷酸组成的添加试剂，所述双链杂交体具有包含相互作用的、共价连接的标记部分的末端，在一条链上为庞大的非平面荧光部分，以及在另一条链上为庞大的非平面荧光部分或非-庞大的平面部分，

其中所述至少一种试剂的两条链均不用作反应中所扩增的模板链上的探针或引物，和

其中所述双链杂交体的浓度足以增强聚合酶选择性。

2.权利要求1的反应混合物，其中所述庞大的非荧光部分连接到所述链之一的5’-末端核苷酸。

3.权利要求1或权利要求2的反应混合物，其中所述荧光部分为荧光团。

4.权利要求1-3中任一项的反应混合物，其中所述试剂的双链杂交体为平端的并且标记部分连接到平端的末端核苷酸。

5.权利要求1-4中任一项的反应混合物，其中所述庞大的非平面部分为荧光团并且其中所述非-庞大的平面部分为非-荧光猝灭剂。

6.权利要求5的反应混合物，其中所述至少一种试剂的猝灭剂-标记链以等于或大于互补链浓度的浓度加入，优选为互补链浓度的1.5-10倍，最优选为互补链浓度的2-5倍。

7.权利要求1-6中任一项的反应混合物，其中所述标记通过接触猝灭相互作用。

8.权利要求1-7中任一项的反应混合物，其中所述双链杂交体的另一个末端包含至少一个dabcyl标记。

9.权利要求1-8中任一项的反应混合物，其中所述至少一种双链寡核苷酸试剂包含计算Tm彼此相差至少10℃的两种双链寡核苷酸试剂。

10.权利要求9的反应混合物，其中所述两种双链寡核苷酸试剂共享一条共有寡核苷酸链。

11.权利要求1的反应混合物，其中所述试剂的至少一个双链寡核苷酸由天然核苷酸组成。

12.权利要求11的反应混合物，其中所述至少一种双链寡核苷酸试剂为DNA。

13.权利要求1-12中任一项的反应混合物，其中所述反应混合物为LATE-PCR反应混合物。

14.权利要求1-13中任一项的反应混合物，其中所述DNA聚合酶为热启动聚合酶。

15.权利要求1-14中任一项的反应混合物，其中所述至少一个核酸靶序列为RNA，并且所述反应混合物包含反转录酶。

16.权利要求1-15中任一项的反应混合物，其中所述反应混合物包含荧光dsDNA染料。

17.权利要求1-16中任一项的反应混合物，其中所述反应混合物包含至少一种能够与所述扩增的靶序列杂交并发射信号的荧光标记探针。

18.权利要求1-17中任一项的反应混合物，其中聚合酶选择性以下列方式中的至少一种来表现：错误引发抑制；偏好完美互补引物-靶杂交体而不利于具有未完美互补的凹陷3’末端序列的杂交体的引物特异性增加；偏好具有富含GC的凹陷3’末端序列的引物-靶杂交体而不利于具有富含AT的凹陷3’末端序列的杂交体的聚合酶选择性增加；产物进化抑制；和重复反应之间的分散减少。

19.用于扩增至少一个DNA靶序列的方法，包括提供权利要求1-18中任一项的反应混合物并使反应混合物经受具有引物退火温度和引物延伸温度的多重PCR热循环。

20.权利要求19的方法，其中所述引物退火和引物延伸温度为同一温度。

21.权利要求19的方法，其中所述双链寡核苷酸试剂的解链温度(Tm)在引物退火温度以下不超过5℃。

22.权利要求19的方法，其中所述双链寡核苷酸具有比引物延伸温度高的Tm。

23.权利要求19的方法，其中所述至少一种双链寡核苷酸试剂为两种双链寡核苷酸试剂的混合物，其中一种具有在引物退火温度至引物退火温度以下不超过5℃的范围内的Tm，第二种具有比第一种高至少10℃的Tm。

24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述反应混合物包含由用三个或四个dabcyl基团末端标记并且具有在引物-退火温度以下但至少30℃的解链温度的双链寡核苷酸组成的热启动试剂。

25.权利要求19-24中任一项的方法，其中所述反应混合物包含荧光dsDNA染料，并且所述方法包括用所述染料检测双链扩增产物。

26.权利要求19-25中任一项的方法，其中所述反应混合物包含至少一种能够与所述扩增靶序列杂交并发射信号的荧光标记探针，并且所述方法包括用所述至少一种探针检测单链扩增产物。

27.权利要求25或权利要求26的方法，其中所述检测为实时检测。

28.权利要求25-27中任一项的方法，其中所述检测为扩增之后的终点检测。

29.权利要求28的方法，其中所述检测包括检测作为温度的函数的荧光。

30.权利要求28的方法，其中所述至少一种试剂的Tm被用作温度标志。

31.权利要求30的方法，其中所述至少一种试剂为其Tm提供至少两个温度标志的至少两种试剂。

32.权利要求28或29的方法，其中所述一个或多个温度标志被用于探针/靶杂交信号的数学分析。

33.扩增至少一个DNA靶序列的试剂盒，所述试剂盒包含用于权利要求1-18中任一项的反应混合物的试剂。