JP2001103956A - 発光検査システム - Google Patents
発光検査システムInfo
- Publication number
- JP2001103956A JP2001103956A JP28893299A JP28893299A JP2001103956A JP 2001103956 A JP2001103956 A JP 2001103956A JP 28893299 A JP28893299 A JP 28893299A JP 28893299 A JP28893299 A JP 28893299A JP 2001103956 A JP2001103956 A JP 2001103956A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- luminescence
- light emission
- light
- emission
- wavelength
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】少なくとも２種類の生物由来の発光を１回の工
程で検出することを特徴とする発光検査方法を提供す
る。 【解決手段】少なくとも２種類の生物由来の発光機構を
備えてなり、前記発光機構の１つの発光は、ｐＨ８にお
いて最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍであり、かつ半
値幅が６０ｎｍ以下の発光であり、かつ、前記発光機構
の別の１つの発光は、ｐＨ８において最大発光波長が４
６０〜５５０ｎｍの発光であることを特徴としており、
発光機構が、酵素を介した発光基質の酸化反応に基づく
機構である発光検査システム、並びに発光検査方法およ
びキットを提供する。
程で検出することを特徴とする発光検査方法を提供す
る。 【解決手段】少なくとも２種類の生物由来の発光機構を
備えてなり、前記発光機構の１つの発光は、ｐＨ８にお
いて最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍであり、かつ半
値幅が６０ｎｍ以下の発光であり、かつ、前記発光機構
の別の１つの発光は、ｐＨ８において最大発光波長が４
６０〜５５０ｎｍの発光であることを特徴としており、
発光機構が、酵素を介した発光基質の酸化反応に基づく
機構である発光検査システム、並びに発光検査方法およ
びキットを提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物発光またはそ
れを模した発光をレポーターおよびシグナルとするあら
ゆるアッセイ系において、それらを検出および測定する
検査方法および検査キットに関する。
れを模した発光をレポーターおよびシグナルとするあら
ゆるアッセイ系において、それらを検出および測定する
検査方法および検査キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、遺伝子の転写活性測定は一般的に
ある種の機能を持ったタンパク質をレポーターとして、
その酵素活性により定量されている。このなかでもホタ
ル・ルシフェラーゼは感度，測定時間，操作性等の優れ
た特徴により広く用いられている。
ある種の機能を持ったタンパク質をレポーターとして、
その酵素活性により定量されている。このなかでもホタ
ル・ルシフェラーゼは感度，測定時間，操作性等の優れ
た特徴により広く用いられている。
【０００３】レポーター遺伝子による転写活性測定を行
う際、個々の実験で生じる微妙な条件の違いによるデー
タのバラツキを解消するために、インターナルコントロ
ール（内部標準）を用いて補正する方法が採られてい
る。これまでホタル・ルシフェラーゼアッセイを生物発
光により内部補正するため、インターナルコントロール
としてウミシイタケ由来のシーパンジー・ルシフェラー
ゼを利用した方法が開発され（Wood,K.V. et al., Prom
ega Note, 57, 2(1996)）用いられてきた。しかしホタ
ルとシーパンジーの両ルシフェラーゼは基質要求性が異
なり、しかも発光スペクトルが重なってしまうため、両
ルシフェラーゼアッセイを測定する際には、各々の発光
基質をそれぞれ添加する等、複数の工程を必要とし、こ
れら２種類のレポーターを１回の工程に測定することは
できなかった。
う際、個々の実験で生じる微妙な条件の違いによるデー
タのバラツキを解消するために、インターナルコントロ
ール（内部標準）を用いて補正する方法が採られてい
る。これまでホタル・ルシフェラーゼアッセイを生物発
光により内部補正するため、インターナルコントロール
としてウミシイタケ由来のシーパンジー・ルシフェラー
ゼを利用した方法が開発され（Wood,K.V. et al., Prom
ega Note, 57, 2(1996)）用いられてきた。しかしホタ
ルとシーパンジーの両ルシフェラーゼは基質要求性が異
なり、しかも発光スペクトルが重なってしまうため、両
ルシフェラーゼアッセイを測定する際には、各々の発光
基質をそれぞれ添加する等、複数の工程を必要とし、こ
れら２種類のレポーターを１回の工程に測定することは
できなかった。
【０００４】また、基質要求性が同一のホタル・ルシフ
ェラーゼにおいて、最大発光波長の異なる酵素を自然界
から探索(Wood,K.V. et al., Science, 244, 700(198
9))、または人為的突然変異による探索(Nakano,E. et a
l., Protein Engineering, 4,6, 691(1991))が進められ
てきたが、これまで得られた多くのホタル・ルシフェラ
ーゼの中から２種を選択しても互いの発光が重なってし
まい、定量的にそれぞれの発光を同時かつ個別に測定す
ることは困難であった。
ェラーゼにおいて、最大発光波長の異なる酵素を自然界
から探索(Wood,K.V. et al., Science, 244, 700(198
9))、または人為的突然変異による探索(Nakano,E. et a
l., Protein Engineering, 4,6, 691(1991))が進められ
てきたが、これまで得られた多くのホタル・ルシフェラ
ーゼの中から２種を選択しても互いの発光が重なってし
まい、定量的にそれぞれの発光を同時かつ個別に測定す
ることは困難であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ｐＨ８にお
いて最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍであり、かつ半
値幅が６０ｎｍ以下という特徴的な発光を用いる発光検
査システムを提供するものである。さらに、少なくとも
２種類の生物由来の発光機構を用いて、識別し得る複数
の発光色（最大発光波長）を生じさせ、これを１回の工
程で検出できる発光検査方法およびキットを供給するこ
とを目的とする。
いて最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍであり、かつ半
値幅が６０ｎｍ以下という特徴的な発光を用いる発光検
査システムを提供するものである。さらに、少なくとも
２種類の生物由来の発光機構を用いて、識別し得る複数
の発光色（最大発光波長）を生じさせ、これを１回の工
程で検出できる発光検査方法およびキットを供給するこ
とを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、生物由来の発
光機構を備えてなり、前記発光機構の発光は、ｐＨ８に
おいて最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍであり、かつ
半値幅が６０ｎｍ以下の発光であることを特徴とする発
光検査システムに関する。
光機構を備えてなり、前記発光機構の発光は、ｐＨ８に
おいて最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍであり、かつ
半値幅が６０ｎｍ以下の発光であることを特徴とする発
光検査システムに関する。
【０００７】また本発明は、少なくとも２種類の生物由
来の発光機構を備えてなり、前記発光機構の１つの発光
は、ｐＨ８において最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍ
であり、かつ半値幅が６０ｎｍ以下の発光であり、か
つ、前記発光機構の別の１つの発光は、ｐＨ８において
最大発光波長が４６０〜５５０ｎｍの発光であることを
特徴とする発光検査システムに関する。
来の発光機構を備えてなり、前記発光機構の１つの発光
は、ｐＨ８において最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍ
であり、かつ半値幅が６０ｎｍ以下の発光であり、か
つ、前記発光機構の別の１つの発光は、ｐＨ８において
最大発光波長が４６０〜５５０ｎｍの発光であることを
特徴とする発光検査システムに関する。
【０００８】また本発明は、発光機構が、酵素を介した
発光基質の酸化反応に基づく機構である上記発光検査シ
ステムに関する。
発光基質の酸化反応に基づく機構である上記発光検査シ
ステムに関する。
【０００９】また本発明は、酵素が、発光生物の発光遺
伝子の一部を含むベクターより生成したものであること
を特徴とする上記発光検査システムに関する。
伝子の一部を含むベクターより生成したものであること
を特徴とする上記発光検査システムに関する。
【００１０】また本発明は、発光遺伝子が、鉄道虫由来
であることを特徴とする上記発光検査システムに関す
る。
であることを特徴とする上記発光検査システムに関す
る。
【００１１】また本発明は、少なくとも２種類の生物由
来の発光機構による発光検査方法であり、前記発光機構
の１つの発光は、ｐＨ８において最大発光波長が６１５
ｎｍ〜６２５ｎｍであり、かつ半値幅が６０ｎｍ以下の
発光であり、かつ、前記発光機構の別の発光は、ｐＨ８
において最大発光波長が４６０〜５５０ｎｍの発光であ
り、少なくとも２種類の発光を１回の工程で検出するこ
とを特徴とする発光検査方法に関する。
来の発光機構による発光検査方法であり、前記発光機構
の１つの発光は、ｐＨ８において最大発光波長が６１５
ｎｍ〜６２５ｎｍであり、かつ半値幅が６０ｎｍ以下の
発光であり、かつ、前記発光機構の別の発光は、ｐＨ８
において最大発光波長が４６０〜５５０ｎｍの発光であ
り、少なくとも２種類の発光を１回の工程で検出するこ
とを特徴とする発光検査方法に関する。
【００１２】また本発明は、マグネシウムイオンまたは
カルシウムイオンを含む試薬（ａ）、発光基質およびＡ
ＴＰを含む試薬（ｂ）、発光生物の発光遺伝子の一部を
含む、少なくとも２種類のベクターを含む試薬（ｃ）か
らなる、少なくとも２種類の発光機構を備えた発光検査
キットであって、前記発光機構の１つの発光は、ｐＨ８
において最大発光波長が６１５ｎｍ〜６２５ｎｍであ
り、かつ半値幅が６０ｎｍ以下の発光であり、かつ、前
記発光機構の別の１つの発光は、ｐＨ８において最大発
光波長が４６０〜５５０ｎｍの発光であることを特徴と
する検査キットに関する。
カルシウムイオンを含む試薬（ａ）、発光基質およびＡ
ＴＰを含む試薬（ｂ）、発光生物の発光遺伝子の一部を
含む、少なくとも２種類のベクターを含む試薬（ｃ）か
らなる、少なくとも２種類の発光機構を備えた発光検査
キットであって、前記発光機構の１つの発光は、ｐＨ８
において最大発光波長が６１５ｎｍ〜６２５ｎｍであ
り、かつ半値幅が６０ｎｍ以下の発光であり、かつ、前
記発光機構の別の１つの発光は、ｐＨ８において最大発
光波長が４６０〜５５０ｎｍの発光であることを特徴と
する検査キットに関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明でいう生物由来の発光機構
とは、発光生物が生体内外で発光する機構およびそれを
模したものであり、具体的には酵素による発光基質の酸
化反応もしくは発光タンパク質の化学反応によって生ず
る化学エネルギーが光に変換され発光する機構である。
とは、発光生物が生体内外で発光する機構およびそれを
模したものであり、具体的には酵素による発光基質の酸
化反応もしくは発光タンパク質の化学反応によって生ず
る化学エネルギーが光に変換され発光する機構である。
【００１４】発光生物には、アメリカホタル(Photinus
pyralis)を始め、ヒカリコメツキ(Pyrophorus plagioph
thalamus)、ゲンジボタル(Luciola cruciata)、ヒメボ
タル(Luciola parvula)、鉄道虫(Phrixothrix)、ウミホ
タル(Cypridina hilgendorfii)、オヨギゴカイ(Odontos
yllis enopla)、炭水産貝(Latia)、発光バクテリア(Pho
tobacterium)、発光エビ(Heterocarpus、Oplophorus)、
渦べん毛藻(Gonyaulax)、発光魚(Apogon、Parapriacant
hus)、ウミシイタケ(Renilla reniformis)、発光キノコ
(Collybia)、ギボシムシ(Balanoglossus)、巨大発光ミ
ミズ(Octochaetus、Diplocardia)、オワンクラゲ(Aequo
rea aequorea)、ツバサゴカイ(Chaetopterus)、発光オ
キアミ(Meganyctiphanes)などが挙げられる。
pyralis)を始め、ヒカリコメツキ(Pyrophorus plagioph
thalamus)、ゲンジボタル(Luciola cruciata)、ヒメボ
タル(Luciola parvula)、鉄道虫(Phrixothrix)、ウミホ
タル(Cypridina hilgendorfii)、オヨギゴカイ(Odontos
yllis enopla)、炭水産貝(Latia)、発光バクテリア(Pho
tobacterium)、発光エビ(Heterocarpus、Oplophorus)、
渦べん毛藻(Gonyaulax)、発光魚(Apogon、Parapriacant
hus)、ウミシイタケ(Renilla reniformis)、発光キノコ
(Collybia)、ギボシムシ(Balanoglossus)、巨大発光ミ
ミズ(Octochaetus、Diplocardia)、オワンクラゲ(Aequo
rea aequorea)、ツバサゴカイ(Chaetopterus)、発光オ
キアミ(Meganyctiphanes)などが挙げられる。
【００１５】本発明でいう酵素とは、触媒活性を有する
タンパク質の総称であり、酵素の触媒する反応の反応物
質を基質と呼ぶ。
タンパク質の総称であり、酵素の触媒する反応の反応物
質を基質と呼ぶ。
【００１６】ここでいう触媒とは、それ自身は少しも化
学変化をこうむらないが、それがまじると化学反応の速
度が速く(遅く)なる物質のことである。
学変化をこうむらないが、それがまじると化学反応の速
度が速く(遅く)なる物質のことである。
【００１７】本発明における酵素は、鉄道虫ルシフェラ
ーゼを始め、各種ホタル・ルシフェラーゼおよびその人
為的変異体、シーパンジー・ルシフェラーゼ、ウミホタ
ル・ルシフェラーゼ等、生物発光に関わるあらゆる酵素
を含む。
ーゼを始め、各種ホタル・ルシフェラーゼおよびその人
為的変異体、シーパンジー・ルシフェラーゼ、ウミホタ
ル・ルシフェラーゼ等、生物発光に関わるあらゆる酵素
を含む。
【００１８】本発明でいう発光基質とは、酵素によって
触媒作用を受けて酸化するときに生ずる化学エネルギー
を光に変換して発光する化合物または分子である。
触媒作用を受けて酸化するときに生ずる化学エネルギー
を光に変換して発光する化合物または分子である。
【００１９】本発明における発光基質は、鉄道虫ルシフ
ェラーゼやホタル・ルシフェラーゼに対するホタル・ル
シフェリンや、シーパンジー・ルシフェラーゼ、ウミホ
タル・ルシフェラーゼ等生物発光に関わる酵素に対応す
るあらゆる発光基質を含む。
ェラーゼやホタル・ルシフェラーゼに対するホタル・ル
シフェリンや、シーパンジー・ルシフェラーゼ、ウミホ
タル・ルシフェラーゼ等生物発光に関わる酵素に対応す
るあらゆる発光基質を含む。
【００２０】本発明でいう発光タンパク質とは、低分子
物質の触媒によって光るタンパク質のことであり、オワ
ンクラゲ由来のエクオリンやグリーン蛍光タンパク質
(ＧＦＰ)を始め、ツバサゴカイ、発光オキアミ等生物発
光に関わるあらゆる発光タンパク質を含む。
物質の触媒によって光るタンパク質のことであり、オワ
ンクラゲ由来のエクオリンやグリーン蛍光タンパク質
(ＧＦＰ)を始め、ツバサゴカイ、発光オキアミ等生物発
光に関わるあらゆる発光タンパク質を含む。
【００２１】本発明でいうベクターとは、組換えＤＮＡ
実験において宿主に異種ＤＮＡを運搬するＤＮＡのこと
をいい、プラスミドまたはファージが使用されている。
実験において宿主に異種ＤＮＡを運搬するＤＮＡのこと
をいい、プラスミドまたはファージが使用されている。
【００２２】ここでいうプラスミドとは、宿主染色体と
は物理的に独立して自律複製し、安定に遺伝することの
できる二重鎖閉環状ＤＮＡである染色体外遺伝因子のこ
とである。またファージとは、バクテリオファージまた
は細菌ウイルス等とも呼ばれる細菌を宿主とするウイル
スのことである。
は物理的に独立して自律複製し、安定に遺伝することの
できる二重鎖閉環状ＤＮＡである染色体外遺伝因子のこ
とである。またファージとは、バクテリオファージまた
は細菌ウイルス等とも呼ばれる細菌を宿主とするウイル
スのことである。
【００２３】本発明でいう鉄道虫とは、南米産のPhrixo
thrixのことであり、頭に赤色の発光器が１個、体側に
黄緑色の発光器が１１個ずつ並んでいる。普通は頭の赤
色のみが光っているが、刺激すると黄緑色の発光が現れ
る。
thrixのことであり、頭に赤色の発光器が１個、体側に
黄緑色の発光器が１１個ずつ並んでいる。普通は頭の赤
色のみが光っているが、刺激すると黄緑色の発光が現れ
る。
【００２４】本発明で用いられるｐＨ８において最大発
光波長が６１５〜６２５ｎｍであり、かつ半値幅が６０
ｎｍ以下の発光は、前記鉄道虫由来の最大発光波長λma
x＝６２２ｎｍ、半値幅５５ｎｍの発光を利用すること
が好ましい。半値幅が６０ｎｍより大きくなると、例え
ば、５５０ｎｍ付近に最大発光波長を有する発光と重な
り、少なくとも２つの発光をそれぞれ区別することがむ
ずかしくなる。
光波長が６１５〜６２５ｎｍであり、かつ半値幅が６０
ｎｍ以下の発光は、前記鉄道虫由来の最大発光波長λma
x＝６２２ｎｍ、半値幅５５ｎｍの発光を利用すること
が好ましい。半値幅が６０ｎｍより大きくなると、例え
ば、５５０ｎｍ付近に最大発光波長を有する発光と重な
り、少なくとも２つの発光をそれぞれ区別することがむ
ずかしくなる。
【００２５】なお、発光生物由来の発光の最大発光波長
および半値幅は、ｐＨの影響を受けて大きく変化する場
合があるので、ｐＨ８で前記波形の発光スペクトルを定
義するものである。
および半値幅は、ｐＨの影響を受けて大きく変化する場
合があるので、ｐＨ８で前記波形の発光スペクトルを定
義するものである。
【００２６】本発明の少なくとも２種類の生物発光由来
の発光を１回の工程で検出する組み合わせとしては、鉄
道虫由来の最大発光波長λmax＝６２２ｎｍ、半値幅５
５ｎｍの発光と組み合わせて、例えば、鉄道虫由来のλ
max＝５４９ｎｍのルシフェラーゼ、ホタル・ルシフェ
ラーゼ（ゲンジボタル：λmax＝５４４ｎｍ、ヒカリコ
メツキ：λmax＝５４６ｎｍ）、シーパンジー・ルシフ
ェラーゼ(λmax＝４７０〜４９０ｎｍ)、ウミホタル・
ルシフェラーゼ(λmax＝４６０〜４８０ｎｍ)がある
が、これらに限定されるものではない。最大発光波長が
４６０〜５５０ｎｍの発光タンパク質も使用できる。こ
の中では、基質要求性が同一であるホタル・ルシフェラ
ーゼの使用が好ましい。
の発光を１回の工程で検出する組み合わせとしては、鉄
道虫由来の最大発光波長λmax＝６２２ｎｍ、半値幅５
５ｎｍの発光と組み合わせて、例えば、鉄道虫由来のλ
max＝５４９ｎｍのルシフェラーゼ、ホタル・ルシフェ
ラーゼ（ゲンジボタル：λmax＝５４４ｎｍ、ヒカリコ
メツキ：λmax＝５４６ｎｍ）、シーパンジー・ルシフ
ェラーゼ(λmax＝４７０〜４９０ｎｍ)、ウミホタル・
ルシフェラーゼ(λmax＝４６０〜４８０ｎｍ)がある
が、これらに限定されるものではない。最大発光波長が
４６０〜５５０ｎｍの発光タンパク質も使用できる。こ
の中では、基質要求性が同一であるホタル・ルシフェラ
ーゼの使用が好ましい。
【００２７】本発明の発光キットは、発光生物由来の発
光遺伝子の一部を含む少なくとも２種類のベクターと、
ベクターより生成した酵素もしくは発光タンパク質と発
光反応可能な発光試薬とからなる。
光遺伝子の一部を含む少なくとも２種類のベクターと、
ベクターより生成した酵素もしくは発光タンパク質と発
光反応可能な発光試薬とからなる。
【００２８】本発明で使用できる１つのベクター上には
ｐＨ８において最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍであ
り、かつ半値幅が６０ｎｍ以下であるルシフェラーゼ遺
伝子が適当なプロモーター配列の下流に配置されてい
る。ここでプロモーター配列としては、ＳＶ４０初期エ
ンハンサー／プロモーター配列、ＣＭＶ即時型初期エン
ハンサー／プロモーター配列、ＨＳＶ（単純ヘルペスウ
イルス）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター配
列、等がある。このベクターを培養細胞にトランスフェ
クションし、細胞内である一定の発光遺伝子の発現から
ホタル・ルシフェラーゼ酵素を生成させ、その生成量を
発光量として定量し、この発光量を、例えば、インター
ナルコントロール（内部標準）とする。
ｐＨ８において最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍであ
り、かつ半値幅が６０ｎｍ以下であるルシフェラーゼ遺
伝子が適当なプロモーター配列の下流に配置されてい
る。ここでプロモーター配列としては、ＳＶ４０初期エ
ンハンサー／プロモーター配列、ＣＭＶ即時型初期エン
ハンサー／プロモーター配列、ＨＳＶ（単純ヘルペスウ
イルス）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター配
列、等がある。このベクターを培養細胞にトランスフェ
クションし、細胞内である一定の発光遺伝子の発現から
ホタル・ルシフェラーゼ酵素を生成させ、その生成量を
発光量として定量し、この発光量を、例えば、インター
ナルコントロール（内部標準）とする。
【００２９】またもう一方のベクター上にはｐＨ８にお
いて最大発光波長が４６０〜５５０ｎｍの発光を示す発
光遺伝子が配置され、かつ前記ベクターには、ＳＶ４０
由来のプロモーター配列を持つもの、ＳＶ４０由来のエ
ンハンサー配列を持つもの、その両配列を含むもの、ま
た両者をふくまないもの、等の４種類がある。実験目的
に合わせたこれらの一つを培養細胞にトランスフェクシ
ョンし、細胞内である一定の発光遺伝子の発現からホタ
ル・ルシフェラーゼ酵素あるいは発光タンパクを生成さ
せ、その発光量から酵素または発光タンパク質の生成量
を導く目的に使用する。
いて最大発光波長が４６０〜５５０ｎｍの発光を示す発
光遺伝子が配置され、かつ前記ベクターには、ＳＶ４０
由来のプロモーター配列を持つもの、ＳＶ４０由来のエ
ンハンサー配列を持つもの、その両配列を含むもの、ま
た両者をふくまないもの、等の４種類がある。実験目的
に合わせたこれらの一つを培養細胞にトランスフェクシ
ョンし、細胞内である一定の発光遺伝子の発現からホタ
ル・ルシフェラーゼ酵素あるいは発光タンパクを生成さ
せ、その発光量から酵素または発光タンパク質の生成量
を導く目的に使用する。
【００３０】本発明で使用される発光試薬は、マグネシ
ウムイオンまたはカルシウムイオンを含む試薬（ａ）、
および発光基質並びにＡＴＰを含む試薬（ｂ）からな
る。試薬（ａ）と試薬（ｂ）とは、構成として欠くこと
ができないものであるが、かならずしも、別々に保管し
なければならないものではない。
ウムイオンまたはカルシウムイオンを含む試薬（ａ）、
および発光基質並びにＡＴＰを含む試薬（ｂ）からな
る。試薬（ａ）と試薬（ｂ）とは、構成として欠くこと
ができないものであるが、かならずしも、別々に保管し
なければならないものではない。
【００３１】本発明で使用される発光試薬は、少なくと
も２種類の上記ベクターが生成した酵素または発光タン
パク質の反応に関する発光基質などの成分が求める濃度
であることが好ましい。試薬の形態としては凍結品と凍
結乾燥品とがある。
も２種類の上記ベクターが生成した酵素または発光タン
パク質の反応に関する発光基質などの成分が求める濃度
であることが好ましい。試薬の形態としては凍結品と凍
結乾燥品とがある。
【００３２】凍結品としては、ルシフェリン類、ＡＴ
Ｐ、ＣｏＡ（補酵素Ａ）、緩衝成分、Ｍｇ2+もしくはＣ
ａ2+を含む成分を凍結したもので、凍結前に溶液の安定
化を図る。通常は試薬（ａ）と試薬（ｂ）とが共存した
形態をとる。凍結品は−７０℃で保存し、解凍後十分に
室温に戻した後に使用する。
Ｐ、ＣｏＡ（補酵素Ａ）、緩衝成分、Ｍｇ2+もしくはＣ
ａ2+を含む成分を凍結したもので、凍結前に溶液の安定
化を図る。通常は試薬（ａ）と試薬（ｂ）とが共存した
形態をとる。凍結品は−７０℃で保存し、解凍後十分に
室温に戻した後に使用する。
【００３３】凍結乾燥品のキットは、ルシフェリン類、
ＡＴＰ、ＣｏＡ(補酵素Ａ)を含む溶液を凍結乾燥した試
薬（ｂ）を含む第１成分であると、緩衝成分、Ｍｇ2+
もしくはＣａ2+を含む溶液である試薬（ａ）を含む第２
成分であるとからなり、使用直前に第１成分と第２成分
を混合する。この場合は、第２成分である溶液の安定化
を図り密封して保存する。第１成分と第２成分は冷凍保
存し、室温に戻してから混合して使用する。
ＡＴＰ、ＣｏＡ(補酵素Ａ)を含む溶液を凍結乾燥した試
薬（ｂ）を含む第１成分であると、緩衝成分、Ｍｇ2+
もしくはＣａ2+を含む溶液である試薬（ａ）を含む第２
成分であるとからなり、使用直前に第１成分と第２成分
を混合する。この場合は、第２成分である溶液の安定化
を図り密封して保存する。第１成分と第２成分は冷凍保
存し、室温に戻してから混合して使用する。
【００３４】ルシフェラーゼによるレポーターアッセイ
は、簡便にはルミノメーターで発光量を測定し結果を得
るが、これは光子量を電気信号に変換し定量させるもの
であって、波長の違いを識別できない。そこで、２種類
の発光反応を個別に測定するにあたり、最大発光波長の
異なる２種類の発光を識別するため、例えば５９５ｎｍ
以下の波長を遮るカットフィルターをルミノメーター装
置内に組み込み、カットフィルターを使用した場合とそ
うでない場合とで２種類の発光量を測定する。 カット
フィルターを通して得られる発光量は、ｐＨ８において
最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍの波長を持つルシフ
ェラーゼによる発光量であり、この値をインターナルコ
ントロールとする。またカットフィルターを通さないで
得られた発光量は、４６０〜５５０ｎｍの発光を示すル
シフェラーゼあるい発光タンパクによる発光量に加え、
６１５〜６２５ｎｍの波長を持つルシフェラーゼによる
発光量の総和として得られる。このためこの総和からカ
ットフィルターを通して得られた発光量を差し引いた値
をレポーターアッセイの実験結果に使用する。
は、簡便にはルミノメーターで発光量を測定し結果を得
るが、これは光子量を電気信号に変換し定量させるもの
であって、波長の違いを識別できない。そこで、２種類
の発光反応を個別に測定するにあたり、最大発光波長の
異なる２種類の発光を識別するため、例えば５９５ｎｍ
以下の波長を遮るカットフィルターをルミノメーター装
置内に組み込み、カットフィルターを使用した場合とそ
うでない場合とで２種類の発光量を測定する。 カット
フィルターを通して得られる発光量は、ｐＨ８において
最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍの波長を持つルシフ
ェラーゼによる発光量であり、この値をインターナルコ
ントロールとする。またカットフィルターを通さないで
得られた発光量は、４６０〜５５０ｎｍの発光を示すル
シフェラーゼあるい発光タンパクによる発光量に加え、
６１５〜６２５ｎｍの波長を持つルシフェラーゼによる
発光量の総和として得られる。このためこの総和からカ
ットフィルターを通して得られた発光量を差し引いた値
をレポーターアッセイの実験結果に使用する。
【００３５】カットフィルターを組み込んでいないルミ
ノメーターによる測定の場合には、測定に用いるキュベ
ットとして５９５ｎｍ以下の波長を遮る能力を持ったも
のとそうでないものの２種類を使用することで、カット
フィルターを使用した場合と同様な結果を得ることがで
きる。
ノメーターによる測定の場合には、測定に用いるキュベ
ットとして５９５ｎｍ以下の波長を遮る能力を持ったも
のとそうでないものの２種類を使用することで、カット
フィルターを使用した場合と同様な結果を得ることがで
きる。
【００３６】またキュベットに５９５ｎｍ以下の波長を
遮る能力を持たせる方法として、キュベットにカットフ
ィルターを巻き付ける方法と、キュベットの成形前に５
９５ｎｍ以下の波長を遮る(吸収する)色素などの物質を
練り込む方法等がある。
遮る能力を持たせる方法として、キュベットにカットフ
ィルターを巻き付ける方法と、キュベットの成形前に５
９５ｎｍ以下の波長を遮る(吸収する)色素などの物質を
練り込む方法等がある。
【００３７】このように、ルミノメーターを用いて１回
の工程で２種類の発光を区別しうる。
の工程で２種類の発光を区別しうる。
【００３８】また、分光光度計または液体シンチレーシ
ョンカウンターを用いて少なくとも２種類の発光を測定
することが可能である。分光光度計の場合は、ルミノメ
ーターのようなカットフィルターの入れ替えの必要はな
く１つのサンプルを１回の測定で区別できる。特に、マ
ルチチャンネルの測光システム（例えば、大塚電子製Ｉ
ＭＵＣ７００）が有効である。
ョンカウンターを用いて少なくとも２種類の発光を測定
することが可能である。分光光度計の場合は、ルミノメ
ーターのようなカットフィルターの入れ替えの必要はな
く１つのサンプルを１回の測定で区別できる。特に、マ
ルチチャンネルの測光システム（例えば、大塚電子製Ｉ
ＭＵＣ７００）が有効である。
【００３９】
【実施例】次に、本発明を実施例を挙げてさらに詳細に
説明する。
説明する。
【００４０】実施例１ 鉄道虫から単離した最大発光波長λmax＝５４２ｎｍの
ルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを用意し、これと「ピ
ッカジーン コントロベクター２（東洋インキ製造株式
会社製：製品番号PGV-C2）」上のｌｕｃ＋遺伝子と置換
させて組み込み、これをテスト・レポーター・ベクター
とした。
ルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを用意し、これと「ピ
ッカジーン コントロベクター２（東洋インキ製造株式
会社製：製品番号PGV-C2）」上のｌｕｃ＋遺伝子と置換
させて組み込み、これをテスト・レポーター・ベクター
とした。
【００４１】また鉄道虫から単離した最大発光波長λma
x＝６２２ｎｍのルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを用
意し、これと「シーパンジーＴＫコントロールベクター
（Promega製：製品番号pRL-TK）」上のＲｌｕｃ遺伝子
と置換させて組み込み、これを内部標準レポーター・ベ
クターとした。
x＝６２２ｎｍのルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを用
意し、これと「シーパンジーＴＫコントロールベクター
（Promega製：製品番号pRL-TK）」上のＲｌｕｃ遺伝子
と置換させて組み込み、これを内部標準レポーター・ベ
クターとした。
【００４２】テスト・レポーター・ベクター１．５μｇ
および内部標準レポーターベクターベクター１．５μｇ
を「Ｔｆｘ−５０（Promega製：製品番号E1811)」６．
７５μｌを用いてＣＯＳ細胞へコトランスフェクション
し、「ＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製：製品番
号391-05915）」を用い５％ＣＯ2インキュベーターで３
７℃、４８時間培養した。培養されたＣＯＳ細胞を「ピ
ッカジーン細胞溶解剤Luc（東洋インキ製造株式会社
製：製品番号PGC50）」で溶解し、その上済み２０μｌ
を測定チューブに取った。このサンプルに「ピッカジー
ン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PG
L100)」のルシフェラーゼアッセイ試薬（マグネシウム
イオン、ＡＴＰ、ルシフェリンを含む）１００μｌを加
え、ベルトールド社製ＬＢ９５０６に５９５ｎｍ以下の
波長を遮るカットフィルターを組み込んだルミノメータ
ーで発光量の測定を行った。
および内部標準レポーターベクターベクター１．５μｇ
を「Ｔｆｘ−５０（Promega製：製品番号E1811)」６．
７５μｌを用いてＣＯＳ細胞へコトランスフェクション
し、「ＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製：製品番
号391-05915）」を用い５％ＣＯ2インキュベーターで３
７℃、４８時間培養した。培養されたＣＯＳ細胞を「ピ
ッカジーン細胞溶解剤Luc（東洋インキ製造株式会社
製：製品番号PGC50）」で溶解し、その上済み２０μｌ
を測定チューブに取った。このサンプルに「ピッカジー
ン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PG
L100)」のルシフェラーゼアッセイ試薬（マグネシウム
イオン、ＡＴＰ、ルシフェリンを含む）１００μｌを加
え、ベルトールド社製ＬＢ９５０６に５９５ｎｍ以下の
波長を遮るカットフィルターを組み込んだルミノメータ
ーで発光量の測定を行った。
【００４３】カットフィルター通したを際の測定値は1
5,245 RLU(Relative Light Unit:相対発光量）で、カッ
トフィルターを通さない場合の測定値は625,856 RLUで
あった。これにより、内部標準レポーター：テストレポ
ーターの比がおよそ１：４０となり、１サンプル内の２
種類のレポーターアッセイが同時に測定できた。
5,245 RLU(Relative Light Unit:相対発光量）で、カッ
トフィルターを通さない場合の測定値は625,856 RLUで
あった。これにより、内部標準レポーター：テストレポ
ーターの比がおよそ１：４０となり、１サンプル内の２
種類のレポーターアッセイが同時に測定できた。
【００４４】実施例２ ヒカリコメツキから単離した最大発光波長λmax＝５４
６ｎｍのルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを用意し、こ
れと「ピッカジーン コントロベクター２（東洋インキ
製造株式会社製：製品番号PGV-C2）」上のｌｕｃ＋遺伝
子と置換させて組み込み、これをテスト・レポーター・
ベクターとした。
６ｎｍのルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを用意し、こ
れと「ピッカジーン コントロベクター２（東洋インキ
製造株式会社製：製品番号PGV-C2）」上のｌｕｃ＋遺伝
子と置換させて組み込み、これをテスト・レポーター・
ベクターとした。
【００４５】また鉄道虫から単離した最大発光波長λma
x＝６２２ｎｍのルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを用
意し、これと「シーパンジーＴＫコントロールベクター
（Promega製：製品番号pRL-TK）」上のＲｌｕｃ遺伝子
と置換させて組み込み、これを内部標準レポーター・ベ
クターとした。
x＝６２２ｎｍのルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを用
意し、これと「シーパンジーＴＫコントロールベクター
（Promega製：製品番号pRL-TK）」上のＲｌｕｃ遺伝子
と置換させて組み込み、これを内部標準レポーター・ベ
クターとした。
【００４６】テスト・レポーター・ベクター１．５μｇ
および内部標準レポーターベクターベクター１．５μｇ
を「Ｔｆｘ−５０（Promega製：製品番号E1811)」６．
７５μｌを用いてＣＯＳ細胞へコトランスフェクション
し、「ＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製：製品番
号391-05915）」を用い５％ＣＯ2インキュベーターで３
７℃、４８時間培養した。培養されたＣＯＳ細胞を「ピ
ッカジーン細胞溶解剤Luc（東洋インキ製造株式会社
製：製品番号PGC50）」で溶解し、その上済み２０μｌ
を測定チューブに取った。このサンプルに「ピッカジー
ン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PG
L100)」のルシフェラーゼアッセイ試薬（マグネシウム
イオン、ＡＴＰ、ルシフェリンを含む）１００μｌを加
え、ベルトールド社製ＬＢ９５０６に５９５ｎｍ以下の
波長を遮るカットフィルターを組み込んだルミノメータ
ーで発光量の測定を行った。
および内部標準レポーターベクターベクター１．５μｇ
を「Ｔｆｘ−５０（Promega製：製品番号E1811)」６．
７５μｌを用いてＣＯＳ細胞へコトランスフェクション
し、「ＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製：製品番
号391-05915）」を用い５％ＣＯ2インキュベーターで３
７℃、４８時間培養した。培養されたＣＯＳ細胞を「ピ
ッカジーン細胞溶解剤Luc（東洋インキ製造株式会社
製：製品番号PGC50）」で溶解し、その上済み２０μｌ
を測定チューブに取った。このサンプルに「ピッカジー
ン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PG
L100)」のルシフェラーゼアッセイ試薬（マグネシウム
イオン、ＡＴＰ、ルシフェリンを含む）１００μｌを加
え、ベルトールド社製ＬＢ９５０６に５９５ｎｍ以下の
波長を遮るカットフィルターを組み込んだルミノメータ
ーで発光量の測定を行った。
【００４７】カットフィルター通したを際の測定値は2
0,1859 RLU(Relative Light Unit:相対発光量）で、カ
ットフィルターを通さない場合の測定値は826,5142 RLU
であった。これにより、内部標準レポーター：テストレ
ポーターの比がおよそ１：４０となり、１サンプル内の
２種類のレポーターアッセイが同時に測定できた。
0,1859 RLU(Relative Light Unit:相対発光量）で、カ
ットフィルターを通さない場合の測定値は826,5142 RLU
であった。これにより、内部標準レポーター：テストレ
ポーターの比がおよそ１：４０となり、１サンプル内の
２種類のレポーターアッセイが同時に測定できた。
【００４８】実施例３ 「シーパンジーｎｕｌｌベクター（Promega製：製品番
号pRL-null)」から切り出したシーパンジー・ルシフェ
ラーゼの構造遺伝子と「ピッカジーン コントロベクタ
ー２（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PGV-C2）」
上のｌｕｃ＋遺伝子と置換させて組み込み、これをテス
ト・レポーター・ベクターとした。
号pRL-null)」から切り出したシーパンジー・ルシフェ
ラーゼの構造遺伝子と「ピッカジーン コントロベクタ
ー２（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PGV-C2）」
上のｌｕｃ＋遺伝子と置換させて組み込み、これをテス
ト・レポーター・ベクターとした。
【００４９】また鉄道虫から単離した最大発光波長λma
x＝６２２ｎｍのルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを用
意し、これと「シーパンジーＴＫコントロールベクター
（Promega製：製品番号pRL-TK）」上のＲｌｕｃ遺伝子
と置換させて組み込み、これを内部標準レポーター・ベ
クターとした。
x＝６２２ｎｍのルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを用
意し、これと「シーパンジーＴＫコントロールベクター
（Promega製：製品番号pRL-TK）」上のＲｌｕｃ遺伝子
と置換させて組み込み、これを内部標準レポーター・ベ
クターとした。
【００５０】テスト・レポーター・ベクター１．５μｇ
および内部標準レポーター・ベクター１．５μｇを「Ｔ
ｆｘ−５０（Promega製：製品番号E1811)」６．７５μ
ｌを用いてＣＯＳ細胞へコトランスフェクションし、
「ＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製：製品番号39
1-05915）」を用い５％ＣＯ2インキュベーターで３７
℃、４８時間培養した。培養されたＣＯＳ細胞を「ピッ
カジーン細胞溶解剤Luc（東洋インキ製造株式会社製：
製品番号PGC50）」で溶解し、その上済み２０μｌを測
定チューブに取った。このサンプルに「ピッカジーン発
光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PGL10
0)」のルシフェラーゼアッセイ試薬に、「ピッカジーン
デュアル・シーパンジー発光キット（Promega製：製造
番号PGD-S)」に含まれている「シーパンジー発光基質」
と「発光基質溶解液」とから調製された「シーパンジー
発光基質溶液」５０μｌを加えた「ホタル／シーパンジ
ー発光試薬」（マグネシウムイオン、ＡＴＰ、ルシフェ
リンを含む）１００μｌを加え、ベルトールド社製ＬＢ
９５０６に５９５ｎｍ以下の波長を遮るカットフィルタ
ーを組み込んだルミノメーターで発光量の測定を行っ
た。
および内部標準レポーター・ベクター１．５μｇを「Ｔ
ｆｘ−５０（Promega製：製品番号E1811)」６．７５μ
ｌを用いてＣＯＳ細胞へコトランスフェクションし、
「ＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製：製品番号39
1-05915）」を用い５％ＣＯ2インキュベーターで３７
℃、４８時間培養した。培養されたＣＯＳ細胞を「ピッ
カジーン細胞溶解剤Luc（東洋インキ製造株式会社製：
製品番号PGC50）」で溶解し、その上済み２０μｌを測
定チューブに取った。このサンプルに「ピッカジーン発
光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PGL10
0)」のルシフェラーゼアッセイ試薬に、「ピッカジーン
デュアル・シーパンジー発光キット（Promega製：製造
番号PGD-S)」に含まれている「シーパンジー発光基質」
と「発光基質溶解液」とから調製された「シーパンジー
発光基質溶液」５０μｌを加えた「ホタル／シーパンジ
ー発光試薬」（マグネシウムイオン、ＡＴＰ、ルシフェ
リンを含む）１００μｌを加え、ベルトールド社製ＬＢ
９５０６に５９５ｎｍ以下の波長を遮るカットフィルタ
ーを組み込んだルミノメーターで発光量の測定を行っ
た。
【００５１】カットフィルター通したを際の測定値は1
2,585 RLU(Relative Light Unit:相対発光量）で、カッ
トフィルターを通さない場合の測定値は516,290 RLUで
あった。これにより、内部標準レポーター：テストレポ
ーターの比がおよそ１：４０となり、１サンプル内の２
種類のレポーターアッセイが同時に測定できた。
2,585 RLU(Relative Light Unit:相対発光量）で、カッ
トフィルターを通さない場合の測定値は516,290 RLUで
あった。これにより、内部標準レポーター：テストレポ
ーターの比がおよそ１：４０となり、１サンプル内の２
種類のレポーターアッセイが同時に測定できた。
【００５２】比較例１ 北米産ホタルから単離した最大発光波長λmax＝５６２
ｎｍのルシフェラーゼ遺伝子を持つ「ピッカジーン コ
ントロベクター２（東洋インキ製造株式会社製：製品番
号PGV-C2）」をテスト・レポーター・ベクターとした。
ｎｍのルシフェラーゼ遺伝子を持つ「ピッカジーン コ
ントロベクター２（東洋インキ製造株式会社製：製品番
号PGV-C2）」をテスト・レポーター・ベクターとした。
【００５３】また最大発光波長λmax＝４７０〜４９０
ｎｍのシーパンジー・ルシフェラーゼ遺伝子を持つ「シ
ーパンジーＴＫコントロールベクター（Promega製：製
品番号pRL-TK）」を内部標準レポーター・ベクターとし
た。
ｎｍのシーパンジー・ルシフェラーゼ遺伝子を持つ「シ
ーパンジーＴＫコントロールベクター（Promega製：製
品番号pRL-TK）」を内部標準レポーター・ベクターとし
た。
【００５４】テスト・レポーター・ベクター１．５μｇ
および内部標準レポーターベクターベクター１．５μｇ
を「Ｔｆｘ−５０（Promega製：製品番号E1811)」６．
７５μｌを用いてＣＯＳ細胞へコトランスフェクション
し、「ＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製：製品番
号391-05915）」を用い５％ＣＯ2インキュベーターで３
７℃、４８時間培養した。培養されたＣＯＳ細胞を「ピ
ッカジーン細胞溶解剤Luc（東洋インキ製造株式会社
製：製品番号PGC50）」で溶解し、その上済み２０μｌ
を測定チューブに取った。このサンプルに「ピッカジー
ン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PG
L100)」のルシフェラーゼアッセイ試薬に、「ピッカジ
ーンデュアル・シーパンジー発光キット（Promega製：
製造番号PGD-S)」に含まれている「シーパンジー発光基
質」と「発光基質溶解液」とから調製された「シーパン
ジー発光基質溶液」５０μｌを加えた「ホタル／シーパ
ンジー発光試薬」（マグネシウムイオン、ＡＴＰ、ルシ
フェリンを含む）１００μｌを加え、ベルトールド社製
ＬＢ９５０６に５３０ｎｍ以下の波長を遮るカットフィ
ルターを組み込んだルミノメーターで発光量の測定を行
った。
および内部標準レポーターベクターベクター１．５μｇ
を「Ｔｆｘ−５０（Promega製：製品番号E1811)」６．
７５μｌを用いてＣＯＳ細胞へコトランスフェクション
し、「ＤＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社製：製品番
号391-05915）」を用い５％ＣＯ2インキュベーターで３
７℃、４８時間培養した。培養されたＣＯＳ細胞を「ピ
ッカジーン細胞溶解剤Luc（東洋インキ製造株式会社
製：製品番号PGC50）」で溶解し、その上済み２０μｌ
を測定チューブに取った。このサンプルに「ピッカジー
ン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PG
L100)」のルシフェラーゼアッセイ試薬に、「ピッカジ
ーンデュアル・シーパンジー発光キット（Promega製：
製造番号PGD-S)」に含まれている「シーパンジー発光基
質」と「発光基質溶解液」とから調製された「シーパン
ジー発光基質溶液」５０μｌを加えた「ホタル／シーパ
ンジー発光試薬」（マグネシウムイオン、ＡＴＰ、ルシ
フェリンを含む）１００μｌを加え、ベルトールド社製
ＬＢ９５０６に５３０ｎｍ以下の波長を遮るカットフィ
ルターを組み込んだルミノメーターで発光量の測定を行
った。
【００５５】カットフィルター通したを際の測定値は10
4,963 RLU(Relative Light Unit:相対発光量）で、カッ
トフィルターを通さない場合の測定値は256,232 RLUで
あった。これにより、内部標準レポーター：テストレポ
ーターの比がおよそ１：１．４となり、前記内部標準レ
ポーターとテストレポーターとで得られる比に及ばず２
種類の発光が重なって測定された。
4,963 RLU(Relative Light Unit:相対発光量）で、カッ
トフィルターを通さない場合の測定値は256,232 RLUで
あった。これにより、内部標準レポーター：テストレポ
ーターの比がおよそ１：１．４となり、前記内部標準レ
ポーターとテストレポーターとで得られる比に及ばず２
種類の発光が重なって測定された。
【００５６】
【本発明の効果】本発明により、レポーター遺伝子によ
る転写活性測定を行う際にインターナルコントロールを
用いてアッセイしても、複数の行程を必要とせず一度で
しかも安定な結果が得られる優れた発光反応が可能とな
る。
る転写活性測定を行う際にインターナルコントロールを
用いてアッセイしても、複数の行程を必要とせず一度で
しかも安定な結果が得られる優れた発光反応が可能とな
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 竹内 秀行 東京都中央区京橋二丁目３番13号 東洋イ ンキ製造株式会社内 Ｆターム(参考） 2G054 EA02 EB01 FB01 4B024 AA11 BA08 BA80 CA04 DA02 EA04 FA02 FA06 GA11 GA18 4B029 AA07 BB11 BB16 FA13 4B063 QA01 QA08 QA18 QQ22 QQ79 QR02 QR24 QR42 QR50 QR58 QR60 QR65 QS05 QS14 QS36 QS39 QX02
Claims (7)
- 【請求項１】 生物由来の発光機構を備えてなり、前記
発光機構の発光は、ｐＨ８において最大発光波長が６１
５〜６２５ｎｍであり、かつ半値幅が６０ｎｍ以下の発
光であることを特徴とする発光検査システム。 - 【請求項２】 少なくとも２種類の生物由来の発光機構
を備えてなり、前記発光機構の１つの発光は、ｐＨ８に
おいて最大発光波長が６１５〜６２５ｎｍであり、かつ
半値幅が６０ｎｍ以下の発光であり、かつ、前記発光機
構の別の１つの発光は、ｐＨ８において最大発光波長が
４６０〜５５０ｎｍの発光であることを特徴とする発光
検査システム。 - 【請求項３】 発光機構が、酵素を介した発光基質の酸
化反応に基づく機構である請求項１または２記載の発光
検査システム。 - 【請求項４】 酵素が、発光生物の発光遺伝子の一部を
含むベクターより生成したものであることを特徴とする
請求項３記載の発光検査システム。 - 【請求項５】 発光遺伝子が、鉄道虫由来であることを
特徴とする請求項４記載の発光検査システム。 - 【請求項６】 少なくとも２種類の生物由来の発光機構
による発光検査方法であり、前記発光機構の１つの発光
は、ｐＨ８において最大発光波長が６１５ｎｍ〜６２５
ｎｍであり、かつ半値幅が６０ｎｍ以下の発光であり、
かつ、前記発光機構の別の発光は、ｐＨ８において最大
発光波長が４６０〜５５０ｎｍの発光であり、少なくと
も２種類の発光を１回の工程で検出することを特徴とす
る発光検査方法。 - 【請求項７】 マグネシウムイオンまたはカルシウムイ
オンを含む試薬（ａ）、発光基質およびＡＴＰを含む試
薬（ｂ）、発光生物の発光遺伝子の一部を含む、少なく
とも２種類のベクターを含む試薬（ｃ）からなる、少な
くとも２種類の発光機構を備えた発光検査キットであっ
て、前記発光機構の１つの発光は、ｐＨ８において最大
発光波長が６１５ｎｍ〜６２５ｎｍであり、かつ半値幅
が６０ｎｍ以下の発光であり、かつ、前記発光機構の別
の１つの発光は、ｐＨ８において最大発光波長が４６０
〜５５０ｎｍの発光であることを特徴とする検査キッ
ト。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28893299A JP2001103956A (ja) | 1999-10-12 | 1999-10-12 | 発光検査システム |
| PCT/JP2000/007049 WO2001027316A1 (fr) | 1999-10-12 | 2000-10-11 | Systeme de test de luminescence |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28893299A JP2001103956A (ja) | 1999-10-12 | 1999-10-12 | 発光検査システム |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001103956A true JP2001103956A (ja) | 2001-04-17 |
Family
ID=17736688
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28893299A Pending JP2001103956A (ja) | 1999-10-12 | 1999-10-12 | 発光検査システム |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001103956A (ja) |
| WO (1) | WO2001027316A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005021791A1 (ja) * | 2003-08-28 | 2005-03-10 | Japan Science And Technology Agency | 生細胞を用いた外部刺激の影響評価方法およびその方法を行うためのキット、並びに外部刺激に対する影響評価システム |
| JP2006271300A (ja) * | 2005-03-30 | 2006-10-12 | Toyobo Co Ltd | Ｔプラスミドベクター |
| JP2009133697A (ja) * | 2007-11-29 | 2009-06-18 | Olympus Corp | 発光測定方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09294600A (ja) * | 1996-04-26 | 1997-11-18 | Kikkoman Corp | 複数のプロモーター活性の測定法 |
-
1999
- 1999-10-12 JP JP28893299A patent/JP2001103956A/ja active Pending
-
2000
- 2000-10-11 WO PCT/JP2000/007049 patent/WO2001027316A1/ja active Application Filing
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005021791A1 (ja) * | 2003-08-28 | 2005-03-10 | Japan Science And Technology Agency | 生細胞を用いた外部刺激の影響評価方法およびその方法を行うためのキット、並びに外部刺激に対する影響評価システム |
| JP2006271300A (ja) * | 2005-03-30 | 2006-10-12 | Toyobo Co Ltd | Ｔプラスミドベクター |
| JP2009133697A (ja) * | 2007-11-29 | 2009-06-18 | Olympus Corp | 発光測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2001027316A1 (fr) | 2001-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Roda et al. | Bioluminescence in analytical chemistry and in vivo imaging | |
| Branchini et al. | Red-emitting luciferases for bioluminescence reporter and imaging applications | |
| Xu et al. | The expanding toolbox of in vivo bioluminescent imaging | |
| Branchini et al. | Red-and green-emitting firefly luciferase mutants for bioluminescent reporter applications | |
| EP0833939B1 (en) | Quenching reagents and assays for enzyme-mediated luminescence | |
| Sherf et al. | Dual-luciferase reporter assay: an advanced co-reporter technology integrating firefly and Renilla luciferase assays | |
| JP5090304B2 (ja) | 突然変異体ルシフェラーゼ | |
| US10364454B2 (en) | Bioluminescent assays utilising secreted luciferases | |
| Heise et al. | Dual luciferase assay for secreted luciferases based on Gaussia and NanoLuc | |
| JP2001103956A (ja) | 発光検査システム | |
| Michelini et al. | Luminescent probes and visualization of bioluminescence | |
| JP2012163577A (ja) | 多色同時測定用ルシフェラーゼ発光方法および発光試薬 | |
| JP5332178B2 (ja) | 多色ルシフェラーゼの検出方法 | |
| Lashgari et al. | Secreted reporters for monitoring multiple promoter function | |
| Bellah et al. | Structure, enzymatic mechanism of action, applications, advantages, disadvantages and modifications of luciferase enzyme | |
| Close et al. | Light without substrate amendment: the bacterial luciferase gene cassette as a mammalian bioreporter | |
| Ugarova et al. | Bioluminescence and Chemiluminescence | |
| JP2008113619A (ja) | 発光持続性の高いルシフェラーゼを用いた破壊系細胞アッセイ法 | |
| US20060024773A1 (en) | Method for measuring intracellular gene transcription using blue luciferase from dinoflagellate | |
| Alam et al. | Reporter genes for monitoring gene expression in mammalian cells | |
| Golz | Reporter Genes in Cell Based ultra High Throughput Screening | |
| Martineau | A next-generation bacterial biosensor for remote or automated applications |