WO2001027316A1

WO2001027316A1 - Systeme de test de luminescence

Info

Publication number: WO2001027316A1
Application number: PCT/JP2000/007049
Authority: WO
Inventors: Yoshihiro Ohmiya; Masayuki Ryufuku; Masashi Ono; Hideyuki Takeuchi
Original assignee: Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.
Priority date: 1999-10-12
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2001-04-19
Also published as: JP2001103956A

Description

明細

発光検査技術分野

本発明は、生物発光またはそれを模した発光をレポーターおよびシグナルとするあらゆるアツセィ系において、それらを検出および測定する検査方法および検査キッ卜に関する。背景技術

従来、遺伝子の転写活性測定は一般的に、ある種の機能を持ったタンパク質をレポ一夕一として、その酵素活性により定量されている。この機能を持ったタンパク質のなかでも、ホタル 'ルシフェラーゼは、感度，測定時間，操作性等において優れた特徴を有することから、広く用いられている。

レポーター遺伝子による転写活性測定を行う際、個々の実験で生じる微妙な条件の違いによるデータのバラツキを解消するために、ィン夕一ナルコントロール (内部標準）を用いて補正する方法が採られている。これまでホ夕ル ·ルシフエラ一ゼアツセィを生物発光により内部補正するため、ィンターナルコントロールとしてゥミシィ夕ケ由来のシ一パンジー 'ルシフェラーゼを利用した方法が開発され（Wood，K.V. et al. , Promega Note, 57, 2 (1996) ) 用いられてきた。しかしホタルとシーパンジーの両ルシフェラーゼは基質要求性が異なり、しかも発光スベクトルが重なってしまう。そのため、両ルシフェラ一ゼアツセィを測定する際には、各々の発光基質をそれぞれ添加する等、複数の工程を必要とし、これら 2 種類のレポ一夕一を 1回の工程に測定することはできなかった。

また、基質要求性が同一のホタル 'ルシフェラーゼにおいて、最大発光波長の異なる酵素を自然界から探索（Wood, K.V. et al. , Science, 244, 700 (1989))、または人為的突然変異による探索（Nakano, E. et al. , Protein Engineering, 4, 6， 691 (1991))が進められてきた。しかし、これまで得られた多くのホ夕ル ·ルシフエラ一ゼの中から 2種を選択しても互いの発光が重なってしまうため、定量的にそれぞれの発光を同時かつ個別に測定することは困難であった。発明の開示

本発明は、 p H 8において最大発光波長が 6 1 5〜6 2 5 n mであり、かつ半値幅が 6 0 n m以下という特徴的な発光を用いる発光検査システムを提供するものである。さらに、少なくとも 2種類の生物由来の発光機構を用いて、識別し得る複数の発光色（最大発光波長）を生じさせ、これを 1回の工程で検出できる発光検査方法およびキッ卜を供給することを目的とする。

すなわち本発明は、生物由来の発光機構を備えてなり、前記発光機構の発光は、 p H 8において最大発光波長が 6 1 5〜 6 2 5 n mであり、かつ半値幅が 6 0 n m以下の発光であることを特徴とする発光検査システムに関する。

またある実施態様において本発明は、生物由来の少なくとも 2種類の発光機構を備えてなり、前記発光機構の発光の 1つは、 P H 8において最大発光波長が 6 1 5 ~ 6 2 5 n mであり、かつ半値幅が 6 0 n m以下の発光であり、かつ、前記発光機構の別の発光の 1つは、 P H 8において最大発光波長が 4 6 0〜5 5 0 n mの発光であることを特徴とする発光検査システムに関する。

またある実施態様において本発明は、発光機構が、酵素を介した発光基質の酸化反応に基づく機構である上記発光検査システムに関する。

またある実施態様において本発明は、酵素が、発光生物の発光遺伝子の一部を含むベクターより生成したものであることを特徴とする上記発光検査システムに関する。

またある実施態様において本発明は、発光遺伝子が、鉄道虫由来であることを特徴とする上記発光検査システムに関する。

またある実施態様において本発明は、生物由来の少なくとも 2種類の発光機構による発光検査方法であり、前記発光機構の発光の 1つは、 p H 8において最大発光波長が 6 1 5 n m〜 6 2 5 n mであり、かつ半値幅が 6 0 n m以下の発光であり、かつ、前記発光機構の別の発光は、 P H 8において最大発光波長が 4 6 0 〜5 5 0 n mの発光であり、少なくとも 2種類の発光を 1回の工程で検出することを特徴とする発光検査方法に関する。

またある実施態様において本発明は、マグネシウムイオンまたはカルシウムィオンを含む試薬（a) 、発光基質および ATPを含む試薬（b) 、発光生物の発光遺伝子の一部を含む、少なくとも 2種類のベクタ一を含む試薬（c) からなる、少なくとも 2種類の発光機構を備えた発光検査キッ卜であって、前記発光機構の発光の一つは、 pH8において最大発光波長が 6 1 5 nm〜 62 5 nmであり、かつ半値幅が 60 nm以下の発光であり、かつ、前記発光機構の別の 1つの発光は、 pH 8において最大発光波長が 460〜 550 n mの発光であることを特徴とする検査キッ卜に関する。発明を実施するための最良の形態

本発明でいう生物由来の発光機構とは、発光生物が生体内外で発光する機構およびそれを模したものである。具体的には、酵素による発光基質の酸化反応もしくは発光タンパク質の化学反応によって生ずる化学エネルギーが光に変換され発光する機構である。

発光生物には、アメリカホ夕ル（Photinus pyralis)を始め、ヒカリコメツキ (Pyrop orus plagiophthalamus)、ゲンジホ夕リレ（Luciola cruciata)、ヒメボ夕リレ (Luciola parvula)、鉄道虫 (Phr ixothrix)、ゥミホタル（Cypridina hi lgendorf i i)、オヨギゴカイ（Odontosyllis enopla) , 炭水産貝（Latia)、発光バクテリア

(Photobacterium)、発光ェビ (Heterocarpus, O lophorus)、渦べん毛藻 (Gonyaulax)、発光魚（Apogon、 Parapriacanthus)、ゥミシィ夕ケ（Reni 1 la reni iormis)、発光キノコ（Collybia)、ギボシムシ（Balanoglossus)、巨大発光ミミズ（Oc〖ochaetus、 Diplocardia)、ォヮンクラブ（Aeauorea aequorea)、ッノ、 'サコカイ (Chaetopterus) , 発光ォキアミ（Meganyctiphanes)などが挙げられる。

本発明でいう「酵素」とは、触媒活性を有するタンパク質の総称であり、酵素の触媒する反応の反応物質を基質と呼ぶ。

ここでいう「触媒」とは、それ自身は少しも化学変化をこうむらないが、それがまじると化学反応の速度が速く（遅く）なる物質のことである。

本発明における「酵素」は、鉄道虫ルシフェラ一ゼを始め、各種ホ夕ル ·ルシフェラーゼおよびその人為的変異体、シーパンジー .ルシフェラーゼ、ゥミホ夕ル -ルシフェラーゼ等、生物発光に関わるあらゆる酵素を含む。

本発明でいう「発光基質」とは、酵素によって触媒作用を受けて酸化するときに生ずる化学エネルギーを光に変換して発光する化合物または分子である。

本発明における「発光基質」は、鉄道虫ルシフェラーゼゃホタル 'ルシフェラーゼに対するホタル 'ルシフェリンや、シーパンジー ·ルシフェラーゼ、ゥミホタル ·ルシフェラ一ゼ等生物発光に関わる酵素に対応するあらゆる発光基質を含む。

本発明でいう「発光タンパク質」とは、低分子物質の触媒によって光るタンパク質のことであり、ォワンクラゲ由来のェクオリンゃグリーン蛍光タンパク質（G F P )を始め、ツバサゴカイ、発光ォキアミ等生物発光に関わるあらゆる発光タンパク質を含む。

本発明でいう「ベクタ一」とは、組換え D N A実験において宿主に異種 D N A を運搬する D N Aのことをいい、プラスミドまたはファージが使用されている。ここでいう「プラスミド」とは、宿主染色体とは物理的に独立して自律複製し、安定に遺伝することのできる二重鎖閉環状 D N Aである染色体外遺伝因子のことである。また「ファージ」とは、バクテリオファージまたは細菌ウィルス等とも呼ばれる細菌を宿主とするウィルスのことである。

本発明でいう「鉄道虫」とは、南米産の Phr ixothr ixのことであり、頭に赤色の発光器が 1個、体側に黄緑色の発光器が 1 1個ずつ並んでいる。普通は頭の赤色のみが光っているが、刺激すると黄緑色の発光が現れる。

本発明で用いられる p H 8において最大発光波長が 6 1 5〜6 2 5 n mであり、かつ半値幅が 6 0 n m以下の発光は、前記鉄道虫由来の最大発光波長 A max= 6 2 2 n m, 半値幅 5 5 n mの発光を利用することが好ましい。半値幅が 6 0 n mより大きくなると、例えば、 5 5 0 n m付近に最大発光波長を有する発光と重なり、少なくとも 2つの発光をそれぞれ区別することがむずかしくなる。

なお、発光生物由来の発光の最大発光波長および半値幅は、 p Hの影響を受けて大きく変化する場合があるので、 p H 8で前記波形の発光スぺクトルを定義するものである。本発明の生物発光由来の少なくとも 2種類の発光を 1回の工程で検出する組み合わせとしては、鉄道虫由来の最大発光波長 Amax= 6 2 2 nm, 半値幅 5 5 nm の発光と組み合わせて、例えば、鉄道虫由来の Amax= 549 nmのルシフェラーゼ、ホ夕ル ·ルシフェラーゼ（ゲンジボタル： λΐΜΧ= 544 nm、ヒカリコメッキ： λΜΧ= 546 nm) 、シーパンジー ·ルシフェラーゼ（Amax= 47 0〜 49 0 n m)、ゥミホタル 'ルシフェラーゼ（λΜΧ= 460〜 480 n m)がある力これらに限定されるものではない。最大発光波長が 460〜 5 50 nmの発光夕ンパク質も使用できる。この中では、基質要求性が同一であるホ夕ル ·ルシフエラーゼの使用が好ましい。

本発明の発光キットは、発光生物由来の発光遺伝子の一部を含む少なくとも 2 種類のベクターと、ベクターより生成した酵素もしくは発光タンパク質と発光反応可能な発光試薬とからなる。

本発明で使用できる 1つのベクター上には pH 8において最大発光波長が 6 1 5〜62 5 nmであり、かつ半値幅が 60 n m以下であるルシフェラーゼ遺伝子が適当なプロモーター配列の下流に配置されている。ここでプロモーター配列としては、 S V 40初期ェンハンサー Zプロモーター配列、 CM V即時型初期ェンハンサー Zプロモーター配列、 HSV (単純へルぺスウィルス）のチミジンキナーゼ（TK) プロモーター配列、等がある。このベクターを培養細胞にトランスフエクシヨンし、細胞内である一定の発光遺伝子の発現からホ夕ル ·ルシフェラーゼ酵素を生成させ、その生成量を発光量として定量し、この発光量を、例えば、インターナルコントロール（内部標準）とする。

またもう一方のベクター上には pH 8において最大発光波長が 460〜550 nmの発光を示す発光遺伝子が配置され、かつ前記ベクターには、 SV40由来のプロモーター配列を持つもの、 S V 40由来のェンハンサー配列を持つもの、その両配列を含むもの、また両者をふくまないもの、等の 4種類がある。実験目的に合わせたこれらの一つを培養細胞にトランスフエクシヨンし、細胞内である一定の発光遺伝子の発現からホ夕ル ·ルシフェラ一ゼ酵素あるいは発光タンパクを生成させ、その発光量から酵素または発光タンパク質の生成量を導く目的に使用する。本発明で使用される発光試薬は、マグネシウムイオンまたはカルシウムイオンを含む試薬（a) 、および発光基質並びに ATPを含む試薬（b) からなる。試薬（a) と試薬（b) とは、構成として欠くことができないものである力かならずしも、別々に保管しなければならないものではない。

本発明で使用される発光試薬は、少なくとも 2種類の上記ベクターが生成した酵素または発光夕ンパク質の反応に関する発光基質などの成分が求める濃度であることが好ましい。試薬の形態としては凍結品と凍結乾燥品とがある。

凍結品としては、ルシフェリン類、 ATP、 C oA (補酵素 A) 、緩衝成分、 Mg²⁺もしくは C a"を含む成分を凍結したもので、凍結前に溶液の安定化を図る。通常は試薬（a) と試薬（b) とが共存した形態をとる。凍結品は一 70°Cで保存し、解凍後十分に室温に戻した後に使用する。

凍結乾燥品のキットは、ルシフェリン類、 ATP、 C o A (補酵素 A)を含む溶液を凍結乾燥した試薬（b) を含む第 1成分であると、緩衝成分、 Mg²⁺ もしくは C a "を含む溶液である試薬（a) を含む第 2成分であるとからなり、使用直前に第 1成分と第 2成分を混合する。この場合は、第 2成分である溶液の安定化を図り密封して保存する。第 1成分と第 2成分は冷凍保存し、室温に戻してから混合して使用する。

ルシフェラ一ゼによるレポーターアツセィは、簡便にはルミノメーターで発光量を測定し結果を得るが、これは光子量を電気信号に変換し定量させるものであつて、波長の違いを識別できない。そこで、 2種類の発光反応を個別に測定するにあたり、最大発光波長の異なる 2種類の発光を識別するため、例えば 595 η m以下の波長を遮るカツ卜フィルターをルミノメ一夕一装置内に組み込み、カツ卜フィル夕一を使用した場合とそうでない場合とで 2種類の発光量を測定する。カツトフィルターを通して得られる発光量は、 pH 8において最大発光波長が 6 1 5〜 625 nmの波長を持つルシフェラーゼによる発光量であり、この値をィン夕一ナルコントロールとする。また力ットフィルターを通さないで得られた発光量は、 460〜 550 nmの発光を示すルシフェラーゼあるい発光タンパクによる発光量に加え、 6 1 5〜 62 5 nmの波長を持つルシフェラーゼによる発光量の総和として得られる。このためこの総和からカツ卜フィルターを通して得られた発光量を差し引いた値をレポ一夕—アツセィの実験結果に使用する。力ッ卜フィルターを組み込んでいないルミノメ一夕一による測定の場合には、測定に用いるキュべットとして 5 9 5 nm以下の波長を遮る能力を持ったものとそうでないものの 2種類を使用することで、カツ卜フィルターを使用した場合と同様な結果を得ることができる。

またキュベットに 5 9 5 nm以下の波長を遮る能力を持たせる方法として、キュべッ卜にカツトフィル夕一を巻き付ける方法と、キュべッ卜の成形前に 5 9 5 nm以下の波長を遮る（吸収する）色素などの物質を練り込む方法等がある。

このように、ルミノメ一夕一を用いて 1回の工程で 2種類の発光を区別しうる。また、分光光度計または液体シンチレーシヨンカウンターを用いて少なくとも 2種類の発光を測定することが可能である。分光光度計の場合は、ルミノメ一夕一のようなカツ卜フィルタ一の入れ替えの必要はなく 1つのサンプルを 1回の測定で区別できる。特に、マルチチャンネルの測光システム（例えば、大塚電子製 I MUC 7 0 0 ) が有効である。実施例

本発明を実施例を挙げてさらに詳細に説明する。

実施例 1

鉄道虫から単離した最大発光波長え max= 5 4 2 n mのルシフェラ一ゼ遺伝子の c DNAを用意し、これと「ピツカジーンコント口べクタ一 2 (商品名、東洋ィンキ製造株式会社製：製品番号 PGV-C2) 」上の 1 u c +遺伝子と置換させて組み込み、これをテスト · レポ一夕一 'ベクターとした。

また鉄道虫から単離した最大発光波長 λ Χ= 6 2 2 nmのルシフェラ一ゼ遺伝子の c DNAを用意し、これと「シーパンジー TKコントロールベクター（商品名、 Promega製：製品番号 pRL-TK) 」上の R 1 u c遺伝子と置換させて組み込み、これを内部標準レポーター ·ベクタ一とした。

テスト · レポ一夕一 'ベクター 1. 5 i gおよび内部標準レポ一夕一ベクターベクター 1. 5 8を「丁ー 5 0 (商品名、 Promega製：製品番号 E1811)」 6. 7 5 i 1 を用いて CO S細胞へコ卜ランスフエクシヨンし、「DMEM培地（和光純薬工業株式会社製：製品番号 39卜 05915) 」を用い 5 %C0₂インキュベータ —で 3 7°C、 48時間培養した。培養された COS細胞を「ピツカジーン細胞溶解剤 Luc (商品名、東洋インキ製造株式会社製：製品番号 PGC50) 」で溶解し、その上済み 2 0 i 1 を測定チューブに取った。このサンプルに「ピツカジーン発光キット（商品名、東洋インキ製造株式会社製：製品番号 PGL100)」のルシフェラーゼアツセィ試薬（マグネシウムイオン、 ATP、ルシフェリンを含む） 1 0 0 X 1 を加え、ベルトールド社製 L B 9 50 6に 5 9 5 nm以下の波長を遮るカツ卜フィルターを組み込んだルミノメーターで発光量の測定を行った。

カツ卜フィル夕一通したを際の測定値は 15， 245 RLU (Relative Light Unit:相対発光量）で、カットフィル夕一を通さない場合の測定値は 625, 856 RLUであった。これにより、内部標準レポ一夕一：テス卜レポーターの比がおよそ 1 ： 40となり、 1サンプル内の 2種類のレポ一夕一アツセィが同時に測定できた。

実施例 2

ヒカリコメツキから単離した最大発光波長 Amax= 546 nmのルシフェラーゼ遺伝子の c DN Aを用意し、これと「ピツカジーンコント口ベクター 2 (商品名、東洋ィンキ製造株式会社製：製品番号 PGV-C2) 」上の 1 u c +遺伝子と置換させて組み込み、これをテスト ' レポ一夕一 'ベクターとした。

また鉄道虫から単離した最大発光波長 Amax= 6 2 2 nmのルシフェラーゼ遺伝子の c DNAを用意し、これと「シ一パンジー TKコントロールベクタ一（商品名、 Promega製：製品番号 pRL- TK) 」上の R 1 u c遺伝子と置換させて組み込み、これを内部標準レポ一夕一 ·ベクターとした。

テスト · レポ一夕一 'ベクター 1. 5 gおよび内部標準レポーターベクターベクタ一 1. 5 8を「丁 1^: ー 5 0 (商品名、 Promega製：製品番号 E1811)」 6. 7 5 / 】を用いて COS細胞へコトランスフエクシヨンし、「DMEM培地（和光純薬工業株式会社製：製品番号 39卜 05915) 」を用い 5 %C0₂インキュベータ一で 3 7° (：、 48時間培養した。培養された COS細胞を「ピツカジーン細胞溶解剤 Luc (商品名、東洋インキ製造株式会社製：製品番号 PGC50) 」で溶解し、その上済み 20 1 を測定チューブに取った。このサンプルに「ピツカジーン発光キット（商品名、東洋インキ製造株式会社製：製品番号 PGL100)」のルシフェラーゼアツセィ試薬（マグネシウムイオン、 ATP、ルシフェリンを含む） 1 0 0 X 1 を加え、ベルトールド社製 L B 9 5 0 6に 5 9 5 nm以下の波長を遮るカツトフィルターを組み込んだルミノメータ一で発光量の測定を行った。

カツ卜フィル夕一通したを際の測定値は 20， 1859 RLU (Relative Light Unit:相対発光量）で、カットフィルターを通さない場合の測定値は 826, 5142 RLUであつた。これにより、内部標準レポーター：テストレポ一夕一の比がおよそ 1 : 40 となり、 1サンプル内の 2種類のレポ一タ一ァッセィが同時に測定できた。

実施例 3

「シーパンジー n u l 1ベクター（商品名、 Promega製：製品番号 pRL-null)」から切り出したシーパンジー'ルシフェラーゼの構造遺伝子と「ピツカジーンコントロベクター 2 (商品名、東洋インキ製造株式会社製：製品番号 PGV-C2) 」上の 1 u c +遺伝子と置換させて組み込み、これをテスト · レポ一夕一 ·ベクターとした。

また鉄道虫から単離した最大発光波長 Amax= 6 2 2 nmのルシフェラ一ゼ遺伝子の c DNAを用意し、これと「シ一パンジー TKコントロールベクター（商品名、 Promega製：製品番号 PRL-TK) 」上の R 1 u c遺伝子と置換させて組み込み、これを内部標準レポ一夕一 ·ベクタ一とした。

テスト · レポ一夕一 'ベクタ一 1. 5 gおよび内部標準レポ一ター 'ベクタ — 1. 5 gを「T f X— 50 (商品名、 Promega製：製品番号 E1811)」 6. 7 5 1 を用いて COS細胞へコトランスフエクシヨンし、「DMEM培地（和光純薬工業株式会社製：製品番号 39卜 05915) 」を用い 5 %C〇₂インキュベーターで 3 7 、 48時間培養した。培養された COS細胞を「ピツカジーン細胞溶解剤 Luc (商品名、東洋インキ製造株式会社製：製品番号 PGC50) 」で溶解し、その上済み 2 0 1 を測定チューブに取った。このサンプルに「ピツカジーン発光キッ卜（商品名、東洋インキ製造株式会社製：製品番号 PGL100)」のルシフェラーゼァッセィ試薬に、「ピツカジーンデュアル'シーパンジー発光キット（商品名、 Promega 製：製造番号 PGD-S)」に含まれている「シーパンジー発光基質」と「発光基質溶解液」とから調製された「シーパンジー発光基質溶液」 5 0 /i 1 を加えた「ホ夕シーパンジー発光試薬」（マグネシウムイオン、 ATP、ルシフェリンを含む） 1 0 0 / 1 を加え、ベルト一ルド社製 L B 9 5 0 6に 5 9 5 nm以下の波長を遮るカツ卜フィルターを組み込んだルミノメーターで発光量の測定を行った。カツ卜フィル夕一通したを際の測定値は 12， 585 RLU (Relative Light Unit:相対発光量）で、カツトフィルターを通さない場合の測定値は 516， 290 RLUであった。これにより、内部標準レポーター：テストレポ一夕一の比がおよそ 1 : 40となり、 1サンプル内の 2種類のレポーターアツセィが同時に測定できた。

比較例 1

北米産ホタルから単離した最大発光波長/ max= 5 6 2 nmのルシフェラ一ゼ遺伝子を持つ「ピツカジーンコント口ベクター 2 (商品名、東洋インキ製造株式会社製：製品番号 PGV- C2) 」をテスト · レポ一夕一 ·ベクターとした。

また最大発光波長 Amax= 4 7 0〜4 9 0 n mのシ一パンジーりレシフェラ一ゼ遺伝子を持つ「シーパンジー TKコントロールベクター（商品名、 Promega製：製品番号 pRL-TK) 」を内部標準レポーター 'ベクタ一とした。

テスト · レポ一夕一 'ベクタ一 1. 5 gおよび内部標準レポ一夕一べクタ一ベクタ一 1. 5 8を「丁一 5 0 (商品名、 Promega製：製品番号 E1811)」 6. 7 5 1 を用いて CO S細胞へコトランスフエクシヨンし、「DMEM培地（和光純薬工業株式会社製：製品番号 39卜 05915) 」を用い 5 %C〇₂インキュベータ一で 3 7°C、 48時間培養した。培養された COS細胞を「ピツカジーン細胞溶解剤 Luc (商品名、東洋インキ製造株式会社製：製品番号 PGC50) 」で溶解し、その上済み 2 0 /2 1 を測定チューブに取った。このサンプルに「ピツカジーン発光キット（商品名、東洋インキ製造株式会社製：製品番号 PGL100)」のルシフェラ一ゼアツセィ試薬に、「ピツカジーンデュアル ·シ一パンジー発光キット（商品名、 Promega製：製造番号 PGD-S)」に含まれている「シーパンジー発光基質」と「発光基質溶解液」とから調製された「シーパンジー発光基質溶液」 5 0 1 を加えた「ホタル Zシ一パンジー発光試薬」（マグネシウムイオン、 ATP、ルシフェリンを含む） 1 0 0 / 1 を加え、ベルトールド社製 L B 9 5 0 6に 5 3 0 nm以下の波長を遮るカツ卜フィルターを組み込んだルミノメーターで発光量の測定を行つた。

カツ卜フィル夕一通したを際の測定値は 104, 963 RLU (Relative Light UnU:相対発光量）で、カットフィルターを通さない場合の測定値は 256, 232 RLUであった。これにより、内部標準レポ一夕一：テストレポ一夕一の比がおよそ 1 ： 1 . 4となり、前記内部標準レポ一夕一とテストレポ一夕一とで得られる比に及ばず 2種類の発光が重なって測定された。

本発明により、レポ一夕一遺伝子による転写活性測定を行う際にィンターナルコントロールを用いてアツセィしても、複数の行程を必要とせず一度でしかも安定な結果が得られる優れた発光反応が可能となる。

Claims

請求の範囲

1. 生物由来の発光機構を備えてなり、前記発光機構の発光は、 pH8において最大発光波長が 6 1 5〜6 2 5 nmであり、かつ半値幅が 60 nm以下の発光であることを特徴とする発光検査システム。

2. 少なくとも 2種類の生物由来の発光機構を備えてなり、前記発光機構の第一の発光は、 pH8において最大発光波長が 6 1 5〜62 5 nmであり、かつ半値幅が 60 nm以下の発光であり、かつ、前記発光機構の第二の発光の一つは、 pH 8において最大発光波長が 460〜5 50 n mの発光であることを特徴とする発光検査システム。

3. 前記発光機構が、酵素を介した発光基質の酸化反応に基づく機構である請求項 1記載の発光検査システム。

4. 前記発光機構が、酵素を介した発光基質の酸化反応に基づく機構である請求項 2記載の発光検査システム。

5. 前記酵素が、発光生物の発光遺伝子の一部を含むベクターより生成したものであることを特徴とする請求項 3記載の発光検査システム。

6. 前記酵素が、発光生物の発光遺伝子の一部を含むベクターより生成したものであることを特徴とする請求項 4記載の発光検査システム。

7. 発光遺伝子が、鉄道虫由来であることを特徴とする請求項 5記載の発光

8. 前記発光機構の第一の発光をもたらす前記発光遺伝子が、鉄道虫由来であることを特徴とする請求項 6記載の発光検査システム。

9. 前記発光機構の第二の発光をもたらす前記発光遺伝子が、ルシフェラーゼ、ホ夕ル ·ルシフェラーゼ、シ一パンジ一 'ルシフェラ一ゼおよびゥミホタル - ルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項 8記載の発光検査システム。

1 0. 生物由来の少なくとも 2種類の発光機構による発光検査方法であり、前記発光機構の 1つの発光は、 P H 8において最大発光波長が 6 1 5 nm〜62 5 nmであり、かつ半値幅が 60 nm以下の発光であり、かつ、前記発光機構の別の発光は、 p H 8において最大発光波長が 460〜 550 nmの発光であり、少なくとも 2種類の発光を 1回の工程で検出することを特徴とする発光検査方法。

1 1. マグネシウムイオンまたはカルシウムイオンを含む試薬（a) 、発光基質および AT Pを含む試薬（b) 、発光生物の発光遺伝子の一部を含む、少なくとも 2種類のベクターを含む試薬（c) からなる、少なくとも 2種類の発光機構を備えた発光検査キットであって、前記発光機構の 1つの発光は、 pH8において最大発光波長が 6 1 5 ηπ！〜 62 5 nmであり、かつ半値幅が 6 0 nm以下の発光であり、かつ、前記発光機構の別の 1つの発光は、 pH 8において最大発光波長が 460〜 550 nmの発光であることを特徴とする検査キット。