CN116063546A - 一种基于共振能量转移的全遗传编码nad+蛋白探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于共振能量转移的全遗传编码nad+蛋白探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于共振能量转移的全遗传编码NAD+蛋白探针及其制备方法和应用，具体公开了一种全基因编码NAD+蛋白探针，其由共振能量转移给体、NAD+响应蛋白和共振能量转移受体串联而成；其中NAD+响应蛋白为DNA连接酶的突变体，所述的DNA连接酶的突变体序列如SEQ ID NO.3，或SEQ IDNO.6所示；所述共振能量转移给体选自萤光素酶或荧光蛋白；所述共振能量转移受体选自荧光蛋白且作为共振能量转移受体的荧光蛋白与共振能量转移给体的荧光蛋白不同。本发明的蛋白探针能够在活细胞中合成并用于检测活细胞中的NAD+浓度。

Description

一种基于共振能量转移的全遗传编码NAD+蛋白探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明专利属于生物探针领域，具体涉及一种基于共振能量转移的全遗传编码NAD+蛋白探针及其制备方法和应用。
背景技术
目前，生物样品中的NAD+含量可用如下方法检测：
1)NAD+比色试剂盒：
NAD+比色试剂盒首先利用酶促反应将NAD+全部转化为NADH，然后利用生成的NADH还原一种染料分子使其吸光度变化，最后通过分光光度计确定染料分子浓度以反推得到样品中的NAD+浓度。
2)高效液相色谱-质谱联用：
在高效液相色谱-质谱联用方法中，利用高效液相色谱层析方法分离待测样品中的不同组分，同时检测不同组分的吸光强度。在高效液相色谱层析的同时，不同组分通过离子化进入质谱，利用核质比对不同组分定性，利用离子强度对不同组分定量。
3)基于荧光强度变化的荧光蛋白探针：
利用蛋白工程设计感应NAD+的荧光蛋白探针。该方法通常将NAD+感应蛋白与荧光蛋白融合，利用NAD+感应蛋白与NAD+特异性结合后产生的构象变化调节荧光蛋白构象，进一步影响荧光蛋白的量子产率等光学特征，从而使探针中的荧光蛋白所发射的荧光信号强弱随体系中NAD+浓度的变化而变化。
4)基于共振能量转移的半合成NAD+蛋白探针：
该方法利用荧光或生物发光共振能量转移原理检测NAD+浓度，并利用重组蛋白(蛋白部分)和合成荧光配体分子(合成部分)共同构建半合成蛋白探针以实现NAD+检测。该类探针由萤光素酶(或荧光蛋白)、NAD+结合蛋白和自标记蛋白融合而成，其中自标记蛋白上通过共价键链接了一个合成分子，该合成分子包含了一个红色荧光团和一个NAD+结合蛋白的配体。NAD+结合蛋白与配体的亲和力受体系中NAD+浓度调控，因此在自然状态下，传感蛋白中的NAD+结合蛋白与配体不结合，探针处于打开状态，荧光团和萤光素酶(或荧光蛋白)疏远，能量共振转移不发生，探针整体发出萤光素酶(或荧光蛋白)的原有发射光。当体系中NAD+浓度升高时，NAD+结合蛋白与配体结合，使荧光团和萤光素酶(或荧光蛋白)靠近，发生能量共振转移，使探针整体发出荧光团的红光。该探针的发光颜色随着样品中NAD+浓度的变化而变化，因此测量萤光素酶(或荧光蛋白)和红色荧光团的发光强度比值即可定量体系中的NAD+浓度。
NAD+比色试剂盒和高效液相色谱-质谱联用法均无法测量活细胞内的NAD+浓度。基于该类方法的单次检测需要裂解大量细胞(约一百万个)，此裂解过程丢失了细胞NAD+浓度的时间和空间信息；同时，样品裂解过程会改变胞内NAD+浓度，导致结果不准确；另外，检测单个样品需耗时10到30分钟，且依赖大型仪器，严重限制了大批量样品的检测，是NAD+代谢研究和药物开发的限速步骤之一。
基于荧光探针的活细胞NAD+测量方法尚难以完成活细胞和亚细胞结构中NAD+动态变化的长时间测量，主要原因在于目前荧光探针需要依赖荧光显微成像读数，激发荧光的光毒性使长时间测量活细胞难以实现。同时，该类探针的使用依赖荧光显微镜等大型精密仪器，限制了大批量样品的检测。另外，该类探针利用单一波长的荧光强度信号定量NAD+浓度，导致探针分子表达量的动态差异对NAD+定量带来明显干扰。因此，该类探针使用过程中依赖其他颜色的内标荧光蛋白作为校准工具，使该类探针的使用过程较为复杂。
基于共振能量转移的半合成NAD+蛋白探针利用了共振能量转移的原理定量NAD+浓度，实现了自我校准，不再依赖单一波长，而是双波长光强比值定量待测物浓度。但是由于该类型探针由重组蛋白和合成荧光配体分子共同组成，进行活细胞NAD+检测时，细胞只能自主表达探针的融合蛋白部分，而合成分子部分需要在胞外提供。对胞外合成分子的依赖限制了该类探针在大量活细胞样品长时间观察等条件下的应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明实现了基于共振能量转移的全基因编码NAD+蛋白探针。
在探针功能上，本发明1)实现了探针结构的全基因编码，完成了不依赖合成荧光配体分子的共振能量转移NAD+定量，2)实现了探针信号的自我校准，即基于双波长光强比值的NAD+定量。
本发明提供几种基于共振能量转移的全基因编码NAD+分子探针。该系列分子探针能够在体外及细胞内响应NAD+分子，且具有高特异性，适宜的C50值(导致50％探针构象变化时的待测物浓度)和高动态范围等优点。
本发明一个方面提供了一种全基因编码NAD+蛋白探针，其由共振能量转移给体、NAD+响应蛋白和共振能量转移受体串联而成；其中NAD+响应蛋白为DNA连接酶的突变体，所述的DNA连接酶的突变体序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6所示，所述共振能量转移给体选自萤光素酶或荧光蛋白；所述共振能量转移受体选自荧光蛋白且作为共振能量转移受体的荧光蛋白与共振能量转移给体的荧光蛋白不同。
进一步地，共振能量转移给体选自环状排列的生物发光蛋白cpNLuc(circularlypermuted Nano Luciferase)或绿色荧光蛋白mNeoGreen。更进一步地，环状排列的生物发光蛋白cpNLuc为引入G4V突变的生物发光蛋白cpNLuc。更优选地，cpNLuc的突变体序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8。绿色荧光蛋白mNeoGreen序列为SEQ ID NO.10或SEQ IDNO.13。
进一步地，共振能量转移受体选自绿色荧光蛋白mNeoGreen或红色荧光蛋白mScarlet。更进一步地，红色荧光蛋白mScarlet为删除了其中的残基G225的红色荧光蛋白mScarlet。更优选地，mScarlet的突变体序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.12。绿色荧光蛋白mNeoGreen序列为SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.13。
进一步地，所述NAD+蛋白探针由mScarlet突变体、LigA突变体和cpNLuc突变体串联构成，优选地，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7。
进一步地，所述NAD+蛋白探针由mNeoGreen突变体、LigA突变体和cpNLuc突变体串联构成，优选地，其氨基酸序列为SEQ ID NO.9。
进一步地，所述NAD+蛋白探针由mScarlet突变体、LigA突变体和mNeoGreen突变体蛋白构成，优选地，其氨基酸序列为SEQ ID NO.11。
在探针结构上，本发明1)设计了一个构象受NAD+剧烈调控的蛋白结构域，即NAD+响应蛋白，2)将NAD+响应蛋白的N端和C端分别和能形成共振能量转移现象的给体和受体融合。该共振能量转移给体和受体分别为一个萤光素酶和一个荧光蛋白，或者两个不同颜色的荧光蛋白。3)优化了NAD+响应蛋白和共振能量转移给体及受体之间的链接方式以最大化探针的动态范围。4)优化了NAD+响应蛋白与NAD+的结合位点以调节探针对NAD+检测的浓度范围。
本发明另一个方面提供了上述NAD+蛋白探针在制备检测NAD+浓度的试剂中的用途。
本发明又一个方面提供了一种检测NAD+浓度的组合物，所述组合物中包含了上述NAD+分子探针。
进一步地，所述组合物中还包含缓冲液。
进一步地，所述组合物中还包含生物发光底物，例如Furimazine。
本发明再一个方面提供了一种编码上述NAD+蛋白探针的核苷酸序列。
本发明再一个方面提供了一种载体，所述载体包含上述核苷酸序列。
优选地，所述的载体为慢病毒表达载体，例如pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo载体或pcDNA3.1载体。
本发明再一个方面提供了一种能够表达上述NAD+蛋白探针的细胞。
优选地，所述细胞通过在活细胞中转入上述载体后获得，所述载体在细胞内能够翻译获得上述NAD+蛋白探针。
优选地，所述活细胞可以选择任意的人或动物细胞，例如选自HEK293、CHO、和HepG2等。
本发明再一个方面提供了上述细胞在制备研究NAD+的实验模型中的用途。
优选地，所述实验模型用于研究NAD+激动剂或抑制剂。
本发明再一个方面提供了一种检测NAD+浓度的方法，所述方法包括以下步骤
S11)采用本发明上述蛋白探针与待检测NAD+浓度的试剂混合，
S12)分别在探针中的共振能量转移给体和共振能量转移受体的最大发光波长下检测发光强度，计算二者的发光强度的比值；
S13)在标准曲线上回归获得对应的NAD+浓度；或者
S13)检测不同时间点发光强度的比值，并获得不同时间点NAD+浓度变化的趋势；或者
S13)检测添加不同活性成分后，发光强度的比值的变化，获得不同活性成分对于NAD+浓度变化的影响。
优选地，步骤S11)中当所述蛋白探针中的共振能量转移给体为荧光素酶时，在检测发光强度前还需要添加生物发光底物。
优选地，步骤S13)中标准曲线的制备方法为，采用不同标准浓度的NAD+，分别采用步骤S11-S12检测对应不同浓度的NAD+对应的发光强度比值，并以NAD+浓度的对数值为横坐标，发光强度比值为纵坐标作标准曲线。
本发明再一个方面提供了一种检测活细胞内NAD+浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
S21)将上述载体通过慢病毒感染法转入待测细胞中，并通过荧光蛋白的荧光信号作为标记筛选获得待测稳转细胞系；
S22)将分别在载体中的核苷酸编码的NAD+蛋白探针中的共振能量转移给体和共振能量转移受体的最大发光波长下检测发光强度，计算二者的发光强度的比值；
S23)在标准曲线上回归获得对应细胞内的NAD+浓度；或者
S23)检测不同时间点发光强度的比值，并获得不同时间点细胞内NAD+浓度变化的趋势；或者
S23)检测添加不同活性成分后，发光强度的比值的变化，获得不同活性成分对于细胞内NAD+浓度变化的影响。
在探针应用上，本发明构建了稳定表达NAD+共振能量转移蛋白探针的细胞系，实现了活细胞内NAD+浓度的表征。
有益效果
本发明创新地实现了基于共振能量转移的全基因编码NAD+蛋白探针。在背景技术中，全基因编码的NAD+蛋白探针不基于共振能量转移原理，因此仅能依赖荧光蛋白发射光强度实现NAD+定量，难以排除探针分子表达量的动态差异对NAD+定量带来的明显干扰。另一种背景技术使用了半合成设计，实现了基于共振能量转移的NAD+定量，解决了探针分子表达量带来的干扰，但是对非基因编码的合成分子的依赖限制了半合成探针在活细胞中的应用。相对于半合成的探针(其中一部分不是氨基酸序列，无法在细胞内编码)，全编码探针的难题是难以找到合适的蛋白片段和设计方法以实现媲美半合成探针的巨大构象变化。但本发明实现了这一突破。而且本发明提供的NAD+蛋白探针不但实现了基于共振能量转移的NAD+定量和探针的全基因编码，即实现了探针信号的自我校准，即基于双波长光强比值的NAD+定量；又实现了不依赖合成荧光配体分子的活细胞NAD+监测。
同时本发明明确了全新的、拥有更好功能的NAD+蛋白探针氨基酸序列。相比于背景技术，本发明提供的全基因编码NAD+蛋白探针拥有完全不同的氨基酸序列。其中，本探针使用的NAD+响应蛋白为全新的、含有结构域界面残基突变(R68N/R163D或R68N/R163P)的DNA连接酶LigA突变体。同时，本探针使用了全新的链接方式将NAD+响应蛋白同共振能量转移给体及受体串联起来，具体表现为：删除mScarlet的残基G225、LigA的残基P5、cpNluc的残基G1、L2、和S3；在cpNluc组分引入G4V突变。
附图说明
图1(A)是本发明基于共振能量转移NAD+分子探针检测NAD+分子浓度的原理图。在本发明中，如图1A所示当NAD+响应蛋白不结合NAD+分子时，探针结构处于“开放”状态，导致共振能量转移给体和受体之间距离较远，共振能量转移效率较低，探针整体发出共振能量转移给体的光。当NAD+响应蛋白结合NAD+分子后，其构象由“开放”转变为“闭合”状态，促使共振能量转移给体和受体靠近，形成较高的共振能量转移效率，探针发出共振能量转移受体的光。NAD+分子引起的共振能量转移效率变化，最终表现为探针内共振能量转移给体和受体发射波长强度的变化。该发射光强比值进而可指示体系中NAD+分子的浓度。图1(B)是纯化的NAD+分子探针NADS1.0、NADS1.1、和NADS1.2响应不同浓度NAD+时，590nm和440nm处峰值比值变化。横坐标为NAD+浓度的对数值，纵坐标为归一化的590nm和440nm处光强度比值。图1(C)为纯化的NAD+分子探针NADS1.0、NADS1.1、和NADS1.2响应不同浓度NAD+时(以NADS1.2为代表)，生物发光光谱图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为归一化的生物发光强度。
图2(A)是纯化的NAD+分子探针NADS2.0响应不同浓度NAD+时，515nm和440nm处峰值比值变化。横坐标为NAD+浓度的对数值，纵坐标为515nm和440nm处光强度比值。图2(B)为纯化的NAD+分子探针NADS2.0响应不同浓度NAD+时，生物发光光谱图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为归一化的生物发光强度。
图3(A)是纯化的NAD+分子探针NADS3.0响应不同浓度NAD+时，585nm和515nm处峰值比值变化。横坐标为NAD+浓度的对数值，纵坐标为585nm和515nm处光强度比值。(B)为纯化的NAD+分子探针NADS3.0响应不同浓度NAD+时，荧光光谱图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为归一化的生荧光强度。
图4为纯化的NAD+分子探针NADS1.2响应不同NAD+类似物时，590nm和440nm处峰值比值变化。横坐标为NAD+浓度的对数值，纵坐标为归一化的590nm和440nm处光强度比值。
图5(A)是探针NADS1.0转入HEK293细胞的明场和RFP荧光图像。图5(B)是稳转HEK293对照组和不同化合物处理组的590nm和440nm处发光强度比值随时间变化图。
图5(C)是稳转HEK293对照组合不同化合物处理组的平均590nm和440nm处光强度比值图，所有的P值均是使用非配对双尾Student’s t tests计算得到。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1NAD+分子探针的制备
制备NAD+分子探针，探针序列如下所示：
NADS1.0序列如SEQ ID NO.1所示
mScarlet突变体-LigA突变体-cpNluc突变体。
MVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFTKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHSTLTLTAATTRAQELRKQLNQYSHEYYVKDQPSVEDYVYDRLYKELVDIETEFPDLITPDSPTQNVGGKVLSGFEKAPHDIPMYSLNDGFSKEDIFAFDERVRKAIGKPVAYCCELLIDGLAISLRYENGVFVRGATRGDGTVGENITENLRTVRSVPMDLTEPISVEVRGECYMPKQSFVALNEEREENGQDIFANPRNAAAGSLRQLDTKIVAKRNLNTFLYTVADFGPMKAKTQFEALEELSAIGFRTNPERQLCQSIDEVWAYIEEYHEKRSTLPYEINGIVIKVNEFALQDELGFTVKAPRWAIAYKFPGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGTGGSGGTGGSMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYE SEQ ID NO.1
其中，mScarlet突变体1序列如SEQ ID NO.2所示：
MVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFTKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHST SEQ ID NO.2
LigA突变体1序列如SEQ ID NO.3所示：
LTLTAATTRAQELRKQLNQYSHEYYVKDQPSVEDYVYDRLYKELVDIETEFPDLITPDSPTQNVGGKVLSGFEKAPHDIPMYSLNDGFSKEDIFAFDERVRKAIGKPVAYCCELLIDGLAISLRYENGVFVRGATRGDGTVGENITENLRTVRSVPMDLTEPISVEVRGECYMPKQSFVALNEEREENGQDIFANPRNAAAGSLRQLDTKIVAKRNLNTFLYTVADFGPMKAKTQFEALEELSAIGFRTNPERQLCQSIDEVWAYIEEYHEKRSTLPYEINGIVIKVNEFALQDELGFTVKAPRWAIAYKFP SEQ ID NO.3
cpNluc突变体1序列如SEQ ID NO.4所示：
GDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGTGGSGGTGGSMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYE SEQ ID NO.4
NADS1.1序列如SEQ ID NO.5所示
mScarlet突变体-LigA突变体-cpNluc突变体
MVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFTKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHSTLTLTAATTRAQELRKQLNQYSHEYYVKDQPSVEDYVYDRLYKELVDIETEFPDLITPDSPTQNVGGKVLSGFEKAPHDIPMYSLNDGFSKEDIFAFDERVRKAIGKPVAYCCELLIDGLAISLRYENGVFVRGATRGDGTVGENITENLRTVRSVPMPLTEPISVEVRGECYMPKQSFVALNEEREENGQDIFANPRNAAAGSLRQLDTKIVAKRNLNTFLYTVADFGPMKAKTQFEALEELSAIGFRTNPERQLCQSIDEVWAYIEEYHEKRSTLPYEINGIVIKVNEFALQDELGFTVKAPRWAIAYKFPGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGTGGSGGTGGSMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYE SEQ ID NO.5
mScarlet突变体1序列如SEQ ID NO.2所示：
MVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFTKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHST SEQ ID NO.2
LigA突变体2序列如SEQ ID NO.6所示：
LNQYSHEYYVKDQPSVEDYVYDRLYKELVDIETEFPDLITPDSPTQNVGGKVLSGFEKAPHDIPMYSLNDGFSKEDIFAFDERVRKAIGKPVAYCCELLIDGLAISLRYENGVFVRGATRGDGTVGENITENLRTVRSVPMPLTEPISVEVRGECYMPKQSFVALNEEREENGQDIFANPRNAAAGSLRQLDTKIVAKRNLNTFLYTVADFGPMKAKTQFEALEELSAIGFRTNPERQLCQSIDEVWAYIEEYHEKRSTLPYEINGIVIKVNEFALQDELGFTVKAPRWAIAYKFPSEQ ID NO.6
cpNluc突变体1序列如SEQ ID NO.4所示：
GDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGTGGSGGTGGSMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYE SEQ ID NO.4
NADS1.2序列如SEQ ID NO.7所示
mScarlet突变体-LigA突变体-cpNluc突变体
MVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFTKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHSTLTLTAATTRAQELRKQLNQYSHEYYVKDQPSVEDYVYDRLYKELVDIETEFPDLITPDSPTQNVGGKVLSGFEKAPHDIPMYSLNDGFSKEDIFAFDERVRKAIGKPVAYCCELLIDGLAISLRYENGVFVRGATRGDGTVGENITENLRTVRSVPMDLTEPISVEVRGECYMPKQSFVALNEEREENGQDIFANPRNAAAGSLRQLDTKIVAKRNLNTFLYTVADFGPMKAKTQFEALEELSAIGFRTNPERQLCQSIDEVWAYIEEYHEKRSTLPYEINGIVIKVNEFALQDELGFTVKAPRWAIAYKFPVDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGTGGSGGTGGSMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYE SEQ ID NO.7
mScarlet突变体1序列如SEQ ID NO.2所示：
MVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFTKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHST SEQ ID NO.2
LigA突变体1序列如SEQ ID NO.3所示：
LTLTAATTRAQELRKQLNQYSHEYYVKDQPSVEDYVYDRLYKELVDIETEFPDLITPDSPTQNVGGKVLSGFEKAPHDIPMYSLNDGFSKEDIFAFDERVRKAIGKPVAYCCELLIDGLAISLRYENGVFVRGATRGDGTVGENITENLRTVRSVPMDLTEPISVEVRGECYMPKQSFVALNEEREENGQDIFANPRNAAAGSLRQLDTKIVAKRNLNTFLYTVADFGPMKAKTQFEALEELSAIGFRTNPERQLCQSIDEVWAYIEEYHEKRSTLPYEINGIVIKVNEFALQDELGFTVKAPRWAIAYKFP SEQ ID NO.3
cpNluc突变体2序列如SEQ ID NO.8所示：
VDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGTGGSGGTGGSMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYE SEQ ID NO.8
NADS2.0序列如SEQ ID NO.9所示
mNeoGreen突变体-LigA突变体-cpNluc突变体
MASLPATHELHIFGSINGVDFDMVGQGTGNPNDGYEELNLKSTKGDLQFSPWILVPHIGYGFHQYLPYPDGMSPFQAAMVDGSGYQVHRTMQFEDGASLTVNYRYTYEGSHIKGEAQVKGTGFPADGPVMTNSLTAADWCRSKKTYPNDKTIISTFKWSYTTGNGKRYRSTARTTYTFAKPMAANYLKNQPMYVFRKTELKHSKTELNFKEWQKAFTDKLTLTAATTRAQELRKQLNQYSHEYYVKDQPSVEDYVYDRLYKELVDIETEFPDLITPDSPTQNVGGKVLSGFEKAPHDIPMYSLNDGFSKEDIFAFDERVRKAIGKPVAYCCELLIDGLAISLRYENGVFVRGATRGDGTVGENITENLRTVRSVPMDLTEPISVEVRGECYMPKQSFVALNEEREENGQDIFANPRNAAAGSLRQLDTKIVAKRNLNTFLYTVADFGPMKAKTQFEALEELSAIGFRTNPERQLCQSIDEVWAYIEEYHEKRSTLPYEINGIVIKVNEFALQDELGFTVKAPRWAIAYKFPVDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGTGGSGGTGGSMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYE SEQ ID NO.9
mNeoGreen1突变体序列如SEQ ID NO.10所示：
MASLPATHELHIFGSINGVDFDMVGQGTGNPNDGYEELNLKSTKGDLQFSPWILVPHIGYGFHQYLPYPDGMSPFQAAMVDGSGYQVHRTMQFEDGASLTVNYRYTYEGSHIKGEAQVKGTGFPADGPVMTNSLTAADWCRSKKTYPNDKTIISTFKWSYTTGNGKRYRSTARTTYTFAKPMAANYLKNQPMYVFRKTELKHSKTELNFKEWQKAFTDKSEQ ID NO.10
LigA1突变体序列如SEQ ID NO.3所示：
LTLTAATTRAQELRKQLNQYSHEYYVKDQPSVEDYVYDRLYKELVDIETEFPDLITPDSPTQNVGGKVLSGFEKAPHDIPMYSLNDGFSKEDIFAFDERVRKAIGKPVAYCCELLIDGLAISLRYENGVFVRGATRGDGTVGENITENLRTVRSVPMDLTEPISVEVRGECYMPKQSFVALNEEREENGQDIFANPRNAAAGSLRQLDTKIVAKRNLNTFLYTVADFGPMKAKTQFEALEELSAIGFRTNPERQLCQSIDEVWAYIEEYHEKRSTLPYEINGIVIKVNEFALQDELGFTVKAPRWAIAYKFP SEQ ID NO.3
cpNluc突变体2序列如SEQ ID NO.8所示：
VDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVT
GTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGTGGSGGTGGSMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYE SEQ ID NO.8
NADS3.0序列如SEQ ID NO.11所示
mScarlet突变体-LigA突变体-mNeoGreen突变体
MVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFTKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHLTLTLTAATTRAQELRKQLNQYSHEYYVKDQPSVEDYVYDRLYKELVDIETEFPDLITPDSPTQNVGGKVLSGFEKAPHDIPMYSLNDGFSKEDIFAFDERVRKAIGKPVAYCCELLIDGLAISLRYENGVFVRGATRGDGTVGENITENLRTVRSVPMDLTEPISVEVRGECYMPKQSFVALNEEREENGQDIFANPRNAAAGSLRQLDTKIVAKRNLNTFLYTVADFGPMKAKTQFEALEELSAIGFRTNPERQLCQSIDEVWAYIEEYHEKRSTLPYEINGIVIKVNEFALQDELGFTVKAPRWAIAYKFPPPATHELHIFGSINGVDFDMVGQGTGNPNDGYEELNLKSTKGDLQFSPWILVPHIGYGFHQYLPYPDGMSPFQAAMVDGSGYQVHRTMQFEDGASLTVNYRYTYEGSHIKGEAQVKGTGFPADGPVMTNSLTAADWCRSKKTYPNDKTIISTFKWSYTTGNGKRYRSTARTTYTFAKPMAANYLKNQPMYVFRKTELKHSKTELNFKEWQKAFTDVMGMDELYK SEQ ID NO.11
mScarlet序列2如SEQ ID NO.12所示：
MVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFTKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHLT SEQ ID NO.12
LigA突变体1序列如SEQ ID NO.3所示：
LTLTAATTRAQELRKQLNQYSHEYYVKDQPSVEDYVYDRLYKELVDIETEFPDLITPDSPTQNVGGKVLSGFEKAPHDIPMYSLNDGFSKEDIFAFDERVRKAIGKPVAYCCELLIDGLAISLRYENGVFVRGATRGDGTVGENITENLRTVRSVPMDLTEPISVEVRGECYMPKQSFVALNEEREENGQDIFANPRNAAAGSLRQLDTKIVAKRNLNTFLYTVADFGPMKAKTQFEALEELSAIGFRTNPERQLCQSIDEVWAYIEEYHEKRSTLPYEINGIVIKVNEFALQDELGFTVKAPRWAIAYKFP SEQ ID NO.3
mNeoGreen突变体2序列如SEQ ID NO.13所示：
PPATHELHIFGSINGVDFDMVGQGTGNPNDGYEELNLKSTKGDLQFSPWILVPHIGYGFHQYLPYPDGMSPFQAAMVDGSGYQVHRTMQFEDGASLTVNYRYTYEGSHIKGEAQVKGTGFPADGPVMTNSLTAADWCRSKKTYPNDKTIISTFKWSYTTGNGKRYRSTARTTYTFAKPMAANYLKNQPMYVFRKTELKHSKTELNFKEWQKAFTDVMGMDELYK SEQ ID NO.13
实施例2基于生物发光共振能量转移(BRET)的全遗传编码NAD+分子探针用于样品中NAD+含量的测定。
验证本发明提供的NAD+分子探针NADS1.0、NADS1.1、NADS1.2、和NADS2.0能够用于样品中的NAD+含量测定，进行如下步骤所示的滴定实验：
(1)配制如下样品
探针溶液：用HEPES缓冲液(50mM NaCl，50mM HEPES，pH 7.2)将纯化的NAD+分子探针稀释至4nM，临时置于冰盒中备用；
NAD+溶液：采用3-倍连续梯度稀释法制备不同浓度(50mM，16.7mM，5.56mM，1.85mM，617μM，206μM，68.6μM和22.9μM)的NAD+溶液，所用的缓冲液为HEPES缓冲液，存放在冰盒中；
生物发光底物溶液：用水将生物发光底物溶液稀释100-倍，避光保存于冰盒中。
(2)向白色96孔酶标板中分别加入80μL探针溶液、10μL NAD+溶液和10μL生物发光底物溶液，立即用多通道移液器轻轻地多次(至少8次)吹吸混匀；用Flex Station3多功能酶标仪在发光模式下读取波长440nm和波长590nm(NADS1.0、NADS1.1、和NADS1.2)或波长515nm(NADS2.0)处光强值，连续监测5min，并计算该时间段的平均受体与给体发光的比值。探针在不同NAD+浓度下的发光波谱通过监测波长范围360-650nm内的光强值获得。
由图1B可见，不同NAD+浓度下，探针NADS1.0、NADS1.1、和NADS1.2的590/440光强比值不同，并在一定NAD+浓度范围内(10μM-1mM)随着浓度增高而变大。图1C是在不同波长的扫描光谱结果，可以看出在590nm和440nm有两个明显的吸收峰，分别为给体和受体的吸收峰。图1结果还显示，本发明探针为可定量测量生理浓度范围的NAD+分子，通过在LigA突变体上引入不同突变，设计产生不同亲和力的探针版本NADS1.0、NADS1.1、和NADS1.2，其C50值(导致50％探针构象变化时的待测物浓度)分别为235μM、388μM、和126μM，可用于不同浓度范围的NAD+检测场景。
由图2显示的是NADS2.0的结果，从图2可知，不同NAD+浓度下，探针NADS2.0的515/440光强值不同，并在一定NAD+浓度范围内(10μM-1mM)随着浓度增高而变大。图2B是在不同波长的扫描光谱结果，可以看出在515nm和440nm有两个明显的吸收峰。与实施例结果类似，本实施例探针同样具有高动态范围(1.8倍)，其C50值为364μM。
说明本发明的NAD+分子探针NADS1.0、NADS1.1、NADS1.2、和NADS2.0在不同波长光强比不同，可以通过不同的光强比回归计算获得NAD+浓度。可以用于NAD+含量的测定，且可测定的浓度范围比较宽。
实施例3基于荧光共振能量转移(FRET)的全遗传编码NAD+分子探针用于样品中NAD+含量的测定。
验证本发明提供的NAD+分子探针NADS3.0能够用于样品中的NAD+含量测定，进行如下步骤所示的滴定实验：
(1)配制如下样品
探针溶液：用HEPES缓冲液(50mM NaCl，50mM HEPES，pH 7.2)将纯化的NAD+分子探针稀释至2μM，临时置于冰盒中备用；
NAD+溶液：采用3-倍连续梯度稀释法制备不同浓度(50mM，16.7mM，5.56mM，1.85mM，617μM，206μM，68.6μM和22.9μM)的NAD+溶液，所用的缓冲液为HEPES缓冲液，存放在冰盒中。
(2)向黑色96孔酶标板中分别加入90μL探针溶液和10μL NAD+溶液，立即用多通道移液器轻轻地多次(至少8次)吹吸混匀；用Flex Station3多功能酶标仪在荧光模式下，激发波长设置为470nm,测量515nm和585nm处的发射波长，连续监测5min，并计算该时间段的平均585nm比515nm发光比值。探针在不同NAD+浓度下的发光波谱通过监测波长范围500-600nm内的发射光强值获得。
由图3可见，不同NAD+浓度下，探针NADS3.0的585/515光强比值不同，并在一定NAD+浓度范围内(10μM-1mM)随着浓度增高而变大。说明本发明的NAD+分子探针NADS3.0可以用于NAD+含量的测定。探针NADS3.0是基于荧光共振能量转移的NAD+分子探针，其动态范围为1.21倍，C50值为162μM。
实施例4NAD+分子探针对不同NAD+类似物的响应。
验证本发明提供的NAD+分子探针具有高选择性，以NADS1.2为例进行如下步骤所示的滴定实验：
(1)配制如下样品
探针溶液：用HEPES缓冲液(50mM NaCl，50mM HEPES，pH 7.2)将纯化的NAD+分子探针稀释至4nM，临时置于冰盒中备用；
NAD+及类似物溶液：采用3-倍连续梯度稀释法制备不同浓度(50mM，16.7mM，5.56mM，1.85mM，617μM，206μM，68.6μM和22.9μM)的NAD+、NADP+、和NADPH溶液，不同浓度(100mM，33.3mM，11.1mM，3.7mM，1.23mM，412μM，137μM和45.7μM)的NADH，NMN和NRH溶液，不同浓度(40mM，13.3mM，4.4mM，1.4mM，494μM，165μM，54.9μM和18.3μM)的NAM溶液，所用的缓冲液为HEPES缓冲液，存放在冰盒中；
生物发光底物溶液：用水将生物发光底物溶液稀释100-倍，避光保存于冰盒中。
(2)向白色96孔酶标板中分别加入80μL探针溶液、10μL NAD+或NAD+类似物溶液和10μL生物发光底物溶液，立即用多通道移液器轻轻地多次(至少8次)吹吸混匀；用FlexStation3多功能酶标仪在发光模式下读取波长440nm和波长590nm处光强值，连续监测5min，并计算该时间段的平均受体与给体发光的比值。
实验结果见图4，实验结果显示本发明的探针对NAD+分子具有高选择性。探针对NAM和NADPH无响应；探针虽然对NADH和NRH有响应，但C50值较高(>1mM)；而探针对NADP+和NMN分子的响应动态范围较小。
实施例5稳定表达NAD+分子探针的哺乳动物细胞系用于测量活细胞内NAD+浓度的动态变化。
本发明提供的NAD+分子探针可以探测细胞中NAD+分子浓度变化。将该探针(NADS1.0)的编码基因克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo载体，利用慢病毒法制备HEK293稳转细胞系。以每孔10000个细胞的接种量将HEK293细胞铺在96孔白色细胞培养板中，DMEM培养基(高糖，无酚红)用量为100μL。37℃，5％CO2条件下培养24h后，利用FK866(NAMPT抑制剂，可有效降低细胞内NAD+水平)和NRH(NAD+前体，可有效提升细胞内NAD+水平)处理稳转细胞系，终浓度分别为10nM和50μM。化合物处理细胞24h后，将DMEM培养基(高糖，无酚红)换成新鲜的含生物发光底物的DMEM培养基(高糖，无酚红，生物发光底物稀释1000-倍)。利用FlexStation3多功能酶标仪检测590nm和440nm波长的发射光强。根据该探针的检测原理，590nm和440nm波长的发射光强比值指示活细胞中的NAD+浓度。检测发现，FK866处理的细胞该比值下降，指示胞内NAD+浓度下降。NRH处理的细胞该比值上升，指示胞内NAD+浓度上升。该变化同预期相符，说明该NAD+探针能够响应胞内NAD+浓度的变化(图5)。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 一种基于共振能量转移的全遗传编码NAD+蛋白探针及其制备方法和应用
<130> CP121010955C
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 716
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Val Ser Lys Gly Glu Ala Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys
1               5                   10                  15
Val His Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly
            20                  25                  30
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys
        35                  40                  45
Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Trp Asp Ile Leu Ser Pro
    50                  55                  60
Gln Phe Met Tyr Gly Ser Arg Ala Phe Thr Lys His Pro Ala Asp Ile
65                  70                  75                  80
Pro Asp Tyr Tyr Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg
                85                  90                  95
Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ala Val Thr Val Thr Gln Asp Thr
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr
        115                 120                 125
Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
    130                 135                 140
Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Glu Asp Gly Val Leu Lys Gly
145                 150                 155                 160
Asp Ile Lys Met Ala Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly Arg Tyr Leu Ala
                165                 170                 175
Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Met Pro Gly
            180                 185                 190
Ala Tyr Asn Val Asp Arg Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp
        195                 200                 205
Tyr Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His Ser Thr
    210                 215                 220
Leu Thr Leu Thr Ala Ala Thr Thr Arg Ala Gln Glu Leu Arg Lys Gln
225                 230                 235                 240
Leu Asn Gln Tyr Ser His Glu Tyr Tyr Val Lys Asp Gln Pro Ser Val
                245                 250                 255
Glu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Tyr Lys Glu Leu Val Asp Ile Glu
            260                 265                 270
Thr Glu Phe Pro Asp Leu Ile Thr Pro Asp Ser Pro Thr Gln Asn Val
        275                 280                 285
Gly Gly Lys Val Leu Ser Gly Phe Glu Lys Ala Pro His Asp Ile Pro
    290                 295                 300
Met Tyr Ser Leu Asn Asp Gly Phe Ser Lys Glu Asp Ile Phe Ala Phe
305                 310                 315                 320
Asp Glu Arg Val Arg Lys Ala Ile Gly Lys Pro Val Ala Tyr Cys Cys
                325                 330                 335
Glu Leu Leu Ile Asp Gly Leu Ala Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Asn Gly
            340                 345                 350
Val Phe Val Arg Gly Ala Thr Arg Gly Asp Gly Thr Val Gly Glu Asn
        355                 360                 365
Ile Thr Glu Asn Leu Arg Thr Val Arg Ser Val Pro Met Asp Leu Thr
    370                 375                 380
Glu Pro Ile Ser Val Glu Val Arg Gly Glu Cys Tyr Met Pro Lys Gln
385                 390                 395                 400
Ser Phe Val Ala Leu Asn Glu Glu Arg Glu Glu Asn Gly Gln Asp Ile
                405                 410                 415
Phe Ala Asn Pro Arg Asn Ala Ala Ala Gly Ser Leu Arg Gln Leu Asp
            420                 425                 430
Thr Lys Ile Val Ala Lys Arg Asn Leu Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Val
        435                 440                 445
Ala Asp Phe Gly Pro Met Lys Ala Lys Thr Gln Phe Glu Ala Leu Glu
    450                 455                 460
Glu Leu Ser Ala Ile Gly Phe Arg Thr Asn Pro Glu Arg Gln Leu Cys
465                 470                 475                 480
Gln Ser Ile Asp Glu Val Trp Ala Tyr Ile Glu Glu Tyr His Glu Lys
                485                 490                 495
Arg Ser Thr Leu Pro Tyr Glu Ile Asn Gly Ile Val Ile Lys Val Asn
            500                 505                 510
Glu Phe Ala Leu Gln Asp Glu Leu Gly Phe Thr Val Lys Ala Pro Arg
        515                 520                 525
Trp Ala Ile Ala Tyr Lys Phe Pro Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu
    530                 535                 540
Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val
545                 550                 555                 560
Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met
                565                 570                 575
Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly
            580                 585                 590
Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile
        595                 600                 605
Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr
    610                 615                 620
Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala Gly
625                 630                 635                 640
Gly Thr Gly Gly Ser Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Phe Thr Leu
                645                 650                 655
Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp
            660                 665                 670
Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu Gly
        675                 680                 685
Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn Gly
    690                 695                 700
Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu
705                 710                 715
<210> 2
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Val Ser Lys Gly Glu Ala Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys
1               5                   10                  15
Val His Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly
            20                  25                  30
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys
        35                  40                  45
Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Trp Asp Ile Leu Ser Pro
    50                  55                  60
Gln Phe Met Tyr Gly Ser Arg Ala Phe Thr Lys His Pro Ala Asp Ile
65                  70                  75                  80
Pro Asp Tyr Tyr Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg
                85                  90                  95
Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ala Val Thr Val Thr Gln Asp Thr
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr
        115                 120                 125
Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
    130                 135                 140
Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Glu Asp Gly Val Leu Lys Gly
145                 150                 155                 160
Asp Ile Lys Met Ala Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly Arg Tyr Leu Ala
                165                 170                 175
Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Met Pro Gly
            180                 185                 190
Ala Tyr Asn Val Asp Arg Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp
        195                 200                 205
Tyr Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His Ser Thr
    210                 215                 220
<210> 3
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Leu Thr Leu Thr Ala Ala Thr Thr Arg Ala Gln Glu Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Leu Asn Gln Tyr Ser His Glu Tyr Tyr Val Lys Asp Gln Pro Ser Val
            20                  25                  30
Glu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Tyr Lys Glu Leu Val Asp Ile Glu
        35                  40                  45
Thr Glu Phe Pro Asp Leu Ile Thr Pro Asp Ser Pro Thr Gln Asn Val
    50                  55                  60
Gly Gly Lys Val Leu Ser Gly Phe Glu Lys Ala Pro His Asp Ile Pro
65                  70                  75                  80
Met Tyr Ser Leu Asn Asp Gly Phe Ser Lys Glu Asp Ile Phe Ala Phe
                85                  90                  95
Asp Glu Arg Val Arg Lys Ala Ile Gly Lys Pro Val Ala Tyr Cys Cys
            100                 105                 110
Glu Leu Leu Ile Asp Gly Leu Ala Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Asn Gly
        115                 120                 125
Val Phe Val Arg Gly Ala Thr Arg Gly Asp Gly Thr Val Gly Glu Asn
    130                 135                 140
Ile Thr Glu Asn Leu Arg Thr Val Arg Ser Val Pro Met Asp Leu Thr
145                 150                 155                 160
Glu Pro Ile Ser Val Glu Val Arg Gly Glu Cys Tyr Met Pro Lys Gln
                165                 170                 175
Ser Phe Val Ala Leu Asn Glu Glu Arg Glu Glu Asn Gly Gln Asp Ile
            180                 185                 190
Phe Ala Asn Pro Arg Asn Ala Ala Ala Gly Ser Leu Arg Gln Leu Asp
        195                 200                 205
Thr Lys Ile Val Ala Lys Arg Asn Leu Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Val
    210                 215                 220
Ala Asp Phe Gly Pro Met Lys Ala Lys Thr Gln Phe Glu Ala Leu Glu
225                 230                 235                 240
Glu Leu Ser Ala Ile Gly Phe Arg Thr Asn Pro Glu Arg Gln Leu Cys
                245                 250                 255
Gln Ser Ile Asp Glu Val Trp Ala Tyr Ile Glu Glu Tyr His Glu Lys
            260                 265                 270
Arg Ser Thr Leu Pro Tyr Glu Ile Asn Gly Ile Val Ile Lys Val Asn
        275                 280                 285
Glu Phe Ala Leu Gln Asp Glu Leu Gly Phe Thr Val Lys Ala Pro Arg
    290                 295                 300
Trp Ala Ile Ala Tyr Lys Phe Pro
305                 310
<210> 4
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro
1               5                   10                  15
Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val
            20                  25                  30
Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr
        35                  40                  45
Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr
    50                  55                  60
Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp
65                  70                  75                  80
Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg
                85                  90                  95
Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ser Gly Gly Thr
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Met Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg
        115                 120                 125
Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val
    130                 135                 140
Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg
145                 150                 155                 160
Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile
                165                 170                 175
Ile Pro Tyr Glu
            180
<210> 5
<211> 716
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Val Ser Lys Gly Glu Ala Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys
1               5                   10                  15
Val His Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly
            20                  25                  30
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys
        35                  40                  45
Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Trp Asp Ile Leu Ser Pro
    50                  55                  60
Gln Phe Met Tyr Gly Ser Arg Ala Phe Thr Lys His Pro Ala Asp Ile
65                  70                  75                  80
Pro Asp Tyr Tyr Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg
                85                  90                  95
Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ala Val Thr Val Thr Gln Asp Thr
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr
        115                 120                 125
Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
    130                 135                 140
Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Glu Asp Gly Val Leu Lys Gly
145                 150                 155                 160
Asp Ile Lys Met Ala Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly Arg Tyr Leu Ala
                165                 170                 175
Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Met Pro Gly
            180                 185                 190
Ala Tyr Asn Val Asp Arg Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp
        195                 200                 205
Tyr Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His Ser Thr
    210                 215                 220
Leu Thr Leu Thr Ala Ala Thr Thr Arg Ala Gln Glu Leu Arg Lys Gln
225                 230                 235                 240
Leu Asn Gln Tyr Ser His Glu Tyr Tyr Val Lys Asp Gln Pro Ser Val
                245                 250                 255
Glu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Tyr Lys Glu Leu Val Asp Ile Glu
            260                 265                 270
Thr Glu Phe Pro Asp Leu Ile Thr Pro Asp Ser Pro Thr Gln Asn Val
        275                 280                 285
Gly Gly Lys Val Leu Ser Gly Phe Glu Lys Ala Pro His Asp Ile Pro
    290                 295                 300
Met Tyr Ser Leu Asn Asp Gly Phe Ser Lys Glu Asp Ile Phe Ala Phe
305                 310                 315                 320
Asp Glu Arg Val Arg Lys Ala Ile Gly Lys Pro Val Ala Tyr Cys Cys
                325                 330                 335
Glu Leu Leu Ile Asp Gly Leu Ala Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Asn Gly
            340                 345                 350
Val Phe Val Arg Gly Ala Thr Arg Gly Asp Gly Thr Val Gly Glu Asn
        355                 360                 365
Ile Thr Glu Asn Leu Arg Thr Val Arg Ser Val Pro Met Pro Leu Thr
    370                 375                 380
Glu Pro Ile Ser Val Glu Val Arg Gly Glu Cys Tyr Met Pro Lys Gln
385                 390                 395                 400
Ser Phe Val Ala Leu Asn Glu Glu Arg Glu Glu Asn Gly Gln Asp Ile
                405                 410                 415
Phe Ala Asn Pro Arg Asn Ala Ala Ala Gly Ser Leu Arg Gln Leu Asp
            420                 425                 430
Thr Lys Ile Val Ala Lys Arg Asn Leu Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Val
        435                 440                 445
Ala Asp Phe Gly Pro Met Lys Ala Lys Thr Gln Phe Glu Ala Leu Glu
    450                 455                 460
Glu Leu Ser Ala Ile Gly Phe Arg Thr Asn Pro Glu Arg Gln Leu Cys
465                 470                 475                 480
Gln Ser Ile Asp Glu Val Trp Ala Tyr Ile Glu Glu Tyr His Glu Lys
                485                 490                 495
Arg Ser Thr Leu Pro Tyr Glu Ile Asn Gly Ile Val Ile Lys Val Asn
            500                 505                 510
Glu Phe Ala Leu Gln Asp Glu Leu Gly Phe Thr Val Lys Ala Pro Arg
        515                 520                 525
Trp Ala Ile Ala Tyr Lys Phe Pro Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu
    530                 535                 540
Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val
545                 550                 555                 560
Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met
                565                 570                 575
Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly
            580                 585                 590
Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile
        595                 600                 605
Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr
    610                 615                 620
Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala Gly
625                 630                 635                 640
Gly Thr Gly Gly Ser Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Phe Thr Leu
                645                 650                 655
Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp
            660                 665                 670
Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu Gly
        675                 680                 685
Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn Gly
    690                 695                 700
Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu
705                 710                 715
<210> 6
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Leu Asn Gln Tyr Ser His Glu Tyr Tyr Val Lys Asp Gln Pro Ser Val
1               5                   10                  15
Glu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Tyr Lys Glu Leu Val Asp Ile Glu
            20                  25                  30
Thr Glu Phe Pro Asp Leu Ile Thr Pro Asp Ser Pro Thr Gln Asn Val
        35                  40                  45
Gly Gly Lys Val Leu Ser Gly Phe Glu Lys Ala Pro His Asp Ile Pro
    50                  55                  60
Met Tyr Ser Leu Asn Asp Gly Phe Ser Lys Glu Asp Ile Phe Ala Phe
65                  70                  75                  80
Asp Glu Arg Val Arg Lys Ala Ile Gly Lys Pro Val Ala Tyr Cys Cys
                85                  90                  95
Glu Leu Leu Ile Asp Gly Leu Ala Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Asn Gly
            100                 105                 110
Val Phe Val Arg Gly Ala Thr Arg Gly Asp Gly Thr Val Gly Glu Asn
        115                 120                 125
Ile Thr Glu Asn Leu Arg Thr Val Arg Ser Val Pro Met Pro Leu Thr
    130                 135                 140
Glu Pro Ile Ser Val Glu Val Arg Gly Glu Cys Tyr Met Pro Lys Gln
145                 150                 155                 160
Ser Phe Val Ala Leu Asn Glu Glu Arg Glu Glu Asn Gly Gln Asp Ile
                165                 170                 175
Phe Ala Asn Pro Arg Asn Ala Ala Ala Gly Ser Leu Arg Gln Leu Asp
            180                 185                 190
Thr Lys Ile Val Ala Lys Arg Asn Leu Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Val
        195                 200                 205
Ala Asp Phe Gly Pro Met Lys Ala Lys Thr Gln Phe Glu Ala Leu Glu
    210                 215                 220
Glu Leu Ser Ala Ile Gly Phe Arg Thr Asn Pro Glu Arg Gln Leu Cys
225                 230                 235                 240
Gln Ser Ile Asp Glu Val Trp Ala Tyr Ile Glu Glu Tyr His Glu Lys
                245                 250                 255
Arg Ser Thr Leu Pro Tyr Glu Ile Asn Gly Ile Val Ile Lys Val Asn
            260                 265                 270
Glu Phe Ala Leu Gln Asp Glu Leu Gly Phe Thr Val Lys Ala Pro Arg
        275                 280                 285
Trp Ala Ile Ala Tyr Lys Phe Pro
    290                 295
<210> 7
<211> 716
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Val Ser Lys Gly Glu Ala Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys
1               5                   10                  15
Val His Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly
            20                  25                  30
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys
        35                  40                  45
Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Trp Asp Ile Leu Ser Pro
    50                  55                  60
Gln Phe Met Tyr Gly Ser Arg Ala Phe Thr Lys His Pro Ala Asp Ile
65                  70                  75                  80
Pro Asp Tyr Tyr Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg
                85                  90                  95
Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ala Val Thr Val Thr Gln Asp Thr
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr
        115                 120                 125
Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
    130                 135                 140
Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Glu Asp Gly Val Leu Lys Gly
145                 150                 155                 160
Asp Ile Lys Met Ala Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly Arg Tyr Leu Ala
                165                 170                 175
Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Met Pro Gly
            180                 185                 190
Ala Tyr Asn Val Asp Arg Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp
        195                 200                 205
Tyr Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His Ser Thr
    210                 215                 220
Leu Thr Leu Thr Ala Ala Thr Thr Arg Ala Gln Glu Leu Arg Lys Gln
225                 230                 235                 240
Leu Asn Gln Tyr Ser His Glu Tyr Tyr Val Lys Asp Gln Pro Ser Val
                245                 250                 255
Glu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Tyr Lys Glu Leu Val Asp Ile Glu
            260                 265                 270
Thr Glu Phe Pro Asp Leu Ile Thr Pro Asp Ser Pro Thr Gln Asn Val
        275                 280                 285
Gly Gly Lys Val Leu Ser Gly Phe Glu Lys Ala Pro His Asp Ile Pro
    290                 295                 300
Met Tyr Ser Leu Asn Asp Gly Phe Ser Lys Glu Asp Ile Phe Ala Phe
305                 310                 315                 320
Asp Glu Arg Val Arg Lys Ala Ile Gly Lys Pro Val Ala Tyr Cys Cys
                325                 330                 335
Glu Leu Leu Ile Asp Gly Leu Ala Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Asn Gly
            340                 345                 350
Val Phe Val Arg Gly Ala Thr Arg Gly Asp Gly Thr Val Gly Glu Asn
        355                 360                 365
Ile Thr Glu Asn Leu Arg Thr Val Arg Ser Val Pro Met Asp Leu Thr
    370                 375                 380
Glu Pro Ile Ser Val Glu Val Arg Gly Glu Cys Tyr Met Pro Lys Gln
385                 390                 395                 400
Ser Phe Val Ala Leu Asn Glu Glu Arg Glu Glu Asn Gly Gln Asp Ile
                405                 410                 415
Phe Ala Asn Pro Arg Asn Ala Ala Ala Gly Ser Leu Arg Gln Leu Asp
            420                 425                 430
Thr Lys Ile Val Ala Lys Arg Asn Leu Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Val
        435                 440                 445
Ala Asp Phe Gly Pro Met Lys Ala Lys Thr Gln Phe Glu Ala Leu Glu
    450                 455                 460
Glu Leu Ser Ala Ile Gly Phe Arg Thr Asn Pro Glu Arg Gln Leu Cys
465                 470                 475                 480
Gln Ser Ile Asp Glu Val Trp Ala Tyr Ile Glu Glu Tyr His Glu Lys
                485                 490                 495
Arg Ser Thr Leu Pro Tyr Glu Ile Asn Gly Ile Val Ile Lys Val Asn
            500                 505                 510
Glu Phe Ala Leu Gln Asp Glu Leu Gly Phe Thr Val Lys Ala Pro Arg
        515                 520                 525
Trp Ala Ile Ala Tyr Lys Phe Pro Val Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu
    530                 535                 540
Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val
545                 550                 555                 560
Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met
                565                 570                 575
Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly
            580                 585                 590
Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile
        595                 600                 605
Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr
    610                 615                 620
Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala Gly
625                 630                 635                 640
Gly Thr Gly Gly Ser Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Phe Thr Leu
                645                 650                 655
Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp
            660                 665                 670
Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu Gly
        675                 680                 685
Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn Gly
    690                 695                 700
Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu
705                 710                 715
<210> 8
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Val Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro
1               5                   10                  15
Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val
            20                  25                  30
Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr
        35                  40                  45
Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr
    50                  55                  60
Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp
65                  70                  75                  80
Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg
                85                  90                  95
Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ser Gly Gly Thr
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Met Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg
        115                 120                 125
Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val
    130                 135                 140
Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg
145                 150                 155                 160
Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile
                165                 170                 175
Ile Pro Tyr Glu
            180
<210> 9
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Ala Ser Leu Pro Ala Thr His Glu Leu His Ile Phe Gly Ser Ile
1               5                   10                  15
Asn Gly Val Asp Phe Asp Met Val Gly Gln Gly Thr Gly Asn Pro Asn
            20                  25                  30
Asp Gly Tyr Glu Glu Leu Asn Leu Lys Ser Thr Lys Gly Asp Leu Gln
        35                  40                  45
Phe Ser Pro Trp Ile Leu Val Pro His Ile Gly Tyr Gly Phe His Gln
    50                  55                  60
Tyr Leu Pro Tyr Pro Asp Gly Met Ser Pro Phe Gln Ala Ala Met Val
65                  70                  75                  80
Asp Gly Ser Gly Tyr Gln Val His Arg Thr Met Gln Phe Glu Asp Gly
                85                  90                  95
Ala Ser Leu Thr Val Asn Tyr Arg Tyr Thr Tyr Glu Gly Ser His Ile
            100                 105                 110
Lys Gly Glu Ala Gln Val Lys Gly Thr Gly Phe Pro Ala Asp Gly Pro
        115                 120                 125
Val Met Thr Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Trp Cys Arg Ser Lys Lys
    130                 135                 140
Thr Tyr Pro Asn Asp Lys Thr Ile Ile Ser Thr Phe Lys Trp Ser Tyr
145                 150                 155                 160
Thr Thr Gly Asn Gly Lys Arg Tyr Arg Ser Thr Ala Arg Thr Thr Tyr
                165                 170                 175
Thr Phe Ala Lys Pro Met Ala Ala Asn Tyr Leu Lys Asn Gln Pro Met
            180                 185                 190
Tyr Val Phe Arg Lys Thr Glu Leu Lys His Ser Lys Thr Glu Leu Asn
        195                 200                 205
Phe Lys Glu Trp Gln Lys Ala Phe Thr Asp Lys Leu Thr Leu Thr Ala
    210                 215                 220
Ala Thr Thr Arg Ala Gln Glu Leu Arg Lys Gln Leu Asn Gln Tyr Ser
225                 230                 235                 240
His Glu Tyr Tyr Val Lys Asp Gln Pro Ser Val Glu Asp Tyr Val Tyr
                245                 250                 255
Asp Arg Leu Tyr Lys Glu Leu Val Asp Ile Glu Thr Glu Phe Pro Asp
            260                 265                 270
Leu Ile Thr Pro Asp Ser Pro Thr Gln Asn Val Gly Gly Lys Val Leu
        275                 280                 285
Ser Gly Phe Glu Lys Ala Pro His Asp Ile Pro Met Tyr Ser Leu Asn
    290                 295                 300
Asp Gly Phe Ser Lys Glu Asp Ile Phe Ala Phe Asp Glu Arg Val Arg
305                 310                 315                 320
Lys Ala Ile Gly Lys Pro Val Ala Tyr Cys Cys Glu Leu Leu Ile Asp
                325                 330                 335
Gly Leu Ala Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Asn Gly Val Phe Val Arg Gly
            340                 345                 350
Ala Thr Arg Gly Asp Gly Thr Val Gly Glu Asn Ile Thr Glu Asn Leu
        355                 360                 365
Arg Thr Val Arg Ser Val Pro Met Asp Leu Thr Glu Pro Ile Ser Val
    370                 375                 380
Glu Val Arg Gly Glu Cys Tyr Met Pro Lys Gln Ser Phe Val Ala Leu
385                 390                 395                 400
Asn Glu Glu Arg Glu Glu Asn Gly Gln Asp Ile Phe Ala Asn Pro Arg
                405                 410                 415
Asn Ala Ala Ala Gly Ser Leu Arg Gln Leu Asp Thr Lys Ile Val Ala
            420                 425                 430
Lys Arg Asn Leu Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Val Ala Asp Phe Gly Pro
        435                 440                 445
Met Lys Ala Lys Thr Gln Phe Glu Ala Leu Glu Glu Leu Ser Ala Ile
    450                 455                 460
Gly Phe Arg Thr Asn Pro Glu Arg Gln Leu Cys Gln Ser Ile Asp Glu
465                 470                 475                 480
Val Trp Ala Tyr Ile Glu Glu Tyr His Glu Lys Arg Ser Thr Leu Pro
                485                 490                 495
Tyr Glu Ile Asn Gly Ile Val Ile Lys Val Asn Glu Phe Ala Leu Gln
            500                 505                 510
Asp Glu Leu Gly Phe Thr Val Lys Ala Pro Arg Trp Ala Ile Ala Tyr
        515                 520                 525
Lys Phe Pro Val Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val
    530                 535                 540
Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly
545                 550                 555                 560
Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly
                565                 570                 575
Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val
            580                 585                 590
Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile
        595                 600                 605
Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr
    610                 615                 620
Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ser
625                 630                 635                 640
Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly
                645                 650                 655
Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln
            660                 665                 670
Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro
        675                 680                 685
Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile
    690                 695                 700
His Val Ile Ile Pro Tyr Glu
705                 710
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Ala Ser Leu Pro Ala Thr His Glu Leu His Ile Phe Gly Ser Ile
1               5                   10                  15
Asn Gly Val Asp Phe Asp Met Val Gly Gln Gly Thr Gly Asn Pro Asn
            20                  25                  30
Asp Gly Tyr Glu Glu Leu Asn Leu Lys Ser Thr Lys Gly Asp Leu Gln
        35                  40                  45
Phe Ser Pro Trp Ile Leu Val Pro His Ile Gly Tyr Gly Phe His Gln
    50                  55                  60
Tyr Leu Pro Tyr Pro Asp Gly Met Ser Pro Phe Gln Ala Ala Met Val
65                  70                  75                  80
Asp Gly Ser Gly Tyr Gln Val His Arg Thr Met Gln Phe Glu Asp Gly
                85                  90                  95
Ala Ser Leu Thr Val Asn Tyr Arg Tyr Thr Tyr Glu Gly Ser His Ile
            100                 105                 110
Lys Gly Glu Ala Gln Val Lys Gly Thr Gly Phe Pro Ala Asp Gly Pro
        115                 120                 125
Val Met Thr Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Trp Cys Arg Ser Lys Lys
    130                 135                 140
Thr Tyr Pro Asn Asp Lys Thr Ile Ile Ser Thr Phe Lys Trp Ser Tyr
145                 150                 155                 160
Thr Thr Gly Asn Gly Lys Arg Tyr Arg Ser Thr Ala Arg Thr Thr Tyr
                165                 170                 175
Thr Phe Ala Lys Pro Met Ala Ala Asn Tyr Leu Lys Asn Gln Pro Met
            180                 185                 190
Tyr Val Phe Arg Lys Thr Glu Leu Lys His Ser Lys Thr Glu Leu Asn
        195                 200                 205
Phe Lys Glu Trp Gln Lys Ala Phe Thr Asp Lys
    210                 215
<210> 11
<211> 760
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Met Val Ser Lys Gly Glu Ala Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys
1               5                   10                  15
Val His Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly
            20                  25                  30
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys
        35                  40                  45
Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Trp Asp Ile Leu Ser Pro
    50                  55                  60
Gln Phe Met Tyr Gly Ser Arg Ala Phe Thr Lys His Pro Ala Asp Ile
65                  70                  75                  80
Pro Asp Tyr Tyr Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg
                85                  90                  95
Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ala Val Thr Val Thr Gln Asp Thr
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr
        115                 120                 125
Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
    130                 135                 140
Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Glu Asp Gly Val Leu Lys Gly
145                 150                 155                 160
Asp Ile Lys Met Ala Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly Arg Tyr Leu Ala
                165                 170                 175
Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Met Pro Gly
            180                 185                 190
Ala Tyr Asn Val Asp Arg Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp
        195                 200                 205
Tyr Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His Leu Thr
    210                 215                 220
Leu Thr Leu Thr Ala Ala Thr Thr Arg Ala Gln Glu Leu Arg Lys Gln
225                 230                 235                 240
Leu Asn Gln Tyr Ser His Glu Tyr Tyr Val Lys Asp Gln Pro Ser Val
                245                 250                 255
Glu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Tyr Lys Glu Leu Val Asp Ile Glu
            260                 265                 270
Thr Glu Phe Pro Asp Leu Ile Thr Pro Asp Ser Pro Thr Gln Asn Val
        275                 280                 285
Gly Gly Lys Val Leu Ser Gly Phe Glu Lys Ala Pro His Asp Ile Pro
    290                 295                 300
Met Tyr Ser Leu Asn Asp Gly Phe Ser Lys Glu Asp Ile Phe Ala Phe
305                 310                 315                 320
Asp Glu Arg Val Arg Lys Ala Ile Gly Lys Pro Val Ala Tyr Cys Cys
                325                 330                 335
Glu Leu Leu Ile Asp Gly Leu Ala Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Asn Gly
            340                 345                 350
Val Phe Val Arg Gly Ala Thr Arg Gly Asp Gly Thr Val Gly Glu Asn
        355                 360                 365
Ile Thr Glu Asn Leu Arg Thr Val Arg Ser Val Pro Met Asp Leu Thr
    370                 375                 380
Glu Pro Ile Ser Val Glu Val Arg Gly Glu Cys Tyr Met Pro Lys Gln
385                 390                 395                 400
Ser Phe Val Ala Leu Asn Glu Glu Arg Glu Glu Asn Gly Gln Asp Ile
                405                 410                 415
Phe Ala Asn Pro Arg Asn Ala Ala Ala Gly Ser Leu Arg Gln Leu Asp
            420                 425                 430
Thr Lys Ile Val Ala Lys Arg Asn Leu Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Val
        435                 440                 445
Ala Asp Phe Gly Pro Met Lys Ala Lys Thr Gln Phe Glu Ala Leu Glu
    450                 455                 460
Glu Leu Ser Ala Ile Gly Phe Arg Thr Asn Pro Glu Arg Gln Leu Cys
465                 470                 475                 480
Gln Ser Ile Asp Glu Val Trp Ala Tyr Ile Glu Glu Tyr His Glu Lys
                485                 490                 495
Arg Ser Thr Leu Pro Tyr Glu Ile Asn Gly Ile Val Ile Lys Val Asn
            500                 505                 510
Glu Phe Ala Leu Gln Asp Glu Leu Gly Phe Thr Val Lys Ala Pro Arg
        515                 520                 525
Trp Ala Ile Ala Tyr Lys Phe Pro Pro Pro Ala Thr His Glu Leu His
    530                 535                 540
Ile Phe Gly Ser Ile Asn Gly Val Asp Phe Asp Met Val Gly Gln Gly
545                 550                 555                 560
Thr Gly Asn Pro Asn Asp Gly Tyr Glu Glu Leu Asn Leu Lys Ser Thr
                565                 570                 575
Lys Gly Asp Leu Gln Phe Ser Pro Trp Ile Leu Val Pro His Ile Gly
            580                 585                 590
Tyr Gly Phe His Gln Tyr Leu Pro Tyr Pro Asp Gly Met Ser Pro Phe
        595                 600                 605
Gln Ala Ala Met Val Asp Gly Ser Gly Tyr Gln Val His Arg Thr Met
    610                 615                 620
Gln Phe Glu Asp Gly Ala Ser Leu Thr Val Asn Tyr Arg Tyr Thr Tyr
625                 630                 635                 640
Glu Gly Ser His Ile Lys Gly Glu Ala Gln Val Lys Gly Thr Gly Phe
                645                 650                 655
Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Thr Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Trp
            660                 665                 670
Cys Arg Ser Lys Lys Thr Tyr Pro Asn Asp Lys Thr Ile Ile Ser Thr
        675                 680                 685
Phe Lys Trp Ser Tyr Thr Thr Gly Asn Gly Lys Arg Tyr Arg Ser Thr
    690                 695                 700
Ala Arg Thr Thr Tyr Thr Phe Ala Lys Pro Met Ala Ala Asn Tyr Leu
705                 710                 715                 720
Lys Asn Gln Pro Met Tyr Val Phe Arg Lys Thr Glu Leu Lys His Ser
                725                 730                 735
Lys Thr Glu Leu Asn Phe Lys Glu Trp Gln Lys Ala Phe Thr Asp Val
            740                 745                 750
Met Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
        755                 760
<210> 12
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Met Val Ser Lys Gly Glu Ala Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys
1               5                   10                  15
Val His Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly
            20                  25                  30
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys
        35                  40                  45
Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Trp Asp Ile Leu Ser Pro
    50                  55                  60
Gln Phe Met Tyr Gly Ser Arg Ala Phe Thr Lys His Pro Ala Asp Ile
65                  70                  75                  80
Pro Asp Tyr Tyr Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg
                85                  90                  95
Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ala Val Thr Val Thr Gln Asp Thr
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr
        115                 120                 125
Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
    130                 135                 140
Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Glu Asp Gly Val Leu Lys Gly
145                 150                 155                 160
Asp Ile Lys Met Ala Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly Arg Tyr Leu Ala
                165                 170                 175
Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Met Pro Gly
            180                 185                 190
Ala Tyr Asn Val Asp Arg Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp
        195                 200                 205
Tyr Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His Leu Thr
    210                 215                 220
<210> 13
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Pro Pro Ala Thr His Glu Leu His Ile Phe Gly Ser Ile Asn Gly Val
1               5                   10                  15
Asp Phe Asp Met Val Gly Gln Gly Thr Gly Asn Pro Asn Asp Gly Tyr
            20                  25                  30
Glu Glu Leu Asn Leu Lys Ser Thr Lys Gly Asp Leu Gln Phe Ser Pro
        35                  40                  45
Trp Ile Leu Val Pro His Ile Gly Tyr Gly Phe His Gln Tyr Leu Pro
    50                  55                  60
Tyr Pro Asp Gly Met Ser Pro Phe Gln Ala Ala Met Val Asp Gly Ser
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Gln Val His Arg Thr Met Gln Phe Glu Asp Gly Ala Ser Leu
                85                  90                  95
Thr Val Asn Tyr Arg Tyr Thr Tyr Glu Gly Ser His Ile Lys Gly Glu
            100                 105                 110
Ala Gln Val Lys Gly Thr Gly Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Thr
        115                 120                 125
Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Trp Cys Arg Ser Lys Lys Thr Tyr Pro
    130                 135                 140
Asn Asp Lys Thr Ile Ile Ser Thr Phe Lys Trp Ser Tyr Thr Thr Gly
145                 150                 155                 160
Asn Gly Lys Arg Tyr Arg Ser Thr Ala Arg Thr Thr Tyr Thr Phe Ala
                165                 170                 175
Lys Pro Met Ala Ala Asn Tyr Leu Lys Asn Gln Pro Met Tyr Val Phe
            180                 185                 190
Arg Lys Thr Glu Leu Lys His Ser Lys Thr Glu Leu Asn Phe Lys Glu
        195                 200                 205
Trp Gln Lys Ala Phe Thr Asp Val Met Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
    210                 215                 220

Claims (12)

1.一种全基因编码NAD+蛋白探针，其特征在于，其由共振能量转移给体、NAD+响应蛋白和共振能量转移受体串联而成；
其中NAD+响应蛋白为DNA连接酶的突变体，所述的DNA连接酶的突变体序列如SEQ IDNO.3，或SEQ ID NO.6所示；
所述共振能量转移给体选自萤光素酶或荧光蛋白；所述共振能量转移受体选自荧光蛋白且作为共振能量转移受体的荧光蛋白与共振能量转移给体的荧光蛋白不同。
2.根据权利要求1所述的全基因编码NAD+蛋白探针，其特征在于，所述共振能量转移给体选自环状排列的生物发光蛋白cpNLuc或绿色荧光蛋白mNeoGreen；
优选地，环状排列的生物发光蛋白cpNLuc为引入G4V突变的生物发光蛋白cpNLuc；
更优选地，cpNLuc的突变体序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8；绿色荧光蛋白mNeoGreen序列为SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.13。
3.根据权利要求1所述的全基因编码NAD+蛋白探针，其特征在于，所述共振能量转移受体选自绿色荧光蛋白mNeoGreen或红色荧光蛋白mScarlet；
优选地，红色荧光蛋白mScarlet为删除了其中的残基G225的红色荧光蛋白mScarlet；
更优选地，mScarlet的突变体序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.12；绿色荧光蛋白mNeoGreen序列为SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.13。
4.根据权利要求1所述的全基因编码NAD+蛋白探针，其特征在于，所述NAD+蛋白探针由mScarlet突变体、LigA突变体和cpNLuc突变体串联构成；或者
所述NAD+蛋白探针由mNeoGreen突变体、LigA突变体和cpNLuc突变体串联构成；或者
所述NAD+蛋白探针由mScarlet突变体、LigA突变体和mNeoGreen突变体蛋白构成；
优选地，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQID NO.11。
5.权利要求1-4任一项所述的NAD+蛋白探针在制备检测NAD+浓度的试剂中的用途。
6.一种检测NAD+浓度的组合物，其特征在于，所述组合物中包含了权利要求1-4任一项所述的NAD+蛋白探针；
优选地，所述组合物中还包含生物发光底物。
7.一种编码权利要求1-4任一项所述的NAD+蛋白探针的核苷酸序列。
8.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求7所述的核苷酸序列；优选地，所述的载体为慢病毒表达载体。
9.一种能够表达权利要求1-4任一项所述的NAD+蛋白探针的细胞；
优选地，所述细胞通过在活细胞中转入权利要求8所述的载体后获得，所述载体在细胞内能够翻译获得权利要求1-4任一项所述的NAD+蛋白探针。
10.权利要求9所述的细胞在制备研究NAD+的实验模型中的用途；
优选地，所述实验模型用于研究NAD+合成和代谢过程的激动剂或抑制剂。
11.一种检测NAD+浓度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S11)采用权利要求1-4任一项所述的蛋白探针与待检测NAD+浓度的试剂混合，
S12)分别在探针中的共振能量转移给体和共振能量转移受体的最大发光波长下检测发光强度，计算二者的发光强度的比值；
S13)在标准曲线上回归获得对应的NAD+浓度；或者
S13)检测不同时间点发光强度的比值，并获得不同时间点NAD+浓度变化的趋势；或者
S13)检测添加不同活性成分后，发光强度的比值的变化，获得不同活性成分对于NAD+浓度变化的影响；
优选地，步骤S11)中当所述蛋白探针中的共振能量转移给体为荧光素酶时，在检测发光强度前还需要添加生物发光底物；
优选地，步骤S13)中标准曲线的制备方法为，采用不同标准浓度的NAD+，分别采用步骤S11-S12检测对应不同浓度的NAD+对应的发光强度比值，并以NAD+浓度的对数值为横坐标，发光强度比值为纵坐标检测做标准曲线。
12.一种检测活细胞内NAD+浓度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S21)将权利要求8所述的载体通过慢病毒感染法转入待测细胞中，并通过荧光蛋白的荧光信号作为标记筛选获得待测稳转细胞系；
S22)将分别在载体中的核苷酸编码的NAD+蛋白探针中的共振能量转移给体和共振能量转移受体的最大发光波长下检测发光强度，计算二者的发光强度的比值；
S23)在标准曲线上回归获得对应细胞内的NAD+浓度；或者
S23)检测不同时间点发光强度的比值，并获得不同时间点细胞内NAD+浓度变化的趋势；或者
S23)检测添加不同活性成分后，发光强度的比值的变化，获得不同活性成分对于细胞内NAD+浓度变化的影响。
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US6803188B1 (en) * 1996-01-31 2004-10-12 The Regents Of The University Of California Tandem fluorescent protein constructs
US20040214227A1 (en) * 1999-12-22 2004-10-28 Erik Joly Bioluminescence resonance energy transfer (bret) fusion molecule and method of use
US8236523B2 (en) * 2004-08-23 2012-08-07 The Johns Hopkins University Camp reporters and high throughput assays
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