JP2003199581A - マーカー遺伝子を用いた生体機能分子の評価並びに同定方法 - Google Patents
マーカー遺伝子を用いた生体機能分子の評価並びに同定方法Info
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、特定の生体現象と特異的に連関す
る遺伝子（マーカー遺伝子）を利用した生体活性物質の
新規なスクリーニング方法を提供する。また本発明は、
そのための遺伝子、当該遺伝子を導入した形質転換体、
それらを含有してなる機能分子を検出、同定又は評価す
るためのキットを提供する。 【解決手段】 本発明は、特定の生体現象を誘起する機
能分子を、その現象と特異的に連関する遺伝子（マーカ
ー遺伝子）の発現量を指標としてスクリーニングする方
法に関する。また本発明は、マーカー遺伝子のプロモー
ターの下流にレポーター遺伝子を融合させた遺伝子、そ
の使用、それを含有してなる特定の生体現象を誘起する
機能分子を検出、同定又は評価するためのキット、及び
当該遺伝子で形質転換された形質転換細胞に関する。
る遺伝子（マーカー遺伝子）を利用した生体活性物質の
新規なスクリーニング方法を提供する。また本発明は、
そのための遺伝子、当該遺伝子を導入した形質転換体、
それらを含有してなる機能分子を検出、同定又は評価す
るためのキットを提供する。 【解決手段】 本発明は、特定の生体現象を誘起する機
能分子を、その現象と特異的に連関する遺伝子（マーカ
ー遺伝子）の発現量を指標としてスクリーニングする方
法に関する。また本発明は、マーカー遺伝子のプロモー
ターの下流にレポーター遺伝子を融合させた遺伝子、そ
の使用、それを含有してなる特定の生体現象を誘起する
機能分子を検出、同定又は評価するためのキット、及び
当該遺伝子で形質転換された形質転換細胞に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特定の生体現象を
誘起する機能分子を、その現象と特異的に連関する遺伝
子の発現量を指標としてスクリーニングする方法に関す
る。また、本発明は、特定の生体現象と特異的に連関す
る遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を融
合させた遺伝子、より詳細には当該遺伝子を含有してな
る、特定の生体現象を誘起する機能分子を、その現象と
特異的に連関する遺伝子の発現量を指標として検出、同
定又は評価するための遺伝子、それを含有してなる、特
定の生体現象を誘起する機能分子を、その現象と特異的
に連関する遺伝子の発現量を指標として検出、同定又は
評価するためのキット、及び当該遺伝子で形質転換され
た形質転換細胞に関する。
誘起する機能分子を、その現象と特異的に連関する遺伝
子の発現量を指標としてスクリーニングする方法に関す
る。また、本発明は、特定の生体現象と特異的に連関す
る遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を融
合させた遺伝子、より詳細には当該遺伝子を含有してな
る、特定の生体現象を誘起する機能分子を、その現象と
特異的に連関する遺伝子の発現量を指標として検出、同
定又は評価するための遺伝子、それを含有してなる、特
定の生体現象を誘起する機能分子を、その現象と特異的
に連関する遺伝子の発現量を指標として検出、同定又は
評価するためのキット、及び当該遺伝子で形質転換され
た形質転換細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】特定の生体現象を誘起する機能分子の同
定は、抗ガン剤や降圧剤など古典的な医薬品の開発基盤
としては言うまでもなく、新しい医療として期待される
再生医療のツールとしても極めて重要である。このよう
な機能分子を同定する方法としては、従来いくつかの戦
略が用いられてきた。最もオーソドックスな方法は、目
的とする生体現象のアッセイ系を用い、当該生体現象の
活性を指標として、種々の物質が混在した粗な標品から
スタートし、粗な標品の中から何段階かの分離精製の後
に精製された標的物質を得、この物質が機能分子である
ことを同定する方法である。こうした生化学的アプロー
チの例としては、血管収縮物質であるエンドセリン−１
（endothelin-1）の発見が挙げられる（Yanagisawa M,
et al., Nature 1988; 332: 411-5.）。この場合のアッ
セイ系にはブタ冠動脈のリング標本が、また粗標品には
血管内皮細胞の培養上清が用いられた。その後に、アッ
セイ系自体は具体的な生体現象を用いるが、標的物質の
ｃＤＮＡを組み込んだｃＤＮＡライブラリーを培養細胞
株に発現させるという方法が出現した。この方法は一般
に、発現クローニング（expression cloning）と呼ば
れ、標的物質の単離・精製を行うことなく、機能分子を
同定することができるようになった。この方法の応用例
としては、心肥大誘発物質であるカルジオトロフィン−
１（cardiotrophin-1）の発見がある（Pennica D, et a
l., Proc Natl AcadSci U S A 1995;92(4):1142-6.）。
この場合のアッセイ系には肥大の程度を顕微鏡下で観察
することができる新生児ラット心筋細胞が用いられ、標
的物質としてはｃＤＮＡライブラリーを２９３細胞株に
発現させた培養上清が用いられた。発現クローニング法
は、古典的な生化学的手法に伴う面倒な精製作業を省く
ことを可能にしたが、標的物質毎に個別なアッセイ系を
組み立てなければならないという問題点は依然として解
決されていない。
定は、抗ガン剤や降圧剤など古典的な医薬品の開発基盤
としては言うまでもなく、新しい医療として期待される
再生医療のツールとしても極めて重要である。このよう
な機能分子を同定する方法としては、従来いくつかの戦
略が用いられてきた。最もオーソドックスな方法は、目
的とする生体現象のアッセイ系を用い、当該生体現象の
活性を指標として、種々の物質が混在した粗な標品から
スタートし、粗な標品の中から何段階かの分離精製の後
に精製された標的物質を得、この物質が機能分子である
ことを同定する方法である。こうした生化学的アプロー
チの例としては、血管収縮物質であるエンドセリン−１
（endothelin-1）の発見が挙げられる（Yanagisawa M,
et al., Nature 1988; 332: 411-5.）。この場合のアッ
セイ系にはブタ冠動脈のリング標本が、また粗標品には
血管内皮細胞の培養上清が用いられた。その後に、アッ
セイ系自体は具体的な生体現象を用いるが、標的物質の
ｃＤＮＡを組み込んだｃＤＮＡライブラリーを培養細胞
株に発現させるという方法が出現した。この方法は一般
に、発現クローニング（expression cloning）と呼ば
れ、標的物質の単離・精製を行うことなく、機能分子を
同定することができるようになった。この方法の応用例
としては、心肥大誘発物質であるカルジオトロフィン−
１（cardiotrophin-1）の発見がある（Pennica D, et a
l., Proc Natl AcadSci U S A 1995;92(4):1142-6.）。
この場合のアッセイ系には肥大の程度を顕微鏡下で観察
することができる新生児ラット心筋細胞が用いられ、標
的物質としてはｃＤＮＡライブラリーを２９３細胞株に
発現させた培養上清が用いられた。発現クローニング法
は、古典的な生化学的手法に伴う面倒な精製作業を省く
ことを可能にしたが、標的物質毎に個別なアッセイ系を
組み立てなければならないという問題点は依然として解
決されていない。
【０００３】ところで、一般に細胞の増殖や再生あるい
は血管の収縮など、生体の形態や機能の発現は外界から
の刺激によって引き起こされる。この場合、外部からの
入力刺激は様々であっても、最終的にはごく少数の遺伝
子発現に帰着されることが多い。例えば心臓の筋肉の肥
大は、エンドセリン−１（endothelin-1）、アンジオテ
ンシン−II（angiotensin-II）、アドレナリン（adrena
lin）など様々な分泌型の生理活性物質が、心筋細胞膜
表面の特異的受容体に結合して引き起こされるが、いず
れの場合にも、細胞内で数段階の情報仲介分子が活性化
された後、β−ＭＨＣやα−骨格筋アクチン（α-skele
tal muscle actin）など、ごく少数の遺伝子の発現に至
る。
は血管の収縮など、生体の形態や機能の発現は外界から
の刺激によって引き起こされる。この場合、外部からの
入力刺激は様々であっても、最終的にはごく少数の遺伝
子発現に帰着されることが多い。例えば心臓の筋肉の肥
大は、エンドセリン−１（endothelin-1）、アンジオテ
ンシン−II（angiotensin-II）、アドレナリン（adrena
lin）など様々な分泌型の生理活性物質が、心筋細胞膜
表面の特異的受容体に結合して引き起こされるが、いず
れの場合にも、細胞内で数段階の情報仲介分子が活性化
された後、β−ＭＨＣやα−骨格筋アクチン（α-skele
tal muscle actin）など、ごく少数の遺伝子の発現に至
る。
【０００４】このように様々な外界からの刺激によって
引き起こされる細胞の特定の形態や機能の発現に直結す
る遺伝子を、本明細書では「マーカー遺伝子」と呼ぶこ
ととする。「マーカー遺伝子」は、特定の生体現象と特
異的に連関する遺伝子であると言うこともできる。「マ
ーカー遺伝子」は様々な機能分子により発現されること
もあるが、「マーカー遺伝子」の発現は細胞の特定の形
態や機能と特異的に関連するものである。
引き起こされる細胞の特定の形態や機能の発現に直結す
る遺伝子を、本明細書では「マーカー遺伝子」と呼ぶこ
ととする。「マーカー遺伝子」は、特定の生体現象と特
異的に連関する遺伝子であると言うこともできる。「マ
ーカー遺伝子」は様々な機能分子により発現されること
もあるが、「マーカー遺伝子」の発現は細胞の特定の形
態や機能と特異的に関連するものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
マーカー遺伝子を利用した新規なスクリーニング方法を
提供する。また本発明は、マーカー遺伝子の発現量を計
測するための遺伝子、当該遺伝子を導入した形質転換細
胞、それらを含有してなる機能分子を検出、同定又は評
価するためのキットを提供する。
マーカー遺伝子を利用した新規なスクリーニング方法を
提供する。また本発明は、マーカー遺伝子の発現量を計
測するための遺伝子、当該遺伝子を導入した形質転換細
胞、それらを含有してなる機能分子を検出、同定又は評
価するためのキットを提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、特定の生体現
象を誘起する機能分子を、その現象と特異的に連関する
遺伝子の発現量を指標としてスクリーニングする方法に
関する。より詳細には、特定の生体現象と特異的に連関
する遺伝子の発現量を指標とする方法が、当該遺伝子の
プロモーターの下流にレポーター遺伝子を融合させた発
現コンストラクトを用い、特定の生体現象を誘起する機
能分子をスクリーニングする方法に関する。さらに詳細
には、特定の生体現象と特異的に連関する遺伝子のプロ
モーターとレポーター遺伝子とを融合させた遺伝子を培
養細胞株のゲノムに組み込んだ細胞株を用いる前記方法
に関する。
象を誘起する機能分子を、その現象と特異的に連関する
遺伝子の発現量を指標としてスクリーニングする方法に
関する。より詳細には、特定の生体現象と特異的に連関
する遺伝子の発現量を指標とする方法が、当該遺伝子の
プロモーターの下流にレポーター遺伝子を融合させた発
現コンストラクトを用い、特定の生体現象を誘起する機
能分子をスクリーニングする方法に関する。さらに詳細
には、特定の生体現象と特異的に連関する遺伝子のプロ
モーターとレポーター遺伝子とを融合させた遺伝子を培
養細胞株のゲノムに組み込んだ細胞株を用いる前記方法
に関する。
【０００７】また、本発明は、特定の生体現象と特異的
に連関する遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺
伝子を融合させた遺伝子に関する。より詳細には、特定
の生体現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を指標と
してその現象に対する機能分子を検出、同定又は評価す
るための、特定の生体現象と特異的に連関する遺伝子の
プロモーターの下流にレポーター遺伝子を融合させた遺
伝子に関する。本発明は、前記した本発明の遺伝子で形
質転換された形質転換細胞に関する。より詳細には、特
定の生体現象を誘起する機能分子を、その現象と特異的
に連関する遺伝子の発現量を指標として検出、同定又は
評価するための前記した本発明の遺伝子で形質転換され
た形質転換細胞に関する。さらに、本発明は、前記した
本発明の遺伝子又は当該遺伝子で形質転換された形質転
換細胞を含有してなる、特定の生体現象を誘起する機能
分子を、その現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を
指標として検出、同定又は評価するためのキットに関す
る。
に連関する遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺
伝子を融合させた遺伝子に関する。より詳細には、特定
の生体現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を指標と
してその現象に対する機能分子を検出、同定又は評価す
るための、特定の生体現象と特異的に連関する遺伝子の
プロモーターの下流にレポーター遺伝子を融合させた遺
伝子に関する。本発明は、前記した本発明の遺伝子で形
質転換された形質転換細胞に関する。より詳細には、特
定の生体現象を誘起する機能分子を、その現象と特異的
に連関する遺伝子の発現量を指標として検出、同定又は
評価するための前記した本発明の遺伝子で形質転換され
た形質転換細胞に関する。さらに、本発明は、前記した
本発明の遺伝子又は当該遺伝子で形質転換された形質転
換細胞を含有してなる、特定の生体現象を誘起する機能
分子を、その現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を
指標として検出、同定又は評価するためのキットに関す
る。
【０００８】また、本発明は、前記した本発明の遺伝子
又は当該遺伝子で形質転換された形質転換細胞を含有し
てなる、特定の生体現象を誘起する機能分子を、その現
象と特異的に連関する遺伝子の発現量を指標として検
出、同定又は評価するためのアッセイ系に関する。本発
明は、前記した本発明のスクリーニング方法によりスク
リーニングされた機能分子に関する。即ち、検体物質
を、特定の生体現象と特異的に連関する遺伝子を含有す
る形質転換細胞に接触させて、当該細胞における特定の
生体現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を指標とし
て、検体物質が当該遺伝子の機能分子であるか否かをス
クリーニングすることからなるスクリーニングされた機
能分子に関する。
又は当該遺伝子で形質転換された形質転換細胞を含有し
てなる、特定の生体現象を誘起する機能分子を、その現
象と特異的に連関する遺伝子の発現量を指標として検
出、同定又は評価するためのアッセイ系に関する。本発
明は、前記した本発明のスクリーニング方法によりスク
リーニングされた機能分子に関する。即ち、検体物質
を、特定の生体現象と特異的に連関する遺伝子を含有す
る形質転換細胞に接触させて、当該細胞における特定の
生体現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を指標とし
て、検体物質が当該遺伝子の機能分子であるか否かをス
クリーニングすることからなるスクリーニングされた機
能分子に関する。
【０００９】本発明の概要を図１に示した例により説明
する。図１は外界として細胞外からの刺激を受容体を介
して受ける場合を例示している。生物の形態や機能の発
現は、刺激の形態は様々であっても最終的には極少数の
「マーカー遺伝子」に帰着されることが多く、図１は様
々なアゴニストにより受容体が活性化される場合を例示
している。様々なアゴニストにより活性化された受容体
は、トランスデューサーやエフェクターなどの細胞内シ
グナル伝達系により核内に伝達され、核内の転写因子に
よりマーカー遺伝子のプロモーター領域に作用すること
になる。一般に、特定の遺伝子のプロモーターの活性の
測定は、それ自身の構造遺伝子に代えて別の測定可能な
遺伝子（レポーター遺伝子）に置換して行うことができ
る。本発明の特徴はマーカ遺伝子のプロモーター領域の
下流にこのようなレポーター遺伝子を融合させて、レポ
ーター遺伝子の発現によりマーカー遺伝子の発現量を測
定可能にしたことである。
する。図１は外界として細胞外からの刺激を受容体を介
して受ける場合を例示している。生物の形態や機能の発
現は、刺激の形態は様々であっても最終的には極少数の
「マーカー遺伝子」に帰着されることが多く、図１は様
々なアゴニストにより受容体が活性化される場合を例示
している。様々なアゴニストにより活性化された受容体
は、トランスデューサーやエフェクターなどの細胞内シ
グナル伝達系により核内に伝達され、核内の転写因子に
よりマーカー遺伝子のプロモーター領域に作用すること
になる。一般に、特定の遺伝子のプロモーターの活性の
測定は、それ自身の構造遺伝子に代えて別の測定可能な
遺伝子（レポーター遺伝子）に置換して行うことができ
る。本発明の特徴はマーカ遺伝子のプロモーター領域の
下流にこのようなレポーター遺伝子を融合させて、レポ
ーター遺伝子の発現によりマーカー遺伝子の発現量を測
定可能にしたことである。
【００１０】本発明は、マーカー遺伝子とレポーター遺
伝子の融合した遺伝子を細胞のゲノムに組み込んだ培養
細胞株を樹立させて、様々な標的物質による刺激に対す
る細胞内のマーカー遺伝子の発現量をレポーター遺伝子
の発現量を指標として標的物質（検体物質）の機能分子
としての有効性を検出、同定又は評価するためのスクリ
ーニングする方法を提供するものである。本発明をさら
に、具体的に説明するために特定の生体現象として心筋
肥大を例として説明する。心筋肥大の場合には、前記し
た図１においては、マーカー遺伝子としてβ−ＭＨＣを
コードする遺伝子が例示され、エフェクターとしてはｃ
−ｍｙｃ、転写因子としてはＧＡＴＡ−４などが例示さ
れる。
伝子の融合した遺伝子を細胞のゲノムに組み込んだ培養
細胞株を樹立させて、様々な標的物質による刺激に対す
る細胞内のマーカー遺伝子の発現量をレポーター遺伝子
の発現量を指標として標的物質（検体物質）の機能分子
としての有効性を検出、同定又は評価するためのスクリ
ーニングする方法を提供するものである。本発明をさら
に、具体的に説明するために特定の生体現象として心筋
肥大を例として説明する。心筋肥大の場合には、前記し
た図１においては、マーカー遺伝子としてβ−ＭＨＣを
コードする遺伝子が例示され、エフェクターとしてはｃ
−ｍｙｃ、転写因子としてはＧＡＴＡ−４などが例示さ
れる。
【００１１】心臓の筋肉（心筋）は、高血圧などの外因
的ストレスあるいは心筋症のような内因的ストレスに曝
されると、肥大という適応現象を起こす。この心筋肥大
を例として説明する。まず、本発明者はアッセイ細胞株
を作成した。心筋肥大のモデル系で「マーカー遺伝子」
を導入させる細胞株には、ヒト右心房筋から樹立された
ジラルディハート（Girardi Heart）（Girardi AJ, et
al.Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1958; 98: 18-22）を
採用し、ジラルディハート（Girardi Heart）の核型分
析と心肥大に関連する主要な遺伝子の発現パターンを解
析した。
的ストレスあるいは心筋症のような内因的ストレスに曝
されると、肥大という適応現象を起こす。この心筋肥大
を例として説明する。まず、本発明者はアッセイ細胞株
を作成した。心筋肥大のモデル系で「マーカー遺伝子」
を導入させる細胞株には、ヒト右心房筋から樹立された
ジラルディハート（Girardi Heart）（Girardi AJ, et
al.Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1958; 98: 18-22）を
採用し、ジラルディハート（Girardi Heart）の核型分
析と心肥大に関連する主要な遺伝子の発現パターンを解
析した。
【００１２】このジラルディハート（Girardi Heart）
の核型分析を行うために古典的なＧ−ｂａｎｄ染色を行
った。結果を図２に図面に代わる写真で示す。さらに、
各染色体を個別の色で検出するために、スペクトルカリ
オタイピング法（Spectral karyotyping （ＳＫＹ））
を行った。結果を図３に図面に代わる写真で示す。１０
細胞を分析した結果、平均染色体数は７８（３倍体）
で、以下の特徴を有していた。
の核型分析を行うために古典的なＧ−ｂａｎｄ染色を行
った。結果を図２に図面に代わる写真で示す。さらに、
各染色体を個別の色で検出するために、スペクトルカリ
オタイピング法（Spectral karyotyping （ＳＫＹ））
を行った。結果を図３に図面に代わる写真で示す。１０
細胞を分析した結果、平均染色体数は７８（３倍体）
で、以下の特徴を有していた。
【００１３】７５−７９ ＜３ｎ＞，ＸＸ，ｄｅｌ
（Ｘ）（ｐ１１ｐ２１）［２］，ｄｅｌ（Ｘ）（ｑ２３
〜２４）［１０］，＋ｄｅｒ（１）ｔ（１；６）（ｑ１
１；？）［９］，＋ｄｅｒ（１；１６）（ｑ１０；ｐ１
０）［７］， ｄｅｒ（１）ｔ（１；１）（ｐ？；？）
［１０］， ＋ｄｅｒ（３；５）（ｐ１０；ｑ１０）
［１０］， ｄｅｒ（３；１６）（ｑ１０；ｑ１０）
［１０］， ｄｅｒ（３）ｔ（３；２０）（ｑ１１；
？）［１０］， ＋ｉ（５）（ｐ１０）ｘ３［１０］，
＋ｄｅｒ（６）ｄｕｐ（６）（ｐ２１ｐ２３）ｄｅｌ
（６）（ｑ１４）［９］，＋７［４］， ｄｕｐ（８）
（ｑ２２ｑ２４）［１０］， ｄｅｒ（１１）ｔ（１
１；１１）（ｐ１１；？）［１０］， ＋１２［８］，
ｄｅｒ（１２）ｔ（３；１２）（ｑ１３；ｑ１４）
［９］， ＋１３［２］， ａｄｄ（１５）（ｑ２２）
［２］， ａｄｄ（１６）（ｑ１２）［９］， ＋１７
［７］， ｄｅｒ（１９）ｔ（１３；１９）（ｑ１４；
ｐ１３）［１０］， ｄｅｒ（２２）ｔ（８；２２）
（？；ｑ１３）［１０］， ＋０〜４ｍａｒ
（Ｘ）（ｐ１１ｐ２１）［２］，ｄｅｌ（Ｘ）（ｑ２３
〜２４）［１０］，＋ｄｅｒ（１）ｔ（１；６）（ｑ１
１；？）［９］，＋ｄｅｒ（１；１６）（ｑ１０；ｐ１
０）［７］， ｄｅｒ（１）ｔ（１；１）（ｐ？；？）
［１０］， ＋ｄｅｒ（３；５）（ｐ１０；ｑ１０）
［１０］， ｄｅｒ（３；１６）（ｑ１０；ｑ１０）
［１０］， ｄｅｒ（３）ｔ（３；２０）（ｑ１１；
？）［１０］， ＋ｉ（５）（ｐ１０）ｘ３［１０］，
＋ｄｅｒ（６）ｄｕｐ（６）（ｐ２１ｐ２３）ｄｅｌ
（６）（ｑ１４）［９］，＋７［４］， ｄｕｐ（８）
（ｑ２２ｑ２４）［１０］， ｄｅｒ（１１）ｔ（１
１；１１）（ｐ１１；？）［１０］， ＋１２［８］，
ｄｅｒ（１２）ｔ（３；１２）（ｑ１３；ｑ１４）
［９］， ＋１３［２］， ａｄｄ（１５）（ｑ２２）
［２］， ａｄｄ（１６）（ｑ１２）［９］， ＋１７
［７］， ｄｅｒ（１９）ｔ（１３；１９）（ｑ１４；
ｐ１３）［１０］， ｄｅｒ（２２）ｔ（８；２２）
（？；ｑ１３）［１０］， ＋０〜４ｍａｒ
【００１４】次にジラルディハート（Girardi Heart）
における遺伝子の発現を、心筋肥大に関連する主要な遺
伝子についてＲＴ−ＰＣＲ（Reverse-Transcription PC
R）で検討した。ジラルディハート（Girardi Heart）か
ら抽出した全ＲＮＡ、あるいは正常のヒト心筋の全ＲＮ
Ａを用いて、定法に従ってｃＤＮＡを合成した（Sakamo
to A, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(2
5):13873-8.）。ｃＤＮＡ合成の確認として、ハウスキ
ーピング遺伝子（housekeeping gene）であるＧＡＰＤ
Ｈ（Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase)を用
いた。結果を図４に図面に代わる写真で示す。図４の上
側は正常なヒト心筋からの全ＲＮＡ（Clontech社より購
入）によるものであり、図４の下側がジラルディハート
（Girardi Heart）によるものである。図４の左側はマ
ーカーとしてのｋｂラダーである。図４のその左から、
プレプロ−エンドセリン−１（prepro-endothelin-1
（ｐｐＥＴ−１））、ＥＴＡエンドセリン受容体（ETA
endothelin receptor （ＥＴＡＲ））、ＥＴＢエンドセ
リン受容体（ETB endothelin receptor（ＥＴ
ＢＲ））、ＡＴ１アンジオテンシン受容体（AT1 angiot
ensin receptor（ＡＴ１Ｒ））、α１Ｃアドレナリン受
容体（α1C adrenergic receptor （α１ｃＡＲ））、
ｇｐ１３０(カージオトロフィン−１受容体（cardiotro
phin-1 receptor））、トランスフォーミング成長因子
β（transforming growth factorβ（ＴＧＦβ））、タ
ンパクキナーゼＣβ（protein kinase Cβ （ＰＫＣ
β））、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｒａｓ、及びβ
−ＭＨＣであり、右端はｃＤＮＡ合成の確認のためのＧ
ＡＰＤＨである。
における遺伝子の発現を、心筋肥大に関連する主要な遺
伝子についてＲＴ−ＰＣＲ（Reverse-Transcription PC
R）で検討した。ジラルディハート（Girardi Heart）か
ら抽出した全ＲＮＡ、あるいは正常のヒト心筋の全ＲＮ
Ａを用いて、定法に従ってｃＤＮＡを合成した（Sakamo
to A, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(2
5):13873-8.）。ｃＤＮＡ合成の確認として、ハウスキ
ーピング遺伝子（housekeeping gene）であるＧＡＰＤ
Ｈ（Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase)を用
いた。結果を図４に図面に代わる写真で示す。図４の上
側は正常なヒト心筋からの全ＲＮＡ（Clontech社より購
入）によるものであり、図４の下側がジラルディハート
（Girardi Heart）によるものである。図４の左側はマ
ーカーとしてのｋｂラダーである。図４のその左から、
プレプロ−エンドセリン−１（prepro-endothelin-1
（ｐｐＥＴ−１））、ＥＴＡエンドセリン受容体（ETA
endothelin receptor （ＥＴＡＲ））、ＥＴＢエンドセ
リン受容体（ETB endothelin receptor（ＥＴ
ＢＲ））、ＡＴ１アンジオテンシン受容体（AT1 angiot
ensin receptor（ＡＴ１Ｒ））、α１Ｃアドレナリン受
容体（α1C adrenergic receptor （α１ｃＡＲ））、
ｇｐ１３０(カージオトロフィン−１受容体（cardiotro
phin-1 receptor））、トランスフォーミング成長因子
β（transforming growth factorβ（ＴＧＦβ））、タ
ンパクキナーゼＣβ（protein kinase Cβ （ＰＫＣ
β））、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｒａｓ、及びβ
−ＭＨＣであり、右端はｃＤＮＡ合成の確認のためのＧ
ＡＰＤＨである。
【００１５】ジラルディハート（Girardi Heart）では
検討した１２の心肥大関連遺伝子のうち、α１Ｃアドレ
ナリン受容体とタンパクキナーゼＣβを除く１０の遺伝
子が発現しており、心肥大の機能評価系としてのマーカ
ー遺伝子として十分使用できるものと考えられた。そこ
で、心筋肥大に対するマーカー遺伝子としてβ−ＭＨＣ
を採用することにして、この「マーカー遺伝子」のプロ
モーターとレポーター遺伝子との融合を行った。シリア
ンハムスターのβ−ＭＨＣのプロモーター領域（Wang,
R., et. al. J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (9), 1155-11
65 (1994)）をＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲ産物
を図５に図面に代わる写真で示す。図５の右側のＭはマ
ーカーとしてのｋｂラダーである。左側の矢印で示され
るバンドがＰＣＲ産物である。
検討した１２の心肥大関連遺伝子のうち、α１Ｃアドレ
ナリン受容体とタンパクキナーゼＣβを除く１０の遺伝
子が発現しており、心肥大の機能評価系としてのマーカ
ー遺伝子として十分使用できるものと考えられた。そこ
で、心筋肥大に対するマーカー遺伝子としてβ−ＭＨＣ
を採用することにして、この「マーカー遺伝子」のプロ
モーターとレポーター遺伝子との融合を行った。シリア
ンハムスターのβ−ＭＨＣのプロモーター領域（Wang,
R., et. al. J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (9), 1155-11
65 (1994)）をＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲ産物
を図５に図面に代わる写真で示す。図５の右側のＭはマ
ーカーとしてのｋｂラダーである。左側の矢印で示され
るバンドがＰＣＲ産物である。
【００１６】得られたＰＣＲ産物（図５）をＸｈｏＩと
ＢａｍＨＩで消化し、定法に従い、プラスミドｐｄ２Ｅ
ＧＦＰ−１のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ認識部位に挿入した
組み替え体（ｐβＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰ）を調製した。
クローン化したＰＣＲ断片の塩基配列はＤＮＡシークエ
ンサー（ＡＢＩ３１０）で確認した。完成した発現コン
ストラクトの部分塩基配列を図６に示した。その塩基配
列を配列表の配列番号１に示す。レポーター遺伝子の翻
訳領域のＮ末端アミノ酸配列の一部を配列表の記載規則
に従って配列番号２に示す。図５の細字部分の塩基配列
はβ−ＭＨＣ遺伝子に由来する部分であり、その転写開
始点（＋１）の５’上流７２８塩基から３’下流９１塩
基までに対応する。ＴＡＴＡボックスとＧＡＴＡ転写因
子の結合部位を、それぞれボックスと下線で示す。太字
部分はプラスミドｐｄ２ＥＧＦＰに由来するものであ
り、レポーター遺伝子ｄ２ＥＧＦの翻訳開始点（ｄ２Ｅ
ＦＧＰ→）はβ−ＭＨＣ遺伝子の転写開始点から１１０
塩基３’下流に位置する。ｄ２ＥＧＦの部分アミノ酸配
列をアミノ酸の一文字表記で塩基配列の下に示した。プ
ラスミドｐｄ２ＥＧＦＰ−１のコードするレポーター遺
伝子ｄ２ＥＧＦＰは、 エンハンスド緑色蛍光蛋白質
（Enhanced Green Fluorescence Protein（ＥＧＦ
Ｐ））の変異体で、ＥＧＦＰのカルボキシル末端に自身
の分解速度を高めるマウスのオルニチンデカルボキシラ
ーゼ（ornithine decarboxylase）のＰＥＳＴ配列を融
合させたものである。その結果、ｄ２ＥＧＦＰのタンパ
ク質の半減期が２時間と短く、測定される蛍光強度はそ
の転写量を良く反映すると考えられる。
ＢａｍＨＩで消化し、定法に従い、プラスミドｐｄ２Ｅ
ＧＦＰ−１のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ認識部位に挿入した
組み替え体（ｐβＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰ）を調製した。
クローン化したＰＣＲ断片の塩基配列はＤＮＡシークエ
ンサー（ＡＢＩ３１０）で確認した。完成した発現コン
ストラクトの部分塩基配列を図６に示した。その塩基配
列を配列表の配列番号１に示す。レポーター遺伝子の翻
訳領域のＮ末端アミノ酸配列の一部を配列表の記載規則
に従って配列番号２に示す。図５の細字部分の塩基配列
はβ−ＭＨＣ遺伝子に由来する部分であり、その転写開
始点（＋１）の５’上流７２８塩基から３’下流９１塩
基までに対応する。ＴＡＴＡボックスとＧＡＴＡ転写因
子の結合部位を、それぞれボックスと下線で示す。太字
部分はプラスミドｐｄ２ＥＧＦＰに由来するものであ
り、レポーター遺伝子ｄ２ＥＧＦの翻訳開始点（ｄ２Ｅ
ＦＧＰ→）はβ−ＭＨＣ遺伝子の転写開始点から１１０
塩基３’下流に位置する。ｄ２ＥＧＦの部分アミノ酸配
列をアミノ酸の一文字表記で塩基配列の下に示した。プ
ラスミドｐｄ２ＥＧＦＰ−１のコードするレポーター遺
伝子ｄ２ＥＧＦＰは、 エンハンスド緑色蛍光蛋白質
（Enhanced Green Fluorescence Protein（ＥＧＦ
Ｐ））の変異体で、ＥＧＦＰのカルボキシル末端に自身
の分解速度を高めるマウスのオルニチンデカルボキシラ
ーゼ（ornithine decarboxylase）のＰＥＳＴ配列を融
合させたものである。その結果、ｄ２ＥＧＦＰのタンパ
ク質の半減期が２時間と短く、測定される蛍光強度はそ
の転写量を良く反映すると考えられる。
【００１７】得られた融合遺伝子を用いてアッセイ細胞
株を樹立した。ジラルディハート（Girardi Heart）
に、得られた融合遺伝子ｐβＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰとＧ
４１８耐性遺伝子をコードするｐＳＶ２ｎｅｏとをＦｕ
ＧＥＮＥ６(Boehringer Mannheim社）試薬を用いて同時
にトランスフェクションした 。翌日から選択培地で培
養し、得られた耐性コロニーから細胞株（Ｇｉｒａｒｄ
ｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰ）を樹立した。こうして得
られた細胞株のゲノムに、ｐβＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰが
実際に組み込まれているか否かをＰＣＲで検討した。結
果を図７に図面に代わる写真で示す。図７は、Ｇ４１８
で選択した複数のコロニーからゲノムを抽出し（レーン
１〜３）ｄ２ＥＧＦＰに対するプライマーでＰＣＲを行
った。ｌａｎｅ３の細胞株のゲノムにはｄ２ＥＧＦＰが
組み込まれていることが分かった。図７の右側のＰＣは
ポジティブコントロール（プラスミドｐβＭＨＣ／ｄ２
ＥＧＦＰ）を表す。
株を樹立した。ジラルディハート（Girardi Heart）
に、得られた融合遺伝子ｐβＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰとＧ
４１８耐性遺伝子をコードするｐＳＶ２ｎｅｏとをＦｕ
ＧＥＮＥ６(Boehringer Mannheim社）試薬を用いて同時
にトランスフェクションした 。翌日から選択培地で培
養し、得られた耐性コロニーから細胞株（Ｇｉｒａｒｄ
ｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰ）を樹立した。こうして得
られた細胞株のゲノムに、ｐβＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰが
実際に組み込まれているか否かをＰＣＲで検討した。結
果を図７に図面に代わる写真で示す。図７は、Ｇ４１８
で選択した複数のコロニーからゲノムを抽出し（レーン
１〜３）ｄ２ＥＧＦＰに対するプライマーでＰＣＲを行
った。ｌａｎｅ３の細胞株のゲノムにはｄ２ＥＧＦＰが
組み込まれていることが分かった。図７の右側のＰＣは
ポジティブコントロール（プラスミドｐβＭＨＣ／ｄ２
ＥＧＦＰ）を表す。
【００１８】樹立したアッセイ細胞株（Ｇｉｒａｒｄｉ
／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰ）に既知の心肥大誘発分子で
あるエンドセリン−１（endothelin-1）を発現させ、レ
ポーター遺伝子（d2EGFP）の発現レベルを検討した。Ｓ
Ｒαプロモーターの下流にヒトｐｒｅｐｒｏ−ＥＴ−１
ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｐｐＥ
Ｔ−１を、ＦｕＧｅｎｅ試薬を用いてＧｉｒａｒｄｉ／
βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰに一過性発現させ、トランスフ
ェクション４８時間後にアッセイした。レポーター遺伝
子（ｄ２ＥＧＦＰ）の発現レベルは、放射性同位元素を
用いたＲＮＡブロットで直接定量した。結果を図８に図
面に代わる写真で示す。図８のコントロールはジラルデ
ィハート（Girardi Heart）であり、Ｂａｓａｌは無刺
激の形質転換体Ｇｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦ
Ｐであり、ＥＴ−１はＥＴ−１を一過性発現させたＧｉ
ｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰである。レーン当
たり５μｇの全ＲＮＡを用いた。
／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰ）に既知の心肥大誘発分子で
あるエンドセリン−１（endothelin-1）を発現させ、レ
ポーター遺伝子（d2EGFP）の発現レベルを検討した。Ｓ
Ｒαプロモーターの下流にヒトｐｒｅｐｒｏ−ＥＴ−１
ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｐｐＥ
Ｔ−１を、ＦｕＧｅｎｅ試薬を用いてＧｉｒａｒｄｉ／
βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰに一過性発現させ、トランスフ
ェクション４８時間後にアッセイした。レポーター遺伝
子（ｄ２ＥＧＦＰ）の発現レベルは、放射性同位元素を
用いたＲＮＡブロットで直接定量した。結果を図８に図
面に代わる写真で示す。図８のコントロールはジラルデ
ィハート（Girardi Heart）であり、Ｂａｓａｌは無刺
激の形質転換体Ｇｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦ
Ｐであり、ＥＴ−１はＥＴ−１を一過性発現させたＧｉ
ｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰである。レーン当
たり５μｇの全ＲＮＡを用いた。
【００１９】図８に示されるＧｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ
／ｄ２ＥＧＦＰ細胞におけるｄ２ＥＧＦＰの発現レベル
のＲＮＡブロットによる検討結果において、それが発す
る蛍光強度も測定した。蛍光の測定には、Wallac 1420
ARVOsxを用いた。結果を図９に示す。図９のコントロー
ル、Ｂａｓａｌ、及びＥＴ−１は前記図８の場合と同じ
である。いずれの場合にも、無刺激でβ−ＭＨＣプロモ
ーターによる基本転写活性をある程度は認めたが、ｄ２
ＥＧＦＰの転写レベルは刺激で有意に上昇し、本発明の
アッセイ系の妥当性が確認できた。
／ｄ２ＥＧＦＰ細胞におけるｄ２ＥＧＦＰの発現レベル
のＲＮＡブロットによる検討結果において、それが発す
る蛍光強度も測定した。蛍光の測定には、Wallac 1420
ARVOsxを用いた。結果を図９に示す。図９のコントロー
ル、Ｂａｓａｌ、及びＥＴ−１は前記図８の場合と同じ
である。いずれの場合にも、無刺激でβ−ＭＨＣプロモ
ーターによる基本転写活性をある程度は認めたが、ｄ２
ＥＧＦＰの転写レベルは刺激で有意に上昇し、本発明の
アッセイ系の妥当性が確認できた。
【００２０】先に動作確認に用いたエンドセリン−１
（endothelin-1）は生理活性ペプチドであり、細胞の外
側から細胞膜表面の受容体に結合して作用する。心肥大
誘発分子はこれ以外にも、細胞質に存在するプロト−オ
ンコジーン（proto-oncogene（ｃ−ｍｙｃなど））や核
内の転写因子（ＧＡＴＡ−４など）などが知られてい
る。そこで、今回開発したアッセイ細胞株が、こうした
様々な部位で機能する心肥大誘発分子の活性も検出でき
るか否かを検討した。ｐＭＥ１８Ｓ／ｃ−ｍｙｃあるい
はｐＭＥ１８Ｓ／ＧＡＴＡ−４を、ＦｕＧｅｎｅ試薬を
用いてＧｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰに一過
性発現させ、その蛍光をＷａｌｌａｃ １４２０ ＡＲ
ＶＯｓｘを用いて測定した。結果を図１０に示す。図１
０のコントロール、Ｂａｓａｌ、及びＥＴ−１は前記図
８の場合と同じであり、その右側がｃ−ｍｙｃ及びＧＡ
ＴＡ−４である。この結果、いずれの場合にも蛍光は有
意に上昇し、細胞内物質についても本発明のアッセイ系
が極めて有効であることが確認された。
（endothelin-1）は生理活性ペプチドであり、細胞の外
側から細胞膜表面の受容体に結合して作用する。心肥大
誘発分子はこれ以外にも、細胞質に存在するプロト−オ
ンコジーン（proto-oncogene（ｃ−ｍｙｃなど））や核
内の転写因子（ＧＡＴＡ−４など）などが知られてい
る。そこで、今回開発したアッセイ細胞株が、こうした
様々な部位で機能する心肥大誘発分子の活性も検出でき
るか否かを検討した。ｐＭＥ１８Ｓ／ｃ−ｍｙｃあるい
はｐＭＥ１８Ｓ／ＧＡＴＡ−４を、ＦｕＧｅｎｅ試薬を
用いてＧｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰに一過
性発現させ、その蛍光をＷａｌｌａｃ １４２０ ＡＲ
ＶＯｓｘを用いて測定した。結果を図１０に示す。図１
０のコントロール、Ｂａｓａｌ、及びＥＴ−１は前記図
８の場合と同じであり、その右側がｃ−ｍｙｃ及びＧＡ
ＴＡ−４である。この結果、いずれの場合にも蛍光は有
意に上昇し、細胞内物質についても本発明のアッセイ系
が極めて有効であることが確認された。
【００２１】
【発明の実施の形態】以上のように本発明の方法は、マ
ーカー遺伝子に着目した新規なアッセイ系を提供するも
のであり、本発明の方法により、細胞外及び細胞内にお
ける様々な刺激に対するアッセイが簡便な方法で可能と
なった。例えば、単離・同定したい標的分子の細胞内局
在を問題にしないのならば、アッセイ細胞株自身にｃＤ
ＮＡライブラリーをトランスフェクションさせれば良
い。一方、標的分子をエンドセリン−１（endotehlin-
1）のような分泌型の生理活性物質に的を絞るならば、
アッセイ細胞株とは別の細胞にｃＤＮＡライブラリー発
現させ、両者を共培養させる方法が効果的である。共培
養でアッセイ細胞株のレポーター遺伝子の発現レベルが
上昇するのは、ｃＤＮＡ発現細胞から培養上清中に生理
活性物質が分泌される場合に限られるからである。もち
ろん本発明の方法は、古典的な生化学手法で精製した標
品（ペプチドに限らず、脂質、ガス性物質を含む）のア
ッセイにも有用である。また、標的分子の単離は、ｃＤ
ＮＡライブラリー全体をトランスフェクションする以外
にも、限られた候補ｃＤＮＡを個別にトランスフェクシ
ョンする方法も有効である。
ーカー遺伝子に着目した新規なアッセイ系を提供するも
のであり、本発明の方法により、細胞外及び細胞内にお
ける様々な刺激に対するアッセイが簡便な方法で可能と
なった。例えば、単離・同定したい標的分子の細胞内局
在を問題にしないのならば、アッセイ細胞株自身にｃＤ
ＮＡライブラリーをトランスフェクションさせれば良
い。一方、標的分子をエンドセリン−１（endotehlin-
1）のような分泌型の生理活性物質に的を絞るならば、
アッセイ細胞株とは別の細胞にｃＤＮＡライブラリー発
現させ、両者を共培養させる方法が効果的である。共培
養でアッセイ細胞株のレポーター遺伝子の発現レベルが
上昇するのは、ｃＤＮＡ発現細胞から培養上清中に生理
活性物質が分泌される場合に限られるからである。もち
ろん本発明の方法は、古典的な生化学手法で精製した標
品（ペプチドに限らず、脂質、ガス性物質を含む）のア
ッセイにも有用である。また、標的分子の単離は、ｃＤ
ＮＡライブラリー全体をトランスフェクションする以外
にも、限られた候補ｃＤＮＡを個別にトランスフェクシ
ョンする方法も有効である。
【００２２】機能分子を探索する方法としては、例え
ば、未分化と分化状態あるいは正常と病気など発現レベ
ルが異なるｃＤＮＡを単離・同定する有力な方法とし
て、サブトラクションハイブリダイゼーション法（subt
ractive hybridization法）やディファレンシャルディ
スプレー法（differential display法）など既にいくつ
かの方法が報告されている。しかし、こうした方法で単
離される数多くのｃＤＮＡの中から、興味ある形質を誘
導するものを同定する方法はこれまで無かった。本発明
の方法はこのような方法で探索されたｃＤＮＡの中か
ら、その機能や作用する遺伝子を特定するための極めて
有効な方法となる。また、ヒトの全ゲノム配列はほぼ決
定され、配列から多数の遺伝子の存在が予測されている
が、そのほとんどは機能不明である。重要な機能分子を
効率よく同定する方法はポストゲノム研究においては必
須の技術である。本発明の方法は、発現量や配列をもと
にリストアップされた候補ｃＤＮＡの中から、目的の活
性を有するものを効率よく同定することにも威力を発揮
するはずである。したがって、ゲノム解析における機能
分析においても本発明の方法は極めて有効な手法となる
ものである。
ば、未分化と分化状態あるいは正常と病気など発現レベ
ルが異なるｃＤＮＡを単離・同定する有力な方法とし
て、サブトラクションハイブリダイゼーション法（subt
ractive hybridization法）やディファレンシャルディ
スプレー法（differential display法）など既にいくつ
かの方法が報告されている。しかし、こうした方法で単
離される数多くのｃＤＮＡの中から、興味ある形質を誘
導するものを同定する方法はこれまで無かった。本発明
の方法はこのような方法で探索されたｃＤＮＡの中か
ら、その機能や作用する遺伝子を特定するための極めて
有効な方法となる。また、ヒトの全ゲノム配列はほぼ決
定され、配列から多数の遺伝子の存在が予測されている
が、そのほとんどは機能不明である。重要な機能分子を
効率よく同定する方法はポストゲノム研究においては必
須の技術である。本発明の方法は、発現量や配列をもと
にリストアップされた候補ｃＤＮＡの中から、目的の活
性を有するものを効率よく同定することにも威力を発揮
するはずである。したがって、ゲノム解析における機能
分析においても本発明の方法は極めて有効な手法となる
ものである。
【００２３】本発明の方法には、大きく二つの特徴があ
る。まず第一に、様々な生物活性を有する機能分子の単
離・同定を、培養細胞における「マーカー遺伝子」の発
現を指標として行うことで、特殊な生物活性のアッセイ
系を不要とした点である。第二に、目的の形質発現に関
与する広範な機能分子群の単離・同定を、単一の方法で
可能にした点である。すなわち、細胞外から作用する分
泌型の生理活性物質のみならず、細胞質内あるいは核内
で機能する情報伝達分子や転写因子などの同定も、本発
明の方法により可能である。さらに、本発明のアッセイ
系はきわめて高感度で、９６穴や３８４穴などのマイク
ロタイタープレートと蛍光プレートリーダーで十分に測
定可能である。本発明の方法は、ポストゲノム時代にお
いて創薬の対象となりうる有用分子の同定に絶大な威力
を発揮するものと期待される。
る。まず第一に、様々な生物活性を有する機能分子の単
離・同定を、培養細胞における「マーカー遺伝子」の発
現を指標として行うことで、特殊な生物活性のアッセイ
系を不要とした点である。第二に、目的の形質発現に関
与する広範な機能分子群の単離・同定を、単一の方法で
可能にした点である。すなわち、細胞外から作用する分
泌型の生理活性物質のみならず、細胞質内あるいは核内
で機能する情報伝達分子や転写因子などの同定も、本発
明の方法により可能である。さらに、本発明のアッセイ
系はきわめて高感度で、９６穴や３８４穴などのマイク
ロタイタープレートと蛍光プレートリーダーで十分に測
定可能である。本発明の方法は、ポストゲノム時代にお
いて創薬の対象となりうる有用分子の同定に絶大な威力
を発揮するものと期待される。
【００２４】本発明は、特定の生体現象を誘起する機能
分子を、その現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を
指標として、スクリーニングする方法を提供するもので
あり、本発明の特定の生体現象としては、前記した例に
おける心筋肥大に限定されるものではなく、生体組織や
細胞における様々な形態の変化や機能の発現などの各種
の現象を包含するものである。これらの現象の中で当該
現象と特異的に関連する遺伝子（マーカー遺伝子）が存
在していることが必要である。マーカー遺伝子としては
前記の例に示したβ−ＭＨＣをコードする遺伝子に限定
されるものでは無く、当該現象と特異的に関連する遺伝
子であればよい。本発明の方法におけるマーカー遺伝子
としては、特異的な関連があるものであるが、必ずしも
特異的な関連性があることが知られている遺伝子に限定
されるものではなく、特定の生体現象に関連性があると
推定される遺伝子も使用することができる。このような
遺伝子については、本発明の方法により公知の機能分子
を用いてその関連性をさらに詳細に計測することが可能
である。
分子を、その現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を
指標として、スクリーニングする方法を提供するもので
あり、本発明の特定の生体現象としては、前記した例に
おける心筋肥大に限定されるものではなく、生体組織や
細胞における様々な形態の変化や機能の発現などの各種
の現象を包含するものである。これらの現象の中で当該
現象と特異的に関連する遺伝子（マーカー遺伝子）が存
在していることが必要である。マーカー遺伝子としては
前記の例に示したβ−ＭＨＣをコードする遺伝子に限定
されるものでは無く、当該現象と特異的に関連する遺伝
子であればよい。本発明の方法におけるマーカー遺伝子
としては、特異的な関連があるものであるが、必ずしも
特異的な関連性があることが知られている遺伝子に限定
されるものではなく、特定の生体現象に関連性があると
推定される遺伝子も使用することができる。このような
遺伝子については、本発明の方法により公知の機能分子
を用いてその関連性をさらに詳細に計測することが可能
である。
【００２５】本発明の特徴のひとつは、特定の生体現象
と特異的に連関する遺伝子（マーカー遺伝子）の発現量
を指標とする方法として、当該遺伝子のプロモーター領
域に着目した点が挙げられる。マーカー遺伝子のプロモ
ーター領域の入手方法は公知の方法により行うことがで
きる。また、本発明の方法は、このプロモーター領域の
下流にレポーター遺伝子を融合させることにより、マー
カー遺伝子の発現量をレポーター遺伝子を用いた簡便な
手段により計測可能にしたことを特徴とするものでもあ
る。本発明のレポーター遺伝子としては、レポーターと
しての機能を果たすものであればよく、例えば、蛍光蛋
白質をコードする遺伝子が好ましいが、これに限定され
るものではなく蛍光若しくは放射性のプローブを用いて
検出や同定が可能な遺伝子を本発明のレポーター遺伝子
として使用することもできる。蛍光蛋白質としては、例
えば、緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescence Protein
（ＧＦＰ））、赤色蛍光蛋白質（Cyan Fluorescence Pr
otein（ＣＦＰ））、青色蛍光蛋白質（Blue Fluorescen
ce Protein（ＢＦＰ））、黄色蛍光蛋白質（Yellow Flu
orescence Protein（ＹＦＰ））、ルシフェラーゼ（luc
iferase）、若しくはβ−ガラクトシダーゼ（β-galact
osidase）、又はこれらの改良型若しくは変異体を使用
することができる。
と特異的に連関する遺伝子（マーカー遺伝子）の発現量
を指標とする方法として、当該遺伝子のプロモーター領
域に着目した点が挙げられる。マーカー遺伝子のプロモ
ーター領域の入手方法は公知の方法により行うことがで
きる。また、本発明の方法は、このプロモーター領域の
下流にレポーター遺伝子を融合させることにより、マー
カー遺伝子の発現量をレポーター遺伝子を用いた簡便な
手段により計測可能にしたことを特徴とするものでもあ
る。本発明のレポーター遺伝子としては、レポーターと
しての機能を果たすものであればよく、例えば、蛍光蛋
白質をコードする遺伝子が好ましいが、これに限定され
るものではなく蛍光若しくは放射性のプローブを用いて
検出や同定が可能な遺伝子を本発明のレポーター遺伝子
として使用することもできる。蛍光蛋白質としては、例
えば、緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescence Protein
（ＧＦＰ））、赤色蛍光蛋白質（Cyan Fluorescence Pr
otein（ＣＦＰ））、青色蛍光蛋白質（Blue Fluorescen
ce Protein（ＢＦＰ））、黄色蛍光蛋白質（Yellow Flu
orescence Protein（ＹＦＰ））、ルシフェラーゼ（luc
iferase）、若しくはβ−ガラクトシダーゼ（β-galact
osidase）、又はこれらの改良型若しくは変異体を使用
することができる。
【００２６】本発明のマーカー遺伝子のプロモーターと
レポーター遺伝子の融合遺伝子の製造方法も特に制限は
ないが、通常はレポーター遺伝子を含有するプラスミド
に当該レポーター遺伝子の翻訳開始点よりも上流側にマ
ーカー遺伝子のプロモーター領域を挿入する方法が簡便
で好ましい。挿入位置は特に制限はないが、プロモータ
ーの機能に影響を与えない位置であればよい。また、本
発明のマーカー遺伝子のプロモーターとレポーター遺伝
子の融合遺伝子は、培養細胞株のゲノムに組み込むのが
好ましい。このような細胞株としては、ヒト、マウス、
ラットなどの各種の動物細胞や大腸菌や酵母などの微生
物が使用できる。
レポーター遺伝子の融合遺伝子の製造方法も特に制限は
ないが、通常はレポーター遺伝子を含有するプラスミド
に当該レポーター遺伝子の翻訳開始点よりも上流側にマ
ーカー遺伝子のプロモーター領域を挿入する方法が簡便
で好ましい。挿入位置は特に制限はないが、プロモータ
ーの機能に影響を与えない位置であればよい。また、本
発明のマーカー遺伝子のプロモーターとレポーター遺伝
子の融合遺伝子は、培養細胞株のゲノムに組み込むのが
好ましい。このような細胞株としては、ヒト、マウス、
ラットなどの各種の動物細胞や大腸菌や酵母などの微生
物が使用できる。
【００２７】本発明のスクリーニング方法は、検体物質
を検出、同定又は定量することができるものであり、ま
た検体物質の機能分子としての作用を評価する方法も包
含するものである。また、本発明のスクリーニング方法
では、特定の生体現象と特異的に連関する遺伝子（マー
カー遺伝子）として、１種または２種以上のものを同時
又は随時に使用することもできる。マーカー遺伝子が複
数存在する場合には、同時に複数種のマーカー遺伝子を
使用することにより、本発明のスクリーニング方法の精
度を上げることができる。例えば、前記の心筋肥大につ
いての例においては、マーカー遺伝子としてβ−ＭＨＣ
のみならずＢＮＰをコードする遺伝子をさらにマーカー
遺伝子として使用することもできる。
を検出、同定又は定量することができるものであり、ま
た検体物質の機能分子としての作用を評価する方法も包
含するものである。また、本発明のスクリーニング方法
では、特定の生体現象と特異的に連関する遺伝子（マー
カー遺伝子）として、１種または２種以上のものを同時
又は随時に使用することもできる。マーカー遺伝子が複
数存在する場合には、同時に複数種のマーカー遺伝子を
使用することにより、本発明のスクリーニング方法の精
度を上げることができる。例えば、前記の心筋肥大につ
いての例においては、マーカー遺伝子としてβ−ＭＨＣ
のみならずＢＮＰをコードする遺伝子をさらにマーカー
遺伝子として使用することもできる。
【００２８】また、本発明は、特定の生体現象と特異的
に連関する遺伝子（マーカー遺伝子）のプロモーターの
下流にレポーター遺伝子を融合させた遺伝子を提供する
ものである。このような遺伝子としては融合遺伝子だけ
であってもよいし、適当なベクターに挿入された遺伝子
であってもよい。本発明の遺伝子におけるマーカー遺伝
子やレポーター遺伝子としては前記したものが使用され
る。本発明の遺伝子の例としては、配列表の配列番号１
に記載の塩基配列、又は当該塩基配列にストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を挙げられ
る。
に連関する遺伝子（マーカー遺伝子）のプロモーターの
下流にレポーター遺伝子を融合させた遺伝子を提供する
ものである。このような遺伝子としては融合遺伝子だけ
であってもよいし、適当なベクターに挿入された遺伝子
であってもよい。本発明の遺伝子におけるマーカー遺伝
子やレポーター遺伝子としては前記したものが使用され
る。本発明の遺伝子の例としては、配列表の配列番号１
に記載の塩基配列、又は当該塩基配列にストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を挙げられ
る。
【００２９】本発明の前記遺伝子は、特定の生体現象を
誘起する機能分子を、その現象と特異的に連関する遺伝
子の発現量を指標としてスクリーニングし、検出、同定
又は評価するための遺伝子である。したがって、本発明
の遺伝子は特定の生体現象を誘起する機能分子を、その
現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を指標としてス
クリーニングする際に使用されるスクリーニング材料を
提供するものである。本発明は、前記した本発明の遺伝
子を含有してなる、特定の生体現象を誘起する機能分子
を、その現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を指標
として検出、同定又は評価するためのキットを提供する
ものである。このような遺伝子としては、同種の生体現
象と特異的に連関する遺伝子のプロモーターの下流にレ
ポーター遺伝子を融合させた遺伝子の１種以上をさらに
含有することができる。この場合にマーカー遺伝子に対
応してレポーター遺伝子を異なる種類、例えばレポータ
ー遺伝子が蛍光蛋白質の遺伝子である場合には蛍光の色
をマーカーに対応させて変えることもできる。これによ
り蛍光の色の変化により多数のマーカー遺伝子の発現を
混合した色の色調により目視可能となる。また、９８穴
や３２８穴のマイクロタイタープレートと蛍光プレート
リーダーを用いて、１又は２以上のアッセイを同時に行
うこともできる。本発明のスクリーニング方法は感度が
よく、少量で確実なスクリーニング系を提供するもので
ある。
誘起する機能分子を、その現象と特異的に連関する遺伝
子の発現量を指標としてスクリーニングし、検出、同定
又は評価するための遺伝子である。したがって、本発明
の遺伝子は特定の生体現象を誘起する機能分子を、その
現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を指標としてス
クリーニングする際に使用されるスクリーニング材料を
提供するものである。本発明は、前記した本発明の遺伝
子を含有してなる、特定の生体現象を誘起する機能分子
を、その現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を指標
として検出、同定又は評価するためのキットを提供する
ものである。このような遺伝子としては、同種の生体現
象と特異的に連関する遺伝子のプロモーターの下流にレ
ポーター遺伝子を融合させた遺伝子の１種以上をさらに
含有することができる。この場合にマーカー遺伝子に対
応してレポーター遺伝子を異なる種類、例えばレポータ
ー遺伝子が蛍光蛋白質の遺伝子である場合には蛍光の色
をマーカーに対応させて変えることもできる。これによ
り蛍光の色の変化により多数のマーカー遺伝子の発現を
混合した色の色調により目視可能となる。また、９８穴
や３２８穴のマイクロタイタープレートと蛍光プレート
リーダーを用いて、１又は２以上のアッセイを同時に行
うこともできる。本発明のスクリーニング方法は感度が
よく、少量で確実なスクリーニング系を提供するもので
ある。
【００３０】さらに、本発明は、前記した本発明の遺伝
子で形質転換された形質転換細胞を提供するものであ
る。本発明の形質転換細胞は、本発明の方法に適してい
るのみでなく、細胞におけるマーカー遺伝子の作用を評
価するためにも有用なものである。本発明の形質転換細
胞は、転写可能な状態で宿主細胞に挿入されたものであ
ればよいが、好ましくはゲノム中に挿入されたものであ
る。形質転換の方法としては、公知の種々の方法を使用
することができる。
子で形質転換された形質転換細胞を提供するものであ
る。本発明の形質転換細胞は、本発明の方法に適してい
るのみでなく、細胞におけるマーカー遺伝子の作用を評
価するためにも有用なものである。本発明の形質転換細
胞は、転写可能な状態で宿主細胞に挿入されたものであ
ればよいが、好ましくはゲノム中に挿入されたものであ
る。形質転換の方法としては、公知の種々の方法を使用
することができる。
【００３１】
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定される
ものではない。なお、以下の実施例に示すジラルディハ
ート（Girardi Heart）細胞株は、ヒト右心房筋から樹
立されたものであり（Girardi AJ, et al. Proc. Soc.
Exp. Biol. Med. 1958; 98: 18-22）、大日本製薬から
購入した。各種の遺伝子操作は、公知の遺伝子操作手段
を採用するか、メーカーのマニュアルに従って操作され
た。
明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定される
ものではない。なお、以下の実施例に示すジラルディハ
ート（Girardi Heart）細胞株は、ヒト右心房筋から樹
立されたものであり（Girardi AJ, et al. Proc. Soc.
Exp. Biol. Med. 1958; 98: 18-22）、大日本製薬から
購入した。各種の遺伝子操作は、公知の遺伝子操作手段
を採用するか、メーカーのマニュアルに従って操作され
た。
【００３２】実施例１ （ジラルディハート（Girardi
Heart）細胞株の核型分析） 古典的なＧ−バンド染色を行った。結果を図２に示す。
また、各染色体を個別の色で検出するスペクトルカリオ
タイピング（Spectralkaryotyping （ＳＫＹ））を行っ
た。結果を図３に示す。この結果、１０細胞を分析した
結果、平均染色体数は７８（３倍体）で、前記した特徴
を有していることがわかった。
Heart）細胞株の核型分析） 古典的なＧ−バンド染色を行った。結果を図２に示す。
また、各染色体を個別の色で検出するスペクトルカリオ
タイピング（Spectralkaryotyping （ＳＫＹ））を行っ
た。結果を図３に示す。この結果、１０細胞を分析した
結果、平均染色体数は７８（３倍体）で、前記した特徴
を有していることがわかった。
【００３３】実施例２ （遺伝子の発現）
ジラルディハート（Girardi Heart）における発現、心
筋肥大に関連する主要な遺伝子のをＲＴ−ＰＣＲ（Reve
rse-Transcription PCR）で検討した。ジラルディハー
ト（Girardi Heart）から抽出した全ＲＮＡ（１０μ
ｇ）、あるいは正常のヒト心筋からの全ＲＮＡ（１０μ
ｇ、Clontech社より購入。）から、ランダムプライマー
（random primer）を用いた定法に従ってｃＤＮＡを合
成し、全量１００μｌに調製した（Sakamoto A, et al.
Proc Natl Acad Sci U SA. 1997;94(25):13873-8.）。
ＰＣＲは、ＡＢＩ９７００を用い、以下の反応系条件で
行った。 Ｈ２Ｏ ６．１５μＬ １０ｘバッファー １．０ μＬ ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ） ０．８ μＬ 順方向プライマー（forward primer：１０μＭ） ０．５ μＬ 逆方向プライマー（reverse primer：１０μＭ） ０．５ μＬ ｃＤＮＡ １ μＬ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造） ０．０５μＬ 合計 １０ μＬ ９４℃で１分の後、９４℃で２０秒、５５℃あるいは６
５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル行った。
筋肥大に関連する主要な遺伝子のをＲＴ−ＰＣＲ（Reve
rse-Transcription PCR）で検討した。ジラルディハー
ト（Girardi Heart）から抽出した全ＲＮＡ（１０μ
ｇ）、あるいは正常のヒト心筋からの全ＲＮＡ（１０μ
ｇ、Clontech社より購入。）から、ランダムプライマー
（random primer）を用いた定法に従ってｃＤＮＡを合
成し、全量１００μｌに調製した（Sakamoto A, et al.
Proc Natl Acad Sci U SA. 1997;94(25):13873-8.）。
ＰＣＲは、ＡＢＩ９７００を用い、以下の反応系条件で
行った。 Ｈ２Ｏ ６．１５μＬ １０ｘバッファー １．０ μＬ ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ） ０．８ μＬ 順方向プライマー（forward primer：１０μＭ） ０．５ μＬ 逆方向プライマー（reverse primer：１０μＭ） ０．５ μＬ ｃＤＮＡ １ μＬ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造） ０．０５μＬ 合計 １０ μＬ ９４℃で１分の後、９４℃で２０秒、５５℃あるいは６
５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル行った。
【００３４】解析した心肥大関連遺伝子とプライマーセ
ット（forward primer / reverse primer）は以下の通
りである。またｃＤＮＡ合成の確認として、ハウスキー
ピング遺伝子（housekeeping gene）であるＧＡＰＤＨ
(Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase)を用い
た。 prepro-endothelin-1 (ppET-1):5’-CCAAGGAGCTCCAGAAA
CAG-3’/5’-TTGACCCAGATGATGTCCAG-3’ ETA endothelin receptor (ETAR):5’-TCTGCGCGCTAAGTG
TTGACAGGT-3’/5’-TCATCAGGCTTTAGGACTGGTAAC-3’ ETB endothelin receptor (ETBR):5’-TCTCTGTGGTTCTGG
CTGTC-3’/5’-TGCTGAGGTGAAGGGGAAGC-3’ AT1 angiotensin receptor (AT1R):5’-GCTGAAGACTGTGG
CCAGTG-3’/5’-ATGCAGGTGACTTTGGCTAC-3’ α1C adrenergic receptor (α1cAR):5’-TCCACGGTGCTG
CCCTTCTC-3’/5’-TTGATCTGGCAGATGGTCTC-3’ gp130 (cardiotrophin-1 receptor):5’-CAGAATGTGTATG
GAGTCAC-3’/5’-ACCCAGACTTCAATGTTGAC-3’ transforming growth factor β (TGFβ):5’-AACTATTG
CTTCAGCTCCAC-3’/5’-ACGTAGTACACGATGGGCAG-3’ protein kinase Cβ (PKCβ):5’-GCAGCCACTGCACCGACTT
C-3’/5’-ACGTAGGGATCTGACAAGCC-3’ c-myc:5’-ACAGCAAACCTCCGCACAG-3’/5’-TGGTCACGCAGG
GCAAAAA-3’ c-fos:5’-GCCCCATCGCAGACCAGAGC-3’/5’-ATGCTGCTGAT
GCTCTTGAC-3’ c-ras:5’-CACCATAGAGGTGAGCTCTG-3’/5’-TCCTCTTGGCC
TGCTGTGTC-3’ β-MHC:5’-CGCATGGACCTGGAGCGAGC-3’/5’-CGCCGCATCT
TCCGGAACTC-3’ GAPDH:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’/5’-TCCACCACCCT
GTTGCTGTA-3’
ット（forward primer / reverse primer）は以下の通
りである。またｃＤＮＡ合成の確認として、ハウスキー
ピング遺伝子（housekeeping gene）であるＧＡＰＤＨ
(Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase)を用い
た。 prepro-endothelin-1 (ppET-1):5’-CCAAGGAGCTCCAGAAA
CAG-3’/5’-TTGACCCAGATGATGTCCAG-3’ ETA endothelin receptor (ETAR):5’-TCTGCGCGCTAAGTG
TTGACAGGT-3’/5’-TCATCAGGCTTTAGGACTGGTAAC-3’ ETB endothelin receptor (ETBR):5’-TCTCTGTGGTTCTGG
CTGTC-3’/5’-TGCTGAGGTGAAGGGGAAGC-3’ AT1 angiotensin receptor (AT1R):5’-GCTGAAGACTGTGG
CCAGTG-3’/5’-ATGCAGGTGACTTTGGCTAC-3’ α1C adrenergic receptor (α1cAR):5’-TCCACGGTGCTG
CCCTTCTC-3’/5’-TTGATCTGGCAGATGGTCTC-3’ gp130 (cardiotrophin-1 receptor):5’-CAGAATGTGTATG
GAGTCAC-3’/5’-ACCCAGACTTCAATGTTGAC-3’ transforming growth factor β (TGFβ):5’-AACTATTG
CTTCAGCTCCAC-3’/5’-ACGTAGTACACGATGGGCAG-3’ protein kinase Cβ (PKCβ):5’-GCAGCCACTGCACCGACTT
C-3’/5’-ACGTAGGGATCTGACAAGCC-3’ c-myc:5’-ACAGCAAACCTCCGCACAG-3’/5’-TGGTCACGCAGG
GCAAAAA-3’ c-fos:5’-GCCCCATCGCAGACCAGAGC-3’/5’-ATGCTGCTGAT
GCTCTTGAC-3’ c-ras:5’-CACCATAGAGGTGAGCTCTG-3’/5’-TCCTCTTGGCC
TGCTGTGTC-3’ β-MHC:5’-CGCATGGACCTGGAGCGAGC-3’/5’-CGCCGCATCT
TCCGGAACTC-3’ GAPDH:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’/5’-TCCACCACCCT
GTTGCTGTA-3’
【００３５】結果を図４に示す。ジラルディハート（Gi
rardi Heart）では検討した１２の心肥大関連遺伝子の
うち、α１Ｃ adrenergic receptorとprotein kinase
Ｃβを除く１０の遺伝子が発現しており、心肥大の機能
評価系として十分使用に耐えると考えられた。
rardi Heart）では検討した１２の心肥大関連遺伝子の
うち、α１Ｃ adrenergic receptorとprotein kinase
Ｃβを除く１０の遺伝子が発現しており、心肥大の機能
評価系として十分使用に耐えると考えられた。
【００３６】実施例３（「マーカー遺伝子」のプロモー
ターとレポーター遺伝子との融合） 心肥大のマーカー遺伝子としては、β−ＭＨＣ（β-myo
sin heavy chain）を用いた。シリアンハムスターのβ
−ＭＨＣのプロモーター領域（Wang, R., et.al. J. Mo
l. Cell. Cardiol. 26 (9), 1155-1165 (1994)）をＰＣ
Ｒで増幅した。用いたプライマーは以下の通りである。 Forward primer (F1) : 5’-CGCTCGAGGAAGCTGTGTGACCT
TGGAG-3’ Reverse primer (R2) : 5’-CGGGATCCCTCTTCCTGAATCTGG
AGCC-3’ 下線の配列はゲノムに対応し、それ以外は後にプラスミ
ド（pd2EGFP-1）に組み込むための付加的な制限酵素認
識配列である。PCRは以下の反応系条件で行った。 Ｈ２Ｏ ６．１５μＬ １０ｘバッファー １．０ μＬ ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ） ０．８ μＬ 順方向プライマー(forward primer：１０μＭ) ０．５ μＬ 逆方向プライマー(reverse primer：１０μＭ) ０．５ μＬ ｃＤＮＡ １ μＬ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造） ０．０５μＬ 合計 １０ μＬ ９４℃で１分の後、９４℃で２０秒、６５℃で３０秒、
７２℃で１分を３５サイクル行った。得られたＰＣＲ産
物（図５）をＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化し、定法に従
い、プラスミドｐｄ２ＥＧＦＰ−１のＸｈｏＩ／Ｂａｍ
ＨＩ認識部位に挿入した組み換え体（ｐβＭＨＣ／ｄ２
ＥＧＦＰ）を調製した。クローン化したＰＣＲ断片の塩
基配列はＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３１０）で確認
した。完成した発現コンストラクトの部分塩基配列を図
６に示した。プラスミドｐｄ２ＥＧＦＰ−１のコードす
るレポーター遺伝子ｄ２ＥＧＦＰは、Enhanced Green F
luorescence Protein(ＥＧＦＰ）の変異体で、ＥＧＦＰ
のカルボキシル末端に自身の分解速度を高めるマウスの
オルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxyl
ase）のＰＥＳＴ配列を融合させたものである。その結
果、ｄ２ＥＧＦＰのタンパク質の半減期が２時間と短
く、測定される蛍光強度はその転写量を良く反映すると
考えられる。
ターとレポーター遺伝子との融合） 心肥大のマーカー遺伝子としては、β−ＭＨＣ（β-myo
sin heavy chain）を用いた。シリアンハムスターのβ
−ＭＨＣのプロモーター領域（Wang, R., et.al. J. Mo
l. Cell. Cardiol. 26 (9), 1155-1165 (1994)）をＰＣ
Ｒで増幅した。用いたプライマーは以下の通りである。 Forward primer (F1) : 5’-CGCTCGAGGAAGCTGTGTGACCT
TGGAG-3’ Reverse primer (R2) : 5’-CGGGATCCCTCTTCCTGAATCTGG
AGCC-3’ 下線の配列はゲノムに対応し、それ以外は後にプラスミ
ド（pd2EGFP-1）に組み込むための付加的な制限酵素認
識配列である。PCRは以下の反応系条件で行った。 Ｈ２Ｏ ６．１５μＬ １０ｘバッファー １．０ μＬ ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ） ０．８ μＬ 順方向プライマー(forward primer：１０μＭ) ０．５ μＬ 逆方向プライマー(reverse primer：１０μＭ) ０．５ μＬ ｃＤＮＡ １ μＬ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造） ０．０５μＬ 合計 １０ μＬ ９４℃で１分の後、９４℃で２０秒、６５℃で３０秒、
７２℃で１分を３５サイクル行った。得られたＰＣＲ産
物（図５）をＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化し、定法に従
い、プラスミドｐｄ２ＥＧＦＰ−１のＸｈｏＩ／Ｂａｍ
ＨＩ認識部位に挿入した組み換え体（ｐβＭＨＣ／ｄ２
ＥＧＦＰ）を調製した。クローン化したＰＣＲ断片の塩
基配列はＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３１０）で確認
した。完成した発現コンストラクトの部分塩基配列を図
６に示した。プラスミドｐｄ２ＥＧＦＰ−１のコードす
るレポーター遺伝子ｄ２ＥＧＦＰは、Enhanced Green F
luorescence Protein(ＥＧＦＰ）の変異体で、ＥＧＦＰ
のカルボキシル末端に自身の分解速度を高めるマウスの
オルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxyl
ase）のＰＥＳＴ配列を融合させたものである。その結
果、ｄ２ＥＧＦＰのタンパク質の半減期が２時間と短
く、測定される蛍光強度はその転写量を良く反映すると
考えられる。
【００３７】実施例４ （アッセイ細胞株の樹立）
φ３．５ｃｍのディッシュに５０％の密度で生着させた
ジラルディハート（Girardi Heart）に、ｐβＭＨＣ／
ｄ２ＥＧＦＰ（１μｇ）とＧ４１８耐性遺伝子をコード
するｐＳＶ２ｎｅｏ（０．１μｇ）とをＦｕＧＥＮＥ６
（Boehringer Mannheim社）試薬を用いて同時にトラン
スフェクションした。翌日から選択培地（０．５ｍｇ／
ｍｌのＧ４１８を含有）で培養し、得られた耐性コロニ
ーから細胞株（Ｇｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦ
Ｐ）を樹立した。こうして得られた細胞株のゲノムに、
ｐｂＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰが実際に組み込まれているか
否かをＰＣＲで検討した。用いたプライマーセットは、 GFP-F: 5’-TCGCCACCATGGTGAGCAAG-3’ GFP-R: 5’-CCTAGCAGAAGCACAGGCTG-3’ で、 反応条件はアニーリング温度を５５℃にした以外
は、β−ＭＨＣの場合と同一で行った。結果を図７に示
す。
ジラルディハート（Girardi Heart）に、ｐβＭＨＣ／
ｄ２ＥＧＦＰ（１μｇ）とＧ４１８耐性遺伝子をコード
するｐＳＶ２ｎｅｏ（０．１μｇ）とをＦｕＧＥＮＥ６
（Boehringer Mannheim社）試薬を用いて同時にトラン
スフェクションした。翌日から選択培地（０．５ｍｇ／
ｍｌのＧ４１８を含有）で培養し、得られた耐性コロニ
ーから細胞株（Ｇｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦ
Ｐ）を樹立した。こうして得られた細胞株のゲノムに、
ｐｂＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰが実際に組み込まれているか
否かをＰＣＲで検討した。用いたプライマーセットは、 GFP-F: 5’-TCGCCACCATGGTGAGCAAG-3’ GFP-R: 5’-CCTAGCAGAAGCACAGGCTG-3’ で、 反応条件はアニーリング温度を５５℃にした以外
は、β−ＭＨＣの場合と同一で行った。結果を図７に示
す。
【００３８】実施例５ （アッセイ細胞株の検定）
樹立したアッセイ細胞株（Ｇｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／
ｄ２ＥＧＦＰ）に既知の心肥大誘発分子であるｅｎｄｏ
ｔｈｅｌｉｎ−１を発現させ、レポーター遺伝子（ｄ２
ＥＧＦＰ）の発現レベルを検討した。ＳＲαプロモータ
ーの下流にヒトｐｒｅｐｒｏ−ＥＴ−１ｃＤＮＡを組み
込んだプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｐｐＥＴ−１を、Ｆｕ
Ｇｅｎｅ試薬を用いてＧｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２
ＥＧＦＰに一過性発現させ、トランスフェクション４８
時間後にアッセイした。レポーター遺伝子（ｄ２ＥＧＦ
Ｐ）の発現レベルは、放射性同位元素を用いたＲＮＡ
ｂｌｏｔで直接定量した（図８）上で、それが発する蛍
光強度でも測定した（図９）。蛍光の測定には、Ｗａｌ
ｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘマルチラベルカウンタ
ー（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８５ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉ
ｏｎ ５３５ｎｍ）を用いた。いずれの場合にも、無刺
激でβ−ＭＨＣプロモーターによる基本転写活性をある
程度は認めたが、ｄ２ＥＧＦＰの転写レベルは刺激で有
意に上昇し、系の妥当性が確認できた。
ｄ２ＥＧＦＰ）に既知の心肥大誘発分子であるｅｎｄｏ
ｔｈｅｌｉｎ−１を発現させ、レポーター遺伝子（ｄ２
ＥＧＦＰ）の発現レベルを検討した。ＳＲαプロモータ
ーの下流にヒトｐｒｅｐｒｏ−ＥＴ−１ｃＤＮＡを組み
込んだプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｐｐＥＴ−１を、Ｆｕ
Ｇｅｎｅ試薬を用いてＧｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２
ＥＧＦＰに一過性発現させ、トランスフェクション４８
時間後にアッセイした。レポーター遺伝子（ｄ２ＥＧＦ
Ｐ）の発現レベルは、放射性同位元素を用いたＲＮＡ
ｂｌｏｔで直接定量した（図８）上で、それが発する蛍
光強度でも測定した（図９）。蛍光の測定には、Ｗａｌ
ｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘマルチラベルカウンタ
ー（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８５ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉ
ｏｎ ５３５ｎｍ）を用いた。いずれの場合にも、無刺
激でβ−ＭＨＣプロモーターによる基本転写活性をある
程度は認めたが、ｄ２ＥＧＦＰの転写レベルは刺激で有
意に上昇し、系の妥当性が確認できた。
【００３９】
【発明の効果】本発明は、新規かつ高感度で、簡便な機
能分子のアッセイ系及びスクリーニング系を提供する。
本発明の方法は、マーカー遺伝子と機能分子の特異性に
着目することにより、細胞内外における刺激によるマー
カー遺伝子の発現をレポーター遺伝子を用いて簡便に検
出、同定、又は測定できる方法を提供するものである。
本発明は、第一に、様々な生物活性を有する機能分子の
単離・同定を、培養細胞における「マーカー遺伝子」の
発現を指標として行うことで、特殊な生物活性のアッセ
イ系を不要とし、第二に、目的の形質発現に関与する広
範な機能分子群の単離・同定を、単一の方法で可能にし
たものである。すなわち、細胞外から作用する分泌型の
生理活性物質のみならず、細胞質内あるいは核内で機能
する情報伝達分子や転写因子などの同定も、本発明の方
法で可能となる。本発明は、重要な機能分子を効率よく
同定する方法であり、ポストゲノム研究においては必須
の技術となるものであり、発現量や配列をもとにリスト
アップされた候補ｃＤＮＡの中から、目的の活性を有す
るものを効率よく同定することにも威力を発揮するもの
である。
能分子のアッセイ系及びスクリーニング系を提供する。
本発明の方法は、マーカー遺伝子と機能分子の特異性に
着目することにより、細胞内外における刺激によるマー
カー遺伝子の発現をレポーター遺伝子を用いて簡便に検
出、同定、又は測定できる方法を提供するものである。
本発明は、第一に、様々な生物活性を有する機能分子の
単離・同定を、培養細胞における「マーカー遺伝子」の
発現を指標として行うことで、特殊な生物活性のアッセ
イ系を不要とし、第二に、目的の形質発現に関与する広
範な機能分子群の単離・同定を、単一の方法で可能にし
たものである。すなわち、細胞外から作用する分泌型の
生理活性物質のみならず、細胞質内あるいは核内で機能
する情報伝達分子や転写因子などの同定も、本発明の方
法で可能となる。本発明は、重要な機能分子を効率よく
同定する方法であり、ポストゲノム研究においては必須
の技術となるものであり、発現量や配列をもとにリスト
アップされた候補ｃＤＮＡの中から、目的の活性を有す
るものを効率よく同定することにも威力を発揮するもの
である。
【００４０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Japan Science And Technology Corporation
Sakamoto, Aiji
<120> A Method for Evalution or Identification for Bioactive Molecules
with the Use of Marker Genes.
<130> PC909155
<150> JP 2001-327576
<151> 2001-10-25
<160> 32
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 900
<212> DNA
<213> Hamster sp.
<220>
<221> CDS
<222> (875)..(901)
<400> 1
tagcgctacc ggactcagat ctcgaggaag ctgtgtgacc ttggaggagg cactcccacc 60
tccataaact aaagcactca cttggatgga tcaccagaga cctgtctggc tctgaggctc 120
ggtgacctca acacattgtc tgctggccca aggaaagcgg tgcctgagcc agagttccag 180
tgtctaaact ctggtcattc ttcttcctcc ttaactagga agctgcctcc tagctgctcc 240
aatccagctg ccataccagg gccatgcccg actctgccct gcccctcttt gctgtggtaa 300
ctaggcccct tcccacctca gtgagatgtg ggactcaggc cagtagagta gggaggattc 360
tggaaacaga gccaggctag tgctgggggc caggactcca aggggcagca tgccagggca 420
gggcagggct ctgtctgcct aaggtcatgg tggtcgttgt cagcttactc tgcagtgagc 480
tgtggaatgt aagagatatt ttctgttcgc tttgagccac cccacccctt ggaactcaga 540
ccctgaacat gccatgccac aacaatgacg accacttcca attgtttcct ggctgggggg 600
ggagggggag cactgtttgg acaagggaag ggggggagtc gagggggaaa tgcttttagt 660
gacaacagcc ctttctaaat ctggctaggg actgggtgca ggtgggggtg ggggcacctt 720
ctgccccata tatacaaccc ctgaggccag gtctgactct gagcagtctc ctgctgtttc 780
cttccttgct gccctcaggt aggagtggga gctggaggcc tcctctggga taaggggctc 840
cagattcagg aagagggatc caccggtcgc cacc atg gtg agc aag ggc gag gag 895
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu
1 5
ctg ttc 901
Leu Phe
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Hamster sp.
<400> 2
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe
1 5
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
prepro-endothelin-1 (ppET-1) , forward primer
<400> 3
ccaaggagct ccagaaacag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
prepro-endothelin-1(ppET-1) , reverse primer
<400> 4
ttgacccaga tgatgtccag 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
ETA endothelin receptor (ETAR) , forward primer
<400> 5
tctgcgcgct aagtgttgac aggt 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
ETA endothelin receptor (ETAR) , reverse primer
<400> 6
tcatcaggct ttaggactgg taac 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
ETB endothelin receptor (ETBR) , forward primer
<400> 7
tctctgtggt tctggctgtc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
ETB endothelin receptor (ETBR) , reverse primer
<400> 8
tgctgaggtg aaggggaagc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
AT1 angiotensin receptor (AT1R) , forward primer
<400> 9
gctgaagact gtggccagtg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
AT1 angiotensin receptor (AT1R) , reverse primer
<400> 10
atgcaggtga ctttggctac 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
α1C adrenergic receptor (α1cAR) , forward primer
<400> 11
vtccacggtg ctgcccttct c 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
α1C adrenergic receptor (α1cAR) , reverse primer
<400> 12
ttgatctggc agatggtctc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
gp130 (cardiotrophin-1 receptor) , forward primer
<400> 13
cagaatgtgt atggagtcac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
gp130 (cardiotrophin-1 receptor) , reverse primer
<400> 14
acccagactt caatgttgac 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
transforming growth factor β (TGFβ) , forward primer
<400> 15
aactattgct tcagctccac 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
transforming growth factor β (TGFβ) , reverse primer
<400> 16
acgtagtaca cgatcccgac 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
protein kinase Cβ (PKCβ) , forward primer
<400> 17
gcagccactg caccgacttc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
protein kinase Cβ (PKCβ) , reverse primer
<400> 18
acgtagggat ctgacaagcc 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
c-myc , forward primer
<400> 19
acagcaaacc tccgcacag 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
c-myc , reverse primer
<400> 20
tggtcacgca gggcaaaaa 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
c-fos , forward primer
<400> 21
gccccatcgc agaccagagc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
c-fos , reverse primer
<400> 22
atgctgctga tgctcttgac 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
c-ras , forward primer
<400> 23
caccatagag gtgagctctg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
c-ras , reverse primer
<400> 24
tcctcttggc ctgctgtgtc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
β-MHC , forward primer
<400> 25
cgcatggacc tggagcgagc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
β-MHC , reverse primer
<400> 26
cgccgcatct tccggaactc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
GAPDH , forward primer
<400> 27
accacagtcc atgccatcac 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
GAPDH , reverse primer
<400> 28
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
forward primer (F1)
<400> 29
cgctcgagga agctgtgtga ccttggag 28
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
reverse primer (R2)
<400> 30
cgggatccct cttcctgaat ctggagcc 28
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:GFP-F
<400> 31
tcgccaccat ggtgagcaag 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:GFP-R
<400> 32
cctagcagaa gcacaggctg 20
【図１】図１は、本発明の概要を例示したものである。
【図２】図２は、ジラルディハート（Girardi Heart）
のＧ−ｂａｎｄ法による核型分析の結果を示す、図面に
代わる写真である。
のＧ−ｂａｎｄ法による核型分析の結果を示す、図面に
代わる写真である。
【図３】図３は、ジラルディハート（Girardi Heart）
のＳＫＹ法による核型分析の結果を示す、図面に代わる
写真である。
のＳＫＹ法による核型分析の結果を示す、図面に代わる
写真である。
【図４】図４は、ジラルディハート（Girardi Heart）
における遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲによる検討結果を示
す、図面に代わる写真である。ジラルディハート（Gira
rdi Heart）では、α１ｃＡＲとＰＬＣβ以外の心肥大
関連遺伝子の発現を認めた。
における遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲによる検討結果を示
す、図面に代わる写真である。ジラルディハート（Gira
rdi Heart）では、α１ｃＡＲとＰＬＣβ以外の心肥大
関連遺伝子の発現を認めた。
【図５】図５は、β−ＭＨＣプロモーターの増幅結果を
示す。シリアンハムスターのゲノムから、β−ＭＨＣ遺
伝子のプロモーター領域をＰＣＲで増幅した結果を示
す、図面に代わる写真である。Ｍはｋｂラダーマーカー
（GIBCO BRL）を表す。
示す。シリアンハムスターのゲノムから、β−ＭＨＣ遺
伝子のプロモーター領域をＰＣＲで増幅した結果を示
す、図面に代わる写真である。Ｍはｋｂラダーマーカー
（GIBCO BRL）を表す。
【図６】図６は、本発明の発現コンストラクトの転写・
翻訳開始点付近の塩基配列を示す。細字の塩基配列はβ
−ＭＨＣ遺伝子に由来し、その転写開始点（＋１）の
５’上流７２８塩基から３’下流９１塩基までに対応す
る。ＴＡＴＡボックスとＧＡＴＡ転写因子の結合部位
を、それぞれボックスと下線で示した。太字の配列はプ
ラスミドｐｄ２ＥＧＦＰに由来し、レポーター遺伝子ｄ
２ＥＧＦの翻訳開始点（ｄ２ＥＦＧＰ→）はβ−ＭＨＣ
遺伝子の転写開始点から１１０塩基３’下流に位置す
る。ｄ２ＥＧＦの部分アミノ酸配列を一文字表記で示し
た。
翻訳開始点付近の塩基配列を示す。細字の塩基配列はβ
−ＭＨＣ遺伝子に由来し、その転写開始点（＋１）の
５’上流７２８塩基から３’下流９１塩基までに対応す
る。ＴＡＴＡボックスとＧＡＴＡ転写因子の結合部位
を、それぞれボックスと下線で示した。太字の配列はプ
ラスミドｐｄ２ＥＧＦＰに由来し、レポーター遺伝子ｄ
２ＥＧＦの翻訳開始点（ｄ２ＥＦＧＰ→）はβ−ＭＨＣ
遺伝子の転写開始点から１１０塩基３’下流に位置す
る。ｄ２ＥＧＦの部分アミノ酸配列を一文字表記で示し
た。
【図７】図７は、本発明の心肥大アッセイ細胞株の樹立
を示す。ジラルディハート（Girardi Heart）にｐβＭ
ＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰとｐＳＶ２ｎｅｏを同時にトランス
フェクトし、Ｇ４１８で選択した複数のコロニーからゲ
ノムを抽出し、ｄ２ＥＧＦＰに対するプライマーでＰＣ
Ｒを行った結果を示す、図面に代わる写真である。ｌａ
ｎｅ３の細胞株のゲノムにはｄ２ＥＧＦＰが組み込まれ
ていることが分かる。ＰＣはポジティブコントロール
（プラスミド ｐβＭＨＣ／ｄ２ＥＦＧＰ）を表す。
を示す。ジラルディハート（Girardi Heart）にｐβＭ
ＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰとｐＳＶ２ｎｅｏを同時にトランス
フェクトし、Ｇ４１８で選択した複数のコロニーからゲ
ノムを抽出し、ｄ２ＥＧＦＰに対するプライマーでＰＣ
Ｒを行った結果を示す、図面に代わる写真である。ｌａ
ｎｅ３の細胞株のゲノムにはｄ２ＥＧＦＰが組み込まれ
ていることが分かる。ＰＣはポジティブコントロール
（プラスミド ｐβＭＨＣ／ｄ２ＥＦＧＰ）を表す。
【図８】図８は、本発明のＧｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／
ｄ２ＥＧＦＰ細胞におけるｄ２ＥＧＦＰの発現レベルの
ＲＮＡブロットによる検討結果を示す、図面に代わる写
真である。ＣｏｎｔｒｏｌはＧｉｒａｒｄｉ Ｈｅａｒ
ｔを示し、Ｂａｓａｌは無刺激のＧｉｒａｒｄｉ／βＭ
ＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰを示し、ＥＴ−１はＥＴ−１を一過
性発現させたＧｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰ
を示す。レーン当たり全ＲＮＡ５μｇである。
ｄ２ＥＧＦＰ細胞におけるｄ２ＥＧＦＰの発現レベルの
ＲＮＡブロットによる検討結果を示す、図面に代わる写
真である。ＣｏｎｔｒｏｌはＧｉｒａｒｄｉ Ｈｅａｒ
ｔを示し、Ｂａｓａｌは無刺激のＧｉｒａｒｄｉ／βＭ
ＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰを示し、ＥＴ−１はＥＴ−１を一過
性発現させたＧｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰ
を示す。レーン当たり全ＲＮＡ５μｇである。
【図９】図９は、本発明のＧｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／
ｄ２ＥＧＦＰ細胞におけるｄ２ＥＧＦＰの発現レベルの
蛍光度による検討結果を示す。ＣｏｎｔｒｏｌはＧｉｒ
ａｒｄｉ Ｈｅａｒｔを示し、Ｂａｓａｌは無刺激のＧ
ｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰを示し、ＥＴ−
１はＥＴ−１を一過性発現させたＧｉｒａｒｄｉ／βＭ
ＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰを示す。
ｄ２ＥＧＦＰ細胞におけるｄ２ＥＧＦＰの発現レベルの
蛍光度による検討結果を示す。ＣｏｎｔｒｏｌはＧｉｒ
ａｒｄｉ Ｈｅａｒｔを示し、Ｂａｓａｌは無刺激のＧ
ｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰを示し、ＥＴ−
１はＥＴ−１を一過性発現させたＧｉｒａｒｄｉ／βＭ
ＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰを示す。
【図１０】図１０は、ｃ−ｍｙｃ、ＧＡＴＡ−４の一過
性発現によるＧｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰ
細胞の蛍光上昇を示す。
性発現によるＧｉｒａｒｄｉ／βＭＨＣ／ｄ２ＥＧＦＰ
細胞の蛍光上昇を示す。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/566
33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
33/566 5/00 Ｂ
Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 BA11 DA12 DA13
DA14 DA36 FB02
4B024 AA11 BA80 CA04 DA03 EA04
FA02 FA10 HA12
4B063 QA01 QQ08 QQ20 QQ43 QQ44
QR77 QR80 QS34 QS36 QS38
QX02
4B065 AA93X AB01 BA02 BA25
CA24 CA28 CA31 CA46
Claims (24)
- 【請求項１】 特定の生体現象を誘起する機能分子を、
その現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を指標とし
て、スクリーニングする方法。 - 【請求項２】 特定の生体現象と特異的に連関する遺伝
子の発現量を指標とする方法が、当該遺伝子のプロモー
ターの下流にレポーター遺伝子を融合させた発現コンス
トラクトを用いる方法である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 レポーター遺伝子が、蛍光蛋白質をコー
ドする遺伝子である請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 蛍光蛋白質が、緑色蛍光蛋白質（Green
Fluorescence Protein（ＧＦＰ））、赤色蛍光蛋白質
（Cyan Fluorescence Protein（ＣＦＰ））、青色蛍光
蛋白質（Blue Fluorescence Protein（ＢＦＰ））、黄
色蛍光蛋白質（Yellow Fluorescence Protein（ＹＦ
Ｐ））、ルシフェラーゼ（luciferase）、若しくはβ−
ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）、又はその改良
型である請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 特定の生体現象と特異的に連関する遺伝
子のプロモーターとレポーター遺伝子のｃＤＮＡとを融
合させた発現コンストラクトが、培養細胞株のゲノムに
組み込むんだ細胞株を用いる請求項２〜４のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項６】 特定の生体現象と特異的に連関する遺伝
子が、２種以上である請求項１〜５のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項７】 機能分子が、心筋肥大を誘発する物質で
ある請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 培養細胞が、ヒト心臓由来の細胞株であ
るジラルディハート（Girardi Heart）である請求項７
に記載の方法。 - 【請求項９】 心筋肥大と特異的に関連する遺伝子が、
β−ｍｙｏｓｉｎｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ（β−ＭＨ
Ｃ）及び／又はＢｒａｉｎ Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ
ｐｅｐｔｉｄｅ（ＢＮＰ）の遺伝子である請求項７又は
８に記載の方法。 - 【請求項１０】 特定の生体現象と特異的に連関する遺
伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を融合さ
せた遺伝子。 - 【請求項１１】 レポーター遺伝子が、蛍光蛋白質をコ
ードする遺伝子である請求項１０に記載の遺伝子。 - 【請求項１２】 遺伝子が、レポーター遺伝子を含有す
るプラスミドのレポーター遺伝子の上流に特定の生体現
象と特異的に連関する遺伝子のプロモーターが導入され
たプラスミドである請求項１０又は１１に記載の遺伝
子。 - 【請求項１３】 特定の生体現象と特異的に連関する遺
伝子が、心筋肥大と特異的に関連する遺伝子である請求
項１０〜１２のいずれかに記載の遺伝子。 - 【請求項１４】 心筋肥大と特異的に関連する遺伝子
が、β−ＭＨＣ及び／又はＢＮＰの遺伝子である請求項
１３に記載の遺伝子。 - 【請求項１５】 遺伝子が、配列表の配列番号１に記載
の塩基配列、又は当該塩基配列にストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有するもので
ある請求項１０〜１４のいずれかに記載の遺伝子。 - 【請求項１６】 請求項１０〜１５のいずれかに記載の
遺伝子を含有してなる、特定の生体現象を誘起する機能
分子を、その現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を
指標として検出、同定又は評価するための遺伝子。 - 【請求項１７】 請求項１０〜１５のいずれかに記載の
遺伝子を含有してなる、特定の生体現象を誘起する機能
分子を、その現象と特異的に連関する遺伝子の発現量を
指標として検出、同定又は評価するためのキット。 - 【請求項１８】 遺伝子が、同種の生体現象と特異的に
連関する遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝
子を融合させた遺伝子の１種以上をさらに含有するもの
である請求項１７に記載のキット。 - 【請求項１９】 レポーター遺伝子が、特定の生体現象
と特異的に連関する遺伝子に応じて異種のものである請
求項１７又は１８に記載のキット。 - 【請求項２０】 マイクロタイタープレートと蛍光プレ
ートリーダーを用いて、１又は２以上のアッセイを同時
に行うための請求項１７〜１９のいずれかに記載のキッ
ト。 - 【請求項２１】 請求項１０〜１５のいずれかに記載の
遺伝子で形質転換された形質転換細胞。 - 【請求項２２】 請求項１０〜１５のいずれかに記載の
遺伝子で形質転換された、特定の生体現象を誘起する機
能分子を、その現象と特異的に連関する遺伝子の発現量
を指標として検出、同定又は評価するための形質転換細
胞。 - 【請求項２３】 遺伝子がゲノムに導入されたものであ
る請求項２１又は２２に記載の形質転換細胞。 - 【請求項２４】 細胞が、ヒト心臓由来の細胞株である
ジラルディハート（Girardi Heart）である請求項２１
〜２３のいずれかに記載の形質転換細胞。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002034378A JP2003199581A (ja) | 2001-10-25 | 2002-02-12 | マーカー遺伝子を用いた生体機能分子の評価並びに同定方法 |
| PCT/JP2002/008983 WO2003035866A1 (fr) | 2001-10-25 | 2002-09-04 | Procede d'evaluation et d'identification de molecule biologiquement fonctionnelle a l'aide d'un gene marqueur |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001-327576 | 2001-10-25 | ||
| JP2001327576 | 2001-10-25 | ||
| JP2002034378A JP2003199581A (ja) | 2001-10-25 | 2002-02-12 | マーカー遺伝子を用いた生体機能分子の評価並びに同定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003199581A true JP2003199581A (ja) | 2003-07-15 |
| JP2003199581A5 JP2003199581A5 (ja) | 2005-07-28 |
Family
ID=26624099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002034378A Pending JP2003199581A (ja) | 2001-10-25 | 2002-02-12 | マーカー遺伝子を用いた生体機能分子の評価並びに同定方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003199581A (ja) |
| WO (1) | WO2003035866A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1982758A1 (de) * | 2007-04-20 | 2008-10-22 | Euroferm Gesellschaft für Fermentation und Messtechnik mbH | Verfahren zur Herstellung sulfatierter Polysaccharide |
| CN102618533A (zh) * | 2012-03-08 | 2012-08-01 | 华南农业大学 | 稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP及其方法与应用 |
-
2002
- 2002-02-12 JP JP2002034378A patent/JP2003199581A/ja active Pending
- 2002-09-04 WO PCT/JP2002/008983 patent/WO2003035866A1/ja not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2003035866A1 (fr) | 2003-05-01 |
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