KR100272459B1 - 리셉터로 트랜스펙션된 세포들의 선택적 증식에 의한 리간드의 동정방법 - Google Patents

리셉터로 트랜스펙션된 세포들의 선택적 증식에 의한 리간드의 동정방법 Download PDF

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Abstract

리간드로서 작용할 수 있는 물질을 검출하는 방법으로서, (a) 세포증식을 허용하는 조건하에서, 리간드에 응답하여 세포증식에 영향을 줄 수 있는 리셉터들을 암호화하는 DNA로 트랜스펙션되고, 세포증식의 표지인자를 함유하는 세포들 리셉터의 잠재 아고니스트(agonist) 또는 길항제(antagonist)인 시험물질과 함께 배양하는 단계와 (b) 세포증식을 허용하기에 충분한 시간후에, 표지인자를 함유하지 않은 세포와 비교하여 표지인자를 함유하는 세포의 증식의 존재 또는 부재를 측정하는 단계로 이루어진다.

Description

[발명의 명칭]
리셉터로 트랜스펙션된 세포들의 선택적 증식에 의한 리간드의 동정방법
[도면의 간단한 설명]
제1(a)도는 포시(foci)의 개수 대 m5 DNA의 농도의 좌표이다.
제1(b)도는 포시의 개수 대 카르바콜의 농도의 좌표이다. 세포를 착색하고 카르바콜처리 2주후에 포시를 계수했다. 시험은 10cm 플레이트에서 수행했고, 카르바콜(100μM)을 트랜스펙션 2일후에 도포하고 매 3-4일마다 변화시켰다.
제2도는 단일 리셉터 포멧의 개략도이며, 아고니스트(agonist)의 리셉터 유도가 β-갈락토시다제 활성으로서 검출된다.
리셉터 DNA 및 β-갈락토시다제 DNA를 고농도의 둘다의 DNA를 사용하여 공트랜스펙션시키며, 조건은 성공적으로 트렌스펙션된 대부분의 세포가 둘다의 DNA로 트랜스펙션될 조건이다.
하기의 인산칼슘 침전방법을 사용하여 오직 소수의 배양세포만이 트랜스펙션될 것이다. 예시된 실시예에서 세포는 매일 한번씩 분할하며, 아고니스트 리간드의 존재는 리셉터로 트랜스펙션된 세포의 분할률(*)을 두배로 증가시킨다.
제3(a)도는 인간 trk A 리셉터로 트랜스펙션된 세포에서 인간 신경성장인자(NGF)의 β-갈락토시다제 활성의 자극의 시간-경로를 도시한다.
420에서의 흡광도 대 10nM NGF의 존재 또는 부재하의 배양일수의 막대그래프를 도시한다.
제3(b)도는 처리 삼일후의 NGF 및 NT3의 투여량-응답 관계를 도시한다.
제4도는 m5 및 m2 무스카린 리셉터로 트랜스펙션된 세포에서 카르바콜의 β-갈락토시다제의 자극의 시간-경로를 도시한다.
제5도는 단일 리셉터 포멧에서 리셉터를 분석하기 위해 사용될 수 있는 실시예 프로토콜을 보여주는 개략도이다.
제6(a)도는 m1, m3 및 m5 무스카린 리셉터의 투여량-응답 관계를 도시한다.
제6(b)도는 m2 및 m4 무스카린 리셉터의 투여량-응답 관계를 도시한다.
제7도는 m5 무스카린 아세틸콜린 리셉터의 랜덤-포화 돌연변이를 위한 전략을 보여주는 개략도이다.
제8(a)도는 적어도 두개의 다른 포시로부터 각각 분리되고 시퀀싱(sequencing)된 8가지 기능적 무스카린 리셉터의 돌연변이 영역내의 서열을 도시한다.
야생형 m5리셉터의 서열이 상부에 포시되어 있고(하나 및 세문자 암호), 돌연변이 서열이 뒤따른다. 암호화된 아미노산을 바꾸지 않는 염기 변화들(*)로 표시하고, 예상된 아미노산 변화를 보통 활체의 보존적 치환 및 굵은 활체의 비보존적 치환으로 표시한다.
20개의 추가의 유일서열을 표시로부터 분리시켰다. 28개의 돌연변이 리셉터 서열에 대하여 리셉터당 평균 2.4 아미노간 변화가 관찰되었다.
제8(b)도는 5개의 야생형 무스카린 리셉터 서브타입의 서열의 비교를 도시한다.
그림자는 m5 리셉터의 서열에 대한 동일 또는 보존적 치환을 표시한다.
오직 동일 또는 보존적 치환만이 모든 5개의 리셉터 서브타입에 대해 허용되는 위치는 (°)으로 표사한다. 리셉터의 기능적 분류(m2/m4 대 m1/m3/m5)에 관련되지 않은 비보존적 치환의 위치는 (X)으로 표시한다. 적어도 PI-연결된 무스카린 리셉터(m1/m3/m5)가 보존되는 위치는 (0)으로 표시한다.
치환이 기능적 분류의 예언이 되는 위치는 (*, ml/m3/m5 보존적, 비보존적 대 m2/m4, m2/m4 보존적)으로 표시한다. 박스표시된 잔기는 전혀 비보존적 치환이 돌연변이 리셉터에서 동정되지 않았던 위치에 대해 보존적이다(C부분에 표시된 위치 아래에 표시됨).
제8(c)도는 적어도 두개의 독립적 포시에서 동정된 모든 아미노산 치환의 편집을 도시한다. 아미노산 치환은 B에 기입된 대응 아미노산 치환 아래에 기입한다.
아미노산 치환은 각각의 독립적 리셉터에 대해 한번씩 기입된다.
적어도 2개의 포시에서 관찰되었던 아미노산 변화의 위치는 대응 야생형 아미노산의 위치 아래에 표시된다. 이들 아미노산 변화는 675재조합 라이브러리로 부터 분리된 28 독립적 돌연변이 리셉터로 부터 편집된다.
전혀 비보존적 치환이 분리되지 않은 위치는 박스표시한다. 다른 무스카린 리셉터가 m5에 대해 보존적인 아미노산을 또한 이들 박스안에 포함한다.
제8(d)도는 E.coli에서 발현되는 돌연변이 리셉터 라이브러리로서 임의적으로 선택된 17클론에서 관찰된 아미노산 치환의 편집을 도시한다(트랜스펙션 및 NIH 3T3세포의 형질전환에 의한 선택에 앞서서), 돌연변이 리셉터당 평균 4.2아미노산 치환이 관찰되었다.
정지코돈의 존재는 (Sto)로 표시한다. 보존적 치환은 다음 군의 일원으로서 정의된다: S(Ser), T(Thr), P(Pro), A(Ala) 및 G(Gly); N(Asn), D(Asp), E(Glu) 및 Q(Gln); H(His), K(Lys) 및 R(Arg); M(Met), I(Ile), L(Leu) 및 V(Val); F(Phe), Y(Tyr) 및 W(Trp); 또는 C(Cys).
제9도는 m5 무스카린 리셉터의 돌연변이 영역의 나선형 표현을 보여주는 개략도이다. 그 영역은 세포간 공간으로 부터 보여진다.
C13은 13고리의 C-말단영역을 나타낸다. 아미노산 치환(제8도로부터)은 소문자로 표시한다. 오직 보존적 치환만이 분리된 위치른 원표시된다.
큰 외곽선 표시되고 그늘진 타원형은 오직 보존적 치환만이 관찰된 아미노산 위치를 둘러싼다. 이것은 기능적으로 나선형의 임계면이 될 것으로 예상된다.
큰 그늘진 타원형은 비보존적 치환이 모든 위치에서 관찰되었던 아미노산 위치를 둘러싼다. 이것은 기능적으로 나선형의 비임계면이 될것으로 예상된다.
큰 외각 원은 TM5에서 시작되는 아미노산의 번호매김을 표시한다.
다른 무스카린 리셉터와의 상동성에 관한 아미노산의 분류는 제8도에 정의된 기호를 사용하여 이 원형위에 표시한다. 체크는 부위-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 판단된 바와 같이 유리기치환을 허용하는 m1 무스카린 리셉터에서의 위치를 표시한다.
제10도는 다수 리셉터 포멧의 실시예의 개략도이다. 이 실시예에서 저농도의 두 개의 리셉터 DNA(R1 및 R2)가 트랜스펙션을 위해 사용된다.
이들 조건하에서 극소수의 세포들은 R1 및 R2로 동시에 트랜스펙션될 것이다.
그래서 R1 리간드는 R1-발현 세포를 선택적으로 증식시킬 것이다.
제11도는 다수 리셉터 포멧의 구체예의 개략도이며, 여기서 오직 β-갈분석법을 사용하여 여러 가지 리셉터가 동시에 분석된다.
제12도는 암유전자 V-ras에 대한 세포의 응답을 도시한다.
NIH 3T3 세포의 6웰 플레이트를 1㎍의 V-ars 또는 n-ras 및 1㎍의 β-갈 cDNA로 트랜스펙션시켰다. 분석은 제5도에 기술된 바대로 표준 단일 리셉터 포멧을 사용하여 수행하였다. 대조(control)는 활성화시키는 리간드 없이 m5 리셉터로 트랜스펙션된 세포를 사용하여 수행했다.
제13도는 돌연변이 m5 리셉터의 아고니스트 및 길항제 표현형을 도시한다.
10cm플레이트의 NIH 3T3세포를 1.5㎍의 야생형 m5(●) 또는 m5-160 돌연변이 리셉터(○) 및 3㎍의 β-갈 cDNA로 트랜스펙션시켰다.
분석은 4일동안 지시된 리간드에서 배양후 제5도에 기술된 바대로 수행했다.
제14도는 다수 리셉터 포멧의 구체예의 개략도이며, 여기서 여러 가지 리셉터가 β-갈락토시다제 및 DNA 증식분석법의 조합을 사용하여 동시에 분석된다.
제15도는 FP 프로스타노이드(B) 및 ERB엔도델린(A) 리셉터의 리간드 및 리셉터 cDNA 투여량/응답 관계를 도시한다. 10cm 플레이트의 NIH 3T3 세포를 지시된 농도의 리셉터 cDNA로 트랜스펙션시켰다.
세포를 지시된 농도의 리간드와 함께 4일동안 96웰 플레이트의 웰안에서 배양했다. 모든 트랜스펙션은 또한 2.5㎍의 D2리셉터 및 2.5㎍의 β-갈 cDNA를 함유했다. 제16도는 지시된 리셉터의 최대 리간드-유도 응답을 도시하며, 제11도에 기술된 것과 유사한 다수 리셉터 포멧을 사용하는 공트랜스펙션된 배양을 사용하며 분석된 것과 같다. 10cm플레이트의 NIH 3T3세포를 0.5㎍의 각각의 5개의 시험 DNA, 2.5㎍의 D2리셉터 cDNA 및 2.5㎍의 β-갈 cDNA로 트랜스펙션시켰다. 각각의 리셉터에 선택적인 7투여량의 아고니스트 리간드를 시험했다(ml/카르바콜: 알파 1B/ 페닐에프린, NK1/ 물질 P: ETB/ 엔도델린-3: FP/ 풀루프로스테놀).
세포를 각각의 리간드와 함께 4일동안 96웰 플레이트의 웰안에서 배양했다.
최대응답은 데이터들 단일 질량-작용 부위의 모델에 맞춤으로써 계산했다.
분리된 실험은 각각의 이들 리간드가 그것의 지시된 표적 리셉터의 부재하에서는 응답을 유도할 수 없었다는 것을 증명했다.
제17도는 아고니스트 UK 14.304에 대한 야생형 및 키메라 알파 2아드레날린 리셉터의 투여량-응답을 도시한다. 지시된 투여량의 아고니스트를 단일 리셉터 포멧을 사용하여 분석했다. 5㎍의 리셉터 DNA 및 5㎍의 베타-갈 DNA를 10cm 플레이트를 위해 사용했다. 리셉터를 5일동안 아고니스트와 함께 배양했다.
데이터는 3중 측정의 평균치이다. 라인은 데이터의 비선형 회귀에 의한 작용의 단일 질량-작용 부위에 대한 맞춤이다. α2C10의 키메라 구조물은 PCR 및 표준 클로닝기술을 사용하여 제조했다. 특히 알파 2C10의 전체13고리를 대부분의 대응 알파 1Ai3 고리로 대체했다.
베타-갈락토시다제는 24시간동안 ONPG에서 배양후에 분광광도계(spectrophotometer)에서 420에서의 흡광도 판독에 의해 분석했다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 클론화된(cloned)리셉터에 대한 리간드로서 작용하는 물질의 동정방법 및 그 동정방법에 사용하기 위한 시험키트(kit)에 관한 것이다.
[발명의 배경]
조제 약품 개발을 위한 많은 목표들은 리셉터 단백질에 대한 리간드이며, 많은 리간드들이 최근에 클론화되었고 약리학적으로 특징지어졌다. 지금 많은 수의 리셉터들이 클론화되었으므로 제약 산업의 주요목표는 광대한 라이브러리(libraries)의 물질들을 스크린(screen)함으로써 이들 리셉터에 대한 리간드들을 동정하는 것이다.
불행하게도 종래의 방법 및 기술에 있어서 약품개발공정의 주요 한계는 이렇게 많은 목표들을 위해 이들 라이브러리들을 스크린하는데 필요한 시간 및 비용이다.
클론화된 리셉터와 리간드의 상호작용의 특성지음에 있어서 첫번째 단계는 리간드-감응성 형태의 리셉터를 발현시키는 것이다.
약간의 리셉터들이 효모(yeast) 및 대장균(E.coli)과 같은 조작용이란 모델시스템에서 발현될 수 있는 반면에, 대부분의 리셉터들에 대한 리간드의 상호작용은 포유동물 세포에만 존재하는 번역후의 수정에 의해 영향을 받으며, 많은 이들 리셉터들은 그것들의 생물학적 효과를 변화시키는 포유동물 단백질을 필요로 한다.
따라서 넓은 응용성을 위해, 분석계는 포유동물 세포에서의 클론화된 리셉터들의 발현에 기초해야 한다.
리간드가 리셉터와 상호작용할 수 있는 능력은 리셉터위의 결합부위에 대한 표지화된(labeled) 리간드(예를들면 방사성누클레오티드)와의 경합에 의해 평가될 수 있다. 그런 분석법들은 상대적으로 적은 단계들을 수반하기 때문에 널리 보급되어 있다. 또한 결함이 종종 다른 세포 단백질과의 상호작용을 요하지 않기 때문에 이들 분석법들은 리셉터의 발현정도 및 세포환경과 같은 인자들에 덜 민감하다.
최근에는 Proximity Assay(Amersham Co)와 같은 기술이 자동화 및 대량 스크린을 가능하게 함으로써 이들 분석법들을 더욱 단순화시켰다.
결합 분석법(binding assays)들은 많은 한계점들을 가진다:
(i) 많은 이유로 인하여 결합 분석법은 거의 항상 비생리학적 버퍼안에서 수행된다. 이들 버퍼는 종종 리셉터 약리학에 현저한 영향을 준다.
(ii) 아고니스트(agonists) 및 길항제(antagonists)들은 결합 분석법에서 확실히 구별되지 않는다.
(iii) 표지화된 리간드가 이용할 수 있는 결합 부위들만이 연구될 수 있다.
(iv) 포유동물 세포내에서는 오직 낮은 정도의 리셉터(결합부위)발현만이 성취되었기 때문에 리셉터의 번식은 이들 분석법에서 큰 부담이다.
(v) 대부분의 표지화된 리간드들이 방사성 동위원소(radioisotopes)들이며, 그것들의 구입, 조작 및 처분은 큰 부담이다.
아고니스트 및 길항제를 확실히 구별하기 위해 리셉터의 응답(response)이 측정되어야만 한다. 리셉터의 아고니스트 활성화에 대한 응답은 보통 다양한 내생적(endogenous)세포 단백질의 변화된 활성에 의해 측정된다.
예들은 cAMP(아데닐일시클라제), 포스포이노시톨 대사(포스포리파제 C), 티로신 인산화 및 이온동로와 같은 2차 전달자의 측정을 포함한다. 모든 이들 분석법은 고도의 생물학적 완전성을 갖는 세포 및/또는 세포제제들의 사용을 필요로 하며, 이들 분석법은 많은 복잡하고 비용이 많이 드는 단계들은 포함한다(Schlessinger and Ulrich, Neuron 9, 383 (1992); chapters in Molecular Biology of G-protein-coupled receptors, M Brann, ed., Birkhauser (1992)).
내생적 단백질들을 측정하는데 드는 시간 및 비용을 회피하기 위해 사용되어온 전략은 리셉터의 활성화에 의해 조절될 수 있는 분석용이한 표지인자(marker) 단백질들을 발현하는 것이다. 예를들면 전자인자들의 수준을 조절하는 리셉터들은 그 발현이 이들 전사인자들의 전사 조절하에 있는 표지인자를 사용함으로써 분석될 수 있다.
이 점근법은 전사의 조절자로서 기능하는 것으로 알려진 리셉터들(예를들면 스테로이드/티로이드 호르몬 리셉터들, Evans (WO 91/07488); Spanjaard et al., Mol. Endocrinology 7: 12-16 (1993))의 용이한 분석법이 되어온 반면에, 이들 분석법은 세포표면 리셉터에 적용될 때에는 제한된 유용성을 갖는 것으로 증명되었는데, 아마도 그 이유는 이들 리셉터가 발휘하는 더 제한된 전사 조절때문일 것이다. 전사조절에 기초한 분석법을 제외하고는 용이하게 측정될 수 있는 재조합(recombinant) 표지인자를 통한 리셉터들의 분석방법은 기술된 바 없다.
또다른 접근법은 리셉터에 대한 리간드 활성화의 용이한 분석을 허용하는 내생적 응답 메카니즘을 갖는 분화된(specialized) 세포내에서 리셉터를 발현시키는 것이다. 투자기 예들은 RBL 세포 및 멜라노프(melanophores)를 포함한다.
RBL 세포에서 포스포리파제 C를 자극하는 무스카린(muscarinic)리셉터들은 효소 헥소스아민이다제의 방출을 향상시켜 (Jones et al., FEBS Lett. 289, 47 (1991)), 응답이 용이하게 측정되도록 한다.
멜라노프(배양된 색소 세포)에서 cAMP 수준을 변화시키는 클론화된 리셉터들은 세포의 색깔을 바꾸어, 마찬가지로 응답이 용이하게 측정되도록 한다(Potenza et al, Anal. Biochem. 206, 315(1992)).
이들 분석법의 한계는 오직 일정한 기능형의 리셉터들만 측정될 수 있다는 것이다. 또한 분석법이 상대적으로 용이한 반면에, 내생적 응답 및 사용되는 세포에 고유한 한계들이 있다.
리간드에 노출되었을때, 넓은 다양성의 리셉터들이 세포배양을 위해 사용되는 배지의 pH를 변화시킬 수 있다. 이들 pH 변화는 양적으로 작으며 측정을 위해 값비싼 기구를 필요로 한다(Cytosensor, Molecular Dynamics Co.). 이 장치는 대량 스크린에 사용되는 다른 기구들(예를들면 96 well plate format의 사용)과 비융화적이며, 샘플들이 수십분동안 그 기구안에서 배양되어야 하기 때문에 집어넣는 샘플에 제한이 있다.
모든 상기 분석법들에 내재한 이론적 한계는 동시에 수개이상의 리셉터들에 대한 주어진 리간드의 분석 불가능이다. 예들들면 방사성 리간드 결합 분석법은 오직 서로 다르고 구별가능한 방사성 동위원소들이 이용될 수 있는 범위(예를들면3H 대125I)까지만 다양화 될 수 있다.
그것들의 제한된 동적 범위, 비융화성 분석조건 및 많은 리셉터들이 그것들의 기능적 응답, 2차 전달자 응답 및 리셉터의 대부분의 다른 생화학적효과들에 기초하여 서로 구별될 수 없다는 사실 때문에 결코 다양화된 분석에 적합하지 않다.
마찬가지로 RBL분석법, 멜라노포 분석법 및 Cytosenor pH분석법들은 오직 한번에 한 리셉터의 분석에만 적용할 수 있다.
많은 리셉터들에 의해 공유되는 또다른 세포 응답은 세포성장을 변화시키는 능력이다.
NIH 3T3세포는 세포성장을 조절하는 매우 다양한 유전자 산물들의 활성도를 평가하기 위에 광범위하게 사용되는 섬유아세포 세포주(cell line)이며. 많은 리셉터들이 각각의 리간드에 의해 자극되었을때 이들 세포의 활성을 조절할 수 있다.
예들은 이들 세포가 trk A 리셉터(NGF 리셉터)로 트랜스펙션되었을때만 성장을 자극하는 신경성장인자(NGF 리셉터)(Cordon-Cardo et al, Cell 66: 173-183 (1992); Chao, Neuron 9; 583-593 (1992)), 일정한 무스카린 리셉터로 트랜스펙션된 세포를 자극하는 카르바콜(무스카린 아고니스트)(Gutkin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4703 (1991); Stphens et al, Oncogene 8, 19-26 (1993)), 및 일정한 알파 아드레날린 리셉터로 트랜스펙션된 세포를 자극하는 노르에피네프린(Allen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11354 (1991))을 포함한다.
아고니스트 리간드에 의한 장기간의 자극후에, 세포는 세포성장, 접촉저해의 상실 및 포시(foci)라고 불리우는 육안으로 보이는 콜로니의 형성을 포함하는 많은 특성들을 변화시킨다.
NIH 3T3 세포에 포시를 유발할 수 있는 능력은 암-관련 유전자(암유전자: oncogenes)의 일반적 특성이다.
성장을 자극하고 NIH 3T3 세포에 포시를 유발할 수 있는 리셉터 및 다른 유전자 산물들의 능력은 각각의 2차 전달자 시스템들의 자극과 관련이 있다.
Trk A리셉터는 티로신 인산화를 자극하며(티로신키나제 리셉터), 티로신 인산화를 자극하는 많은 다른 유전자들은 성장 및 NIH 3T3 세포에서의 포커스(focus) 생산을 자극한다(Schlessinger와 Ullrich, Neuron 9, 383 (1992)). 포스포리파제 C를 자극하는 일정한 무스카린리셉터(Gutkind et al. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 88, 4703 (1991)), 아드레날린리셉터(Allen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 11354 (1991))및 세로토날린리셉터 (Julius et al. Science 244, 1057 (1989))는 또한 성장 및 NIH 3T3 세포에서의 포커스 헝성을 자극한다.
무스카린리셉터의 경우에 포시 및 포스포리파제 C를 자극할 수 있는 능력은 정확하게 같은 투여량/응답 특성을 가지며, 이들 응답이 리간드 상호작용에 대한 분석법으로서 사용될 수 있다는 것을 암시한다. 불행하게도 이들 분석법은 상술한 접근법에 비해 거의 이점을 제공하지 않는다.
포커스 분석법(focus assays)은 적어도 2주동안의 세포배양을 요하는 응답을 수반하며, 성장패턴의 질적 변화에 의해 혼동된다.
세포 성장의 적접적 측정도 또한 리간드의 효과를 측정하기 위해 사용되어 왔다.
가장 일반적으로 사용된 분석법은3H-티미딘 동합이다(Stephens et al. Oncogens 8, 1993, pp. 19-26).
이들 분석법들은 실행하기에 편리하지도 저렴하지도 않다.
[발명의 개요]
본 발명의 목적은 클론화된 리셉터에 대한 리간드의 향상된 동정방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 다수의 클론화된 리셉터에 대한 화합물의 활성을 동시에 스크린 함으로써 리간드를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 클론화된 리셉터에 대한 활성에 의해 리간드 농도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 추가의 클론화된 리셉터에 대한 리간드의 분석법을 용이하게 하기 위해 재조합 신호용(signaling) 분자를 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 리간드에 대한 리간드들 암호화하는 DNA들의 동정방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 변화된 리간드 의존성을 갖는 돌연변이형의 리셉터를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서 본 발명은 리간드로서 작용할 수 있는 물질을 검출하는 방법에 관한 것이며, 그 방법을 다음 (a) 및 (b)로 이루어진다:
(a) 세포증식을 허용하는 조건하에서, 리간드에 응답하여 세포증식에 영향을 줄 수 있는 리셉터를 암호화하는 DNA로 트렌스펙션되고, 세포증식의 표지인자를 함유하는 세포를 리셉터의 잠재적 아고니스트 또는 길항적인 시험물질과 함께 배양함, 및
(b) 세포증식을 허용하기에 충분한 시간후에, 표지인자를 함유하지 않는 세포와 비교하여 표지인자를 함유하는 세포의 증식의 존재 또는 부재를 측정함.
본 발명의 방법에서 트랜스펙션된 세포 및 비트랜스펙션된 세포의 혼합물은 전형적으로 단계(a)에 존재할 것이다. 시험물질들이 혼합물에 첨가되었을때, 관심의 리셉터에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 시험물질의 능력은 리셉터를 발현하지 않는 세포와 비교하여 리셉터를 발현하는 혼합물중의 세포에 경쟁적 이점을 부여할 수 있는 시험물질의 능력의 관점에서 측정된다. 예를들면 일반적으로, 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro)든지, 리셉터를 발현하는 세포 집단은 세포기능의 전반적 향상에 의해 리간드에 긍정적으로 응답할 것이며, 그것의 한 측면은 성장률의 증가 또는 접촉저해의 상실이 될 것이다. 이 관찰을 본 발명의 실행에 적용하면, 시험관애에서 배양중의 모든 세포들은 필연적으로 서로 경쟁한다: 관심의 리셉터를 발현하는 세포(트랜스펙셕된 세포)가 리간드에 의해 자극되었을때 자극된 세포의 향상된 기능은 비자극된 (비트랜스펙션된) 세포의 희생으로 자극된 세포가 번성하도록 허용할 것이다. 그래서 만약 시험중인 리간드가 리셉터의 아고니스트이면, 혼합물중 트랜스펙션된 세포는 비트랜스펙션된 세포와 비교하여 아고니스트에 대한 응답으로 선택적으로 증식될 것이다.
달리 말하면, 트랜스펙션된 세포집단은 비트랜스펙션된 세포보다 높은 속도로 팽창할 것이다.
본 방법에서 트랜스펙션된 세포는 트랜스펙션된 세포내의 표지인자의 존재에 의해 혼합 집단중의 비트랜스팩션된 세포로 부터 구별될 수 있다. 오직 트랜스펙션된 세포가 시험 리간드에 의해 자극되었을때만 증식신호(표지인자)가 축적될 것이다.
리간드가 길항제인 때에는, 그 작용은 유사하게 측정되나, 반대의 결과, 즉 표지인자를 함유하는 세포는 비트랜스펙션된 세포에 비하여 경쟁적으로 불리할 것이며, 비트랜스펙션된 세포집단은 트랜스펙션된 세포보다 높은 속도로 팽창할 것이다.
그러나 길항제에 대한 분석은 아고니스트의 존재하에 실행되는 것이 바람직하며, 관찰된 효과는 자극적 리간드안의 존재에 의해 발생하는 증식응답의 감소이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 리간드로서 작용할 수 있는 물질을 검출하기 위한 시험 키트에 관한 것이며, 그 키트는 다음 (a), (b) 및 (c)로 이루어진다:
(a) 리간드에 응답하여 세포증식에 영향을 줄 수 있는 리셉터를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션되고, 세포증식의 표지인자를 함유하는 냉동된 세포,
(b) 세포의 성장을 위한 배지, 및
(c) 표지인자의 존재 및 양을 검출하기 위한 시약.
이 시험키트는 시험물질(또는 잠재적으로 많은 수의 시험물질들)의 리간드 활성이 단일 리셉터의 수단에 의해 측정되는 본 발명의 구체예는 유용하다(하기 Signal Receptor Format으로 불리우는 본 발명의 구체예).
또다른 측면에서 본 발명은 리간드로서 작용할 수 있는 물질을 검출하기 위한 시험키트에 관한 것이며, 그 키트는 다음 (a), (b), (c) 및 (d)로 이루어진다:
(a) 리간드에 응답하여 세포증식에 영향을 줄 수있는 제1리셉터를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션되고, 세포증식의 표지인자를 함유하는 냉동된 세포,
(b) 리간드에 응답하여 세포증식에 영향을 줄 수 있는 제2리셉터(제1리셉터와 별개의 것)를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션되고, 세포증식의 표지인자를 함유하는 냉동된 세포,
(c) 세포의 성장을 위한 배지, 및
(d) 표지인자의 존재 및 양을 검출하기 위한 시약.
이 시험 키트는 특정한 리셉터에 대한 리간드로서 작용하는 시험물질(또는 잠재적으로 많은 수의 시험물질)의 활성이 동시에 적어도 두개의 리셉터, 잠재적으로 많은 수의 리셉터와 함께 시험물질을 배양함으로써 측정되는 본 발명의 구체예에 유용하다(하기 Multiple Receptor Format으로 불리우는 본 발명의 구체예).
본 방법은 종래의 스크린 분석법들에 비해 중대한 향상을 나타낸다.
전형적으로 기지의 성장분석법(growth assays)은 리셉터 발현 증가의 직접적 관찰을 필요로 하며, 일반적으로 양적인데, 예를들면 결과들이 세포성장의 지시약으로서 일정기간 동안의 방사성 표지화된 시약의 통합에 의해 양적으로 측정된다.
포커스 분석법과 같은 많은 경우에서, 세포성장의 지시기(indicator), 즉 분석에서 찾을 수 있는 포커스 형성은 발달하는데 수주가 걸릴 것이다. 더욱이 별개의 시험세포 및 대조(control) 세포주는 리간드의 스크린이 시작되기 전에 확립되어야 한다는 것과 따로 배양된 세포주와 함께 다룰때는 일관된 결과를 얻기가 어렵다는 것은 일반적이다.
따라서 그런 분석법들은 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라 상당한 비용이 든다.
이와 대조적으로 본 분석법은 필연적으로 질적이어서, 리셉터를 발현하는 세포의 리간드 유발된 향상된 세포기능이 동일한 배양으로부터 비트랜스펙션된 세포집단에 비하여 트랜스펙션된 세포집단의 증식을 관찰함으로써 측정된다. 증식은 트랜스펙션된 세포내에서 표지인자 유전자(예를들면, 그것의 기질과 반응했을때 시각적으로 검출할 수 있는 산물을 생산하는 효소)의 향상된 발현의 관찰에 의해 쉽게 확인된다. 별도의 대조 세포주가 필요치 않으며, 결과는 수일내에 관찰할 수 있다.
[용어정의]
본 상세한 설명 및 청구의 범위에서 다음 용어들은 하기한 바와 같이 정의될 것이다.
“시험물질”은 잠재적 생물학적 활성을 갖는 어떤 약품, 화합물 또는 분자도 포함하는 것으로 의도된다.
“리간드”는 리셉터의 활성을 저해하거나 자극하는 어떤 물질도 포함하는 것으로 의도된다. “아고니스트”는 리셉터의 기능적 활성(즉 리셉터를 통한 신호전달)을 증식시키는 리간드로서 정의된다.
“길항제”는 아고니스트의 활성을 저해하거나 그거의 고유활성에 의해 리셉터의 기능적 활성을 감소시키는 리간드로서 정의된다.
“리셉터”는 리간드에 의해 저해되거나 자극되었을때 세포생리효과를 낼 수 있는 세포내 또는 표면상에 존재하는 어떤 분자도 포함하는 것으로 의도된다.
전형적으로 본 발명의 목적을 위해 사용되는 리셉터는 리간드-결합성질을 갖는 세포밖 영역, 리셉터를 세포막에 고정시키는 막동과 영역 및 리간드 결합에 응답하여 세포내 신호를 발생시키는(“신호전달”) 세포질 영역으로 구성된다. 몇몇 경우, 예를들면 아드레날린리셉터에서 막동과 영역은 세포막에 퍼져있는 최대 일곱 나신형, 지배적으로 소수성 구조의 형태이며, 막동과 영역의 일부분은 리간드-결합 성질을 가진다.
“티로신키나제리셉터”는 고유의 티로신키나제 효소활성을 갖는 어떤 리셉터도 포함하는 것으로 의도된다.
“티로신 포스파타제리셉터”는 고유의 티로신포스파타제 효소활성을 갖는 어떤 리셉터도 포함하는 것으로 의도된다.
“키메라리셉터”는 한 리셉터의 기능적 “신호전달”성분이 또다른 리셉터의 리간드 결합성분과 융합된 두개이상의 리셉터들의 어떤 조합도 포함하는 것으로 의도된다.
“키메라 G-단백질”은 한 G-단백질의 이펙터 결합성분이 또다른 G-단백질의 리셉터 결합성분과 융합된 두개의 G-단백질의 어떤 조합도 포함하는 것으로 의도된다.
“Gq-i5”는 C-말단의 5개의 아미노산이 Gi의 C-말단 5개의 아미노산으로 대체된 G-단백질 Gq으로 구성된 키메라 G-단백질로서 정의된다.
“Gi”는 활성화되었을 때 효소 아데닐사이클라제를 저해하는 어떤 G-단백질도 포함하는 것으로 의도된다.
“Gq”는 활성화되었을때 효소 포스포리파제 C를 자극하는 어떤 G-단백질도 포함하는 것으로 의도된다.
“Gs”는 활성화되었을때 효소 아데닐사이클라제를 자극하는 어떤 G-단백질도 포함하는 것으로 의도된다.
“G-단백질-연결된 리셉터”는 구아닌누클레오티드 결합 단백질과 연결함으로써 신호전달을 매개하는 어떤 리셉터도 포함하는 것으로 의도된다.
“G-단백질”은 헤테로트리머(heterotrimeric) 신호전달 구아닌누클레오티드 결합 단백질측의 어떤 구성원으로서 정의된다.
“신호전달”은 리간드로부터 리셉터까지의 정보가 생리적 변화로 번역되는 공정으로서 정의된다.
“암유전자”는 어떤 리간드의 부재시에 NIH 3T3 세포에서 포커스 형성을 자극할 수 있는 어떤 유전자로서 정의된다. 이들 유전자들은 종종 암성종양과 관련된다.
“전사인자”는 주어진 유전자의 전사를 변화시킬수 있는 어떤 물질로 정의된다. 이들 인자들은 종종 DNA의 영역에 결합하여 프로모터의 활성을 변경시키는 단백질이다.
“트랜스펙션”은 외부유전자가 배양세포내로 삽입되는 어떤 방법으로서 정의된다.
“표지인자”는 쉽게 측정되고 다른 세포성분들로 부터 구별될 수 있는 어떤 물질로써 정의된다. 표지인자는 트랜스펙션된 리셉터 DNA, 전사된 리셉터 mRNA, 효소, 결합단백질 또는 항원일 수 있다.
본 발명의 목적에 유용한 “세포”는 세포증식에 의해 주어진 리셉터를 통한 신호전달에 응답할 수 있는 능력을 가지는 세포이다.
“앨리컷”은 고형지지체, 예를들면 마이크로티터접시, 시험관 또는 마이크로비드 위에 제공된 약간의 트랜스펙션된 세포로서 정의된다.
“증식”은 특히 리셉터-비트랜스펙션된 세포와 비교하여 리셉터-트랜스펙션된 세포의 성장을 나타내는 것으로 의도된다.
“변화된 성장특성”은 함께 배양된 리셉터-비트랜스펙션된 세포(백그라운드)와 비교하여 리셉터-트랜스펙션된 세포의 향상되거나 감소된 성장을 나타내는 것으로 의도된다. 아고니스트와 함께 배양된 세포는 전형적으로 향상된 성장 또는 몇몇 경우에 배양접시상의 포시의 형성에 의해 응답할 것이다. 길항제와 함께 배양된 세포는 전형적으로 감소된 성장에 의해 응답할 것이다.
[설비(Utility)]
본 발명은 일정한 리셉터가 세포성장을 리간드-의존형으로 조절할 수 있는 능력에 기초한다. 본 방법은 두가지 포멧(format)으로 사용될 수 있다.
특히 단일 리셉터의 정밀 약리학에 적용할 수 있는 단일 리셉터 포멧(Single Receptor format)에서 리셉터-트랜스펙션된 세포의 성장을 선택적으로 유발할 수 있는 리간드의 능력은 편리한 표지인자의 유발과 연결되어 있다. 동시에 다수의 리셉터에 대한 잠재적 리간드의 분석에 적용되는 다수의 리셉터 포멧(Multiple Receptor format)은 여러가지 리셉터들로 트랜스펙션된 세포들의 혼합물인 배양액내의 개개의 리셉터에 유일한 표지인자를 선택적으로 유발할 수 있는 리간드의 능력을 이용한다.
단일 리셉터 포멧은 아고니스트 및 길항제 리간드와 개개의 리셉터와의 상호작용의 용이한 분석을 허용한다. 다수 리셉터 포멧은 아고니스트 및 길항제 리간드와 동시에 여러가지 리셉터들과의 상호작용의 용이한 분석을 허용한다.
단일 리셉터 포멧은 매우 적은 단계들; 저렴한 시약;
부분적 아고니스트, 완전 아고니스트 및 길항제를 양적으로 식별할 수 있는 능력을 내포한다. 분석법이 제조합 리셉터 및 표지인자 DNA의 트랜스펙션에 의존하기 때문에, 분석은 매우 다양한 리셉터, 표지인자 및 세포형과 함께 실행될 수 있다. 이들 성질들과 더불어 다수 리셉터 포멧은 동시에 다수의 리셉터들에 대한 리간드 활성의 스크린에 적용할 수 있다고 발명자에게 알려진 유일한 방법을 나타낸다.
그래서 다수 리셉터 포멧은 특히 “히트”(hits; 즉 리간드 활성을 갖는 물질)가 다수의 시험물질로부터 빨리 동정될 수 있는 약품 스크린 프로그램에서의 사용에 적합하다.
리셉터-기초 분석법은 기지의 리간드의 농도를 측정하는데 사용될 수 있다.
측정될 리간드는 본 방법에 따라 트랜스펙션된 세포와 함께 배양될 수 있다. 화학적 또는 연역학적으로 기초된 분석법과 리셉터-기초 분석법의 주요 차이점은 리셉터-기초 분석법이 리간드의 기능적효과를 측정한다는 것이다. 이 특성의 한가지 응용분야는 화합물의 약리학적 분석이다. 이들 분석법들에서 리셉터-기초 분석법은 화학적 또는 연역학적 기술로는 놓치기 쉬운 활성 대사물질을 검색할 것이다. 리셉터-기초 분석법은 비활성 대사물질을 간과할 수 있다. 이러한 데이타는 시험 화합물의 치유적 효과에 있어 주어진 리셉터의 점유의 역할을 평가하는데 매우 유용할 것이다. 이 접근법의 또다른 응용분야는 약력(drug history)이 알려지지 않은 체액(bodily fluids)의 약리학적 성질을 동정하는 것이다. 한가지 그러한 응용분야는 불법 약품시험일 것이다. 이경우 어떤 개인이 많은 아펀양제재(opioids)중의 한가지를 복용했는지를 결정하기 위해 혈액이 아편제(opiate)리셉터를 활성화하는 능력에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 또다른 용도는 cDNA 라이브러리로부터 주어진 리간드에 리셉터를 새로 클로닝하는 것일수 있다. cDNA 라이브러리로부터의 cDNA의 풀(pools)이 주어진 리간드에 의한 활성화에 대하여 스크린 될 수 있다. 주어진 풀중의 어느 cDNA가 응답성 리셉터들 암호화하는 지는 응답가능한 리셉터가 확인될때까지 라이브러리 중의 개개의 cDNA를 트랜스펙션시킴으로써 동정될 수 있다. 그 방법은 미지의 cDNA들이 트랜스펙션을 위해 사용된다는 것을 제외하고는 첨가된 도면 11에 설명된 방법과 유사할 것이다.
본 발명의 또다른 용도에서 주어진 리셉터의 라이브러리는 여러가지 개체, 종양, 조직 또는 임의적으로 돌연변이된 풀로부터 특정유전자를 증식함으로써 제조될 수 있다.
그다음 이들 cDNA의 라이브러리는 cDNA의 풀을 세포에 트랜스펙션시키고, 그 세포를 리간드의 존재 또는 부재하에 성장시킴으로 스크린될 수 있다. 이 방법은 본질적으로 활성형인 리셉터(예를들면 어떤 암유전자)의 동정에 적용될때 특히 강력할 것이다.
[발명의 상세한 설명]
[단일 리셉터 포멧]
본 발명은 한가지 구체예에서, 세포는 단일 리셉터를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션된다. 트랜스펙션은 기지의 방법에 따라서 실행될 수 있다. 일반적으로 리셉터를 암호화하는 DNA서열은 재조합 DNA공정을 받기 쉬운 적당한 클로닝 백터(cloning vector)에 삽입될 수 있다. 벡터는 자동복제되는 벡터, 즉 염색체외의 물질로서 존재하며, 그것의 복제가 염색체의 복제와 독립적인 벡터, 예를들면 플라스미드(plasmid) 일 수 있다. 이와 선택적으로 벡터는 세포에 도입되었을때 숙주세포게놈(genome)에 통합되어 통합된 염색체(들)와 함께 복제하는 것일수 있다.
벡터내에서 리셉터를 암호화하는 DNA서열은 작동될 수 있도록 적당한 프로모터 서열에 연결되어야 한다. 프로모터는 선택된 숙주세포에서 전자활성을 보이는 어떤 DNA서열도 될 수 있으며, 숙주세포에 동종 또는 이종인 단백질을 암호화하는 유전자로 부터 유래될 수 있다. 포유동물 세포에서 리셉터를 암호화하는 DNA의 전사를 지시하는 적당한 프로모터의 예들은 SV40 프로모터(Subramani et al. Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), MT-1(메탈로티오네인 유전자) 프로모터(Palmiter et al., Science 222 (1983), 809-814) 또는 아데노비루스 2주요 말기 프로모터이다.
또한 리셉터들 암호화하는 DNA서열은 작동될 수 있도록 인간 성장호르몬 터미네이터(Palmiter ey al. op. cit.)와 같은 적당한 터미네이터에 연결될 수 있다.
벡터는 또한 폴리아데닐화 신호(예를들면 SV40 또는 아데노비루스 5E1b 영역), 전자증강서열(예를들면 SV40인핸서) 및 번역증강서열(예를들면 아데노비루스 VA RNAs를 암호화하는 것)과 같은 요소들을 함유할 수 있다.
벡터는 또한 벡터가 의문의 숙주세포에서 복제할 수 있도록 해주는 DNA서열을 함유할 수 있다. 그러한 서열의 한 예는 (숙주세포가 포유동물 세포일때) SV40의 복제시작점이다.
각각 리셉터, 프로모터 및 터미네이터를 암호화하는 DNA서열들을 라이게이션(ligation)시키고, 그것들을 복제에 필요한 정보를 함유하는 적당한 벡터내에 삽입시키기 위해 사용하는 방법은 당업자들에세 잘 알려져 있다(예를들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
본 방법에 사용될 수 있는 세포는 주어진 리셉터를 통한 신호전달에 대해 세포 4 장으로 응답할 수 있는 세포이다. 하등 생물형태의 세포는 일반적으로 본 발명의 목적에 적당한 신호전달통로가 없기 때문에, 그러한 세포는 전형적으로 포유동물세포 (또는 다른 진핵세포)이다.
적합한 세포의 예들은 암유전자(예를들면 ras (참조 Barbacid, Ann, Rev. Biochem, 56, 1987, pp. 779-827) 또는 p53), 돌연변이 G 단백질(참조 Kalinec et al, Mol. Cell. Biol. 12, 1992, p. 4687)뿐만 아니라 Gq 및 티로신키나제리셉터에 대해 세포성장으로 응답하는 쥐섬유아세포 세포주 NIH 3T3의 세포(ATCC CRL 1658); Gi 및 Gs 리셉터에 의해 매개되는 시클릭 AMP의 변화에 응답하는 RAT 1 세포(Pace et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991, pp. 7031-7035); Gi 및 Gs 리셉터에 의해 매개되는 시클릭 AMP의 변화에 대해 또한 응답하는 뇌하수체 세포(Vallar et al., Nature 330, 1987, pp. 556-558)이다.
포유동물세포를 트랜스펙션시키고 도입된 DNA서열을 세포내에서 발현시키는 방법은 예를들면 Kaufman 및 Sharp, J. Mol.Biol. 159(1982), 601-621; Southern 및 Bery, J. Mol. Appl. Genet. 1(1982), 327-342; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(1982), 422-426; Wigler et al.Cell 14 (1978), 725; Corsaro 및 Person, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603; Graham 및 van der Eb, Virology 52 (1973), 456; Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845; 및 Wingler et al., Cell 11 (1977), pp. 223-232에 기술되어 있다.
리셉터를 암호화하는 DNA서열은 콜로니자극인자 1 (CSF-1), 혈소판-유래성장인자(PDGF), 표피성장인자(EGF), 형질전환성장인자(TGF), 신경성장인자(NGF), 인슐린, 인슐린-유사성장인자 1(IGF-1)리셉터 등과 같은 티로신키나제리셉터; Gi-연결, Gq-연결 또는 Gs-연결 리셉터, 예를들면 무스카린리셉터(예를들면 서브타입 m1, m2, m3, m4, m5), 돕아민리셉터(예를들면 서브타입 D1, D2, D4, D5), 아편제리셉터(예를들면 서브타입 μ또는 δ), 아드레날린리셉터(예를들면 서브타입 α1A,α1B,α1C,α2C10,α2C2,α2C4), 세로토닌리셉터, 티치키닌리셉터, 루테인화 호르몬리셉터 또는 티로이드-자극 호르몬리셉터와 같은 G-단백질 연결 리셉터(G-단백질 연결 리셉터에 대한 더이상의 정보를 위해서는 다음을 참조: vide M. Brann (ed.), Molecular Biology of G-Protein Coupled Receptors, Birhauser, Boston, 1992)를 암호화할 수 있다.
G-단백질인 Gs에 연결된 리셉터는 Gs 및 Gq 사이의 키메라(예를들면 Gq-s 5)와 함께 발현되었을때 β-gal을 유발한다.
선택적으로, Gs활성 또는 cAMP의 변화에 응답하는 세포는 NIH 3T3 세포 대신에 사용할 수 있다. 적당한 후보자로서는 cAMP가 세포성장에 중요한 효과를 갖는다고 알려진 RAT 1세포(Pace et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 88; 7031-7035(1991)) 및 성장이 Gs동로의 변화에 민간한 어떤 뇌하수체 세포주(Vallar et al., Nature 330: 558-558 (1987))가 있다.
세번째 가능성은 주어진 Gs-연결 리셉터의 리간드 결합부위가 Gq-연결 리셉터의 G-단백질 연결부위와 융합된 키메라리셉터를 제조하는 것이다. 그러한 키메라는 m1 무스카린(Gq) 및 β-아드레날린리셉터에 대해 보고되었다(Wong et al., J. Biol. Chem. 265: 6219-6224 (1990)).
최근에 고유의 티로신키나제 활성을 갖지는 않으나, NIH 3T3 세포를 포함한 다양한 세포에 내성적인 티로신키나제의 활성을 자극할 수 있는 여러가지 리셉트들이 동정되었다.
한가지 예는 리간드에 의해 활성화되었을때 NIH 3T3 세포내에서 포시를 유발하는 GM-CSF 리셉터이다(Areccs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3963-3967 (1993)). 티로신키나제리셉터와 마찬가지로, 이들 리셉터는 본 발명에 의해 분석될 수 있다.
최근에 고유의 티로신포스파타제 활성을 갖는 여러가지 리셉터들이 동정되었다. 본 방법에서 사용하기 위해 티로신포스파타제리셉터는 티로신키나제리셉터와 함께 공-발현될 수 있다. 이들 리셉터는 티로신키나제리셉터에 의한 티로신 인산화를 역전시켜서, 이들 리셉터에 의해 매개되는 신호를 저해할 수 있을 것이다.
전사인자들은 전사인자의 DNA결합표적이 세포성장을 자극하는 유전자의 발현을 조절하도록 설계된 조립벡터에 의해 분석될 수 있다.
그래서 만약 리간드가 전사인자의 기능을 억제 (또는 DNA결합부위에 대해 경쟁)한다면, 성장을 조절하는 유전자의 발현이 억제될 것이다(Spanjaard et al., Mol. Enodcrinology. 7: 12-16 (1993)).
레티노산/스테로이드 슈퍼패밀리의 리셉터는 이들 리셉터의 리간드 결합부분과 전사인자로서 작용하여 세포성장을 자극하는 단백질 사이의 키메라를 제조함으로써 분석될 수 있다. 글루코코티코이드리셉터 및 암유전자 c-fos 사이의 키메라는 글루코코티코이드가 NIH 3T3 세포에서 표시를 자극하도록 허용한다(Superti-Furga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5114-5118 (1991)).
리간드-의존성 성장을 유발할 수 있는 많은 유전자 산물들은 또한 본 방법에 의해 손쉽게 분석될 수 있다. 리간드-의존성 성장을 유발하는 많은 단백질은 리셉터의 돌연변이형이다. 예들은 trkA리셉터형, EGF리셉터의 돌연변이형, neu 암유전자를 포함한다(Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2965-2969 (1992); Schlessinger et al., Neuron 9: 383-391 (1992)). 또한 많은 이들 단백질은 G-단백질과 같은 신호전달 단백질의 돌연변이형이다(Barbacid Ann. Rev. Biochem. 56: 779-827 (1987)).
원칙적으로 이 응용에서 본 방법의 이점은 화합물의 성장에 대한 일반효과가 암유전자의 활성에 대한 특별효과로 부터 구별될 수 있다는 것이다.
이것은 트랜스펙션된 세포안에 존재하는 특별한 표지인자와 병행하여 배양의 전체적 세포성장 및 생존률을 측정함으로써 성취될 수 있다.
대부분의 세포들은 트랜스펙션되지 않기 때문에, 세포성장에 대한 일반효과는 특별하지 않아야 한다.
리셉터는 리간드-또는 전압-게이트(gated) 이온 통로일 수 있다는 것이 또한 예상되었다. 리간드-게이트 통로는 니코틴아세틸콜린리셉터의 서브타입, GABA리셉터, 글루탐산리셉터(NMDA 또는 다른 서브타입), 세로토닌리셉터의 서브타입 3 또는 시스틱피브로시스를 일으키는 cAMP-조절 동로를 포함한다. 전압-게이트 이온 통로는 칼륨, 나트륨, 염소 또는 칼슘 동로의 서브타입을 포함한다(참조 Lester, Science 241, 1988, p. 1057: Nicoll, Science 241, 1988, P.545). 이들 채널을 분석하기 위해 세포는 동로의 활성화 (또는 불활성화)가 이온 흐름의 순수 변화를 얻을 수 있는 이온조건하에서 배양될 것이다.
세포는 세포증식에 대한 세포내 이온통로농도의 변화의 효과를 증가시키도록 유전적으로 수정될 것이다. 예를들면 칼슘통로는 원하는 통로를 칼슘레벨에 민감한 암유전자와 함께 공-트랜스펙션시킴으로써 분석될 수 있다.
본 발명에 따르면, 시험물질의 어떤 아고니스트 활성도 리셉터도 트랜스펙션되지 않은 세포의 백그라운드와 비교하여 리셉터-트랜스펙션된 세포의 성장에 대한 리셉터의 향상된 효과에 의해 결정될 수 있다.
비록 향상된 효과가 성장의 증가 또는 감소로서 측정될지라도, 아고니스트의 존재하의 리셉터의 향상된 효과는 매우 동상적으로 리셉터-트랜스펙션된 세포의 향상된 증식으로서 검출된다.
본 발명에 따르면, 시험물질의 어떤 길항제 활성도 리셉터로 트랜스펙션되지 않은 세포의 백그라운드와 비교하여 트랜스펙션된 세포의 성장에 대한 리셉터의 효과에 저해로서 결정될 수 있다. 비록 효과의 저해가 성장의 증가 또는 감소로서 측정될지라도, 리셉터의 효과의 저해는 전형적으로 리셉터-트랜스펙션된 세포의 증식의 저해로서 검출된다.
특정된 구체예에서, 시험물질은 세포증식의 리셉터 자극의 아고니스트의 존재하에 트랜스펙션된 세포와 함께 배양된다. 아고니스트에 의한 세포증식의 저해는 길항제의 존재를 증명한다.
트랜스펙션된 세포에서, 표지인자는 트랜스펙션된 리셉터 DNA 또는 전사된 리셉터 mRNA일 수 있다.
리셉터 DNA 또는 mRNA의 존재는 DNA증식 및/또는 혼성화(hybridisation) 기술에 의해 결정될 수 있다.
혼성화 목적을 위해, DNA는 세포로부터 분리되고, 적당한 제한효소(restriction endonuclease)에 의해 절단될 것이다.
절단후에, 결과의 DNA단편은 아가로스 갤 상에서 전기영동(electrophoresis)될 것이다. 겔로부터의 DNA는 그다음 니트로셀룰로스 필터상에 빨아들이고 (blotted), 방사성 표지된 올리고누클레오티드 프로브(probe)에 위해 혼성화될 것이다.
프로브는 편리하게 리셉터 유전자의 DNA단편을 함유할 수 있다(실질적으로 다음의 방법에 따름: E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98, 1975. pp. 503).
증식의 목적을 위해, 세포로부터 분리된 층 mRNA는 역전사(reverse transcription)되어서 cDNA 라이브러리를 제조할 것이다.
리셉터를 암호화하는 cDNA는 그다음 의문의 리셉터를 암호화하는 유전자의 단편에 대응하는 올리고누클레오티드 프라이머(Primer)를 사용한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의해 증식되고, 아가로스 겔 상에서 크기에 의해 검출될 것이다.
증식된 리셉터 cDNA는 또한 적어도 리셉터를 암호화한 유전자의 일부분에 대응하는 DNA서열을 함유하는 방사성 표지된 올리고누클레오티드 프로브에 혼성화함으로써 검출될 것이다. 이 방법은 예를들면 상기의 Sambrook et al., Supra에 의해 기술되어 있다. 표지인자는 또한 효소, 결합단백질 또는 항원일 수 있다.
이 경우에 세포는 의문의 표지인자를 암호화하는 DNA서열으로 트랜스펙션된다.
표지인자로서 유용한 효소의 예들은 포스파타제(산성 또는 알칼리성 포스파타제와 같은), β-갈락토시다제, 우레아제, 글루코스산화제, 카본무수화제, 아세틸콜린에스터라제, 글루코아밀라제, 말레이트탈수소제, 글루코스-6-인산 탈수소제, β-글루코시다제, 프로테아제, 피르베이트 탈카르복실제, 에스테라제, 루시퍼라제, 알코올탈수소제, 또는 과산화제(호스라디쉬 과산화제와 같은)이다.
본 방법에서 효소 활성을 가시화하기 위해, 기질은 최종 산물이 검출가능한 반응을 촉매하기 위해 첨가되어야 한다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 기질의 예들은 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드, 5-브로모-4-클로로-3-인돌-β-D-갈락토피라노시드, 클로로나프톨, o-페닐렌디아민, 3-(p-히드록시페닐)프로피온산, 루미놀, 인독실 인산염, p-니트로페닐인산염, 니트로페닐갈락토스, 4-메틸움벨리퍼릴-D-갈락토피라노시드, H2O2/테트라메틸벤지딘 또는 루시퍼린을 포함한다.
본 방법에 사용될 수 있는 결합 단백질의 예들은 표지화된 비오틴으로 검출될 수 있는 아비딘 또는 스트렙타비딘이다. 비오틴을 표지화하기 위한 적당한 물질은 형광 꼬리표(예를들면, 플루오레신, 피코에리스턴, 피코시아닌) 또는 표지인자효소(예를들면, 상기 효소중의 하나)일 수 있다. 다른 가능한 결합 단백질은 렌틴, 특히 편두렉틴 또는 일렉틴과 같은 식물 렉틴이다. 렉틴은 각각의 렉틴에 결합할 수 있는 탄수화물의 수단에 의해 가시화될 수 있다. 그러한 탄수화물은 비오틴에 대해 상술된 것과 같은 물질로 표지화될 수 있다.
본 방법에 사용될 수 있는 항원의 예들은 HLA 또는 C-myc이다.
항원은 각각의 항원에 반응성인 표지화된 항체의 수단에 의해 가시화될 수 있다. 항체는 비오틴에 의해 상술된 것들과 같은 물질로 표지화될 수 있다.
표지인자는 바람직하게는 효소, 특히 E.coli lac z 유전자에 의해 암호화되는 β-갈락토시다제 또는 개똥벌레 루시퍼라제이다. 표지인자효소를 암호화하는 DNA는 리셉터 DNA를 싣고 있는 벡터위에 존재할 수 있고, 또는 그것은 별도로 벡터위에 존재하여 그다음 리셉터 DNA를 싣고 있는 벡터와 공-트랜스펙션될 수 있다.
단일 리셉터 포멧의 특히 바람직한 구체예에서, 본 방법은 다음으로 구성된다:
(a) 리셉터를 암호화하는 DNA 및 표지인자효소를 암호화하는 DNA로 세포를 트랜스펙션시킨다.
(b) 트랜스펙션된 세포를 여러개의 동일 앨리컷으로 나눈다.
(c) 자극된 것과 비자극된 리셉터 사이를 구별하기에 충분한 시간동안 한개 이상의 시험물질로 개개의 앨리컷을 배양한다. 및
(d) 개개의 앨리컷에서 표지인자효소활성을 측정함으로써 세포성장의 어떤 변화를 결정한다.
단계(d)에서 세포성장에 대한 비특이적 효과를 조절하기 위해 자극된 세포에 의해 발현되는 표지인자효소의 양은 시험물질의 첨가전에 배양물에 혼합된 비트랜스펙션된 세포에 의해 발현되는 두번째 및 쉽게 구별될 수 있는 표지인자효소의 양에 비교될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 표지인자로서 두개의 다른 효소들을 사용하는 이점은 자극된 것과 비자극된 세포사이를 구별하는데 필요한 시간이 비교적 짧다는 것이다.
포시가 배양 플레이트 위에 형성되기까지 며칠동안 기다릴 필요가 없고, 실질적으로 플레이트의 배지를 변화하는데 필요한 시간전에 구별될 수 있다.
게다가 만약 효소반응이 형식적 또는 발광적이라면, 검출전에 기질의 분리가 필요하지 않다.
제2도는 단일 리셉터와의 리간드 상호작용의 편리한 분석법으로서 세포성장을 이용하기 위한 전략의 도시적 표현이다.
고농도의 리셉터 DNA 및 편리한 표지인자 DNA(예를들면 β-갈락토시다제를 암호화하는 DNA)는 인산칼슘침전을 이용하여 NIH 3T3 세포를 트랜스펙션시키는데 사용된다.
선택적으로 리셉터 및 표지인자는 동일한 플라스미드 안으로 동합될 수 있다.
이러한 조건을 이용하면 소수의 세포가 실제로 트랜스펙션될 것이고, 대부분의 트랜스펙션된 세포가 둘다의 DNA를 발현할 것이다.
어떤 리간드의 부존재하에 성장된 배양에서, 모든 세포는 유사한 성장 득성을 가질것이고, 이론적으로 배양에서 주어진 시간후에 배양에서 발견된 표지인자의 양은 처음 표지인자로 트랜스펙션된 세포의 백분율에 비례할 것이다. 만약 세포가 리셉터들 자극하는 리간드(아고니스트)의 존재하에 배양된다면, 리셉터-트랜스펙션된 세포는 배양에서 다른 세포와 비교하여 긍정적인 성장 이점을 가질것이다. 대부분의 리셉터-트랜스펙션된 세포는 또한 표지인자를 발현하기 때문에, 그다음 표지인자의 양은 최종배양에서 증가될 것이다.
[다수의 리셉터 포멧]
본 발명의 또다른 구체예에서, 세포를 2이상의 별개의 리셉터를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시키고, 각각의 트랜스펙션된 세포는 각각의 리셉터를 발현한다. 이것은 통계적으로 각각의 세포가 오직 한가지 개개의 리셉터로 트랜스펙션되었음을 의미한다고 보아야 한다.
이것은 오직 작은양의 트랜스펙션을 위한 리셉터 DNA를 사용하여 어떤 한가지 특정한 리셉터를 암호화하는 DNA가 트랜스펙션을 위해 사용된 총 DNA의 오직 작은 비율을 구성함으로써, 예를들면 운반체 DNA를 사용하거나 다수의 서로 다른 리셉터 DNA로 동시에 세포를 트랜스펙션시킴으로써 얻어질 수 있다. 후자의 경우에 비록 몇몇 세포에서 다른 리셉터 DNA가 미량으로 존재할 수도 있음을 배제할 수는 없지만, 매우 적은 수의 세포만이 한가지 이상의 리셉터 DNA로 트랜스펙션될 것이다.
그러나 오직 세포에 첨가된 특정한 리간드에 의해 자극된 리셉터를 함유하는 세포만이 그 방법에 따라 증식될 것이다(그래서 분석에서 가시적으로 된다).
이 방법의 또다른 것으로서, 분리된 세포 배양물을 개개의 리셉터로 트랜스펙션시키고, 이어서 혼합후에 시험물질(들)을 첨가할 수 있다.
다른 방법으로는 트랜스펙션방법은 단일 리셉터 포멧에 대해 상기된 것과 같다.
마찬가지로 트랜스펙션을 위해 사용된 리셉터 타입도 상기된 것과 동일하다.
응답의 강도는 신호전달타입과 관련되기 때문에, 최상의 결과는 동종의 리셉터, 예를들면 α1A, B 및 C 아드레날린리셉터, m1, m3 및 m5 무스카린리셉터, S2 및 1c 세로토닌 리셉터와 같은 Gq-연결 리셉터;
m2 및 m4 무스카린리셉터, D2 및 D4 돕아민리셉터,
1e 및 1d 세로토닌리셉터와 같은 Gi-연결 리셉터;
trk A, B와 C리셉터, EGF 및 PDGF 리셉터;
아데노신리셉터, α2 아드레날린리셉터 서브타입, 소마토스태틴리셉터, 아펀, μ 및 δ 리셉터; ras, p53, neu 암유전자와 같은 암유전자, 또는 trk, EGF, PDGF등의 리셉터의 암유전자형을 함께 시험함으로써 얻어질 수 있다.
적당한 표지인자는 상기된 바와 같다. 그러나 본 발명의 방법에서 서로 다른 표지인자를 포함하는 것이 특히 유리할 것이며, 따라서 주어진 리셉터들 발현하는 세포는 또다른 리셉터로 트랜스펙션된 세포에 의해 발현되는 표지인자로부터 구별될 수 있는 표지인자를 또한 발현하여 서로 다른 리셉터사이의 구별을 더 용이하게 된다.
구별가능하기 위해서는 효소적 표지인자는 그것들의 기질특이성이 중복되지 않아야 한다(예를들면 알칼리성 포스파타제 및 β-갈락토시다제).
그러므로 기질 및 검출 메카니즘은 구별될 수 있는 분석법을 선택해야 한다(예를들면 흑색반응산물을 만드는 알칼리성 포스파타제와 황색반응산물을 만드는 β-갈락토시다제). 선택적으로 염색적 및 발광적 검출이 조합될 수 있다(예를들면 β-갈락토시다제 및 개똥벌레 루시퍼라제). 이 경우에 반응은 쉽게 구별될 수 있는데, 왜냐하면 β-가락토시다제는 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드와 반응될때 염색적 산물을 만드는 반면에, 루시퍼라제는 루시퍼린과 반응될때 발광성 산물을 만들기 때문이다.
발광반응은 불안정한 산물(빛)을 만드는 추가의 이점을 가진다.
그래서 여러가지 발광성 효소반응은 동일 반응혼합물에서 연이어서 수행될 수 있다.
다수 리셉터 포멧의 한가지 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음으로 구성된다:
(a) 세포들 개개의 트랜스펙션된 세포가 개개의 리셉터를 발현하도록 2이상의 별개의 리셉터를 암호화 DNA로, 그리고 표지인자효소를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시킨다.
(b) 트랜스펙션된 세포를 여러개의 동일 앨리컷으로 나눈다.
(c) 자극된 및 비자극된 리셉터사이를 구별하기에 충분한 시간동안 한가지 이상의 시험물질과 함께 개개의 앨리컷을 배양한다.
(d) 개개의 앨리컷내의 표지인자 효소활성을 측정함으로써 세포성장의 어떤 변화를 결정하고, 세포성장특성을 바꾸는 그것들의 능력에 의해 활성 리간드를 동정한다. 및
(e) 개개의 리셉터를 단일 리셉터 포멧의 (a)-(d)단계에 상기된 방법에 따르게 함으로써 어떤 리셉터가 리간드에 의해 활성화되는지를 동정한다.
다수 리셉터 포멧의 또한가지 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음으로 구성된다:
(a) 세포를 개개의 트랜스펙션된 세포가 개개의 리셉터를 발현하도록 2이상의 별개의 리셉터를 암호화하는 DNA로, 그리고 표지인자효소를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시킨다.
(b) 트랜스펙션된 세포를 여러개의 동일 앨리컷으로 나눈다,
(c) 자극된 및 비자극된 리셉터사이를 구별하기에 충분한 시간동안 한가지 이상의 시험물질과 함께 개개의 앨리컷을 배양한다.
(d) 개개의 앨리컷내의 표지인자 효소활성을 측정함으로써 세포성장의 어떤 변화를 결정하고, 세포성장특성을 바꾸는 그것들의 능력에 의해 활성리간드를 동정한다. 및
(e) DNA 증식 및/또는 혼성화 기술에 의해 리셉터 DNA 및/EH는 mRNA를 분석함으로써 리셉터가 리간드에 의해 활성화되는지를 동정한다.
다수 리셉터 포멧의 또 한가지 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음으로 구성된다:
(a) 세포를 2이상의 별개의 리셉터를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시켜서 개개의 트랜스펙션된 세포가 개개의 리셉터를 발현하도록 하고, 2이상의 표지인자효소를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시켜서 주어진 리셉터를 발현하는 세포가 또다른 리셉터로 트랜스펙션된 세포에 의해 발현되는 표지인자로부터 구별가능한 표지인자를 발현하도록 한다.
(b) 트랜스펙션된 세포를 여러개의 동일 앨리컷으로 나눈다.
(c) 자극된 및 비자극된 리셉터 사이를 구별하기에 충분한 시간동안 한가지 이상의 시험물질과 함께 개개의 앨리컷을 배양한다.
(d) 개개의 앨리컷내의 표지인자 효소활성을 측정함으로써 세포성장의 어떤 변화를 결정하고, 세포정상득성을 바꾸는 그것들의 능력에 의해 활성리간드를 동정한다, 및
(e) 분석에 따르는 개개의 표지인자효소에 대한 기질을 첨가함으로써 어떤 리셉터가 리간드에 의해 활성화되는지를 동정한다.
본 발명의 이들 구체예는 만약 한 시리즈의 단일 리셉터의 돌연변이형 대신에 다수 리셉터 타입이 함께 트랜스펙션되고 리간드의 존재하에 성장된다면, 많은 수의 리셉터 및 가능하면 잠재성 리간드도 동시에 시험될 수 있어서 약품 스크리닝 프로그램에의 시간을 절약한다는 원리에 기초한다.
리간드가 활성화할 수 있는 리셉터 또는 리셉터들은 그 리셉터를 발현하는 세포의 증식을 유발하여, 따라서 주어진 리간드에 의해 활성화된 리셉터는 예를들면 DNA증식기술에 의해 배양에서 동정될 수 있다.
다수 리셉터 포멧에 대한 다수의 구성이 기술적으로 가능하다.
제10도는 다수 리셉터 포멧의 일반 개념을 나타낸다. 여기서 두가지 리셉터가 저농도의 리셉터 DNA를 사용하여 NIH 3T3 세포안으로 트랜스펙션된다. 이들 조건하에 소수의 세포가 트랜스펙션될 것이며, 트랜스펙션된 세포들은 보통 오직 단일 리셉터만을 발현할 것이다.
드물게 둘다의 리셉터가 주어진 세포에서 발현될 것이다. 만약 배양물이 R1에 대한 아고니스트 활성을 갖는 리간드의 존재하에 성장된다면, R1 트랜스펙션된 세포는 배양에서 증식될 것이다. R2가 R1과 함께 또한 발현되는 세포에서는 약간의 R2가 또한 증식될 것이다. 리셉터 증식의 양은 구별가능한 표지인자를 개개의 리셉터 플라스미드 상에 발현되도록 하거나, 선택적으로 DNA증식 기술의 수단에 의해 DNA의 리셉터 mRNA를 직접 검출함으로써 결정될 수 있다.
다수 리셉터 포멧의 한가지 구성이 제11도에 도시되어 있다.
여기서 다수의 리셉터가 단일 표지인자와 함께 공-발현된다.
한가지 이상의 리셉터의 활성화는 결과적으로 표지인자를 유도하고, 활성을 가지는 것으로서 시험 리간드를 동정할 것이다. 그다음 어떤 리셉터가 활성화되었는 지는 분리된 개개의 리셉터에 대한 스크리닝에 의해 결정될 수 있다.
이 접근법은 다수 리셉터 표적에 대한 리간드 활성에 관한 화합물의 집단 스크리닝에 유용성을 가질 것이다. 어떤 리셉터가 활성되었는 지를 동정하는 또다른 접근법은 제14도에 도시된 바와 같은 DNA증식 기술에 의해 리셉터 mRAN 및/또는 DNA를 측정하는 것 일 수 있다.
후자의 접근법은 고유활성을 갖는 리셉터(예를들면 암유전자)의 길항제 또는 저해제로서의 리간드의 분석에 중요한 유용성을 가지기 쉽다.
본 발명은 다음 실시예에서 더욱 예시되며, 이것은 결코 청구된 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않는다.
[실시예]
[단일 리셉터 포멧에 대한 일반 프로토콤]
NIH 3T3 세포의 배양물(ATCC CRL 1658과 같이 American Type Culture Collection으로부터 구할 수 있음)을 50-60% 합류점으로 제조했다. 첫째날에 세포를 트립신화하고, 스펀다운시키고, 10ml 둘베코의 Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% 소혈청에서 1×106세포/10cm 플레이트로 플레이트 했다(한개의 175cm2플라스크로부터 3∼4개의 10cm 플레이트를 얻었다). 둘째날에 세포를 Wigler et al. Cell 11: 223-232 (1977)의 인산 칼슘 침전방법을 사용하여 트랜스펙션시켰다. 각 플레이트에 대해 5㎍리셉터 DNA, 5㎍ β-갈 DNA(β-갈, pSV-β-갈락토시다제, 프로메가), 20㎍연어정자 DNA, 62.5㎕ 2.0M CaCl2를 H2O로 0.5ml에 맞추었다. DNA용액을 0.5ml 2×HEPES-버퍼된 살린(280mM NaCl, 10mM KCl, 1.5mM Na2HPO4-2H2O, 12mM 덱스트로스, 50mMN-(2-수산화에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)(HEPES), pH 7.05)이 되도록 적가하는 동안 공기방울로 부드럽게 혼합했다. 셋째날에 플레이트 HANK의 균형 살린 용액(HBSS)로 세척하고 10ml DMEM+10%소혈청을 첨가했다.
넷째날에 세포를 트립신화하고 스펀다운시키고 10ml(DMEM+10% 소혈청)에 재현탁했다. 100㎕의 현탁액을 96웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가했다. 100㎕ DMEM(10% 소혈청)중의 2×농도의 시험화합물을 각각의 웰에 첨가했다. 세포를 배지의 변화없이 3-5일 동안 시험화합물과 함께 배양했다.
Lim 및 Chae, Biotechniques 7: 576-579 (1989)의 변형된 방법을 β-갈을 분석하기 위해 사용했다. β-갈을 분석하는 날에 배지를 흡기하고, 웰을 100㎕ 인산염-버퍼된 살린(PBS)으로 헹구었다. 3.5mM o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 및 0.5% Nonidet P-40(시그마)을 갖는 200㎕의 PBS를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 4시간동안 배양했다.
β-갈 응답은 여러시간동안 선형이었다. 각각의 웰의 흡광도는 약 405nm로 맞추어진 플레이트 판독기(Bio Tec)의 수단에 의해 결정했다.
[실시예 1]
[trk A 리셉터로 트랜스펙션된 세포에서의 β-갈락토시다제 활성]
신경성인자(NGF)는 trk A 리셉터에 대한 아고니스트이다.
NGF-자극된 trk A 리셉터는 티로신 인산화를 활성하고, NIH 3T3 세포에서 포시를 유도한다. 제3(a)도는 상기 일반공정에 이어서 trk A 리셉터-트랜스펙션된 세포를 NGF의 존재 또는 부재하에 성장시킨 실험으로부터의 데이터를 도시한다.
10cm 플레이트의 NIH 3T3 세포를 5㎍의 trk A 리셉터 DNA(Kaplan et al., Science 252, 1991, p.554 및 Martin-Zanca et al, Mol. Cell. Biol. 9, 1989, p. 24에 기술된 바 대로 실질적으로 클론됨) 및 5㎍의 β-갈 DNA로 트랜스펙션시켰다. 세포를 24시간후에 세척하고, 48시간후에 세포를 미세적정 플레이트의 96웰에 옮기고, 지시된 날수동안 NGF의 존재 또는 부재하에 성장시켰다. β-갈활성은 3일내에 관찰된 현저한 유도를 가지고 NGF에 의해 유도되었다. 제3(a)도에 보여진 데이타는 3중측정(각각 분리된 웰로부터)의 평균치 +/-SD이였다. 제3(b)도는 NGF처리의 3일후 β-갈을 유도하는 NGF 투여량-응답 관계를 도시한다. 이 응답의 NGF ED50은 PC12세포에서 내생적 NGF 리셉터로 유도된 신경돌기 성장으로부터 관찰된 것과 유사했다(Cordon-Cardo et al., Cell 66: 173-183 (1991); Chao et al., Neuron 9: 583-593 (1992)).
또한 관련 신경영양인자 NT3의 투여량-응답 관계가 도시되어 있다.
뉴로트로핀 리셉터의 기지 선택성과 일치하여 NGF가 trk C 리셉터 서브타입으로 트랜스펙션된 세포에서 증식 응답을 유도할 수 없다는 사실은 보여지지 않는다(표 2참조).
[실시예 2]
[무스카린리셉터 서브타입 m1, m2, m3, m4 및 m5로 트랜스펙션된 세포에서의 β-갈락토시다제 활성]
포스포리파제 c(m1,m3,m5)를 자극하는 무스카린 아세틸콜린리셉터는 오직 트랜스펙션된 리셉터가 아고니스트 활성을 갖는 리간드에 의해 활성화되었을때만 NIH 3T3 세포에서 세포성장을 자극하고 포시를 유도할 수 있다.
이들 리셉터로 트랜스펙션된 NIH 3T3 세포로부터 분리된 단일 클론주에서, 포스포리파제 C의 자극, 미토제네시스 및 포시의 자극에 대한 아고니스트의 투여량-응답 관계는 동일하며, 이들 리셉터는 무스카린리셉터 길항제 아트로핀에 의해 중단된다.
m2 및 m4무스카린리셉터는 NIH 3T3 세포에서 포스포리파제 C를 강하게 자극하지 못하고, 또한 그것들은 포시를 유도하지도 않는다. 이들 데이터는 리간드-유도된 세포성장의 변화가 몇몇 무스카린리셉터 서브타입의 약리학의 분석법으로서 사용될 수 있다는 것을 가리킨다(Gutkind et al., PANS 88, 4703 (1991); Stephens et al., Oncogene 8, 19-26 (1993)).
NIH 3T3 세포에서 포시의 유도에 대한 m5 DNA의 투여량-응답 관계는 제1(a)도에 도시된다. 이들 데이터는 포커스 응답이 저농도의 DNA(∼1ng)를 요구하고, 광범위한 DNA농도(1ng 내지 최소한 1000ng)에 걸쳐 선형이라는 것을 가리킨다.
100ng의 m5 DNA에 대해서 표시의 유도에 대한 투여량-응답 관계는 제1(b)도에 도시된다. 일반 프로토콜하에 상기된 인산 칼슘 침전조건을 사용하여 각 배양물내의 소수의 세포는 실제로 DNA로 트랜스펙션된다. 이들 데이타는 저농도의 DNA가 배양물내의 소수의 세포를 트랜스펙션시키기 위해 사용되어왔던 조건하에서, 강한 리간드-의존성 응답이 관찰된다는 것을 가리킨다.
무스카린리셉터 서브타입은 많은 다른 리셉터와 같이 기능적으로 별개의 G-단백질과 선택적으로 상호작용할 수 있다. 예를들면 m1, m3 및 m5 리셉터는 G-단백질 Gq와 연결함으로써 포스포리파제 C를 선택적으로 자극하며, m2 및 m4는 G-단백질 Gi와 연결함으로써 아데닐사이클라제를 선택적으로 저해한다.
m2 및 m4는 또한 G-단백질 Go와 선택적으로 연결한다(Jones et al., in Molecular Biology of G-protein-coupled receptors, M Brann ed. Birharser Boston. pp 170-197 (1992)). 리셉터의 기능적 표현형을 바꾸는 한가지 전략은 돌연변이 G-단백질을 갖는 리셉터를 발현하는 것이다. 예를들면 만약 Gq의 리셉터-연결 선택성이 Gi의 선택성으로 변화되면, m2 및 m4 리셉터는 그러한 돌연변이 Gq를 활성화할 수 있을 것이다.
G-단백질의 카르복시-말단이 다른 리셉터에 대한 그것들의 선택성을 지시한다는 것이 최근에 밝혀졌다. 우리의 연구에서 우리는 Gq 및 Gi의 카르복시-말단 5아미노산 사이의 키메라(Gq-i5) 또는 Go와 사이의 키메라(Gq-o5)를 시험했다(Gq-i5 및 Gq-o5 구조물은 Conklin et al., Nature 363, 1993, p. 274에 기술된다).
카르바콜의 β-갈락토시다제 활성의 유도의 시간-경로를 m5 및 m2 무스카린리셉터로 트랜스펙션된 NIH 3T3 세포에서 조사했다(제4도). 5㎍의 인간 m5 무스카린리셉터 DNA 및 5㎍의 대조플라스미드 DNA, 또는 5㎍의 인간 m2 무스카린리셉터 DNA 및 5㎍의 Gq-i5DNA(m2/Gq-i5)를 5㎍의 β-갈락토시다제 DNA와 조합시켜 10cm 플레이트를 트랜스펙션했다.
48시간후에 세포를 96웰 플레이트의 웰로 옮기고, 카르바콜로 즉시 처리했다. 카르바콜 처리는 지시된 날수동안 계속했으며, 배지 및 카르바콜을 매 3일마다 변화시켰다. m2 리셉터의 경우에는 G-i5 키메라는 리셉터와 공발현되었다(5㎍의 리셉터 및 5㎍의 G-단백질).
발현된 G-단백질의 부재하에 m2 리셉터는 β-갈락토시다제 레벨에 영향을 주지 않는다. m2/q-i5 및 m5로 트랜스펙션된 배양물 둘다에 대해 카르바콜은 β-갈락토시다제 레벨을 상당히 유도할 수 있었으며, 이 효과는 약품처리의 약 5일째에 플래토우에 도달했다. β-갈락토시다제 응답을 매개하는 Gq-i5 및 Gq-o5의 능력은 카르바콜에 의한 m4 리셉터의 자극에 비교되었다. m4/q-i5에 대한 카르바콜의 ED50은 0.037+/-0.046이었고, m4/q-o 5에 대한 0.032+/-0.047이었으며, 조합 둘다는 유사한 최대 응답을 얻었다. 이들 데이터는 m4 리셉터가 유사한 효율성을 가지고 q-i5 및 q-o5에 연결한다는 것을 가리킨다.
세포밀도가 최적화되어 최대 β-갈락토시다제 신호를 얻는 상기 타임-경로 및 실험에 기초하여, 상기 단일 리셉터 포맷에 대한 일반 프로토콜을 적용하였다.
m1-m5 무스카린 리셉터를 Bonner et al., Science 237, 1987, p, 527 및 Bonner et al., Neuron 1 1988, p. 403에 기술된 바 대로 실질적으로 클론닝했다.
각각의 m1, m3 및 m5 무스카린리셉터에 대해 NIH 3T3 세포를 5㎍의 리셉터 DNA 및 5㎍의 β-갈락토시다제 DNA로 트랜스펙션시켰다. 각각의 m2 및 m4 무스카린리셉터에 대해 NIH 3T3 세포를 5㎍의 리셉터 DNA, 5㎍의 Gq-i5 DNA 및 5㎍의 β-갈락토시다제 DNA로 트랜스펙션시켰다. m1, m3 및 m5 무스카린리셉터에 대한 데이터는 카르바콜처리의 5일후에 수집했고, m2 및 m4 무스카린리셉터에 대한 데이터는 카르바콜처리의 4일후에 수집했다.
매시변화는 수행하지 않았다. 데이나 3,4 독립적 웰로부터의 평균치이며, 기질 및 세제의 첨가의 4시간후에 원래의 웰로부터 직접 판독했다. 라인은 작용의 단일 일당-작용 부위의 등식에 대한 데이터의 컴퓨터 발생 맞춤이다.
m1, m3 및 m5도 트랜스펙션된 세포의 카르바콜 투여량 응답 관계를 조사했다(제6(a)도). 유사한 실험을 Gq-i5와 공트랜스팩션된 m2 및 m4 리셉터를 가지고 수행했다(제6(b)도).
도시된 바와 같이 일반 프로토콜은 이들 5가지 리셉터에 대한 카르바콜의 ED60의 정확한 결정을 허용했다. 이들 값은 포시 유도(Gutkind et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4703 (1991)), 미토제네시스(Stephens et al., Oncogene 8: 19-26 (1993)), 2차 전달자 및 생리적 응답(Jones et al. Mol. Pharm. 40: 242-247 (1991))을 사용한 이전의 측정과 매우 일치한다. 작용의 단일 질량 작용 부위의 동시에 대한 데이터의 작용도 또한 도시된다. 표시된 바 대로 모든 리셉터는 이 리셉터 질량-작용 관계를 따른다.
표 1은 분석법을 사용하여 측정된 m1-m5 리셉터에 대한 여러 무스카린 아고니스트 및 길항제의 약리학을 나타낸다.
대부분의 길항제가 결합 분석법에서 보다 이들 기능 분석법에서 더 낮은 효능을 갖는다는 것을 제외하고는, 모든 길항제 데이터는 결합분석법을 사용하여 이전에 측정된 매개변수와 매우 일치 했다(앞에 인용한 Jones et al., in Molecular Biology of G-Protein Coupled Receptors에 비평됨). 완전한 및 부분적 아고니스트의 응답들 사이를 구별하는 분석법의 능력이 또한 설명된다.
부분적 아고니스트는 가끔 기능 분석법에서 완전한 아고니스트로부터 구별하기가 어렵다. 그 어려움은 종종 상한 효과 및 리셉터 결핍 때문이다.
사실상 분석법들은 약한 부분적 아고니스트에 대한 고민감성을 전부의 및 부분적 아고니스트를 구별하는 능력과 거의 조합시키지 못한다.
[실시예 3]
[m5 및 m2 (Gq-i5) 무스카린 리셉터로 트랜스펙션된 세포에서의 루시퍼라제 활성]
상기 일반 프로토콜에 따라서, m5 무스카린 리셉터 및 m2 무스카린 리셉터(Gq-i5로 공트랜스펙션)의 증식은 β-갈락토시다제 대신에 표지인자로서 개똥벌레 루시퍼라제(luc, pGL2-컨트롤벡터, Promega)를 사용하여 결정했다. 리셉터, 표지인자 및 G-단백질 DNA농도는 실시예 2에서 β-갈락토시다제 실험에 대해 기술될 것과 동일하였다.
카르바콜의 ED50은 개똥벌레 루시퍼다제의 활성화를 유도하기 위해 m5에 대하여는 0.22+/-0.1μM이고 m2/q-i5에 대하여는 0.14+/-0.11μM이었다. 개똥벌레 루시퍼라제는 제조자(Promega)의 지시서대로 분석했다. 얻어진 데이타는 β-갈락토시다제와 같이, 개똥벌레 루시퍼라제도 리간드에 의한 무스카린 리셉터 활성화의 민감한 표지인자로서 작용할 수 있다는 것을 가리킨다.
[실시예 4]
[다른 리셉터의 자극]
여러 기능적 범주에 속하는 리셉터들을 상기 단일 리셉터 포멧의 일반프로토콜을 사용하여 성공적으로 분석해왔다. 그 결과는 하기 표 2에 보여진다.
이들 데이타는 광범위한 리셉터 및 관련 분자들이 우리의 증식분석법에 의해 분석될 수 있다는 것을 가리킨다. 모노아민, 아미노산, 펩티드 및 거대 호르몬을 포함하는 다양한 전달자(transmitter)에 대한 다양한 리셉터의 예들이 설명되어 있다.(무스카린 리셉터, Bonner et al., Science 237: 527, 1987: Bonner et al., Neuron 1: 403, 1988: 돕아민 D2 리셉터, Stormann et al., mol. pharm. 37: 1. 1990: 타치키닌 리셉터, Takeda et al., BBRC 179: 1232, 1991: Huang et al., BBRC 1984: 966, 1992: Gerard et al., JBC 265: 20455, 1990: 알파 1아드레날린 리셉터, Cottecchia et al., PNAS 85: 7159: 1988: Lomasney et al., JBC 266: 6365, 1991: 알파 2아드레날린 리셉터, Regan et al., PANS 85: 6301,1988: Lomasney et al., PANS 87: 5094, 1990: 엔도델린 리셉터, Arai et al., Nature 348: 730, 1990: Sakurai et al., Nature 348: 732, 1990: p53, Baker et al., Science 249: 912, 1990: G-단백질 돌연변이체, Voyno-Yasenetskaya et al., JBC 269: 4721).
다양한 신호전달(Signal transduction) 유형이 또한 설명된다:
G-단백질 연결 리셉터, 티로신키나제 연결리셉터, G-단백질 및 암유전자, 약간의 이러한 경우에는 포커스분석법이 예시된 리셉터들과의 리간드 상호작용을 분석하기 위해 사용되어 왔다.
많은 경우에 포커스 분석법이 측정가능한 응답을 얻지못한다는 것이 보여졌다(예를들면 Gq-i5를 갖는 m2 및 m4 무스카린 리셉터).
알파 아드레날린 리셉터의 약리학의 상세한 분석을 또한 표 3에 제공한다.
[실시예 5]
[m5 무스카린 리셉터의 임위적 돌연변이]
다수 리셉터 포멧의 유용성을 설명하기 위해, m5 리셉터를 G-단백질과의 연결에 관련된 리셉터 부위인, 5차 막통과 영역(TM5)에 인접한 3차 세포내 고리의 N-말단 20 아미노산 (N-i3)에 걸쳐 임의적으로 돌연변이 시켰다. 두개의 PCR산물은 첫번째 산물을 위한 역방향 프라이머(P2)가 전체 TM5 영역을 포함하며, 두번째 산물을 위한 정방향 프라이머(P3)가 돌연변이를 함유하는 전체 N-i3 영역을 포함하고, 4개 염기의 등가물 혼합물이 P3 프라이머의 합성도중 15%비율로 야생형 누클레오티드로 치환되도록 제조했다.
외곽프라이머(P1 및 P4)는 후속 클로닝를 위한 Apal 및 EcoRl 절단부위를 포함한다.
두개의 PCR 산물을 T4 DNA 중합효소로 처리하여 비접착 말단을 생성하고, 라이게이션시켜 콘카타머를 얻고, Apal 및 EcoRl으로 절단하여 임위적으로 돌연변이된(*)Ni3*Apal/EcoRl 삽입체를 만들었다.
삽입체를 pcD-m5의 Apal/EcoRl 단편내에 라이개이션시켜 한집단의 돌연변이 m5 리셉터 cDNA(pcD-m5-mi3*)를 얻었다. 전체 클로닝 전략은 제7도에 보여진다.
각각 다른 세트의 임위적 돌연변이를 갖는 리셉터의 cDNA 라이브러리를 NIH 3T3세포를 트랜스펙션시키기 위해 사용했다. 트랜스펙션은 10cm 플레이트당 450ng의 라이브러리 cDNA(675제조합체)로 수행했다.
NIH 3T3세포를 포시가 형성될때까지 100μM카르바콜의 존재하에 성장시켰다.
2-3주후에 눈으로 볼 수 있는 포시를 플레이트로부터 제거하고, 총 RNA를 추출한후, 플라이머로서 랜덤-헥사머를 사용하여 cDNA를 합성했다. 이들 cDNA주형을 PCR 프라이머로서 p4 및 p5를 사용하여 1.6kb단편을 증식하기 위해 사용했다.
p5는 전사되는 플라스미드 DNA서열에 상보적이거나, m5 리셉터 cDNA의 상류에 있다. 그래서 내성적 게놈 서열은 증식될 수 없었다. PCR산물은 프라이머로서 p1을 사용하는 사이클-시퀀싱 프로토콜에서의 Taq중합효소를 사용하여 직접 시퀀싱했다.
제8도 및 제9도에 도시된 바와같이, 많은 다른 돌연변이 리셉터들이 포시에서 동정되었다. 이들 데이타는 G-단백질-연결에 관련된 무스카린 리셉터의 부위의 가능성 있는 구조에 관한 예상을 허용했다. 기술적 레벨에서 이들 데이타는 적당한 농도의 리셉터 DNA가 사용되었을 때 단일 플라스미드 DNA가 NIH 3T3세포를 트랜스펙션하고, 리간드 카르바콜이 세포의 성장을 자극하여 포시들 형성하도록 허용할 수 있다는 것과 포시를 유도했던 돌연변이 리셉터가 DNA증식방법에 의해 동정될 수 있었다는 것을 가리킨다.
[실시예 6]
[β-가락토시다제의 증식에 의해 분석되는 m5 무스카린 리셉터의 임위적 돌연변이]
제7도에 기술된 것과 유사한 임위적 돌연변이를 사용하여, 우리는 리간드 결합 및 G-단백질 연결에 관련된 것으로 여겨지는 m5 리셉터의 부위내로 돌연변이를 도입하였다.
이들 돌연변이체를 분석하기위해 작은 규모 플라스미드 제조를 각 클론에 대해 만든다. 이것은 미니 Qiagen 음이온 교환 칼럼을 사용하여 수행한다. 이들 DNA제조는 단일 리셉터 포멧의 변형인 트랜스펙션 및 분석에 사용한다.
변형은 10cm 플레이트에 사용된 양으로부터 6웰 또는 24웰 플레이트의 각 웰에 적당한 양으로 NIH 3T3세포 수 및 DNA양의 비례적 규모축소를 포함한다. 24웰 플레이트에서 수행된 트렌스펙션의 경우에, 베타-갈 분석은 중간전달단계(예를들면 표준 단일 레셉터 포멧의 10cm플레이트 내지 96웰 플레이트전달, 제5도) 없이 트랜스펙션에 사용된 웰에서 직접 수행한다.
이들 방법을 사용하여 우리는 다양한 기능적 표현형에 대한 수백개의 클론을 스크리닝했다. 아고니스트에 응답할 수 있는 능력을 지닌 돌연변이 리셉터들 동정하기 위해, 우리는 고농도의 아고니스트로 스크리닝 한다. 리간드의 부재하에 높아진 활성을 갖는 돌연변이체를 동정하기 위해, 우리는 아고니스트의 부재 및/ 또는 길항제의 존재하에 돌연변이체를 스크리닝한다. 이방법에 의해 분리된 한가지 클론이 제13도에 도시된다. 야생형과 비교하여 이 클론은 리간드의 부재하에 상당히 높아진 응답을 가지며, 이 기본응답은 길항제에 의해 중단된다.
이들 데이타는 돌연변이 표현형을 갖는 리셉터의 동정을 위한 증식분석법의 유용성을 가리킨다.
[실시예 7]
[다중 리셉터포멧]
다중 리셉터 포멧의 한가지 배치가 제11도에 도시된다.
이 실시예에서 여러 가지 리셉터 cDNA를 NIH 3T3세포의 배양물내로 베타-갈 cDNA와 함께 공트랜스펙션시킨다.
리간드의 첨가후에 효과적인 리간드/리셉터 상호작용을 긍정적 베타-갈 응답에 의해 동정한다. 이 접근법의 실행가능성을 지지하는 데이타는 제15도에 도시되어 있다. 이들 실시예에서 엔도텔린 및 프로스테노이드 리셉터 DNA가 농도에서 실직적으로 감소되었을 때 전혀 신호의 손실이 없다. 다중 리셉터를 사용하는 실험적 데이타는 제16도에 도시된다. 이 실시예에서 무스카린, 아드레날린, 뉴로키닌, 에도텔린 및 프로스테노이드 리셉터 활성화로의 라간드 응답을 공트랜스펙션된 배양물에서 분석했다.
이 실험에서 과량의 불활성 리셉터 DNA를 10배 다중분석(동시에 분석되는 10리셉터)을 흉내내기 위해 사용했다.
[실시예 8]
[질병 유전자 분석 및 동정]
많은 질병이 리셉터 및/ 또는 관련신호전달 단백질에서의 돌연변이에 의해 유발된다.
가장 잘 특성화된 예는 암유전자이나, 다른 예들은 색소성망막염, 색맹 및 인슐린 의존성 또는 독립적 당뇨병과 관련된 유전자를 포함한다. 다른 예들은 당업계의 숙련자에 잘알려졌을 것이다. 가장 잘 특성화된 암유전자중의 하나가 작은 G-단백질 ras의 돌연변이 형이다.
제12도에 도시된 바와같이, 돌연변이 ras(V-ras)는 증식분석에서 상당한 응답을 매개할 수 있으나, 야생형 ras(c-ras)는 그렇지 않다. 표 2에 요약된 바와같이 p53 및 G-단백질 G12의 돌연변이형과 같은 다른 암유전자는 증식응답을 매개할 수 있다.
또한 실시예 6에 표시된 바와같이 아고니스트의 부재하에 활성인 m5 리셉터의 돌연변이 형을 증식분석에 의해 동정했다.
이들 데이타는 함께 증식분석법이 질병유전자의 분석 및 동정 둘다에 강력한 접근법이라는 것을 가리킨다.
질병유전자의 동정방법은 다음과 같다.
1) 주어진 질병으로 의심되는 리셉터의 암호와 부위를 PCR에 의해 증식한다. 증식은 질병을 갖는 개체 또는 개체의 집단을 사용하여 수행할 수 있다.
2) 리셉터를 리간드 부재하의 활성 및/ 또는 부적당한 리간드 감수성에 대해 증식분석법에 의해 시험한다. “부적당한 리간드 감수성”이란 돌연변이형이 야생형 보다 저농도의 리간드에 응답하는 것으로 기대될 수 있다는 것을 의미한다.
더욱이 돌연변이형의 높아진 활성은 예를들어 제13도에 보여진 바와같이 길항제에 의해 또한 중단 될 것이다. 분석은 실시예 6에서와 같이 한번에 한 개씩 수행될 수 있거나, 여러환자 DNA들이 실시예 7에 기술된 다중분석법을 사용하여 동시에 시험될 수 있다.
[실시예 9]
[키메라 리셉터의 분석]
증식분석에서 강한 응답을 매개하지 않는 많은 리셉터는 신호전달 통로에 대한 그것들의 선택성을 변화함으로써 응답을 매개하도록 설계될 수 있다. 제17도에 도시된 바와같이 기능적 응답을 매개하는 알파2아드레날린 리셉터의 능력은 알파1리셉터의 세 번째 고리를 삽입시킴으로써 크레 증식할 수 있다.
알파1리셉터가 Gq에 효율적으로 연결하는 반면, 알파2리셉터는 Gi에 더효율적으로 연결한다. 이 데이타 및 다른 것들에 제시된 바와같이 세번째 고리는 연결선택성의 주요 결정요소인 것으로 생각된다.

Claims (39)

  1. (a) 세포증식을 허용하는 조건하에서 리간드에 응답하여 세포증식에 영향을 줄 수 있는 리셉터를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션되고 세포증식의 표지인자를 함유하는 세포를, 리셉터의 잠재 아고니스트 또는 길항제인 시험물질과 함께 배양하는 단계와, (b) 세포증식을 허용하기에 충분한 시간후에 표지인자를 함유하지 않는 세포와 비교하여 표지인자를 함유하는 세포의 증식의 존재 또는 부존재를 결정하는 단계로 이루어진, 리간드로서 작용할 수 있는 물질을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포를 단일 리셉터를 암호화하는 DNA로 트렌스펙션시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, DNA는 티로신키나제리셉터, G-단백질 연결 리셉터, 티로신키나제 활성화 리셉터, 티로신포스파라제리셉터, 전사인자, 스테로이드리셉터, 암유전자 또는 리간드- 또는 전압-게이트 이온통로, 또는 한 리셉터의 리간드-결합부위와 다른 리셉터의 신호 전달 부위로 이루어진 키메라 리셉터를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 한 개 이상의 시험물질의 어떤 아고니스트 활성을 리셉터로 트랜스펙션되지 않은 세포의 백그라운드와 비교하여 트랜스펙션된 세포의 증식에 대한 리셉터의 향상된 효과에 의해 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 시험물질의 어떤 길항제 활성을 리셉터로 트렌스펙션되지 않은 세포의 백그라운드와 비교하여 트랜스펙션된 세포의 증식에 대한 리셉터의 효과의 저해에 의해 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 시험물질을 세포증식을 자극하는 리셉터의 아고니스트의 존재하에 트랜스펙션된 세포와 함께 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 표지인자는 트랜스펙션된 리셉터 DNA, 전사된 리셉터 mRNA, 효소, 결합단백질 또는 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 표지인자는 리셉터 DNA 또는 mRNA이고, 그것의 존재를 DNA증식 및/ 또는 혼성화 기술에 의해 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 표지인자는 포스파타제(산성 또는 알칼리성 포스파타제와 같은), β-갈락토시다제, 우레아제, 글루코스산화제, 탄소무수화제, 아세틸콜린에스테르화제, 글루코아밀라제, 말레이트탈수소화제, 글루코스-6-인산탈수소화제, β-글루코시다제, 프로테아제, 피루브산염 탈탄산화제, 에스테라제, 루시퍼라제, 알코올 탈수소화제, 또는 과산화제(고추냉이 과산화제와 같은)로 구성된 군으로부터 선택된 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 한항에 있어서, (a) 세포를 리셉터를 암호화하는 DNA로 그리고 표지인자효소들 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시키는 단계, (b) 트랜스펙션된 세포를 여러 동일 앨리컷으로 나누는 단계, (c) 각각의 앨리컷을 자극된 및 비-자극된 리셉터 사이를 구별하기에 충분한 시간동안 한 개 이상의 시험물질과 함께 배양하는 단계, 그리고 (d) 각각의 앨리컷에서 표시인자 효소활성을 측정함으로써 세포증식의 어떤 변화를 결정하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 세포를 두개 이상의 별개의 리셉터를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션 시켜서, 각각의 트랜스펙션된 세포가 개개의 리셉터를 발현하도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, DNA는 티로신키나제리셉터, G-단백질 연결 리셉터, 티로신키나제 활성화리셉터, 티로신포스파타제리셉터, 전사인자, 스테로이드리셉터, 암유전자 또는 리간드- 또는 전압-게이트 이온 통로, 또는 한 리셉터의 리간드- 결합부의와 다른 리셉터의 신호전달부위로 이루어진 키메라리셉터를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 한 개 이상의 시험물질이 어떤 아고니스트 활성을 리셉터로 트랜스펙션되지 않은 세포의 백그라운드와 비교하여 트랜스펙션된 세포의 증식에 대한 한 개 이상의 리셉터의 향상된 효과에 의해 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 한 개 이상의 시험물질의 어떤 길항제 활성을 리셉터로 트랜스펙션 되지 않는 세포의 백그라운드와 비교하여 트랜스펙션된 세포의 증식에 대한 한 개 이상의 리셉터의 효과의 저해에 의해 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 시험물질(들)을 세포증식을 자극하는 리셉터의 아고니스트의 존재하에 트랜스펙션된 세포와 함께 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 표지인자는 트랜스펙션된 리셉터 DNA, 전사된 리셉터 mRNA, 효소, 결합 단백질 또는 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 표지인자는 리셉터 DNA또는 mRNA이고, 그것의 존재를 DNA증식 및/ 또는 혼성화 기술에 의해 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 표시인자는 β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 개똥벌레 루시퍼라제, 알코올 탈수소화제로 구성된 군으로부터 선택된 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제11항에 있어서, 주어진 리셉터를 발현하는 세포는 또다른 리셉터로 트렌스펙션된 세포에 의해 발현되는 표지인자로부터 구별될 수 있는 표지인자를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제11항 내지 제19항중 어느 한항에 있어서, (a) 세포를 두개 이상의 별개의 리셉터를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시켜 트랜스펙션된 세포가 개개의 리셉터를 발현하도록 하고, 표지인자 효소를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시키는 단계, (b) 트랜스펙션된 세포를 여러 동일 앨리컷으로 나누는 단계, (c) 각각의 앨리컷을 자극된 및 비-자극된 리셉터 사이를 구별하기에 충분한 시간동안 한 개 이상의 시험물질과 함께 배양하는 단계, (d) 각각의 앨리컷에서 표시인자 효소활성을 측정함으로써 세포증식의 어떤 변화를 결정하고, 세포증식을 바꾸는 리간드의 능력에 의해 활성화리간드를 동정하는 단계, 그리고 (e) 각각의 리셉터를 제10항의 단계(a)-(d)에 따른 방법에 따르게 함으로써 어떤 리셉터가 리간드에 의해 활성화되는지를 동정하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제11항 내지 제19항중 어느 항에 있어서, (a) 세포를 두개 이상의 별개의 리셉터를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시켜 트랜스펙션된 세포가 개개의 리셉터를 발현하도록 하고, 표지인자 효소를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시키는 단계, (b) 트랜스펙션된 세포를 여러 동일 앨리컷으로 나누는 단계, (c) 각각의 앨리컷을 자극된 및 비-자극된 리셉터 사이를 구별하기에 충분한 시간동안 한 개 이상의 시험물질과 함께 배양하는 단계, (d) 각각의 앨리컷에서 표시인자 효소활성을 측정함으로써 세포증식의 어떤 변화를 결정하고, 세포증식을 바꾸는 리간드의 능력에 의해 활성화리간드를 동정하는 단계, 그리고 (e) DNA증식 및/ 또는 혼성화 기술에 의해 리셉터 DNA 및/또는 mRNA를 분석함으로써 어떤 리셉터가 리간드에 의해 활성화되는지를 동정하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제11항 내지 제19항중 어느 한항에 있어서, (a) 세포를 두개 이상의 별개의 리셉터를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시켜 트랜스펙션된 세포가 개개의 리셉터를 발현하도록 하고, 두개 이상의 표지인자효소를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시켜 주어진 리셉터를 발현하는 세포가 또다른 리셉터로 트랜스펙션된 세포에 의해 발현된 표지인자로부터 구별될 수 있는 표지인자를 발현하도록 하는 단계, (b) 트랜스펙션된 세포를 여러 동일 앨리컷으로 나누는 단계, (c) 각각의 앨리컷을 자극된 및 비-자극된 리셉터 사이를 구별하기에 충분한 시간동안 한 개 이상의 시험물질과 함께 배양하는 단계, (d) 각각의 앨리컷에서 표시인자 효소활성을 측정함으로써 세포증식의 어떤 변화를 결정하고, 세포증식을 바꾸는 리간드의 능력에 의해 활성화리간드를 동정하는 단계, 그리고 (e) 각각의 표지인자 효소에 대한 기질을 첨가한후 분석함으로써 어떤 리셉터가 리간드에 의해 활성화되는지를 동정하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  23. (a) 리간드에 응답하여 세포증식에 영향을 줄 수 있는 리셉터를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션되고, 세포증식의 표지인자를 함유하는 냉동세포, (b) 세포의 성장을 위한 배지, (c) 표지인자의 존재 및 양을 검출하기 위한 시약으로 이루어진, 리간드로서 작용할 수 있는 물질을 검출하기 위한 시험키트.
  24. 제23항에 있어서, DNA는 티로신키나제리셉터, G-단백질 연결 리셉터, 티로신키나제 활성화 리셉터, 티로신포스파타제리셉터, 전사인자, 스테로이드리셉터, 암유전자 또는 리간드- 또는 전압-게이트 이온 통로, 또는 한 리셉터의 리간드- 결합부위와 다른 리셉터의 신호전달부위로 이루어진 키메라리셉터를 암호화하는 것을 특징으로 하는 시험키트.
  25. 제23항에 있어서, 세포증식을 자극하는 리셉터의 아고니스트들 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시험키트.
  26. 제23항에 있어서, 표지인자는 트랜스펙션된 리셉터 DNA, 전사된 리셉터 mRNA, 효소, 결합 단백질 또는 항원인 것을 특징으로 하는 시험키트.
  27. 제26항에 있어서, 표지인자는 포스파타제(산성 또는 알칼리성 포스파타제와 같은), β-갈락토시다제, 우레아제, 글루코스산화제, 탄소무수화제, 아세틸콜린에스테르화제, 글루코아밀라제, 말레이트탈수소화제, 글루코스-6-인산탈수소화제, β-글루코시다제, 프로테아제, 피루브산염 탈탄산화제, 에스테라제, 루시퍼라제, 알코올 탈수소화제, 또는 과산화제(양고추냉이 과산화제와 같은)로 구성된 군으로부터 선택된 효소인 것을 특징으로 하는 시험키트.
  28. 제27항에 있어서, 표지인자는 존재 및 양을 검출하기 위한 시약은 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드, 클로로나프톨, o-페닐렌다아민, 3-(p-수산화페닐)프로피온산, 루미놀, 인독실포스페이트, p-니트로페닐포스페이트, 니트로페닐갈락토스, 4-메틸움벨리페릴-D-갈락토피라노시드, H2O2/테트라메틸벤지딘 또는 루시퍼린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시험키트.
  29. (a) 리간드에 응답하여 세포증식에 영향을 줄 수 있는 첫번째 리셉터를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션되고, 세포증식의 표지인자를 함유하는 냉동세포, (b) 리간드에 응답하여 세포증식에 영향을 줄 수 있는 두번째 리셉터(첫번째 리셉터와는 별개의 것임)을 암호화하는 DNA로 트랜스펙션되고, 세포증식의 표지인자를 함유하는 냉동세포, (c) 세포의 성장을 위한 배지, (d) 표지인자의 존재 및 양을 검출하기 위한 시약으로 이루어진, 리간드로서 작용할 수 있는 물질을 검출하기 위한 시험키트.
  30. 제29항에 있어서, 또다른 개개의 리셉터(각각의 후속 리셉터는 각각의 선행 리셉터와는 별개의 것임)를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션된 냉동세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시험키트.
  31. 제29항에 있어서, 세포를 두개 이상의 표지인자를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시켜 주어진 리셉터를 발현하는 세포가 또다른 리셉터로 트랜스펙션된 세포에 의해 발현되는 표지인자로부터 구별될 수 있는 표지인자를 발현하도록 하고, 각각의 표지인자를 검출하기 위한 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시험키트.
  32. 제29항에 있어서, DNA는 티로신키나제리셉터, G-단백질 연결 리셉터, 티로신키나제 활성화 리셉터, 티로신포스파타제리셉터, 전사인자, 스테로이드리셉터, 암유전자 또는 리간드- 또는 전압-게이트 이온 통로, 또는 한 리셉터의 리간드- 결합부위와 다른 리셉터의 신호전달부위로 이루어진 키메라리셉터를 암호화하는 것을 특징으로 하는 시험키트.
  33. 제29항에 있어서, 세포증식을 자극하는 리셉터의 아고니스트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시험키트.
  34. 제29항에 있어서, 표지인자는 트랜스펙션된 리셉터 DNA, 전사된 리셉터 mRNA, 효소, 결합 단백질 또는 항원인 것을 특징으로 하는 시험키트.
  35. 제29항에 있어서, 표지인자는 포스파타제(산성 또는 알칼리성 포스파타제와 같은), β-갈락토시다제, 우레아제, 글루코스산화제, 탄소무수화제, 아세틸콜린에스테르화제, 글루코아밀라제, 말레이트탈수소화제, 글루코스-6-인산탈수소화제, β-글루코시다제, 프로테아제, 피루브산염 탈탄산화제, 에스테라제, 루시퍼라제, 알코올 탈수소화제, 또는 과산화제(양고추냉이 과산화제와 같은)로 구성된 군으로부터 선택된 효소인 것을 특징으로 하는 시험키트.
  36. 제35항에 있어서, 표지인자의 존재 및 양을 검출하기 위한 시약은 o-니트로 페닐-β-D-갈락토피라노시드, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드, 클로로나프톨, o-페닐렌디아민, 3-(p-수산화페닐) 프로피온산, 루미놀, 인톡실포스페이트, p-니트로페닐포스페이트, 니트로페닐갈락토스, 4-메틸움벨리페틸-D-갈락토피라노시드, H2O2/테트라메틸벤지딘 또는 루시퍼틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 시험키트.
  37. (a) 세포증식을 허용하는 조건하에서 유전자의 돌연변이형에 대한 암호화 부위를 함유하는 것으로 기대되는 DNA로 트랜스펙션되고 세포증식의 표지인자를 함유하는 세포를, 리간드의 부재하에 또는 부적당한 양의 리간드의 존재하에 배양하는 단계와, (b) 세포증식을 허용하기에 충분한 시간후에 표지인자를 함유하지 않는 세포와 비교하여 표지인자를 함유하는 세포의 증식의 존재 또는 부재를 결정하는 단계로 이루어진, 리간드의 부재하에 세포증식을 매개할 수없는 야생형 유전자의 돌연변이형을 검출하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 돌연변이형이 질병상태와 관련된 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 돌연변이형이 암유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
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