EA003423B1 - Штамм трансгенных растительных клеток и трансгенное растение, содержащие кассету экспрессии полипептида-мишени usp рецептора, способы получения их потомства, способы регулирования экспрессии полипептида-мишени в указанном растении с помощью ювенильного гормона или его агонистов, способы выявления и получения лиганда для полипептида usp рецептора и соответствующий лиганд - Google Patents

Abstract

Описан способ регулирования экспрессии гена в растениях. В частности способ включает трансформацию растения с помощью кассеты экспрессии рецептора USP, кодирующей полипептид рецептора USP, и, по крайней мере, одной кассеты экспрессии мишени, кодирующей полипептид-мишень. Контактирование трансформированного растения с ювенильным гормоном или одним из его агонистов активирует экспрессию полипептида-мишени в присутствии полипептида рецептора USP. Необязательно могут применяться дополнительные "вспомогательные" кассеты экспрессии рецептора, причем такая вспомогательная кассета экспрессии рецептора кодирует полипептид рецептора, отличный от USP. Способ пригоден для регулирования различных агрономически важных признаков, таких как фертильность растений. Также описан способ выявления ранее неизвестных лигандов для USP. Подлежащие тестированию соединения выявляют путем контактирования с растительными клетками, трансформированными с помощью кассеты экспрессии рецептора USP и кассеты экспрессии мишени. Кассета экспрессии мишени кодирует репортерный полипептид, экспрессия которого может быть определена качественно или количественно, посредством чего выявляют, является ли тестируемое соединение лигандом для USP.

Description

Настоящее изобретение относится к химическому регулированию экспрессии гена в растениях. В частности оно относится к способу, в котором ювенильный гормон или один из его агонистов применяют в качестве химического лиганда для регулирования опосредуемой рецептором экспрессии полипептида-мишени в растительной клетке, а также к трансгенным растительным клеткам, растительному материалу или растениям и их потомству, которые содержат соответствующие кассеты экспрессии.

В некоторых случаях необходимо регулировать время или уровень проявления фенотипического признака в растениях, растительных клетках или ткани растения. В идеальном случае было бы желательно регулировать проявление такого признака, вызывая его химическим соединением, которое можно легко наносить на сельскохозяйственные культуры, декоративные кустарники и т.д. Одной из таких систем регулирования экспрессии гена, которая может применяться для осуществления этого идеального варианта и в отношении которой до сих пор неизвестно, присутствует ли она в естественных условиях в растениях, является суперсемейство ядерных рецепторов стероидного и тироидного гормонов. Суперсемейство ядерных рецепторов стероидного и тироидного гормонов обнаружено у млекопитающих и насекомых, и оно состоит из более чем 100 известных протеинов. Некоторые из рецепторов этого суперсемейства, которые обнаружены у млекопитающих, представляют собой рецептор ретиноевой кислоты (ВАВ), рецептор витамина Ό (УЭВ). рецептор тироидного гормона (Т₃В) и ретиноевый Хрецептор (ВХВ). Эти и другие рецепторы суперсемейства связываются с 5'-регуляторной областью гена-мишени и в результате связывания химического лиганда с рецептором трансактивируют экспрессию гена-мишени.

Кроме описанных выше рецепторов, обнаруженных у млекопитающих, рецепторы аналогичной структуры и активности были выявлены у насекомых рода ЭгокорНба (Кое11е и др.. Се11 67: 59 (1991); Сйпкбапкоп и КаГаЮк, Вюсйет. Вюрйук. Век. Сотт. 193: 1318 (1993); Неписй и др., №.1с1е1с Ас1бк Век. 18: 4143 (1990)). Рецептор экдизона (ЕсВ) связывает стероидный гормон насекомых 20-гидроксиэкдизон и при гетеродимеризации с продуктом гена ИИтакрпаск (И8Р) трансактивирует экспрессию гена. Помимо 20-гидроксиэкдизона другие химические лиганды, такие как агонисты гормонов, также связываются с ЕсВ в аналогичных условиях и вызывают трансактивацию гена-мишени.

Было также установлено, что И8Р является представителем суперсемейства ядерных рецепторов стероидного и тироидного гормонов, хотя он рассматривается как сиротский рецептор, поскольку к настоящему времени не выявлен его лиганд (8еадтауек, Се11 67: 225-228 (1991)). И8Р имеет сходную с ВХВа последователь ность (Ого и др., ЫаШге, 347: 298-301 (1990)), а ВХВ обладает способностью образовывать гетеродимеры с ЕсВ (Тйотак и др., ЫаШге, 362: 471-475 (1993)). Было установлено, что метопрен и его производное - метопреновая кислота, которые являются агонистами ювенильного гормона, в результате транскрипции приобретают способность активировать рекомбинантный репортерный ген как в клетках насекомых, так и млекопитающих, действуя через ВХВа (Нагтоп и др., Ргос. №111. Асаб. 8сь 92: 61576160 (1995)). Однако ювенильный гормон не индуцирует трансактивацию, опосредуемую ВХВа (Нагт и др.). В настоящее время отсутствует четкое доказательство существования ядерного рецептора ювенильного гормона (Нагтоп и др.; Нештсй и Вготеп, !пкес( Вюсйет. Мо1ес. Вю1. 25: 881-897 (1995)), хотя и высказано предположение, что сиротский рецептор И8Р может являться таковым (Нагтоп и др.; см. также у 8еадтауек; Ого и др.. Сштеп! Ор1пюп ίπ Сепебск апб Эеуе1ортеп1 2: 269-274 (1992)).

Ювенильный гормон и его агонисты открывают ранее неизвестные возможности химического регулирования экспрессии генов в растениях, поскольку для этих химических соединений уже известно применение в сельском хозяйстве. Однако в настоящее время отсутствуют способы, посредством которых эти химические соединения могут применяться для индукции трансактивации гена-мишени в трансгенном растении. Согласно настоящему изобретению было установлено, что ювенильный гормон и его агонисты являются лигандами для сиротского рецептора И8Р. Открытие этого факта позволяет использовать стратегии регулирования генов для растений, основанные на применении ядерного рецептора, который не встречается в растениях в естественных условиях. Это означает, что единственным эффектом применения ювенильного гормона или одного из его агонистов будет индукция экспрессии сконструированного генетическим путем генамишени. Согласно настоящему изобретению были разработаны полипептиды рецептора И8Р и кодирующие их экспрессируемые в растении гены, функция которых в растительных клетках состоит в регулировании экспрессии полипептида-мишени, причем полипептид рецептора И8Р активирует 5'-регуляторную область кассеты экспрессии мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. Такой способ регулирования экспрессии генов в растениях может использоваться для регулирования различных агрономически важных признаков, таких как фертильность растения.

Настоящее изобретение относится к способу регулирования экспрессии генов в растениях. В частности этот способ включает трансформацию растения с помощью кассеты экспрессии рецептора И8Р, которая кодирует по3 липептид рецептора И8Р, по крайней мере, с помощью одной кассеты экспрессии мишени, которая кодирует полипептид-мишень, и необязательно с помощью вспомогательной кассеты экспрессии рецептора, кодирующей вспомогательный полипептид рецептора, отличный от полипептида рецептора И8Р. При контакте трансформированного растения с ювенильным гормоном или с одним из его агонистов происходит активация или ингибирование экспрессии полипептида-мишени в присутствии полипептида рецептора И8Р. Необязательно могут применяться дополнительные вспомогательные кассеты экспрессии рецептора, причем такая вспомогательная кассета экспрессии рецептора кодирует полипептид рецептора, отличный от И8Р. Способ пригоден для регулирования различных агрономически важных признаков, таких как фертильность растения.

Кроме того, изобретение относится к трансгенным растениям, содержащим кассету экспрессии рецептора И8Р и кассету экспрессии мишени, способную к активации ювенильным гормоном или одним из его агонистов. Изобретение также включает способ выявления ранее неизвестных лигандов для И8Р, которые обладают эффективностью в окружающей среде, представляющей собой растительные клетки. Тестируемые химические соединения оценивают путем их контактирования с растительными клетками, трансформированными с помощью кассеты экспрессии рецептора И8Р и кассеты экспрессии мишени. Кассета экспрессии мишени кодирует репортерный полипептид, экспрессия которого может быть оценена количественно или качественно, в результате чего определяют, является ли тестируемое соединение лигандом для И8Р.

На фиг. 1 представлено схематическое изображение растительной клетки, содержащей кассету экспрессии рецептора УР16-И8Р и кассету экспрессии мишени, имеющую в 5'регуляторной области прямой повтор реагирующего элемента (гекропкс с1сшсп1). В присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов рецептор УР16-И8Р активирует экспрессию полипептида-мишени.

На фиг. 2 представлено схематическое изображение растительной клетки, содержащей кассету экспрессии как рецептора И8Р-УР16, так и ОАЬ4-ЕсВ. При воздействии ювенильного гормона или одного из его агонистов происходит реверсия активации экспрессии полипептида-мишени, вызванная комбинацией рецепторных полипептидов ОАЬ4-ЕсВ и И8Р-УР16.

Фиг. 3 соответствует фиг. 2 за исключением того, что присутствует химический лиганд тебуфенозид (также известный как ВН 5992). В присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов в этих условиях также происходит реверсия активации экспрессии.

Понятие ювенильный гормон относится к классу химических соединений, которые продуцируются насекомыми. Ювенильный гормон контролирует метаморфоз личинок, приводя к сохранению у насекомого ювенильных характеристик и в результате этого к предотвращению созревания. Биологическое действие ювенильного гормона проявляется в поведенческих, биохимических или молекулярных реакциях. Было выделено и охарактеризовано несколько встречающихся в естественных условиях ювенильных гормонов. Понятие агонисты ювенильного гормона относится к классу соединений, которые обладают одной или несколькими биологическими активностями ювенильного гормона. Агонисты ювенильного гормона могут быть структурными аналогами ювенильного гормона, но могут и не являться таковыми. Под это понятие также подпадают такие соединения, которые могут быть метаболическими предшественниками соединения, которое непосредственно вызывает вышеуказанные биологические эффекты, подобные таковым, характерным для ювенильного гормона. Например, метопрен является метаболическим предшественником метопреновой кислоты, которая в свою очередь непосредственно вызывает биологические эффекты, подобные таковым, характерным для ювенильного гормона, которые наблюдаются при применении метопрена.

Понятие полипептид рецептора в контексте настоящего описания относится к полипептидам, которые могут либо активировать, либо ингибировать экспрессию полипептидамишени в ответ на применяемый химический лиганд. Полипептид рецептора включает лигандсвязывающий домен, ДНК-связывающий домен и трансактивирующий домен. Лигандсвязывающий домен включает последовательность аминокислот, которая нековалентно связывает комплементарный химический лиганд. Таким образом, лигандсвязывающий домен и его химический лиганд образуют комплементарно связанную пару. ДНК-связывающий домен включает последовательность аминокислот, которая нековалентно связывает специфическую нуклеотидную последовательность, известную как реагирующий элемент (ВЕ). Один или несколько реагирующих элементов локализованы в 5'-регуляторной области кассеты экспрессии мишени. Каждый ВЕ включает пару полусайтов, каждый из которых имеет состоящее из 5-6 пар оснований ядро, в котором отдельный ДНК-связывающий домен распознает отдельный полусайт. Полусайты могут быть расположены в близкой к линейной ориентации по отношению друг к другу в виде прямых повторов, палиндромных повторов или инвертированных повторов. Нуклеотидная последовательность, пространственное размещение и линейная ориентация полусайтов определяют, какой ДНК-связывающий домен или домены бу5 дут образовывать комплементарно связанную пару с реагирующим элементом. Трансактивирующий домен включает одну или несколько последовательностей аминокислот, действующих в качестве субдоменов, которые влияют на функцию факторов транскрипции во время периода, предшествующего инициации, и объединены в ТАТА-боксе (боксе Хогнесса). Роль трансактивирующего домена заключается в том, что он позволяет осуществлять повторные случаи инициации транскрипции, приводя к увеличению уровней экспрессии гена.

Кассета экспрессии рецептора включает нуклеотидную последовательность для 5'регуляторной области, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид рецептора, и нетранслируемую 3'-терминирующую область (стоп-кодон и полиаденилирующую последовательность). 5'-Регуляторная область способна обеспечивать экспрессию в растениях.

Понятие υδΡ относится к рецептору υΐ1гакр1гас1с. обнаруженному в Эго^орЕйа. Он также известен как ХК2С, и этот рецептор был выделен и клонирован, а его лигандсвязывающий домен был идентифицирован на основе гомологии последовательности с известными лигандсвязывающими доменами (Неппсй и др., №.1с1с1с Ас1й§ Яекеатсй 18: 4143-4148 (1990)), хотя в настоящее время пока неизвестны химический лиганд или лиганды, которые связываются с ним. Обозначение υδΡ в контексте настоящего описания относится к нативным формам рецептора, а также к его мутантным или химерным формам. Они включают, но не ограничены ими, мутантные или химерные формы, представленные в данном описании, а также химерные формы υδΡ, которые, по крайней мере, включают лигандсвязывающий домен нативного υδΡ и его мутанты. В соответствии с настоящим изобретением одновременно может применяться более одной формы υδΡ.

Вспомогательная кассета экспрессии рецептора включает нуклеотидную последовательность для 5'-регуляторной области, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид рецептора, отличный от υδΡ, функционально связанный с 3'-терминирующей областью. Вспомогательная кассета экспрессии рецептора включает ЕсЯ. ЯХЯ. ΌΗΚ38 (КаГа1О8 и др., Ргос. Ыа11. Асай. δ^. 92: 7966-7970 (1995)), а также их мутантные и химерные формы, но не ограничена ими.

Понятие фрагмент относится к части полипептида рецептора, полученной из указанного источника. Например, υδΡ-фрагмент относится к такой части полипептида рецептора, которая получена из нативного рецептора υΐΐπίδρίπιс1е. В контексте настоящего описания фрагмент может включать один или несколько доменов и, по крайней мере, включать лигандсвязывающий домен рецептора, от которого фрагмент получает свое название.

Понятие химерный используют для обозначения того, что полипептид рецептора включает домены, по крайней мере, один из которых имеет происхождение, гетерологичное по отношению к другим присутствующим доменам. Гетерологичный означает, что один или несколько доменов, присутствующих в полипептиде рецептора, отличаются по их естественному происхождению от других присутствующих доменов. Например, если трансактивирующий домен протеина νΡ16 герпеса простого функционально связывают с υδΡ-рецептором ΌτοκοрЫ1а, то трансактивирующий домен νΡ16 является гетерологичным по отношению к υδΡфрагменту. Кроме того, если домен из υδΡ функционально связывают с доменом из ЯХЯ для создания функционального рецептора, то химерный гибрид будет иметь домены, гетерологичные по отношению друг к другу. Эти химерные рецепторные полипептиды кодируются нуклеотидными последовательностями, которые были функционально связаны, что приводит к получению кодирующей последовательности, которая не встречается в естественных условиях. Химерные рецепторные полипептиды по настоящему изобретению обозначают в соответствии с линейной номенклатурой в направлении от Ν-концевой к С-концевой части полипептида. В соответствии с этой номенклатурой химерный рецепторный полипептид, имеющий трансактивирующий домен из νΡ16, добавленный к Ν-концевой области υδΡ-рецептора, обозначают как νΡ16-υδΡ. И наоборот, если νΡ16 добавлен к С-концевой области υδΡ-рецептора, то химерный рецепторный полипептид обозначают как υδΡ-νΡ16.

Генные конструкции обозначают на основе 5'-регуляторной области и функционально связанной с ней кодирующей последовательности, причем обозначение 5'-регуляторной области помещают перед значком дроби (/), а обозначение кодирующей последовательности помещают после этого знака. Например, генная конструкция 35δ/υδΡ-νΡ16 обозначает промотор 35δ вируса мозаики цветной капусты, функционально связанный с последовательностью ДНК, кодирующей химерный рецептор υδΡ-νΡ16, в котором трансактивирующий домен νΡ16 был добавлен к С-концевой области υδΡ. Когда ссылка делается на полипептид рецептора, то промотор не обозначают. Например, вышеуказанная генная конструкция кодирует полипептид υδΡ-νΡ16.

Кассета экспрессии мишени включает нуклеотидную последовательность для 5'регуляторной области, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид-мишень, экспрессия которого либо активируется, либо ингибируется рецепторными полипептидами в присутствии химического лиганда. 5'-Регуляторная область гена-мишени включает коровую промоторную последовательность, последовательность инициации транскрипции и реагирующий элемент или реагирующие элементы, необходимые для комплементарного связывания рецепторных полипептидов. 5'-Регуляторная область способна обеспечивать экспрессию в растениях. Кассета экспрессии мишени также несет 3'терминирующую область (стоп-кодон и полиаденилирующую последовательность).

Известны ювенильные гормоны I, II, III и О в качестве замещенного варианта I (см., например, РипбашеЩаИ о Г ^зес! Рйу8ю1о§у, М.8. В1ит (ред.), 1оКп АИеу & 8опз, Ые^ Уогк, 1985). Ювенильный гормон I имеет формулу метил-10,11-эпокси-7-этил-3,11-диметил-транс2,6-тридекадиеноат. Строение ювенильного гормона I приведено ниже.

Агонисты ювенильного гормона представляют собой соединения, которые обладают одной или несколькими биологическими активностями ювенильного гормона. Обладающие этим свойством соединения, которые имеют структурное сходство с ювенильным гормоном, включают кинопрен, метопрен, гидропрен и метопреновую кислоту, но не ограничены ими. Строение кинопрена в качестве примера одного из этих агонистов ювенильного гормона приведено ниже.

Также известны агонисты ювенильного гормона, структура которых не является сходной с таковой ювенильного гормона. Такие соединения включают полициклическое неизопреноидное соединение феноксикарб, который является хорошо известным агонистом ювенильного гормона, но не ограничены этим соединением. Феноксикарб имеет формулу этил[2-(4-феноксифенокси)этил] карбамат. Строение феноксикарба приведено ниже.

Другим агонистом ювенильного гормона, пригодным в соответствии с изобретением, является диофенолан, соединение, представляющее собой дифениловый эфир. Диофенолан имеет формулу фениловый эфир 4-(2-этил-1,3диоксолан-4-илметокси)фенила. Известно, что это соединение обладает активностью ювенильного гормона и вероятно функционирует аналогично таким соединениям, как феноксикарб или метопрен.

Применение агонистов ювенильного гормона по настоящему изобретению обладает рядом преимуществ. Во-первых, соединения являются синтетическими и легко доступными. Во-вторых, преимуществом многих из этих соединений является то, что они уже были оценены в сельскохозяйственном производстве, что делает эти соединения готовыми к применению на сельскохозяйственных культурах в полевых условиях.

Настоящее изобретение основано на том неожиданно обнаруженном факте, что ювенильный гормон или один из его агонистов действует в качестве химического лиганда для рецептора И8Р. Ранее неизвестный химический лиганд для рецептора И8Р был использован согласно изобретению в сочетании с экспрессируемыми в растении кассетами экспрессии рецептора И8Р и соответствующими кассетами экспрессии мишени для создания нового способа регулирования экспрессии генов в растениях.

Было обнаружено, что многие регуляторы роста насекомых ингибируют линьку насекомых и вероятно воздействуют непосредственно на рецепторы, участвующие в инициации линьки. Такие регуляторы роста насекомых включают трифлумурон (1-(2-хлорбензоил)-3-(4-трифторметоксифенил)мочевина), гексамфлумурон (1[3,5-дихлор-4-(1,1,2,2,-тетрафторэтокси)фенил]3-(2,6-дифторбензоил)мочевина), тефлубензурон (1-(3,5-дихлор-2,4-дифторфенил)-3-(2,6дифторбензоил)мочевина), флуфеноксурон (1[4-(2-хлор-а,а,а-трифтор-паратолилокси)-2-фторфенил]-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина), флуциклоксурон (1 - [а-(4-хлор- α- циклопропилбензилиденаминоокси)-паратолил]-3-(2,6-дифторбензоил) мочевина) и луфенурон (1-[2,5-дихлор-4-(1,1,2, 3,3,3-гексафторпропокси)фе-нил]-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина), но не ограничены ими. В соответствии с настоящим изобретением также могут использоваться дополнительные инсектициды из класса бензоилфенилмочевин, которые включают, но не ограничены ими, дифлубензурон и хлорфлузурон.

Ретиноевая кислота или ее производные также могут использоваться в качестве лиганда для регулирования экспрессии гена в трансгенных растениях.

Было установлено, что ретиноевая кислота обладает способностью активировать гетерологично экспрессируемый продукт гена И8Р в культивируемых линиях клеток млекопитающих (Нагтоп и др.). Следовательно, рецепторы насекомых могут регулироваться при воздействии производных ретиноевой кислоты на трансгенные растения, несущие соответствующую комбинацию рецептора(ов) и конструкций генамишени, как описано ниже.

Естественные источники также могут действовать в качестве лигандов для рецепторов насекомых, экспрессируемых в трансгенных растениях, таких как трансгенная кукуруза или пшеница. Известен целый ряд растений, обладающих способностью синтезировать соединения, которые либо усиливают, либо ингибируют линьку насекомых. Например, один из наиболее активных экдистероидов - муристерон выделен из источников растительного происхождения. Известно много семейств растений, обладающих либо экдистероидной активностью, либо активностью ювенильного гормона.

Антагонисты ювенильного гормона также могут служить в качестве лигандов для регулирования экспрессии генов в трансгенных растениях. Примерами таких лигандов являются этил-4-[2-трет-бутилкарбоксилокси]бензоат; бистиокарбамат, 5 -метокси-6-[1-(4-метоксифенил)этил]-1,3-бензодиоксол или этил-Е-3-метил2-додеценоат. Такие лиганды-антагонисты могут служить для активации низкого основного уровня экспрессии трансгенов или для ингибрования высокого основного уровня экспрессии в гетерологичной растительной системе, экспрессирующей модифицированный(ые) рецептор(ы) насекомых.

Способ по настоящему изобретению включает трансформацию растительной клетки или растения с помощью кассеты экспрессии рецептора И8Р и кассеты экспрессии мишени. При экспрессии в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов полипептид рецептора И8Р в полученных растительных клетках, растениях или их потомстве активирует 5'-регуляторную область кассеты экспрессии мишени в трансгенных клетках или растениях (фиг. 1). Ювенильный гормон или один из его агонистов, для которых характерно связывание с лигандсвязывающим доменом И8Р, являются частью настоящего изобретения.

Регулирование экспрессии кассеты экспрессии мишени также может быть достигнуто необязательно путем экспрессии в растении дополнительного вспомогательного полипептида или полипептидов рецептора, отличного от И8Р (фиг. 2 и 3). Примеры дополнительных вспомогательных полипептидов рецепторов согласно изобретению включают ЕсК, КХК, ΌΗΚ38 (КаГаЮ5 и др., Ргос. Асаб. 8сг 92: 7966-7970 (1995)), а также их мутантные и химерные формы, но не ограничены ими. Применение этих рецепторов для опосредования индуцированной лигандом трансактивации описано в международной заявке РСТ/ЕР 96/00686, поданной 19 февраля 1996, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Лигандсвязывающий домен полипептида рецептора И8Р позволяет осуществлять химическое регулирование активации 5'-регуляторной области кассеты экспрессии мишени посредством ювенильного гормона или одного из его агонистов. И8Р аналогичен стероидному рецептору КХКа, химическим лигандом для которого является 9-цисретиноевая кислота. Также уста новлено, что И8Р образует гетеродимеры с полипептидом рецептора ЕсК. и регулирует экспрессию полипептида-мишени в трансформированных клетках почки мыши в ответ на применение гормона насекомых экдизона, который связывается с ЕсК и не является родственным ювенильному гормону и его агонистам (\νϋ 94/01558). Согласно изобретению было установлено, что рецептор И8Р и его лигандсвязывающий домен являются наиболее пригодными для регулирования экспрессии полипептидамишени в ответ на воздействие ювенильного гормона или одного из его агонистов в растениях, что описано ниже в примерах.

Химерные формы полипептидов рецептора И8Р также могут применяться в соответствии с настоящим изобретением для активации экспрессии полипептида-мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. В качестве гетерологичного источника могут быть выбраны либо ДНК-связывающий домен, либо трансактивирующий домен химерного полипептида рецептора И8Р на основе данных об их эффективности в отношении трансактивации или связывания ДНК. Эти домены химерного полипептида рецептора могут быть получены из любого организма, такого как растения, насекомые и млекопитающие, который имеет сходные функции регуляции транскрипции. В одном из вариантов осуществления изобретения эти домены выбирают из других представителей суперсемейства ядерных рецепторов стероидного и тироидного гормонов. Преимуществом применения химерных полипептидов рецептора является объединение доменов из различных источников. Преимуществом химерных полипептидов рецептора И8Р согласно настоящему описанию является объединение оптимальной трансактивирующей активности или измененного связывания КЕ или распознавания специфического реагирующего элемента с ювенильным гормоном или одного из его агонистов в качестве лиганда. Таким образом, химерный полипептид может быть сконструирован таким образом, чтобы специально адаптировать его для конкретной цели. Такие химерные полипептиды рецептора также обладают улучшенной функциональной активностью в гетерологичной окружающей среде, представляющей собой растительную клетку.

Согласно настоящему изобретению трансактивирующий, лигандсвязывающий и ДНКсвязывающий домены могут быть объединены в виде химерного полипептида рецептора в любом функциональном расположении. Например, если один субдомен трансактивирующего домена расположен на Ν-концевой части встречающегося в естественных условиях рецептора, то химерный рецепторный полипептид по настоящему изобретению может включать трансактивирующий субдомен на С-конце вместо или в дополнение к субдомену на Ν-конце. Химерные рецепторные полипептиды, как описано ниже, также могут иметь множественные домены такого же типа, например, более одного трансактивирующего домена (или два субдомена) на один полипептид рецептора.

Так, один из вариантов осуществления изобретения относится к полипептиду рецептора И8Р, который активирует экспрессию полипептида-мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов и который также обладает улучшенными характеристиками в отношении трансактивации. Трансактивирующие домены могут быть определены как аминокислотные последовательности, которые усиливают инициацию продуктивной транскрипции с помощью РНК-полимераз (см. обзор Р1акйие, №11иге. 335: 683-689 (1988)). Известно, что различные трансактивирующие домены обладают различной эффективностью в отношении их способности усиливать инициацию транскрипции. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно применять трансактивирующие домены, обладающие повышенной трансактивирующей эффективностью в растительных клетках, чтобы создать высокий уровень экспрессии полипептидамишени в ответ на присутствие ювенильного гормона или одного из его агонистов. Трансактивирующие домены, которые, как было установлено, являются наиболее эффективными в соответствии со способом по настоящему изобретению, включают, но не ограничены им, УР16 (выделенный из вируса герпеса простого). В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения трансактивирующий домен из УР16 функционально связывают с И8Р-фрагментом для создания химерного полипептида рецептора И8Р для регулирования экспрессии в растениях полипептидамишени. Также могут быть эффективными и другие трансактивирующие домены.

ДНК-связывающий домен представляет собой последовательность аминокислот, которая имеет определенные функциональные особенности, ответственные за связывание полипептида рецептора И8Р со специфической последовательностью нуклеотидов, называемой реагирующим элементом, которая присутствует в 5'-регуляторной области кассеты экспрессии мишени. Строение ДНК-связывающих доменов для суперсемейства ядерных рецепторов стероидного и тироидного гормонов является высоко консервативным у различных видов, и, следовательно, имеются лишь небольшие вариации в реагирующих элементах, которые применяются для образования комплементарно связывающейся пары (Еуаик, 8с1еисе 240: 889-895 (1989)). Однако способ регулирования экспрессии гена может быть сделан более гибким за счет использования реагирующих элементов другими путями. В предпочтительном варианте осуществления изобретения в 5'-регуляторную область интродуцируют множественные копии, предпочтительно от 1 до 11 копий соответствующего реагирующего элемента, что позволяет создать множественные сайты связывания И8Р или необязательно вспомогательных рецепторных полипептидов, что приводит к большей степени активации.

Дополнительная гибкость способа регулирования гена может быть достигнута путем изменения линейной ориентации или положения реагирующих элементов в 5'-регуляторной области. Реагирующие элементы, которые распознаются рецепторными протеинами класса II, имеют диадную симметричную структуру, состоящую из двух полусайтов (Еуаик, 8с1еисе 240:889-895 (1988)). Каждый рецепторный полипептид связывается с полусайтом. Эти полусайты могут быть ориентированы в виде либо прямого повтора, инвертированного повтора, либо палиндромного повтора. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения более одной молекулы полипептида И8Ррецептора распознает прямой повтор (ΌΚ) реагирующего элемента, благодаря чему достигается активация кассеты экспрессии мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов.

Дополнительная гибкость способа регулирования экспрессии гена по настоящему изобретению может быть достигнута благодаря использованию ДНК-связывающих доменов и реагирующих элементов из других активаторов транскрипции, которые включают, но не ограничены ими, протеины ЬехЛ или ОЛЬ4. Могут быть использованы ДНК-связывающий домен из протеина ЬехЛ, кодируемого геном 1ехА Е.со11, и комплементарный ему сайт связывания (см. Вгеп! и Р1акйие, Се11 43: 729-736, (1985), где описан активатор транскрипции ЬехА/ОАТ4). Другим пригодным источником является форма протеина САБ-4 дрожжей (см. 8або\\ък| и др., Иа1иге 335: 563-564 (1988), где описан активатор транскрипции САБ4-УР16). В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения химерный вариант необязательного вспомогательного рецепторного полипептида конструируют путем слияния ДНКсвязывающего домена САБ4 и фрагмента, содержащего лигандсвязывающий домен из ЕеК

Кроме того, 5'-регуляторная область И8Р и необязательные вспомогательные кассеты экспрессии рецептора содержат промотор, который обеспечивает экспрессию в растительных тканях и клетках. Соответствующие промоторы для кассет экспрессии рецептора выбирают таким образом, чтобы экспрессия рецепторных полипептидов могла быть конститутивной, регулируемой в процессе развития, тканеспецифичной, специфичной по отношению к клетке или специфичной по отношению к компартменту клетки. Промоторы также могут быть выбраны таким образом, чтобы сама экспрессия рецептор13 ных полипептидов могла индуцироваться в растении химическим путем, что приводит к увеличению уровня индукции промотора лигандом. При объединении элементов промотора, обеспечивающих специфическую экспрессию с таковыми, обеспечивающими индуцируемую химическим путем экспрессию, рецепторные полипептиды могут экспрессироваться или активироваться в специфических клетках или тканях растения в ответ на обработку химическим соединением.

Нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид рецептора, может быть модифицирована с целью улучшения экспрессии в растениях, улучшения функциональной активности или обоих этих параметров. Такие модификации включают изменение наиболее часто встречающегося кодона, встраивание интронов или создание мутаций, но не ограничены ими. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения кассеты экспрессии, включающие специфический по отношению к пыльнику или специфический по отношению к пестику промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид рецептора И8Р, применяют для активации экспрессии полипептида-мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов.

Настоящее изобретение также относится к полипептидам-мишеням, экспрессия которых активируется рецепторными полипептидами в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. В соответствии с настоящим изобретением может регулироваться экспрессия любой кодирующей последовательности при условии, что был сконструирован промотор, функционально связанный с этой кодирующей последовательностью, содержащий реагирующий элемент или реагирующие элементы, комплементарные ДНК-связывающему домену рецептора И8Р, и необязательно реагирующий элемент или реагирующие элементы, необходимые для вспомогательного рецептора. Например, полипептиды-мишени, пригодные для регулирования фертильности растения, активируют полипептидом рецептора И8Р в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов.

Мутанты полипептида рецептора И8Р также включены в настоящее изобретение. Могут быть получены мутанты, которые обладают способностью уменьшать уровень фоновой активации кассеты экспрессии мишени таким образом, чтобы индукция оказалась высокой относительно неиндуцируемой фоновой экспрессии. Кроме того, могут быть созданы мутанты, у которых изменена способность связываться с ювенильным гормоном или одним из его агонистов. Мутанты, обладающие измененными характеристиками связывания, будут реагировать на различные агонисты способами, специфиче скими для этих агонистов. Например, могут быть созданы мутантные рецепторы И8Р, которые реагируют только на агонист феноксикарб и не реагируют на гидропрен, различая, таким образом, агонисты ювенильного гормона изопреноидного и неизопреноидного строения. Пригодные методы мутагенеза, такие как химический мутагенез или сайтнаправленный мутагенез, хорошо известны в данной области.

В другом способе мутантные полипептиды рецептора получают путем ПЦР-мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей лигандсвязывающий домен И8Р. Эти мутантные рецепторные полипептиды экспрессируют в организме-хозяине, который сам по себе пригоден для общепринятых методов скрининга и выделения, в таком, как дрожжи. Скрининг мутантных рецепторных полипептидов, которые обладают пониженной основной активностью и многократно увеличенной индукцией, в таком организме-хозяине позволяет, однако, отобрать только кандидатов для дальнейшего изучения в растительных клетках, поскольку из работы с глюкокортикоидным рецептором (СК.) ясно, что хотя рецепторы из суперсемейства рецепторов стероидного и тироидного гормонов могут функционировать в дрожжах, нельзя заранее предсказать, что они будут функционировать в трансгенных растениях (Ь1оуб и др., 8с1еиее 226:436 (1994)). Кроме того, ограничение применимости результатов, полученных с использованием дрожжей, обусловлено имеющимися данными, что дрожжевые клетки, которые экспрессируют СК, не реагируют на обычно применяемый химический лиганд дексаметазон, тогда как этот лиганд обладает функциональной активностью в других гетерологичных системах (8сйеиа и др., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 88:10421-10425 (1991)).

Дополнительное исследование на растительных клетках проводят, создавая кассеты экспрессии рецептора, которые кодируют мутантные рецепторные полипептиды, и трансформируя ими растительные клетки в сочетании с кассетой экспрессии мишени. Трансформированные растительные клетки тестируют в отношении активации 5'-регуляторной области кассеты экспрессии мишени мутантными рецепторными полипептидами в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. Мутантные рецепторные полипептиды, которые вызывают низкий основной уровень экспрессии полипептида - мишени при отсутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов и высокий уровень экспрессии полипептидамишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов, пригодны для регулирования экспрессии гена в растениях.

Как описано выше, способ по настоящему изобретению может применяться для статистически достоверного увеличения экспрессии гена по сравнению с минимальным основным уров15 нем. Однако настоящее изобретение также может применяться для статистически достоверного понижения или ингибирования активации экспрессии гена, что может опосредоваться комплексом, состоящим из таких рецепторов, как И8Р и ЕсК. Регулирование генной экспрессии в растениях, опосредуемое такими комплексами рецепторов, является объектом заявки РСТ/ЕР 96/00686, поданной 3 марта 1995, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Реверсия активации, опосредуемой этими комплексами рецепторов, вызывается присутствием ювенильного гормона или одного из его агонистов, которые являются химическими лигандами для полипептида рецептора И8Р (см. фиг. 2 и 3). В присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов комплекс И8Р:ЕсК разрушается, приводя тем самым к реверсии активации. Например, в трансгенном растении, экспрессирующем рецепторные полипептиды И8Р и ОАЬ4-ЕсК-С1 и включающем кассету экспрессии мишени, несущую элемент сайта связывания ОЛЬ4, активация экспрессии гена полипептида-мишени, вызванная этим комплексом, окажется ревертированной. Эта реверсия будет происходить либо в присутствии тебуфенозида (также известного как КН 5992) или другого химического лиганда, который связывается с лигандсвязывающим доменом ЕсК, либо в отсутствии такого химического лиганда.

Для экспрессии в растениях могут быть выбраны промоторы, приемлемые как для кассет экспрессии рецептора, так и для кассеты экспрессии мишени. Если не указано иное, описанные ниже промоторы могут применяться для обеспечения экспрессии в растениях как рецепторных полипептидов, так и полипептидамишени. Эти промоторы включают конститутивные, индуцируемые, регулируемые временными параметрами, регулируемые параметрами, связанными со стадией развития, регулируемые химическими стимулами, предпочтительные для определенной ткани и тканеспецифичные промоторы, но не ограничены ими. Предпочтительные конститутивные промоторы включают, но не ограничены ими, промоторы 358 и 198 СаМУ (патент США № 5352605). Дополнительные предпочтительные промоторы включают один из нескольких генов актина, которые, как известно, обеспечивают экспрессию в большинстве типов клеток, но не ограничены ими. Промотор, описанный у МсЕ1гоу и др., Мо1. Оеп. СепеЕ 231: 150-160 (1991), может быть легко включен в кассеты экспрессии рецептора по настоящему изобретению и особенно предпочтителен для применения в однодольных растениях-хозяевах. Еще один предпочтительный конститутивный промотор получают из убикитина, который представляет собой еще один генный продукт, для которого известна способность накапливаться во многих типах клеток. Промотор убикитина клонировали из несколь ких видов для применения в трансгенных растениях (например, в подсолнечнике - Вше! и др., Р1ап! 8с1епсе 79: 87-94 (1991); в кукурузе Ошйепкеп и др., Р1ап! Мо1ес. Вю1. 12: 619-632 (1989)). Промотор убикитина кукурузы исследовали в трансгенных системах однодольных растений, а его последовательность и векторы, сконструированные для трансформации однодольных растений, описаны в заявке ЕР-А342926. Промотор убикитина пригоден для применения по настоящему изобретению в трансгенных растениях, особенно в однодольных растениях. Также приемлемыми промоторами являются И2 и И5 малой ядерной РНК (мяРНК) из кукурузы (Вго\\'п и др., Ыис1е1с Асίάκ Кек. 17: 8991 (1989)) и промотор спиртовой дегидрогеназы Щептк и др., Ыис1е1с Аайк Кек. 12: 3983 (1984)).

Тканеспецифичные или тканепредпочтительные промоторы, пригодные для использования в соответствии с настоящим изобретением в растениях, в частности в кукурузе, являются таковыми, которые обеспечивают экспрессию в корне, сердцевине растения, листе или в пыльце. Такие промоторы описаны в заявке \¥О 93/07278, в полном объеме включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Также приемлемы промоторы, которые обеспечивают специфическую для семени экспрессию, например описанные у 8с11егп111апег и др., ЕМВО 1. 7: 1249 (1988); специфические для пыльника промоторы ап!32 и ап143Э. описанные в заявке ЕРА-578611, в полном объеме включенной в настоящее описание в качестве ссылки; специфический для пыльника (тапетальный) промотор В6 (Нийшап и др., 1. Се11. Вюсйеш. 17В: АЬк!гас! №Ό209 (1993)); специфические для пестика промоторы, такие как модифицированный промотор 813 (Э/е1ка1пк и др., Р1ап! Се11 5: 855 (1993)).

Также пригодными для использования в соответствии с настоящим изобретением являются промоторы, индуцируемые химическим путем. Конкретные промоторы этой категории, пригодные для обеспечения экспрессии рецепторных полипептидов или полипептида-мишени в растениях, описаны, например, в заявке ЕР-А332104, в полном объеме включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

5'-Регуляторная область либо кассеты экспрессии рецептора, либо кассеты экспрессии мишени также может включать другие усиливающие последовательности. Обнаружены многочисленные последовательности, усиливающие экспрессию гена в трансгенных растениях. Например, известно, что многочисленные нетранслируемые лидерные последовательности, происходящие из вирусов, усиливают экспрессию. В частности было подтверждено, что лидерные последовательности из вируса мозаики табака (ТМУ, Ω-последовательность), вируса хлорозной пятнистости кукурузы (МСМУ) и вируса мозаики люцерны (АМУ) эффективны в отношении усиления экспрессии (см., например, СаШе и др. Ыис1. Ас1бк Кек. 15: 8693-8711 (1987); 81<1.«екк1 и др., Р1аи1 Мо1ес. Βίο1. 15: 6579 (1990)). Другие лидерные последовательности, известные в данной области, включают, но не ограничены ими:

- лидерные последовательности пикорнавирусов, например ЕМСУ-лидер, (5'некодирующая область энцефаломиокардита) (Е1тоу-81еш, О., Еиетк!, Т.К. и Мокк, В., ΡΝΑ8 И8А, 86: 6126-6130, (1989)),

- лидерные последовательности потивирусов, например ТЕУ-лидер (вирус табачной гравировки) (АШкои и др., (1986)), МОМУ-лидер (вирус мозаичной карликовости кукурузы) (У1то1оду, 154: 9-20),

- лидерную последовательность тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, связывающую протеин (ΒίΡ) (Масе)ак. Э.С. и 8агпо\\'. Р., №1ите, 353: 90-94, (1991)).

- нетранслируемую лидерную последовательность мРНК покровного протеина вируса мозаики люцерны (АМУ КNΑ 4) (1оЬ1шд, 8.А. и Сейгке Ь., Уинге, 325: 622-625, (1987)),

- лидерную последовательность вируса мозаики табака (ТМУ) (Са1йе Ό.Κ. и др., Мо1еси1аг Вю1оду оГ Ш, стр. 237-256, (1989)) и

- лидерную последовательность вируса хлорозной мозаики кукурузы (МСМУ) (Ьотте1, 8.А. и др., У1го1оду, 81: 382-385, (1991), см. также у Ое11а-Сюрра и др., Р1аи1 Рйукю1оду, 84: 965-968, (1987)).

Было установлено, что различные интронные последовательности усиливают экспрессию при добавлении к 5'-регуляторной области, прежде всего в клетках однодольных растений. Например, было установлено, что интроны гена кукурузы Абй1 значительно усиливают экспрессию гена дикого типа под контролем родственного ему промотора при интродукции в клетки кукурузы (Са1йк и др., Сепек Эеуе1ор. 1: 11831200 (1987)).

Кроме включения одного или нескольких вышеуказанных элементов в 5'-регуляторную область в кассеты экспрессии мишени также могут быть включены другие элементы, характерные для кассеты экспрессии мишени. Такие элементы включают минимальный промотор, но не ограничены им. Под минимальным промотором понимают, что основные элементы промотора являются неактивными или практически неактивными без сайтов связывания для расположенных против хода транскрипции активаторов. Такой промотор обладает низкой фоновой активностью в растениях, когда в них не присутствует трансактиватор или когда в них отсутствуют энхансер или сайты связывания реагирующих элементов. Одним из минимальных промоторов, который особенно пригоден для генов-мишеней в растениях, является минимальный промотор Βζ1, который получают из гена кукурузы Ьто^е1. Коровый промотор Βζ1 получали из конструкции ρΒζ1ΕπσΚ98, содержащей тус-мутант Βζ1-люциферазу, путем расщепления сайта №1еР локализованного на нуклеотидах от -53 до -58 (Ко1й и др., Р1ап1 Се11 3: 317 (1991)). Таким образом, фрагмент, происходящий из корового промотора Βζ1, располагается между нуклеотидами -53 и +227 и, когда применяется для трансгенного растения кукурузы, содержит интрон-1 Βζ1 в 5'-нетранслируемой области.

Помимо промоторов для использования в соответствии с настоящим изобретением также пригодны различные 3'-терминаторы транскрипции. Терминаторы транскрипции ответственны за прекращение транскрипции и за правильное полиаденилирование мРНК. Пригодными терминаторами транскрипции являются таковые, для которых известно, что они функционируют в растениях и они включают терминатор 358 СаМУ, терминатор 1т1, терминатор нопалинсинтазы, терминатор Е9 гена гЬс8 гороха и другие известные в данной области. Они могут применяться как в однодольных, так и в двудольных растениях.

Кассеты экспрессии по настоящему изобретению могут быть интродуцированы в растительную клетку многочисленными известными в данной области способами. Для специалиста в данной области очевидно, что выбор способа может определяться типом растения, подлежащим трансформации, а именно однодольным или двудольным растением. Пригодные методы трансформации растительных клеток включают микроинъекцию (Стокк^ау и др., Β^οТесйη^^иек 4: 320-334 (1986)), электропорацию (К1ддк и др., Ргос. №111. Асаб. 8с1, И8А 83:5602-5606 (1986)), опосредуемую АдтоЬас1егшт трансформацию (Ншсйее и др., Β^οΐесйηο1оду 6: 915-921 (1988)), непосредственный перенос гена (Ра^ко\ткк1 и др., ЕМΒΟ 1. 3: 27172722 (1984)) и способ баллистического ускорения частиц с использованием устройств, выпускаемых фирмами Адгасейк, 1пс., Маб1коп, XV 1ксопкш и Β^οКаб, Негси1ек, СайГотша (см., например, 8апГогб и др., патент США № 4945050; и МсСаЬе и др., Β^οΐесйηο1οду 6: 923-926 (1988)). К таким известным публикациям относятся также, но не ограничены ими, Vе^кк^ηде^ и др., Аппиа1 Кеу. СепеР 22: 421-477 (1988); 8апГогб и др., Ратйси1а1е 8с1епсе апб Тесйпо1оду 5: 27-37 (1987) (лук); Сйпкйи и др., Р1ап1 РЬуяок 87: 671-674 (1988) (соя); МсСаЬе и др., Β^ο/Тесйпο1οду 6: 923-926 (1988) (соя); ЭаИа и др., Β^ο/Тесйпο1οду 8: 736-740 (1990) (рис); К1еш и др., Ргос. №Й. Асаб. 8сР И8А 85: 43054309 (1988) (кукуруза); К1еш и др.

Β^ο/Тесйпο1οду 6: 559-653 (1988) (кукуруза),

К1еш и др., Р1ап1 Рйукю1. 91: 440-444 (1988) (кукуруза); Етотт и др., Β^ο/Тесйпο1οду 8: 833-939 (1990) (кукуруза); и Согбоп-Катт и др., Р1ап1

Се11 2: 603-618 (1990) (кукуруза); 8уаЬ и др.,

Ргос. N311. Асаб. δοΐ. И8А 87:8526-8530 (1990) (хлоропласт табака); Ко/1е1 и др., Вю1ес1то1оду 11: 194-200 (1993) (кукуруза); 81птато1о и др., ΝοΙιιιό 338: 274-277 (рис); СпкЮн и др., Вю1ес11по1оду 9: 957-962 (1991) (рис); ЕР-А-332591 (ежа сборная и другие РооБбеае); УаШ и др., Вю1ес1то1оду 11: 1553-1558 (1993) (пшеница); Аеекк и др., Р1ап1 РйукюБ 102: 1077-1084 (1993) (пшеница).

Ряд наиболее предпочтительных вариантов осуществления интродукции кассет экспрессии по настоящему изобретению в растение кукурузы путем бомбардировки микроснарядами описан у Ко/1е1 и др., Вю/Тес1шо1оду 11: 194-200 (1993), причем эта публикация в полном объеме включена в настоящее описание в качестве ссылки. Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления является способ трансформации протопласта кукурузы, как описано в заявке ЕР-А-292435, в полном объеме включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Ряд наиболее предпочтительных вариантов осуществления интродукции кассет экспрессии по настоящему изобретению в растение пшеницы путем бомбардировки микроснарядами можно найти в заявке АО 94/13822, в полном объеме включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

Трансформация растений может быть осуществлена с помощью одной молекулы ДНК или с помощью многих молекул (т.е. котрансформация), и обе эти методики пригодны для применения с кассетами экспрессии по настоящему изобретению. Для трансформации растений пригодны многочисленные трансформирующие векторы, а кассеты экспрессии по изобретению могут применяться вместе с любыми такими векторами. Выбор вектора будет зависеть от предпочтительного способа трансформации и видов-мишеней, предназначенных для трансформации.

Для трансформации с использованием АдгоЬас1епит ШшеГааепк пригодны многочисленные векторы. Они обычно несут, по крайней мере, одну пограничную последовательность ТДНК и включают такие векторы, как ρΒΙΝ19 (Веуап, №с1. Аабк Век. (1984)). В одном из предпочтительных вариантов осуществления кассеты экспрессии по настоящему изобретению могут быть встроены в любые бинарные векторы рС1В200 и рС1В2001 для применения в АдгоЬас1епит. Эти векторные кассеты для опосредуемой АдгоЬас1етшт трансформации конструировали следующим образом. Плазмиду рТ1875кап создавали обработкой рТ1875 с помощью ΝπγΙ (8с1ишб11аи8ег и НеШъкт 1. Вас1еио1. 164:446-455 (1985)), что позволило вырезать ген устойчивости к тетрациклину, с последующим встраиванием Асс1-фрагмента из плазмиды риС4К, несущей ΝΡΤΙΙ (Меккшд и У1етга, Сепе 19: 259-268 (1982); Веуап и др., №Ш.1ге 304: 184-187 (1983); МсВпбе и др., Р1ап1 Мо1еси1аг

Вю1оду 14: 266-276 (1990)). Линкеры ΧΙιοΙ лигировали с ЕсоВУ-фрагментом рС1В7, содержащим левую и правую пограничные последовательности Т-ДНК, селектируемый в растении химерный ген пок/прШ и полилинкер рИС (ВоШйеш и др., Сепе 53: 153-161 (1987)) и обработанный с помощью Х1ю Ι фрагмент клонировали в обработанной с помощью 8аН плазмиде рТ1875кап, создавая рС1В200 (см. также ЕРА-332104, пример 19). рС1В200 содержит в полилинкере следующие уникальные сайты рестрикции: ЕсоВ1, δκίΙ, Крп1, ВдШ, ХЬа1 и 8аИ. Плазмиду рС1В2001 получали из рС1В200, создавая ее путем встраивания в полилинкер дополнительных сайтов рестрикции. Уникальными сайтами рестрикции полилинкера рС1В2001 являются ЕсоВ1, δκΐΙ, Крп1, ВдШ, ХЬа1, 8ай, М1и1, ВсП, АутП, АраБ Хра! и δίυΙ. В конструкцию рСБВ2001 помимо указанных уникальных сайтов рестрикции также входят ген канамицина для отбора трансформированных растений и бактерий, левая и правая пограничные последовательности Т-ДНК для опосредуемой АдгоЬас1епит трансформации, происходящий из ВК2 функциональный ген 1гГА. предназначенный для мобилизации от Е.со11 к другим хозяевам, и другие функциональные гены ОпТ и ОпУ, также происходящие из ВК2. Полилинкер рСШ2001 пригоден для клонирования растительных кассет экспрессии, содержащих их собственные регуляторные сигналы.

Для опосредуемой АдгоЬас1епит трансформации дополнительным пригодным вектором является бинарный вектор рСБВ10, который содержит ген, кодирующий устойчивость к канамицину для отбора трансформированных растений, правую и левую пограничные последовательности Т-ДНК и включает последовательности из плазмиды рВК252 с широким спектром хозяев, что позволяет осуществлять репликацию как в Е.сой, так и в АдгоЬас1епит. Эта конструкция описана у ВоШйеш и др., Сепе 53: 153161 (1987). Были сконструированы различные производные рСБВ10, которые включают ген фосфотрансферазы-гигромицин В, описанные у Сг11^ и др., Сепе 25: 179-188 (1983). Эти производные позволяют осуществлять селекцию растительных клеток только по признаку устойчивости к гигромицину (рСБВ743) или по признаку устойчивости к гигромицину и канамицину (рСШ715, рСШ717).

Способы, в которых используется либо форма непосредственного переноса гена, либо опосредуемого АдгоЬас1епит переноса, обычно, но необязательно, осуществляют с использованием селектируемого маркера, который может обеспечивать устойчивость к антибиотику (например, канамицину, гигромицину или метотрексату) или к гербициду (например, фосфинотрицину). Выбор селектируемого маркера для трансформации растения, однако, не имеет решающего значения для изобретения.

Для определенных видов растений могут быть предпочтительны различные маркеры для селекции по признаку устойчивости к антибиотику или гербициду. Маркеры для селекции, применяемые обычно при трансформации, включают ген ирШ, который обусловливает устойчивость к канамицину и родственным антибиотикам (Мекк1пд и У1егга, Сспс 19: 259-268 (1982); Веуап и др., Ыа1иге 304: 184-187 (1983)), ген Ьаг, который обусловливает устойчивость к гербициду фосфинотрицину (А1Ше и др., Νιιοί. АсИк Век. 18: 1062 (1990), 8репсег и др., Тйеог. Арр1. СепеР 79: 625-631 (1990)), ген йрй, который обусловливает устойчивость к антибиотику гигромицину (В1осЫпдег и Э1дде1тапп, Мо1. Се11 Вю1. 4: 2929-2931), и ген б11Гг. который обусловливает устойчивость к метотрексату (Воигошк и др., ЕМВО 1. 2: 1099-1104 (1983)).

Одним из таких векторов, пригодных для использования в методе непосредственного переноса гена в сочетании с селекцией по признаку устойчивости к гербициду Баста (или фосфинотрицину), является рС1В3064. Основой этого вектора является плазмида рС1В246, которая включает промотор 358 СаМУ, функционально слитый с геном 6И8 Е.со11, и терминатор транскрипции 358 СаМУ, которая описана в международной заявке АО 93/07278, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Одним из генов, пригодных для придания устойчивости к фосфинотрицину, является ген Ьаг из 81гер1отусек утбосйготодепек (Тйотркоп и др., ЕМВО 1. 6: 2519-2523 (1987)). Этот вектор пригоден для клонирования растительных кассет экспрессии, содержащих их собственные регуляторные сигналы.

Дополнительным трансформирующим вектором является р8ОС35, в котором в качестве селектируемого маркера, обусловливающего устойчивость к метотрексату, используется ген дигидрофолатредуктазы (ЭНБВ) Е.со1г Для амплификации промотора 358 (длиной ~800 пар оснований), интрона 6 из гена А6111 кукурузы (длиной ~550 пар оснований) и нетранслируемой лидерной последовательности СИ8 из р8О610 применяли ПЦР. Фрагмент длиной 250 пар оснований из гена дигидрофолатредуктазы типа II Е.со11 также амплифицировали с помощью ПЦР и два ПЦР-фрагмента объединяли с 8ас1-РкН фрагментом рВ1221 (фирма С1оп1есй), который включает каркас вектора рИС19 и терминатор нопалинсинтазы. Объединение этих фрагментов приводило к созданию р8О619, которая содержит промотор 358, слитый с последовательностью интрона 6, лидерной последовательностью 6И8, геном ЭНБК. и терминатором нопалинсинтазы. Замещение лидера 6И8 р8О619 лидерной последовательностью гена сйеск-вируса хлорозной пятнистости кукурузы (МСМУ) приводило к получению вектора р8О635. р8О619 и р8О635 несут происходящий из рИС ген устойчивости к ампициллину и имеют сайты ΗίηάΙΙΙ, 8рЫ, РкП и ЕсоВ1, пригодные для клонирования чужеродных последовательностей.

Одним из преимуществ настоящего изобретения является его применимость для регулирования фертильности растений в полевых условиях. Эффективное оплодотворение определяется образованием жизнеспособных зигот и может быть измерено в виде процента семян, образовавших жизнеспособные зиготы. В соответствии с настоящим изобретением фертильность может регулироваться путем включения нуклеотидной последовательности, кодирующей соответствующую мишень в кассете экспрессии мишени, причем экспрессия этого полипептида-мишени оказывает влияние на фертильность растения, означая, что она обладает способностью статистически достоверно понижать или повышать фертильность растения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения этот полипептид-мишень делает неэффективным процесс оплодотворения, означая, что образование жизнеспособных зигот будет затруднено или прекращено. Такое неэффективное оплодотворение может быть измерено в виде процента семян, не образовавших жизнеспособные зиготы, и может быть вызвано различными способами. Они включают 1) нарушение или изменение тех процессов, которые важны для образования жизнеспособных гамет, 2) нарушение функциональной способности пыльцы или семяпочки, если они образуются, или 3) неспособность к нормальному развитию зародышевого мешка, пестика, рыльца или передающего пути, но не ограничены ими. В соответствии с настоящим изобретением ювенильный гормон или один из его агонистов наносят или приводят в контакт с трансгенными растениями в полевых условиях, при этом активируется экспрессия полипептида-мишени, вследствие чего оплодотворение становится неэффективным. В другом варианте осуществления настоящего изобретения экспрессия этого полипептида-мишени увеличивает или восстанавливает фертильность растения.

Было установлено, что в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены различные степени эффективного или неэффективного оплодотворения. В предпочтительном варианте осуществления может быть достигнута степень неэффективного оплодотворения свыше 80% и более предпочтительно свыше 95%. Способность обеспечивать вариабельность уровня фертильности позволяет использовать изобретение в различных сельскохозяйственных целях.

Кодирующие последовательности, пригодные в качестве полипептида-мишени, включают, но не ограничены ими, любую последовательность, которая кодирует продукт, способный сделать оплодотворение неэффективным.

Эти кодирующие последовательности могут быть либо гомологичного, либо гетерологично23 го происхождения. Генные продукты этих кодирующих последовательностей включают, но не ограничены ими, следующие:

- А-цепь токсина дифтерии (ЭТА), которая ингибирует синтез протеинов (Стеепйе1б и др., Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. И8А, 80: 6853 (1983); Ра1тйет и др., Се11, 50: 435 (1987)),

- пектатлиазу ре1Е Επνίπία сйтукап1йет1 ЕС16, которая разлагает пектин, вызывая лизис клеток (Кееп и др., 1. Вас1етю1оду, 168: 595 (1986)),

- Т-игГ13 (ТИВЕ-13) митохондриальных геномов стк-Т кукурузы; этот ген кодирует полипептид, обозначенный как ИКР13, который разрушает мембраны митохондрий или плазмы (Вгаип и др., Р1ап1 Се11, 2: 153 (1990); Эе\\'еу и др., Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. И8А, 84: 5374 (1987); Эе\\'еу и др., Се11, 44: 439 (1986)),

- бета-1,3-глюканазу, которая вызывает растворение каллозной стенки микроспоры до ее созревания (Уотта1 и др., Р1ап1 Се11, 4: 759771 (1992)),

- ген Сш-рекомбиназы фага Ми, который кодирует сайтспецифическую ДНКрекомбиназу, которая вызывает перестройку генома и приводит к потере жизнеспособности клетки при экспрессии в клетках растений (Маекег и др., Мо1. Сеп. Сепей, 230: 170-176 (1991)),

- лизинсинтазу индолуксусной кислоты (1аа1) Ркеиботопак кутшдае, которая кодирует фермент, связывающий лизин с индолуксусной кислотой (1АА); при экспрессии в клетках растений она вызывает изменение развития в результате удаления 1АА из клетки путем конъюгации (Вотапо и др., Сепек апб Эеуе1ортепЕ 5: 438-446 (1991); 8репа и др., МоЬ Сеп. Сепей, 227: 205-212 (1991); ВоЬейо и др., Ргос. Ыаб. Асаб. 8сй И8А, 87: 5795-5801),

- рибонуклеазу ВасШик ату1о11диеГас1епк, также известную как барназа, разлагающую мРНК в тех клетках, в которых она экспрессируется, приводя к гибели клетки (Мапаш и др., №1Шге 347: 737-741 (1990); Мапаш и др., №1Шге 357: 384-387 (1992)), и

- ген токсина Су1А ВасШик 1Виг1пд1епк1к 1ктаейепкщ, который кодирует протеин, являющийся токсичным для комаров и обладающий гемолитической активностью; при экспрессии в растительных клетках он вызывает гибель клетки вследствие разрушения клеточной мембраны (МсЬеап и др., 1. Вас1епо1оду. 169: 1017-1023 (1987); Е11аг и др., патент США 4918006 (1990)).

Такие полипептиды также включают аденинфосфорибозилтрансферазу (АРВТ) (МоГГаИ и ЗотетуШ, Р1аи1 Рйукюй, 86: 1150-1154 (1988)), ДНКазу, РНКазу, протеазу, салицилатгидроксилазу и т. д.

Кроме того, было установлено, что кассета экспрессии мишени может содержать 5'регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая при транскрипции образует антисмысло вую версию кодирующей последовательности, имеющую решающее значение для образования жизнеспособных гамет, такую как АРВТ. В альтернативном варианте могут использоваться рибозимы, действие которых направлено на мРНК гена, который имеет решающее значение для образования или функции гамет. Такие рибозимы должны включать область гибридизации длиной приблизительно 9 нуклеотидов, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, по крайней мере, части РНКмишени, и каталитическую область, адаптированную для расщепления РНК-мишени. Рибозимы описаны в заявках ЕР-А-321201 и в XV О 88/04300, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Можно назвать также следующие публикации: Наке1оГГ и Сег1ас1, Ыа1ите, 334: 585-591 (1988); Еебот и ИЫепЬеск, Ргос. N311. Асаб. 8с1. ИЗА, 87: 1668-1672 (1990); Сес1 и Вакк, Апп. Веу. Вюсйет., 55: 599-629 (1986); Сес1 Т.В., 236: 1532-1539 (1987); Сес1 Т.В. Сепе, 73: 259-271 (1988); и /аиу и Сес1, 8с1епсе, 231: 470-475 (1986).

Было установлено, что вышеуказанные нуклеотидные последовательности, кодирующие полипетид-мишень, также могут быть функционально связаны с 5'-регуляторной последовательностью, которая ориентирует их экспрессию специфическим для ткани или клетки образом. Способы получения такой специфической для ткани или клетки экспрессии описаны выше. Эта специфичность экспрессии гарантирует, что воздействие полипептидамишени будет направлено только на те ткани или клетки, которые необходимы для образования жизнеспособных зигот, и не будут оказывать вредного воздействия на растение, помимо воздействия на его фертильность.

В соответствии с настоящим изобретением может регулироваться либо мужская фертильность трансгенных растений, женская фертильность трансгенных растений, либо и то и другое. Мужская стерильность заключается в недостаточной способности производить функциональную или жизнеспособную пыльцу или в отсутствии этой способности. Мужская стерильность может быть результатом дефектов, приводящих к отсутствию образования пыльцы или к отсутствию функционально активной пыльцы, если она образуется. Следовательно, либо пыльца не образуется, либо, если она образуется, она является либо нежизнеспособной, либо неспособной по каким-либо другим причинам осуществлять эффективное оплодотворение в нормальных условиях.

Женская стерильность заключается в недостаточной способности производить функциональные или жизнеспособные мегаспоры или зародышевые мешки или другие ткани, необходимые для прорастания пыльцы, роста или оплодотворения, или в отсутствии этой способности. Женская стерильность может быть ре25 зультатом дефектов, приводящих к отсутствию образования мегаспор или зародышевого мешка или к неспособности развиваться соответствующим образом завязи, семяпочки, пестика, рыльца или передающих путей. Следовательно, либо жизнеспособный зародышевый мешок не образуется, либо, если он образуется, он неспособен эффективно оплодотворяться в нормальных условиях.

Например, может быть получено трансгенное растение, которое экспрессирует полипептид или полипептиды рецептора И8Р в пыльниках, с использованием специфического для пыльника промотора, функционально связанного с соответствующими нуклеотидными последовательностями. Кроме того, трансгенное растение дополнительно может содержать кассету экспрессии мишени, имеющую 5'регуляторную последовательность, которая содержит соответствующую последовательность реагирующего элемента с элементами корового промотора из Βζΐ, функционально связанную с кодирующей последовательностью рибонуклеазы барназы. При обработке ювенильным гормоном или одним из его агонистов трансгенного растения, экспрессирующего полипептиды рецептора И8Р, происходит активация 5'регуляторной последовательности кассеты экспрессии мишени с последующим производством полипептида-мишени барназы. Происходящая в результате этого специфическая для пыльников экспрессия барназы приводит к гибели клетки и вследствие этого к мужской стерильности. Аналогичная комбинация рецепторных полипептидов и кассеты экспрессии мишени при использовании специфического для пестика промотора, функционально связанного с нуклеотидными последовательностями, кодирующими рецепторные полипептиды, может привести к женской стерильности.

В альтернативном варианте может быть создано растение, в котором экспрессия полипептида-мишени восстанавливает фертильность стерильного мужского или стерильного женского растения. Например, может быть получено растение, которое экспрессирует ген барназы под контролем промотора Αηΐ43Ό, Αηΐ32 или В6, либо, как описано у Мапаш и др., ИаНге 347: 737-741 (1990) и Мапаш и др., ЫаНге 357: 384-387 (1992), под контролем промотора ТА29. Эти растения дополнительно включают кассеты экспрессии рецептора для полипептида рецептора И8Р и необязательно полипептид вспомогательного рецептора либо из того же самого специфического для пыльника промотора, либо из конститутивного промотора, такого как промотор убикитина кукурузы, 358 или актина риса. Эти растения, кроме того, включают кассету экспрессии мишени, несущую 5'-регуляторную последовательность, включающую соответствующую последовательность реагирующего элемента с коровыми элементами промотора из

Βζΐ, функционально связанную с кодирующей последовательностью ингибитора барназы барстара (Ьаг51аг). Растения обладают мужской стерильностью, но после обработки ювенильным гормоном или одним из его агонистов происходит активация 5'-регуляторной последовательности кассеты экспрессии мишени с последующим продуцированием полипептида-мишени барстара. Барстар ингибирует рибонуклеазную активность полипептида барназы и происходит нормальное развитие пыльника и пыльцы. Тем самым восстанавливается фертильность.

Аналогичный подход может быть использован для регулирования женской стерильности. Растения, обладающие женской стерильностью, могут быть получены при использовании для управления экспрессией барназы промоторов, специфических для экспрессии в репродуктивных тканях женского растения, вместо специфических для пыльника промоторов. Индукция кассеты экспрессии мишени, включающей кодирующую последовательность гена барстара, с помощью ювенильного гормона или одного из его агонистов приводит к восстановлению женской фертильности.

Вышеуказанные подходы могут быть основаны на использовании любого гена женской или мужской стерильности, для которого создан ген-восстановитель. Возможные гены-восстановители, отличные от гена барстара, описаны в ЕР-А-412911.

Генетические особенности, сконструированные в описанных выше трансгенных растениях и их семенах, передаются с помощью полового размножения или вегетативного роста и, таким образом, могут сохраняться и передаваться потомству растений. Обычно указанное сохранение и передачу потомству осуществляют с использованием известных сельскохозяйственных методов, разработанных для этих конкретных целей, таких как обработка почвы, посев или сбор урожая. Также могут применяться специализированные способы, такие как гидропоника или выращивание в закрытом грунте. Поскольку выращиваемые культурные растения подвержены нападению со стороны насекомых и повреждениям в результате такого нападения или инфекций, а также подвержены конкуренции со стороны сорных растений, для улучшения урожая проводят мероприятия по борьбе с сорняками, болезнями растений, насекомыми, нематодами и другими вредными факторами. Они включают механические способы, такие как обработка почвы или удаление сорняков и зараженных растений, а также применение средств защиты растений, таких как гербициды, фунгициды, гаметоциды, нематоциды, регуляторы роста, агенты, способствующие созреванию, и инсектициды.

Кроме того, дающие преимущества генетические особенности трансгенных растений и семян по изобретению могут быть использова27 ны при селекции растений с целью выведения растений с улучшенными свойствами, такими как толерантность к пестицидам, гербицидам или стрессу, с улучшенной питательной ценностью, повышенной урожайностью или улучшенным строением, способствующим уменьшению потерь от полегания или осыпания. Для различных стадий селекции характерно целенаправленное вмешательство человека, такое как отбор линий, подлежащих скрещиванию, непосредственное опыление родительских линий или отбор соответствующего потомства растений. В зависимости от требуемых свойств выбирают различные способы селекции. Соответствующие методы хорошо известны в данной области и включают гибридизацию, инбридинг, обратное возвратное скрещивание, многолинейное скрещивание, смешивание сортов, межвидовую гибридизацию, методы анэуплодии и т.д., но не ограничены ими. Таким образом, трансгенные растения по настоящему изобретению и их семена могут применяться для селекции улучшенных линий растений, что, например, позволяет увеличить эффективность обычных методов, таких как обработка гербицидом или пестицидом, или позволяет отказаться от этих методов благодаря модифицированным генетическим особенностям этих растений. Кроме того, могут быть получены новые культурные растения с улучшенной толерантностью к стрессу благодаря оптимизации генетического аппарата, что позволяет получить урожай продуктов лучшего качества по сравнению с продуктами, полученными от растений, которые не обладают способностью сопротивляться аналогичным вредным условиям в процессе их развития.

При производстве семян качество прорастания и однородность семян являются важными характеристиками продукта, в то время как качество прорастания и однородность семян, собираемых и продаваемых фермером, не являются важными. Поскольку трудно выращивать культурное растение вне контакта с семенами другого культурного и сорного растения, для борьбы с передающимися с семенами болезнями и для получения семян с хорошим прорастанием производителями, занимающимися выращиванием, кондиционированием и продажей чистых семян, разработаны довольно обширные и целенаправленные способы производства семян. Так, обычно фермер практикует покупку сертифицированного семенного материала, удовлетворяющего определенным стандартам качества, а не использует семенной материал, полученный от его собственной культуры. Материал для размножения, который используют в качестве семенного материала, обычно обрабатывают защитным покрытием, включающим гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскициды или их смеси. Обычно применяемые защитные покрытия включают такие соединения, как каптан, кар боксин, тирам (ΤΜΤΏ®), металаксил (Аргоп®) и пиримифосметил (Ас1сШс®). При необходимости эти соединения изготавливают в виде препаративной формы вместе с дополнительными носителями, поверхностно-активными веществами или способствующими нанесению адьювантами, обычно применяемыми в технике приготовления препаративных форм, предназначенных для защиты от повреждения, вызванного бактериями, грибами или вредителями. Защитные покрытия могут быть нанесены путем пропитывания материала для размножения жидкой композицией или путем нанесения покрытия из объединенной влажной или сухой композицией.

Также возможны другие способы нанесения, такие как обработка почек или плодов.

Еще одним объектом изобретения являются новые сельскохозяйственные методы, такие как приведенные выше, для которых характерно применение трансгенных растений, трансгенного растительного материала или трансгенных семян по настоящему изобретению.

В соответствии с настоящим изобретением может использоваться любое растение, которое может быть трансформировано и из которого может быть получено трансгенное растение. Мужская стерильность, женская стерильность или оба вида стерильности могут регулироваться путем применения соответствующего химического лиганда. Регулирование фертильности растения является наиболее пригодным для производства гибридных семян. Для получения гибридных семян, не загрязненных семенами, полученными в результате самоопыления, должны применяться методы регулирования опыления, обеспечивающие перекрестное опыление, а не самоопыление. Это обычно осуществляют механическим, генетическим путем или с помощью химических гибридизующих агентов (ХГА). Например, для кукурузы общепринятой практикой является механическое удаление женских (или семенных) родительских растений, что является трудоемким процессом, требующим много времени. У пшеницы регулирование фертильности механическими способами принято в промышленном семеноводстве и пока не разработаны генетические источники регулирования фертильности. Преимущество применения настоящего изобретения для производства гибридных семян состоит в надежности, простоте применения и регулирования как мужской, так и женской фертильности.

Могут быть созданы гомозиготные трансгенные растения, содержащие соответствующие кассеты экспрессии рецептора и кассету экспрессии мишени, которые будут сохраняться в них неограниченно долго. Для получения гибридных семян скрещивают гомозиготные линии родительского растения 1 и родительского растения 2. В одном из примеров практического осуществления настоящего изобретения для получения гибридных семян создают родительское растение 1, обладающее мужской стерильностью в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов, тогда как родительское растение 2 конструируют таким образом, чтобы оно обладало женской стерильностью в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. При контакте родительского растения 1 и родительского растения 2 с ювенильным гормоном или одним из его агонистов успешное производство семян может быть достигнуто только в том случае, когда пыльцой родительского растения 2 опыляются семяпочки родительского растения 1. В другом примере практического осуществления настоящего изобретения создают родительское растение 1, обладающее мужской стерильностью в отсутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов, а родительское растение 2 конструируют таким образом, чтобы оно обладало женской стерильностью в отсутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. Контакт родительского растения 1 и родительского растения 2 с ювенильным гормоном или одним из его агонистов позволяет поддерживать каждую линию путем самоопыления. Для получения гибридных семян проводят уплотненную посадку двух родительских линий и получают только гибридные семена. Фертильность в гибридных растениях потомства восстанавливают путем интродуцирования гена-восстановителя. Этими способами могут быть получены любые требуемые гибридные семена.

Регулирование экспрессии трансгенного растения химическим путем может применяться для регулирования либо значительных изменений в процессе развития культуры-мишени, либо для изменения культурного растения с целью его большей приспособленности к вредным условиям окружающей среды, либо для изменения направления специфических путей метаболизма, либо для простой индукции высокого уровня экспрессии отдельного требуемого продуктапротеина.

Регулирование программ развития растений химическим путем может позволить фермеру задавать время, когда должны наступать конкретные стадии, такие как развитие цветков, опадание листьев или плодов или другие важные стадии развития. Такое регулирование химическим путем позволит фермеру более гибко реагировать на условия окружающей среды, такие как раннее наступление зимы или дождливой весны. Такие изменения могут быть сделаны с помощью регулирования генов, имеющих решающее значение для развития или реакции на условия окружающей среды, по аналогии с гомеотическими генами Иго8орЫ1а.

Также может быть обеспечено достижение ряда преимуществ для регулирования экспрессии гена, участвующего в метаболическом обмене. Предполагается, что растением может быть израсходовано только фиксированное количество энергии и что любое усиление определенного пути метаболизма, такого как биосинтез запасаемых протеинов, должно приводить к одновременному снижению процесса биосинтеза в конкурентных энергетических путях, таких как синтез крахмала или липидов. В случае, когда такие изменения путей биосинтеза оказываются приемлемыми только по достижении растением определенной стадии развития (т.е. созревание по отношению к росту), химическое регулирование экспрессии гена может оказаться целесообразным или даже необходимым для достижения определенных изменений биосинтеза.

Регулирование экспрессии гена химическим путем может оказаться целесообразным для обеспечения высоких уровней сверхэкспрессии определенного протеина. Известно, что определенные протеины являются токсичными для клетки при экспрессии в гетерологичном хозяине, чужеродном субклеточном компартменте или даже при экспрессии с необычно высоким уровнем. Регулирование химическим путем экспрессии таких протеинов может быть либо благоприятным для нормального роста растения, либо даже необходимым для получения достаточной растительной массы при использовании растения в качестве фабрики биосинтеза протеина. Протеины, которые могут быть пригодны для крупномасшабного биосинтеза в растениях, включают промышленные ферменты, фармацевтические протеины, антигены, а также другие протеины.

Способы биологического анализа для выявления лигандов для рецепторов стероидных гормонов являются известными (Еуап8 и др., патент США № 5298429). Описанные рецепторы ограничены рецепторами глюкокортикоида, минералкортикоида, гормонов, родственных эстрогену, и тироидного гормона.

Этими рецепторами трансформировали культуру клеток почки мыши (линии клеток СУ-1 или СО8) и тестировали на их способность трансактивировать экспрессию химерного гена САТ в присутствии соответствующего гормона млекопитающего. В известной литературе не описаны ни трансформация растительных клеток с помощью этих рецепторов, ни конструирование экспрессируемых в растении генов, ни использование рецепторов, отличных от таковых, для которых лигандом является гормон млекопитающего.

Было сделано предположение (Ого и Ενапк, XVО 91/14695), что И8Р является ретиноидным рецептором насекомого. В этом примере ХК2С, кодирующим И8Р, трансформируют культуру клеток насекомого (линия клеток 82) для трансактивации химерного гена САТ в ответ на добавление ретиноевой кислоты. В описании к указанной выше заявке предполагается, что клетки насекомого или животного, транс формированные такими ретиноидными рецепторами насекомого, могут использоваться для скрининга соединений в отношении их способности приводить к активации рецепторов. Однако Ого и др. позднее показали в опытах на культуре клеток ОгоюрНПа. что И8Р не активируется ретиноевой кислотой, и в условиях, при которых КХК является реактивным, И8Р не реагирует ни на один из изученных ретиноидов или ювеноидов, включая метопреновую кислоты (Нагтоп и др. и приведенные в этой работе ссылки).

На основании приведенного в данном описании того неожиданного факта, что ювенильный гормон и его агонисты являются лигандами для И8Р и что И8Р может использоваться для активации в растительных клетках экспрессии гена-мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов, в настоящее время представляется возможным обнаружение новых лигандов для рецептора И8Р, которые эффективны в окружающей среде, представляющей собой растительную клетку. Скрининг базируется на экспрессии кассеты экспрессии мишени, кодирующей регулируемый рецептором репортерный ген в трансгенных растениях или растительных клетках, которая также экспрессирует трансгенный полипептид рецептора И8Р, а также необязательно вспомогательный рецепторный полипептид, отличный от полипептида рецептора И8Р. Химические соединения в различной концентрации, исследуемые на их способность индуцировать опосредуемую рецептором И8Р активацию экспрессии полипептида-мишени, приводят в контакт с трансгенным растением или растительными клетками, после чего проводят анализ экспрессии репортерного гена для определения экспрессии полипептида-мишени. Тестируемые соединения, которые проявляют активацию или статистически достоверное увеличение экспрессии полипептида-мишени, а также тестируемые соединения, которые проявляют ингибирование или статистически достоверное уменьшение экспрессии полипептида-мишени, признаются лигандами полипептида рецептора И8Р. Способ позволяет определить, являются ли лигандами тестируемые соединения, для которых ранее не было известно, что они являются лигандами И8Р в среде, представляющей собой растительную клетку, или подтвердить, что лигандами являются тестируемые соединения, для которых предполагалось, что они являются лигандами И8Р в окружающей среде, представляющей собой растительную клетку. Таким образом, согласно настоящему изобретению стало возможным получать лиганды полипептида рецептора И8Р, осуществляя следующие стадии:

- синтез новых тестируемых соединений в соответствии с общепринятыми методами, известными в химии,

- трансформацию растительной клетки с помощью кассеты экспрессии рецептора И8Р, кодирующей полипептид рецептора И8Р, и кассеты экспрессии мишени, кодирующей полипептид-мишень,

- культивирование клеток потомства этих трансформированных растительных клеток,

- экспрессию полипептида рецептора И8Р в клетках потомства,

- контактирование клетки потомства с новым тестируемым соединением, синтезируемым по описанной выше методике, и

- определение экспрессии полипептидамишени,

- повторение двух предыдущих стадий процесса с использованием других новых тестируемых соединений,

- отбор тестируемого соединения, которое в значительной степени активирует или ингибирует экспрессию полипептида-мишени, и

- дополнительный химический синтез отобранного соединения.

Лиганды полипептида рецептора И8Р, полученные в соответствии с описанными выше стадиями процесса, представляют собой еще один объект настоящего изобретения.

Кроме того, данный способ может быть использован для выявления антагонистов или ингибиторов опосредуемой рецептором И8Р активации экспрессии полипептида-мишени. Такие антагонисты могут быть выявлены по их способности снижать индуцируемую лигандом активность экспрессии полипептида-мишени.

В этом способе скрининга в качестве кассеты экспрессии мишени могут быть использованы различные репортерные гены. Одним из пригодных репортерных генов является ген люциферазы светляка. Его использование в кассете экспрессии мишени описано ниже в примерах 7 и 9. Другим пригодным репортерным геном является ген ОИ8 или глюкуронидазы, которая катализирует расщепление хромогенного субстрата, такого как 5-бром-4-хлор-3-индолил-вΌ-глюкуронид или орто-нитрофенил-β-Όглюкуронид. Репортерный ген ОИ8 предпочтителен при получении продукта хромогенной реакции, который может быть определен количественным способом, например, с помощью спектрометрии или качественным способом путем визуальной оценки. Кассетами экспрессии рецептора, пригодными для скрининга, являются И8Р или химерные варианты И8Р, такие как И8Р-УР16 или УР16-И8Р.

Поскольку последовательность И8Р сходна с последовательностью рецептора КХКа млекопитающего и КХК обладает способностью образовывать гетеродимеры с ЕсК (Тйотак и др., №1Ц.1гс 362: 471-475 (1993)), кассеты экспрессии рецептора, кодирующие КХК, также могут быть использованы в скрининге. Таким образом может быть установлено, в какой сте пени лиганды И8Р могут быть пригодны в качестве лигандов КХК в растительных клетках, или могут быть выявлены химические вещества, отличные от ювенильного гормона или одного из его агонистов и являющиеся пригодными химическими лигандами КХК в растительных клетках.

Примеры

В следующих примерах дополнительно описаны материалы и методы, использованные при осуществлении изобретения, и полученные при этом результаты. Эти примеры представлены только с целью иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Конструирование экспрессируемой в растении кассеты экспрессии рецептора, кодирующей рецептор экдизона.

Кодирующую область ДНК для рецептора экдизона (ЕсК) БгокорШа выделяли из библиотеки кДНК, происходящей из куколки линии СаПоп 8 (день 6), полученной в λ§ΐ11 (С1оп1ес11. каталожный номер 1Ь 1005Ь), и из полученных с помощью геномной ПЦР фрагментов олигонуклеотидов, сконструированных на основе опубликованной последовательности изоформы В1 ЕсК (Кое11е и др., Се11 67: 59 (1991)). Последовательность изоформы В1 ЕсК. подтверждали с помощью автоматического секвенирования с использованием стандартных методов сравнительного анализа последовательности с опубликованной последовательностью (Та1Ьо1 и др., Се11 73: 1323 (1993)). Экспрессируемую полноразмерную кодирующую область ЕсК модифицировали таким образом, чтобы она содержала сайт ВатН1 непосредственно за старт-кодоном против хода транскрипции, используя в ПЦР олигонуклеотид 8Е43 (5'-С6С 66А ТСС ТАА АСА АТС АА6 666 С6С Т66 ТС6 ААС ААС 66С-3', 8Е6 ΙΌ N0: I). Растительные векторы экспрессии рМЕ6 и рМЕ7 содержат промотор 358 вируса мозаики цветной капусты (358 СаМУ), интрон 1 А6111 кукурузы и участок полиаденилирования гена нопалинсинтазы и сигнал терминации транскрипции (см. 6о££ и др., 6епе§ апб Беуе1ортеп1 5: 298 (1991)). Векторы рМЕ6 и рМЕ7 отличаются только по ориентации полилинкера, использованного для встраивания требуемой кодирующей последовательности. Полноразмерную кодирующую последовательность ЕсК лигировали в растительном векторе экспрессии рМЕ6, содержащем 358 СаМУ, используя фланкирующие сайты рестрикции ВатН1. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 358/ЕсК.

Пример 2: Конструирование экспрессируемой в растении кассеты экспрессии рецептора, кодирующей рецептор ИИгакрпаск.

кДНК, кодирующая нативный рецептор и11га5рйас1е (И8Р) БгокорШа, описана у НеппсН и др., М.1с1е1с Ас1б§ Кекеагсй. 18: 4143 (1990). Полноразмерную последовательность, коди рующую И8Р, с фланкирующими 5'- и 3'нетранслируемыми областями лигировали с растительным вектором экспрессии рМЕ7 (описанном в примере 1), используя фланкирующие сайты рестрикции ЕсоК1. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 358/И8Р.

Пример 3. Конструирование кассеты экспрессии рецептора, имеющей ДНКсвязывающий домен 6АЕ4 и лигандсвязывающий домен ЕсК.

Конструировали кассету экспрессии рецептора, в которой ДНК-связывающий домен ЕсК замещен на ДНК-связывающий домен 6АЕ4, слитый в Ν-концевом положении. Кодирующую область ДНК для ЕсК Бгокорйба получали аналогично примеру 1. Кодирующую последовательность для ДНК-связывающего домена 6АЕ4 субклонировали из плазмиды рМА210 (Ма и РйзЬпе, Се11 48: 847 (1987)).

Кассету экспрессии рецептора, кодирующую химерный рецепторный полипептид 6АЕ4-ЕсК, конструировали путем слияния ДНК-связывающего домена 6АЕ4 с лигандсвязывающим доменом и карбоксильным концом ЕсК. При осуществлении слияния для интродукции с помощью ПЦР сайга ВатН1 в последовательность кДНК для ЕсК в положении нуклеотида, эквивалентного остатку аминокислоты 330 (непосредственно за ДНК-связывающим доменом ЕсК), применяли олигонуклеотид 8Е23 (5'-С6С 666 АТС САТ 6С6 6СС 66А АТ6 С6Т С6Т ССС 6-3', 8 ЕС) ГО N0: 2). Образовавшуюся усеченную кодирующую последовательность ЕсК (ЕсК^330-878) субклонировали в плазмиде рК8+ (фирма 81га1адепе).

Субклон 6АЕ4 получали из плазмиды рМА210, которая содержала кодирующую последовательность для ДНК-связывающего домена (аминокислоты 1-147), субклонируя Νконец кодирующей последовательности ДНК 6АЬ4 в сайте С1а1 в плазмиде рК8 + (фирма 81га1адепе), как описано выше (6оГГ и др., 6епе§ апб Беуе1ортеп1 5: 298 (1991)). Эта плазмида была названа р8К6АЬ2 и ее разлагали с помощью С1а1 и Кпр1 и встраивали следующий двухцепочечный олигонуклеотид:

5’- СССОССАТССТААОТААСТААОСТАС-3 ' (ЗЕС Ιβ N0:3) ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ

3'- ССССТАСОАТТСАТТСАТТС - 5' (ЗЕО Ю N0:4)

Образовавшаяся плазмида была названа как р8К6АЬ2.3. Полный гибрид 358/6АЬ4ЕсК получали с использованием сайтов ВатН1 в полилинкерах, фланкирующих ДНКсвязывающий домен 6АЕ4 в плазмиде рК8+ и фрагмент ЕсК^330-878 в рК8+. Эти кодирующие последовательности лигировали в векторе экспрессии однодольных растений рМЕ6 (описанном в примере 1) с использованием фланкирующих сайтов рестрикции ЕсоК1. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 358/6АЬ4_ЕсК330-878_.

Пример 4. Конструирование экспрессируемой в растении кассеты экспрессии рецепто35 ра, имеющей лигандсвязывающий домен И11гакр1гас1е и трансактивирующий домен УР16.

Конструировали кассету экспрессии рецептора, которая содержит лигандсвязывающий домен И8Р вместе с трансактивирующим доменом УР16, слитые либо с Ν-концом, либо с Сконцом полипептида И8Р.

Для конструирования кассеты экспрессии рецептора, кодирующей химерный полипептид, имеющий трансактивирующий домен УР16 в Сконцевом положении, карбоксильный конец и стоп-кодон кДНК рецептора И8Р (описанной в примере 2) удаляли путем субклонирования в плазмиде рК8+ (фирма 81га1адепе), используя сайт Х1ю1 на нуклеотиде номер 1471 кодирующей последовательности И8Р. Образовавшийся субклон И8Р, кодирующий аминокислоты с 1 по 490, сливали с трансактивирующим доменом УР16, используя фланкирующий сайт рестрикции Крп1 субклона И8Р и сайт Крп1 плазмиды р81Т1193СКЕ3, который кодирует 80 Сконцевых аминокислот УР16 (ТпехепЬегд и др., Сепек апб Эеуе1ортеп1 2: 718-729 (1988)). Образовавшийся гибрид И8Р-УР16 клонировали в растительном векторе экспрессии рМЕ6, содержащем 358 СаМУ (описанном в примере 1), используя сайты рестрикции ЕсоК1 и ВатН1, фланкирующие кодирующую последовательность И8Р-УР16. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 358/И8Р-УР16.

И8Р-производное с доменом активации транскрипции, слитым с Ν-концом, конструировали сначала путем создания сайта ВатН1, соседнего со стартовым кодоном И8Р, используя в ПЦР олигонуклеотид 8Е42 (5'-ССС ССА ТСС АТС САС ААС ТСС САС САС САС-3'; 8ЕО ГО N0: 5). Стоп-кодон в УР16 удаляли и интродуцировали фланкирующий сайт ВатН1, используя олигонуклеотид 8Е37 (5'-ССС ССА ТСС ССС АСС СТА СТС СТС ААТ ТС-3', 8 ЕЕ) ГО Ν0: 6) и стартовый кодон с растительной консенсусной последовательностью, расположенной непосредственно за стартовым кодоном против хода транскрипции, а также интродуцировали сайт ВатН1 на Ν-конец, используя олигонуклеотид 8А115 (5'-СТС САС СТС ТСС САТ ССТ ААА АСА АТС ССС ССС ССС АСС САТ СТС-3'; 8Е0 ГО N0: 7) в качестве праймера в ПЦР. Образовавшийся домен активации УР16 и кодирующую последовательность И8Р (кодирующую аминокислоты с 1 по 507) объединяли в рамке считывания с помощью соседних сайтов ВатН1 и кодирующую последовательность УР16-И8Р встраивали в растительный вектор экспрессии рМЕ7, содержащий 358 СаМУ, с помощью 5'-сайта ВатН1 и 3'-сайта ЕсоК!. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 358/УР16-И8Р.

Пример 5. Конструирование экспрессируемой в растении кассеты экспрессии рецептора, имеющей ДНК-связывающий домен и лигандсвя зывающий домен Ес К и трансактивирующий домен регуляторного гена С1 кукурузы.

Гибрид ЕсК^227-825-С1 получали, помещая стартовый кодон непосредственно перед ДНКсвязывающим доменом ЕсК, с использованием в ПЦР на полноразмерной кодирующей последовательности ЕсК олигонуклеотида 8Е30 (5'-ССС ССА ТСС АТС ССТ ССС САТ СТС ТСС ССТ ТС-3'; 8Е0 ГО N0: 8). Кодирующую последовательность домена активации транскрипции (аминокислоты 219-273) протеина С1 кукурузы (Со££ и др., Сепек апб Эеуе1ортеп1 5: 298-309 (1991)) сливали в рамке считывания с кодирующей последовательностью для аминокислот с 51 по 825 ЕсК (в сайте рестрикционного фермента Крп1 ЕсК). Трансактивирующий домен С1 связывали с ЕсК с помощью полилинкера, кодирующего УРСРР8К8КУ818БНА (8 ЕЕ) ГО N0: 9). Растительный экспрессирующий векторный гибрид 358/ЕсК^227-825-С1 конструировали путем встраивания фрагмента ВатН1, несущего кодирующую последовательность, в вектор рМЕ7. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 358/ЕсК^227-825-С1.

Пример 6. Конструирование кассеты экспрессии рецептора, имеющей ДНК-связывающий домен САБ4, лигандсвязывающий домен из ЕсК и трансактивирующий домен регуляторного гена С1 кукурузы.

Гибрид САЬ4-ЕсК³³⁰'⁸²⁵-С1 конструировали с использованием описанной в примере 3 конструкции САЬ4-ЕсК^330-878 и конструкции ЕсК^227-825-С1, описанной в примере 5. Последовательность кодирующей области ЕсК (начиная с аминокислоты 456) заменяли в сайте АаШ. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 358/САБ4ЕсК^330-825-С1.

Пример 7. Конструирование экспрессируемой в растении кассеты экспрессии мишени, кодирующей ген люциферазы светляка, имеющий реагирующий элемент для ДНКсвязывающего домена САЕ4.

Экспрессируемую в растении кассету экспрессии мишени, кодирующую ген люциферазы светляка, имеющий реагирующий элемент для ДНК-связывающего домена САЕ4, конструировали следующим образом. Коровый промотор Вгопхе-1 (В/1) кукурузы, обеспечивающий синтез люциферазы светляка, удаляли из В/1репортера рВ/1ЕисК98 (Ко!й и др., Р1ап! Се11 3: 317 (1991)) с помощью сайтов N№1 и 8рЫ и помещали в плазмиду, полученную из плазмиды рИС68, несущую ген люциферазы. Модифицированный коровый промотор В/1 содержит последовательности сайта N№1 (ССТАСС) и промотора В/1 до нуклеотида в положении -53 (Ко!й и др., Р1ап! Се11 3: 317 (1991)). Из регуляторного репортера САБ4 плазмиды рСАЬЕис2 удаляли десять сайтов связывания САЬ4 (Со££ и др., Сепек апб Эеуе1ортеп1 5: 298 (1991)), обрабатывая с помощью ЕсоК! и РкИ и встраивая в вектор рВ1ие8спр1 (фирма 81га1адепе) с исполь37 зованием этих же сайтов рестрикции. Сайт Ηίη6ΙΙΙ на 5'-конце сайтов связывания САЬ4 заменяли на сайт ВатН1 с помощью встраивания адаптера НшбШ/ВатШ/НшбШ и образовавшийся фрагмент ВатН1, содержащий сайты связывания СЛЬ4, удаляли и помещали в сайт ВдШ против хода транскрипции корового промотора Βζΐ, обеспечивающего синтез люциферазы. Эта кассета экспрессии мишени названа как (ΟΑΒ⁴5.8.)ιο^-Βζ1ΤΑ_ΤΛ^/Βπε.

Пример 8. Конструирование экспрессируемой в растении кассеты экспрессии мишени, кодирующей ген люциферазы светляка, имеющий прямой повтор реагирующего элемента.

Экспрессируемую в растении кассету экспрессии мишени, кодирующую ген люциферазы светляка, имеющий прямой повтор (ΌΚ.) реагирующего элемента с полусайтом ЕсНЕ и РХВ-предпочтительным полусайтом, конструировали следующим образом. Конструкцию коровый промотор Βζΐ кукурузы люцифераза в плазмиде, полученной из плазмиды рИС68, как описано в примере 7, применяли в качестве исходного материала. Синтезировали двухцепочечные синтетические олигонуклеотиды, содержащие ΌΚ. НЕ и спейсинг длиной 3 пары оснований между полусайтами, с помощью липких концов ВатН1 и ВдШ (8Е77: 5'-САТ ССС ТАС ССС ТСА ССА АСТ ТСА СТС ССА-3'; 8ЕО ГО N0 10) (8Е78: 5'-САТ СТС ССА СТС ААС ТТС СТС АСС ССТ АСС-3'; 8ЕО ГО N0: 11) в результате фосфорилирования, отжига и лигирования против хода транскрипции корового промотора Βζ1 путем встраивания в уникальный сайт Вд111. Три копии НЕ получали путем последовательной обработки Вд111 и встраивания дополнительных двухцепочечных олигонуклеотидов. Эта кассета экспрессии мишени названа как (^Κ3)з-Βζ1_ΤΑΤΑ/^ис.

Пример 9. Трансформация растительных клеток и регулирование экспрессии полипептида-мишени с помощью рецепторных полипептидов в присутствии химического лиганда.

Регулирование экспрессии полипептидамишени с помощью различных рецепторных полипептидов, включая химерные рецепторные полипептиды по изобретению, может быть продемонстрировано путем одновременной трансформации растительных клеток необходимыми генными конструкциями с использованием высокоскоростной бомбардировки микроснарядами с последующим биохимическим анализом на присутствие полипептида-мишени. Необходимые генные конструкции включают кассету экспрессии рецептора И8Р, которая кодирует полипептид рецептора И8Р (фиг. 1). Необязательно кассета экспрессии рецептора И8Р может быть трансформирована вместе с вспомогательной кассетой экспрессии рецептора, которая кодирует полипептид рецептора, отличного от И8Р (фиг. 2 и 3). Кроме того, также необходима кассета экспрессии мишени, которая кодирует полипептид-мишень.

Кассеты экспрессии одновременно доставляли в суспензионные клетки кукурузы, которые культивировали в жидкой среде N6 (СБи и др., 8с1епсе 81шса XVIII: 659-668 (1975)) с помощью высокоскоростной бомбардировки микроснарядами, используя стандартные методы осаждения ДНК на микроснаряды и осуществление высокоскоростной бомбардировки с помощью сжатого гелия (устройство РЭ8-1000/Не. фирма ВюВаб, Нетси1е8, СА). Подвергнутые трансфекции клетки инкубировали в жидкой суспензии в среде N6 в присутствии соответствующего химического лиганда в течение приблизительно 48 ч. После инкубации трансформированные клетки собирали и затем гомогенизировали при 0°С. Дебрис удаляли из экстракта центрифугированием при 10000хд при 4°С в течение 5 мин.

Экспрессию полипептида-мишени обнаруживали путем анализа экстракта на присутствие продукта, кодируемого кассетой экспрессии мишени. Обычно используемой кодирующей последовательностью полипеп-тидамишени при тестировании регулирования экспрессии с помощью рецепторных полипептидов в присутствии химического лиганда является люцифераза светляка. Активность люциферазы светляка определяют с помощью количественной оценки хемолюминесценции, которая обусловлена катализируемым люциферазой фосфорилированием люциферина, с использованием АТФ в качестве субстрата (набор Рготеда БиаГегаха КБ, каталожный номер Е1500) с помощью люминометра типа Апа1уБса1 Ьитшексепсе Мобе1 2001.

Пример 10. Рецепторные полипептиды САЬ4-ЕсК^330-825-С1 и ИЗР-’УРШ, активирующие экспрессию полипептида-мишени в растительных клетках, и активация, блокируемая агонистами ювенильного гормона.

Используя метод трансформации, изложенный в примере 9, кассетой экспрессии рецептора 358/САЬ4-ЕсК^330-825-С1 (пример 6), кассетой экспрессии рецептора 358/И8Р-9^гР16 (пример 4) и кассетой экспрессии мишени (СΑ^4ь.₈.)1₀-Βζ1_ΤΑΤΑ/^ис (пример 7) совместно трансформировали клетки кукурузы. Трансформированные клетки инкубировали в присутствии 10мкМ феноксикарба или метопрена в качестве химических лигандов в течение приблизительно 48 ч. Анализ люциферазы осуществляли аналогично примеру 9.

Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Таблица 2

Рецептор	Химический лиганд	Активность люциферазы (единицы света)
Эксперимент № 1
нет	нет	2,503
3.^/САЕ4-ЕсК330-825-С1 +
35δ/υδΡ-νΡ16	нет	277,862
3.^/САЕ4-ЕсК330-823-С1 +	фенок-
35δ/υδΡ-νΡ16	сикарб	77,418
3.^/САЕ4-ЕсК330-823-С1 +	мето-
35δ/υδΡ-νΡ16	прен	14,786
Эксперимент № 2
нет	нет	1,302
3.^/САЕ4-ЕсК330-823-С1 +
35δ/υδΡ-νΡ16	нет	178,092
3.^/САЕ4-ЕсК330-823-С1 +	мето-
35δ/υδΡ-νΡ16	прен	5,730

Вышеприведенные результаты показывают, что 5'-регуляторная область кассеты экспрессии мишени, содержащая реагирующие элементы 6АЬ4, может быть активирована в растительных клетках с помощью рецепторных полипептидов 6АЬ4-ЕсЯ-С1 и υδΡ-νΡ16 и что эта активация является обратимой в присутствии агониста ювенильного гормона. Уровень экспрессии полипептида-мишени люциферазы оказался в 3,5-31 раз ниже в присутствии агониста ювенильного гормона по сравнению с вариантом, когда он отсутствовал.

Пример 11. Рецепторные полипептиды 6АЬ4-ЕсК^330-825-С1 и υδΡ-νΡ16, активирующие экспрессию полипептида-мишени в растительных клетках, и активация, блокируемая агонистами ювенильного гормона.

Используя метод трансформации, описанный в примере 9, кассетой экспрессии рецептора ^п^/САЕ4-ЕсЯ^33,0-825-С1 (пример 6), кассетой экспрессии рецептора 35δ/υδΡ-νΡ16 (пример 4) и кассетой экспрессии мишени (6АЬ4ь.₈.)1₀В/1_ТАТА/Ьис (пример 7) совместно трансформировали клетки кукурузы. Трансформированные клетки инкубировали в течение приблизительно 48 ч в присутствии 10мкМ тебуфенозида с использованием 10мкМ феноксикарба или метопрена в качестве химических лигандов или без них. Анализ люциферазы осуществляли аналогично примеру 9. Результаты представлены в табл. 2.

Рецептор	Химический лиганд	Активность люциферазы (единицы света)
нет	нет	1,302
3.^/САЕ4-ЕсК330-823-С4 +
35δ/υδΡ-νΡ16	нет	178,092
3.^/САЕ4-ЕсК330-823-С4 +	тебуфено-
35δ/υδΡ-νΡ16	зид	908,912
35δ/6А^4-ЕсЯ330-825-С1 +	тебуфено-
35δ/υδΡ-νΡ16	зид + ме-
	топрен	159,873

Вышеприведенные результаты показывают, что 5'-регуляторная область кассеты экспрессии мишени, содержащая реагирующие элементы 6АЬ4, может быть активирована в растительных клетках с помощью рецепторных полипептидов 6АЬ4-ЕсЯ-С1 и υδΡ-νΡ16 в ответ на присутствие химического лиганда тебуфенозида и что эта активация блокируется в присутствии агониста ювенильного гормона метопрена. Уровень индуцированной тебуфенозидом активации экспрессии гена люциферазы при использовании только тебуфенозида оказался увеличенным приблизительно в 6 раз, и он полностью блокировался в присутствии агониста ювенильного гормона метопрена.

Пример 12. Рецепторный полипептид νΡ16-υδΡ, активирующий экспрессию полипептида-мишени в растительных клетках.

Используя метод трансформации, описанный в примере 9, кассетой экспрессии рецептора 35δ/νΡ16-υδΡ (пример 4) и кассетой экспрессии мишени (ОК3)₃-Вх1_ТЛТЛ/Еис (пример 8) совместно трансформировали клетки кукурузы. Трансформированные клетки инкубировали в присутствии 10 мкМ метопрена в качестве химического лиганда в течение 48 ч. Анализ люциферазы осуществляли аналогично примеру 9. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Рецептор	Химический лиганд	Активность люциферазы (единицы света)
нет	нет	5,690
35δ/νΡ16υδΡ	нет	29,967
35δ/νΡ16υδΡ	метопрен	485,458

Вышеприведенные результаты показывают, что 5'-регуляторная область кассеты экспрессии мишени, содержащая прямой повтор реагирующих элементов, может быть активирована в растительных клетках с помощью рецепторного полипептида νΡ16-υδΡ в присутствии агониста ювенильного гормона. Уровень экспрессии полипептида-мишени люциферазы оказался примерно в 16 раз выше по сравнению с таковым, который наблюдался в отсутствии агониста ювенильного гормона.

Пример 13: Конструирование векторов для трансформации растений АтаЫборщк, которые экспрессируют ЕсВ-, И8Р или КХКпроизводные и несут регулируемый рецептором репортерный ген.

Векторные плазмиды, содержащие Т-ДНК АдгоЬас1етшт, конструировали из ранее описанных плазмид рСРТУ-Кап и рСРТУ-Нуд (Вескег и др., Р1ап1 Мо1. Βΐοΐ. 20: 1195-1197 (1992)). 8ас1/Ншб111-фрагмент репортерного гена шбА (СИ8) обеих плазмид рСРТУ-Кап и рСРТУ-Нуд заменяли на полилинкер 8ас1/Ншб111 из рСЕМ42£(+), р8РОВТ1, рВ1иекспр1К8(+), р1С20Н или рИС18, получая плазмиды р8ССЕ^, р8ССЕХ, рЗсСрУ, р8ССЕ2, р8СССА, р8СССС, р8СССО, р8СССЕ, р8СССЕ и р8СССС соответственно. СЛЬ4-регулируемый репортерный ген люциферазы в виде кассеты экспрессии мишени конструировали как плазмиду Т-ДНК АдгоЬас1етшт, сначала субклонируя фрагмент Крп1/Нтб111 длиной 328 пар оснований с 10 сайтами связывания СЛЬ4 и ТАТА гена Вгопхе-1 аналогично примеру 7 в сайтах Крп1/Ншб111 модифицированной плазмиды р8РЬис+ (фирма Рготеда), несущей репортерный ген люциферазы, создавая плазмиду р8ССЕО1. Крп1/ХЬа1-фрагмент длиной 1,991 т.п.н. из р8ССЕО1, содержащий сайты связывания САБ4-ТАТА Βζΐ-репортер люциферазы, субклонировали в векторе Т-ДНК с помощью лигирования с Ыбе1/8ре1фрагментом длиной 7,194 т.п.н. р8ССЕХ1 и Ыбе1/Крп1-фрагментом длиной 4,111 т.п.н. описанной выше плазмиды р8ССЕ21. Образовавшуюся плазмиду обозначили как р8СССЬ1, и она несет селектируемый маркер ИРТП под контролем промотора пок, обусловливающий устойчивость к канамицину трансгенного растения, и САЕ4-регулируемый репортерный ген люциферазы. САБ4-регулируемый репортерный ген СИ8, включающий 10 сайтов связывания САБ4, ТАТА-область 358 и кодирующую область СИ8, конструировали аналогичным образом и полученную из этих фрагментов плазмиду обозначили как рТА86. Прямой повтор (ΌΡ) реагирующего элемента репортерного гена с 3 копиями ΌΚ. ВЕ, ТАТА Βζΐ, кодирующую область люциферазы и терминатор пок, аналогичный таковому, описанному в примере 8, также конструировали способом, аналогичным описанному для р8СССЬ1, и полученную плазмиду назвали как р8ССНИ1. Кассеты экспрессии рецептора, описанные выше в примерах 3-6, применяли для создания аналогичных Т-ДНК АдтоЬас1етшт конструкций, несущих промотор 358 СаМУ и сигнал полиаденилирования пок. Одиночные и двойные конструкции рецепторов получали путем субклонирования соответствующей кассеты экспрессии в плазмиде р8СССЬ1, несущей САЕ4-репортер люциферазы.

Пример 14. Получение трансгенных растений АтаЫборкщ, экспрессирующих УР16-И8Р и несущих репортерный ген ΌΒ-люциферазы.

АгаЫборкк ЛаНапа (Колумбия) трансформировали вектором АдгоЬас1епит, несущим промотор 358 СаМУ и ΌΡ-репортер люциферазы (аналогично примеру 13, см. выше) с помощью следующего метода, основанного на вакуумной пропитке. Электрокомпетентные клетки АдтоЬас1епит СУ3101 получали путем инкубирования клеток АдгоЬас1епит СУ3101 в двукратной УТ-среде при 28°С с аэрацией в течение 24-30 ч до ОП₆₀₀ (оптическая плотность), равной приблизительно 0,5-0,7 единиц. Клетки охлаждали на льду в течение 10-30 мин и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Супернатант удаляли и клеточный дебрис ресуспендировали в однократном объеме охлажденного на льду 10%ного глицерина. Клетки снова центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4° С. Супернатант удаляли и клеточный дебрис ресуспендировали в 0,05-кратном объеме охлажденного на льду 10%-ного глицерина. Клетки снова центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Супернатант удаляли и клеточный дебрис ресуспендировали в 0,02-кратном объеме охлажденного на льду 10%-ного глицерина. Клетки снова центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Супернатант удаляли и клеточный дебрис ресуспендировали в 0,02-кратном объеме охлажденного на льду 10%-ного глицерина. Клетки снова центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Супернатант удаляли и клеточный дебрис ресуспендировали в 0,01кратном объеме охлажденного на льду 10%-ного глицерина. 200 мл клеток распределяли в аликвотных количествах в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, быстро замораживали в жидком Ν₂ и хранили при -80°С. Электрокомпетентные клетки использовали в течение не более чем 6 недель при хранении при -80°С. Замороженные электрокомпетентные клетки подвергали оттаиванию на льду и 40 мл этих клеток вносили в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. К подвергнутым оттаиванию клеткам добавляли по 1 мл соответствующей плазмидной ДНК АдгоЬас1епит (2-10 нг) и смешивали при охлаждении на льду. Смесь клетка/плазмида переносили в предварительно охлажденную кювету для электропорации фирмы Вю-Ваб размером 0,2 см и подвергали электропорации при 2,0 кВ, 600 Ом, 25 мкФ с постоянной времени, составляющей 6 мс. В кювету для электропорации добавляли 1 мл двукратной УТ-среды, раствор клетка/плазмида перемешивали кончиком пипетки и содержимое переносили в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Затем клетки инкубировали при 37 °С в течение 1 ч на шейкере при 200 об/мин. Клетки отделяли центрифугированием в течение 2 мин при значении регулировочного параметра 6 в микроцентрифуге Эппендорфа с регулируемой скоростью, суперна тант снимали и клеточный дебрис ресуспендировали в оставшейся жидкости. Ресуспендированные клетки наносили на пластину с ЬВ-средой, содержащей соответствующий антибиотик. Пластины инкубировали при 28-30°С в течение 2-3 дней. 50 мл ЬВ-культуры инокулировали одной трансформированной колонией в колбах объемом 250 мл, содержащих рифамицин в концентрации 100 мкг/мл, гентомицин в концентрации 25 мкг/мл и канамицин в концентрации 100 мкг/мл. Культуры инкубировали в течение 24-36 ч при 28°С при 250 об/мин и 10 мл культуры использовали для инокуляции 500 мл среды ЬВ + антибиотик в двухлитровых колбах. Эту культуру инкубировали в течение ночи при 28° С при встряхивании при 250 об/мин. ДНК плазмиды выделяли из этой культуры АдгоЬас1епит и оценивали с помощью рестрикционного анализа.

Растения АгаЫборЦк выращивали в покрытой сеткой почве в пластиковых горшках площадью 3 квадратных дюйма в фитотроне, отрегулированном на 16-часовой световой период и на 8-часовой темновой период, при 20°С в течение 4-5 недель. Растения выращивали до тех пор, пока цветочная меристема не достигала высоты приблизительно 2 дюйма. Цветочную меристему растений АгаЫборкЦ, предназначенную для трансформации, удаляли за два дня до обработки АдгоЬабегшт. Культуру АдгоЬас1епиш центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин и образовавшийся дебрис ресуспендировали в 500 мл пропитывающей среды (4,3 г М8-солей/л, 5% сахарозы, 0,01 мг/мл бензиламинопурина, 100 мл/л 8П\\'е1 Ь77, рН 5,8). Растения АгаЫборкЦ пропитывали водой, насыщая почву. 500 мл суспензии клеток бактерий переносили на дно стерильного вакуумного дессикатора и растения АгаЫборЦк в горшках верхушкой погружали в раствор, содержащий АдгоЬас1епшп. В дессикаторе на период времени 5 мин создавали вакуум и затем медленно восстанавливали давление. Вакуумную обработку повторяли три раза, затем растения промывали для удаления избытка АдгоЬас1егшт и возвращали в климатическую камеру. Пропитанным с помощью вакуума растениям давали созреть, зацвести и дать семена. Затем полученные семена высушивали в камере для сушки с низкой влажностью при 95°С в течение приблизительно 5-10 дней. Семена отделяли от высушенных цветков путем дробления, затем просеивали через сито с размером ячеек 425 мкм. Для получения семян требовалось приблизительно 5 недель после вакуумной пропитки. После полного высушивания приблизительно 240 мг семян стерилизовали путем добавления 1 мл 70%-ного ЕЮН, тщательно перемешивали и инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре. Семена центрифугировали в течение короткого промежутка времени при высокой скорости в микроцентрифуге Эппендорфа и удаляли супернатант. Пеллетированные семена ресуспендировали в 1 мл буфера для стерилизации (1 часть 10%-ного тритона Х-100, 10 частей хлорной извести, 20 частей двукратно дистиллированной (д.д.) Н₂О), перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Семена центрифугировали в течение короткого промежутка времени при высокой скорости в микроцентрифуге Эппендорфа и удаляли супернатант. Семена ресуспендировали в 1 мл стерильной д.д. Н2О, перемешивали, центрифугировали при высокой скорости в микроцентрифуге и удаляли супернатант. Эту стадию промывки повторяли три раза, после чего семена переносили в центрифужную пробирку объемом 50 мл для окончательной промывки в 5 мл д. д. Н2О. Семена центрифугировали в течение короткого промежутка времени при максимальной скорости в центрифуге типа Весктап с верхним расположением пробирок. Супернатант сливали и семена ресуспендировали при 50°С в 24 мл стерильной 0,8% (масса/объем) агарозы с низкой температурой плавления, смешивали и добавляли аликвотные количества по 8 мл в каждый из трех планшетов размером по 150 мм со средой для прорастания (СМ) (МигакЫде и 8коод, РЬ.у8ю1. Р1ап1 15: 473-497, 1962), содержащей антибиотик для селекции (либо 50 мкг/мл канамицина, либо 50 мкл/мл гигромицина) и 500 мкг/мл карбенициллина. Высеянные семена инкубировали при 4°С в темноте в течение 24 ч, затем их переносили в климатическую камеру, настроенную на суточный режим, включавший 16-часовой световой период и 8-часовой темновой период, при 20°С. Осуществляли отбор проросших сеянцев на планшетах в течение 5-10 дней, проростки переносили на планшеты со свежей средой для селекции и высаживали в почву через 5-10 дней после дополнительной селекции. Непосредственно после высаживания проростки покрывали пластиковой оболочкой на 2-3 дня, после чего выращивали до начала образования цветочных меристем.

Пример 15. Химическая индукция выделенных тканей трансгенных растений.

Трансгенные растения тестировали в отношении индуцируемой экспрессии гена с помощью следующей методики. Два листа приблизительно одинакового размера срывали с трансгенного растения и инкубировали в воде, содержащей 50 мкг/мл канамицина (или 25 мкг/мл гигромицина в случае, когда трансгенное растение несло этот маркер) с добавлением либо 0,1% этанола, либо 0,1% этанола и 10 мкМ метопрена или феноксикарба. Листья инкубировали в течение приблизительно 24 ч в стандартных условиях для роста, описанных в примере 14. После инкубации с индуцирующим соединением получали экстракт листа путем гомогенизации листа в 500 мкл 100мМ К₂РО₄, 1мМ ДТТ с рН буфера 7,8 при 0°С. Экстракты центрифугировали в течение 5 мин в микроцентрифужной пробирке Эппендорфа при 4°С и хра нили при 0°С до анализа. Люциферазную активность в каждом экстракте определяли, используя люминометр типа Апа1уйса1 Ьиттексепсе Мойе1 2001 и систему для определения люциферазной активности фирмы Рготеда в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрацию протеина в экстракте определяли по методу Р1егсе ВСА Рто1ет Аккау (8тйй и др., Апа1. Вюсйет. 150: 76-85). Значения люциферазной активности выражают в виде световых единиц, измеренных в течение 10 с при комнатной температуре с использованием 100 мкг протеина экстракта. Обработка феноксикарбом привела к увеличению люциферазной активности в 6,2 раза, а обработка метопреном привела к увеличению люциферазной активности в 25 раз, как показано ниже в табл. 4.

Таблица 4

Рецептор	Химический лиганд	Активность люциферазы (единицы света)
нет	нет	638
358/УР16- и8Р	феноксикарб	3,991
358/УР16- и8Р	метопрен	15,790

Пример 16. Скрининг новых лигандов, которые связываются с И8Р, с использованием трансгенного растения или растительных клеток, экспрессирующих производные И8Р или КХК и несущих регулируемый рецептором репортерный ген.

Новые лиганды для И8Р или КХК, эффективные в окружающей среде, представляющей собой растительную клетку, могут быть выявлены с использованием метода скрининга, основанного на экспрессии регулируемого рецептором репортера в качестве кассеты экспрессии мишени в трансгенных растениях или растительных клетках, которые также экспрессируют соответствующий рецепторный полипептид. При этом химические соединения в различных концентрациях, исследуемые на их способность опосредовать с помощью И8Р или КХК активацию экспрессии полипептида-мишени, приводят в контакт с трансгенным растением или растительными клетками, после чего осуществляют анализ экспрессии репортерного гена. Например, 1) на трансгенные растения или растительные клетки, несущие регулируемый репортерный ген люциферазы в качестве кассеты экспрессии мишени и кассеты экспрессии рецепторов САЬ4-ЕсК и И8Р-УР16, можно воздействовать предназначенными для тестирования соединениями и сравнивать их с растениями, не обработанными с помощью усилительного светового устройства, такого как Натата!ки Эе1ес11оп Оеу1се, 2) на трансгенные растения или растительные клетки, несущие регулируемый САЬ4 репортерный ген СИ8 в качестве кассеты экспрессии мишени и кассеты экспрессии рецепторов САЬ4-ЕсК-С1 и УР16-КХК, можно воздействовать предназначенными для тестирования соединениями и сравнивать их с необработанными растениями в отношении их способности катализировать расщепление хромогенного субстрата, такого как 5-бром-4-хлор-3-индолил-в-Оглюкуронид или орто-нитро-фенил-β-Όглюкуронид, 3) на трансгенные растения или растительные клетки, несущие регулируемый ОК КЕ репортерный ген люциферазы в качестве кассеты экспрессии мишени и кассеты экспрессии УР16И8Р, можно воздействовать предназначенными для тестирования соединениями и сопоставлять с растениями, не обработанными усилительным световым устройством, таким как Натата1кн ЫдЫ Эе1ес11оп Оемюе. Положительные контроля, которые целесообразно применять в вышеописанных способах скрининга, включают тебуфенозид и метопрен, но не ограничены ими. В каждом из указанных выше способов более высокий уровень обнаруживаемой экспрессии полипептидамишени в присутствии тестируемого соединения по отношению к уровню экспрессии в отсутствии тестируемого соединения означает, что тестируемое соединение является лигандом либо для И8Р, либо для КХК в зависимости от кассеты экспрессии рецептора, используемой в данном способе. Таким образом может быть установлено, являются ли лигандами для И8Р в окружающей среде, представляющей собой растительную клетку, тестируемые соединения, в отношении которых это было ранее неизвестно, или может быть подтверждено, что тестируемое соединение, которое, как предполагалось, должно быть лигандом для И8Р в окружающей среде, представляющей собой растительную клетку, в действительности является таковым.

Пример 17. Выделение мутантов рецепторного полипептида, обладающих пониженной основной активностью.

Мутации в лигандсвязывающем домене рецептора иИгакр1гас1е (И8Р) получали ш уйто путем ПЦР-мутагенеза, как описано у Ьеипд и др., Тесйпк|ие 1: 11-15 (1989). ПЦР-фрагменты подвергнутого мутации лигандсвязывающего домена И8Р клонировали в векторе экспрессии дрожжей, функционально связывая с активирующим транскрипцию доменом УР16. Конструкции мутантов трансформировали в репортерный штамм дрожжей ССУ1::171, несущий САЬ4-репортер. Трансформанты дрожжей высевали на среду, содержащую индикатор Х-Са1. Мутанты, обладавшие пониженным основным уровнем активности полипептида рецептора И8Р в отношении гетеродимера, образовывали на планшете с индикатором ХСа1 колонии, имеющие цвет от белого до светло голубого, тогда как трансформанты, экспрессировавшие мутантный полипептид рецептора И8Р, образовывали колонии темно-синего цвета. Колонии, имеющие цвет от белого до светло-голубого, тестировали для определения основного и индуцированного химическим лигандом уровня актив ности рецепторного полипептида путем выращивания клеток дрожжей из этих отобранных колоний в 8-среде, содержащей глицерин, этанол и галактозу в качестве источника углерода. Образовавшуюся культуру разделяли на две части, одну из которых обрабатывали ювенильным гормоном или одним из его агонистов, а другую использовали в качестве контроля при отсутствии химического лиганда. После обработки ювенильным гормоном или одним из его агонистов обе, т. е. обработанную и служащую в качестве контроля, части культуры анализировали в отношении активности β-галактозидазы по методу МШсг (Ехрсптсйк ίη Мо1сси1аг бспсЛск, стр. 352-355, ГН. МШсг, ред., Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1й 8рппд НагЬог, Ν.Υ., 1972). Нуклеотидные последовательности, кодирующие мутантные рецепторные полипептиды, выделенные и идентифицированные этим методом, приемлемы для дальнейших исследований, поскольку рецепторные полипептиды, которые они кодируют, могут обладать в растительных клетках пониженной основной активностью, многократно увеличенной индукцией экспрессии гена-мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов или различной реакцией на различные агонисты ювенильного гормона.

Пример 18. Идентификация мутантных рецепторных полипептидов, обладающих улучшенной функцией в растительных клетках.

Кассеты экспрессии рецепторов, кодирующие мутантные полипептиды рецептора И8Р из примера 15, получали в соответствии с вышеописанными примерами 2 и 4. Этими кассетами экспрессии рецепторов в комбинации с кассетами экспрессии мишени из примера 8 трансформировали растительные клетки в соответствии с методом, описанным в примере 9. Трансформированные растительные клетки тестировали в отношении активации 5'-регуляторной области кассеты экспрессии мишени мутантными рецепторными полипептидами в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. Мутантные полипептиды рецептора И8Р, которые обладают в растительных клетках низким основным уровнем экспрессии полипептида-мишени в отсутствии химического лиганда и высоким уровнем экспрессии полипептида-мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов, пригодны для регулирования экспрессии гена в растениях.

Пример 19. Выращивание потомства трансгенных растений.

Трансформированные растения АгаЫйормк ШаЛапа (Колумбия), полученные аналогично примеру 14, выращивали в покрытой сеткой почве в пластиковых горшках площадью 3 квадратных дюйма в фитотроне, отрегулированном на 16-часовой световой период и на 8часовой темновой период, при 20°С в течение 45 недель. Растения содержали интегрированную в их геном чужеродную ДНК в форме рецептора и кассеты экспрессии мишени в соответствии с изобретением. Эту интегрированную ДНК передавали от одного поколения растений к следующему путем оплодотворения в соответствии с жизненным циклом трансформированного растения.

Оплодотворение представляет собой процесс, при котором мужской гаметофит и спорофитные или гаметофитные женские ткани успешно взаимодействуют с получением зиготы. Зрелые пыльцевые зерна производятся в пыльниках цветка и попадают на поверхность стигмы (опыление), где они увлажняются и прорастают с образованием пыльцевой трубки. Клетки спермы в пыльцевой трубке доставляются в зародышевый мешок, находящийся в завязи (гинецее), где происходит сам процесс оплодотворения (слияние гамет) с образованием зиготы. Зигота в виде семени является реализацией следующего поколения линии растений. Это следующее поколение называют потомством трансформированного растения.

Потомство может быть получено путем самоопыления, когда мужской гаметофит и женская гаметофитная ткань происходят из одного и того же отдельного растения. Это означает, что одно отдельное растение является источником геномной ДНК для следующего поколения. В другом варианте потомство может быть получено путем перекрестного опыления двух отдельных растений в результате контактирования мужского гаметофита из одного растения с женскими спорофитными тканями другого растения для получения следующего поколения растений. В этом случае геномная ДНК потомства происходит из двух различных растений. Кроме того, если трансформированное растение подвергается перекрестному опылению нетрансформированным растением, геномная ДНК потомства состоит из трансгенной геномной ДНК одного растения и нетрансгенной геномной ДНК другого растения. Вне зависимости от того, получено ли потомство трансформированного растения путем самоопыления или путем перекрестного опыления, некоторая часть потомства может получить неодинаковый генетический вклад, обусловленный наличием чужеродной ДНК, интегрированной в геном. Этот неодинаковый генетический вклад может быть оценен с помощью методов классической генетики и молекулярной биологии.

Для получения следующего поколения растений, содержащих кассеты экспрессии рецептора и мишени по изобретению, исходным трансформированным растениям давали созреть, зацвести и произвести семена в контролируемых условиях окружающей среды. Затем полученные семена сушили в камере для сушки с низким уровнем влажности при 95°Г в течение приблизительно 510 дней. Семена отделяли от высушенных цветков путем дробления стручков и последующего просеивания через сито с размером ячеек 425 мкм для отделения семян от другого растительного материала. После этого семена могут быть использованы для выращивания следующих поколений растений.

Хотя этот способ получения следующего поколения трансформированных растений описан применительно к АгаЫборык, он в целом применим для всех покрытосеменных растений, имеющих интегрированные в их геном кассеты экспрессии рецептора и мишени по изобретению.

Все публикации и заявки на патент, упомянутые в настоящем описании, относятся к уровню техники в той же области, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации и заявки на патент включены в настоящее описание в качестве ссылок в той степени, как если бы было особо указано, что каждая индивидуальная публикация или заявка на патент включена в качестве ссылки.

Хотя настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на конкретные примеры его осуществления, очевидно, что в объеме прилагаемой формулы изобретения в изобретение могут быть внесены различные изменения и модификации.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ:

(1) ЗАЯВИТЕЛЬ:

(A) НАИМЕНОВАНИЕ: СГОА-СЕЮУ АС (B) УЛИЦА: К1уЬескк1г. 141 (C) ГОРОД: Базель (е) СТРАНА: Швейцария (р) ПОЧТОВЫЙ КОД (ΖΙΒ): 4002 (С) ТЕЛЕФОН: +41 61 691111 (н) ТЕЛЕФАКС: +41 61 6967976 (Ι) ТЕЛЕКС: 962 991 (11) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Ювенильный гормон или один из его агонистов в качестве химического лиганда для регулирования экспрессии гена в растениях путем опосредуемый рецептором трансактивации (ш) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 11 (ίν) ФОРМА ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ДЛЯ КОМПЬЮТЕРА:

(A) ТИП НОСИТЕЛЯ: флоппи-диск (B) КОМПЬЮТЕР: ΙΒΜ РС, совместимый (C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РСΌΟ8/Μ8-ΌΟ8 (В) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Ра1епПп Ке1еаке #1.0, версия #1.30В (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 8Ер ГО ΝΟ: 1:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 42 пары оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /бекс = олигонуклеотид 8Р43 (ш) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ГО ΝΟ: 1:

СОСООАТССТ АААСААТОАА 0С00С0СТ06 ТССААСААСО ОС 42 <

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 8Ер ГО ΝΟ: 2:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 34 пары оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /бекс = олигонуклеотид 8Р23 (ш) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ГО ΝΟ: 2:

С6С600АТСС АТОСООССОО ААТОСОТСОТ ССС6 34 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 8Ер ГО ΝΟ: 3:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 26 пар оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /бекс = положительная цепь олигонуклеотида, используемая для создания р8КСАЕ2.3 (ш) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ГО ΝΟ: 3:

СОООООАТСС ТААОТААОТА АООТАС (2) ИНФОРМАЦИЯ О ТЕЛЬНОСТИ 8Ер ГО ΝΟ: 4:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 20 пар оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /бекс = комплементарная цепь олигонуклеотида, используемая для создания р8КСАЕ2.3 (ш) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ΙΌ ΝΟ: 4:

СТТАСТТАСТ ТАООАТСССС 20

ПОСЛЕДОВАПОСЛЕДОВА51 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 8Ер ГО N0: 5:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (с) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /безс = олигонуклеотид 8Г42 (ш) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ГО N0: 5:

С6С0САТССА ТСОАСААСТС С6АССАССАС 30 * ‘ (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 8Ер ГО N0: 6:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 29 пар оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (с) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /безс = олигонуклеотид 8Г37 (ш) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ГО N0: 6:

ОСОООАТССС ССАССОТАСТ СОТСААТТС 29 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 8Ер ГО N0: 7:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 45 пар оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (с) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /безс = олигонуклеотид 8А115 (ш) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ГО N0: 7:

ОТСОАОСТСТ СООАТССТАА ААСААТООСС СССССОАССО АТОТС 45 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 8Ер ГО N0: 8:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 35 пар оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (с) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: /безс = олигонуклеотид 8Г30 (ш) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ГО N0: 8:

ССС06АТССА ТСССТСССОА ТОАТСТСТСО ССТТС 35 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 8Ер ГО N0: 9:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 16 аминокислот (B) ТИП: аминокислота (с) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид (ίϋ) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (ν) ТИП ФРАГМЕНТА: внутренний (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ГО N0: 9:

\7а1 Рго С1у Рго Рго Зег Агд Зег Агд ν&1 Зег Не Зег Ьеи Ηίβ А1а 15 10 15 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 8Ер ГО N0: 10:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (с) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: Мезс = праймер 8Г77 (ίϋ) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ГО N0: 10:

ОАТССОТАОО ООТСАСОААО ТТСАСТСОСА 30 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 8Ер ГО N0: 11:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (с) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: другая нуклеиновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: Мезс = праймер 8Г78 (ίϋ) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ГО N0: 11:

САТСТСССАС ТОААСТТСОТ 6АССССТАС0 30

Claims (31)

1. Штамм трансгенных растительных клеток, содержащих:

а) кассету экспрессии И8Р рецептора, кодирующую полипептид И8Р рецептора для контроля экспрессии полипептида-мишени, и

б) кассету экспрессии полипептидамишени, включающую ген полипептидамишени, экспрессия которого опосредуется И8Р рецептором в ответ на ювенильный гормон или его агонист, и необязательно

в) вспомогательную кассету экспрессии рецептора, кодирующую вспомогательный полипептид рецептора, отличный от полипептида И8Р рецептора, для контроля экспрессии полипептида-мишени.

2. Штамм растительных клеток по п.1, отличающийся тем, что экспрессия полипептидамишени оказывает влияние на фертильность растения.

3. Трансгенное растение, содержащее:

а) кассету экспрессии И8Р рецептора, кодирующую полипептид И8Р рецептора для контроля экспрессии полипептида-мишени, и

б) кассету экспрессии полипептид-мишени, включающую ген полипептида-мишени, экспрессия которого опосредуется И8Р рецептором в ответ на ювенильный гормон или его агонист, и необязательно

в) вспомогатальную кассету экспрессии рецептора, кодирующую вспомогательный полипептид рецептора, отличный от полипептида И8Р рецептора, для контроля экспрессии полипептида-мишени.

4. Растение по п.3, отличающееся тем, что экспрессия полипептида-мишени оказывает влияние на фертильность растения.

5. Растение по п.3, представляющее собой кукурузу.

6. Растение по п.3, представляющее собой пшеницу.

7. Способ получения дочернего штамма трансгенных растительных клеток по п.1, включающий трансформацию растительной клетки с помощью

а) кассеты экспрессии И8Р рецептора, кодирующей полипептид И8Р рецептора для контроля экспрессии полипептида-мишени, и

б) кассеты экспрессии полипептидамишени, включающей ген полипептидамишени, экспрессия которого опосредуется И8Р рецептором в ответ на ювенильный гормон или его агонист, и необязательно

в) вспомогательной кассетой экспрессии рецептора, кодирующей вспомогательный полипептид рецептора, отличный от полипептида И8Р рецептора, для контроля экспрессии полипептида-мишени, и

г) отбор трансформированных клеток и выращивание этих клеток с получением дочернего штамма.

8. Способ получения потомства трансгенного растения по п.3, включающий трансформацию растительных клеток с помощью

а) кассеты экспрессии И8Р рецептора, кодирующей полипептид И8Р рецептора для контроля экспрессии полипептида-мишени, и

б) кассеты экспрессии полипептидамишени, включающей ген полипептидамишени, экспрессия которого опосредуется И8Р рецептором в ответ на ювенильный гормон или его агонист, и необязательно

в) вспомогательной кассеты экспрессии рецептора, кодирующей вспомогательный полипептид рецептора, отличный от полипептида И8Р рецептора, для контроля экспрессии полипептида-мишени,

г) регенерацию указанных клеток в трансгенное растение и

д) отбор трансформированных растений, их оплодотворение путем самоопыления, получение семян и их выращивание.

9. Способ регулирования экспрессии полипептида-мишени в растении по п.3, включающий:

а) обеспечение экспрессии полипептида И8Р рецептора и полипептида-мишени в растении и необязательно вспомогательного полипептида рецептора за счет трансформации растительной клетки соответствующими кассетами экспрессии и

б) контактирование клеток растения с ювенильным гормоном или одним из его агонистов.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что экспрессию полипептида-мишени увеличивают или активируют под действием ювенильного гормона или одного из его агонистов.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что экспрессию полипептида-мишени уменьшают или ингибируют под действием ювенильного гормона или одного из его агонистов.

12. Способ по п.9, отличающийся тем, что полипептид рецептора И8Р включает гетерологичный трансактивирующий домен.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что гетерологичный трансактивирующий домен представляет собой трансактивирующий домен протеина УР16 вируса простого герпеса.

14. Способ по п.9, отличающийся тем, что вспомогательный полипептид рецептора выбирают из группы, включающей ЕсВ, ΌΗΚ38 и ВХВ.

15. Способ по п.9, отличающийся тем, что агонист выбирают из группы, включающей феноксикарб, диофенолан, кинопрен, метопрен, гидропрен, диофенолан, метопреновую кислоту, трифлумурон, гексамфлумурон, тефлубензурон, флуфеноксурон, флуциклоксурон и луфенурон, дифлубензурон и хлорфлузурон.

16. Способ по п.9, отличающийся тем, что кассета экспрессии полипептида-мишени включает 5'-регуляторную область, содержащую от 1 до 11 копий реагирующего элемента.

17. Способ регулирования фертильности растения по п.4, включающий:

а) обеспечение экспрессии полипептида

И8Р рецептора и полипептида-мишени в растении и необязательно вспомогательного полипептида рецептора за счет трансформации рас55 тительной клетки соответствующими кассетами экспрессии и

б) контактирование растения с ювенильным гормоном или одним из его агонистов.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что экспрессию полипептида-мишени увеличивают или активируют под действием ювенильного гормона или одного из его агонистов.

19. Способ по п.17, отличающийся тем, что экспрессию полипептида-мишени уменьшают или ингибируют под действием ювенильного гормона или одного из его агонистов.

20. Способ по п.17, отличающийся тем, что кассета экспрессии полипептида И8Р рецептора или вспомогательного полипептида рецептора включает специфичный для пыльника промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью полипептида рецептора.

21. Способ по п.17, отличающийся тем, что кассета экспрессии полипептида И8Р рецептора или вспомогательного полипептида рецептора включает специфичный для пестика промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью полипептида рецептора.

22. Способ по п.17, отличающийся тем, что полипептид-мишень представляет собой рибонуклеазу барназу.

23. Способ по п.17, отличающийся тем, что кассета экспрессии полипептида-мишени кодирует антисмысловую последовательность, что приводит к неэффективности оплодотворения.

24. Способ по п.17, отличающийся тем, что полипептид-мишень восстанавливает эффективность оплодотворения.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что полипептид-мишень представляет собой ингибитор рибонуклеазы барстар.

26. Способ выявления лиганда для полипептида И8Р рецептора, который в клетках штамма по п.1 активирует или ингибирует экспрессию полипептида-мишени, включающий:

а) обеспечение экспрессии полипептида И8Р рецептора и необязательно вспомогательного полипептида рецептора в данном штамме,

Фиг. 1

б) контактирования ее с тестируемым соединением,

в) определение экспрессии полипептидамишени и

г) выявление тестируемых соединений, которые в значительной степени активируют или ингибируют экспрессию полипептида-мишени.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что экспрессию полипептида-мишени определяют качественно.

28. Способ по п.26, отличающийся тем, что экспрессию полипептида-мишени определяют количественно.

29. Способ получения лиганда для полипептида И8Р рецептора, включающий:

а) синтез новых тестируемых соединений в соответствии с известными методами,

б) культивирование штамма клеток по п.1 с получением штамма дочерних трансформированных растительных клеток,

в) обеспечение экспрессии полипептида И8Р рецептора и необязательно вспомогательного полипептида рецептора в штамме дочерних клеток,

г) обеспечение контактирования штамма дочерних клеток с тестируемыми соединениями, синтезированными на стадии а), и

д) определение экспрессии полипептидамишени,

е) отбор тестируемых соединений, которые в значительной степени активируют или ингибируют экспрессию полипептида-мишени, и

ж) повторение стадии а) для соединений, отобранных на стадии е).

30. Лиганд для И8Р рецептора, полученный способом по п.29.

31. Применение ювенильного гормона или агониста ювенильного гормона для регулирования экспрессии полипептида-мишени в штамме клеток по п.1 или растении по п.3.