CN111534529A - 一种报告基因细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种报告基因细胞株及其构建方法和应用，所述报告基因细胞株的基因组中整合有嵌合基因，所述嵌合基因包括IFN‑β启动子和报告基因；所述报告基因为分泌性荧光素酶基因。本发明构建的报告基因细胞株可以将荧光素酶分泌到细胞外，为检测IFN通路激活提供了简易手段，为进一步研究病毒诱导IFN‑β的转录、调控，动态监测IFN‑β启动子活性奠定了基础。

Description

一种报告基因细胞株及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种报告基因细胞株及其构建方法和应用，尤其涉及IFN-β启动子分泌性荧光素酶稳定表达细胞系及其构建方法和在检测IFN通路激活状态中的应用。
背景技术
先天性免疫是细胞抵御病毒感染的第一道防线，病毒感染细胞后，细胞的模式识别受体(RIG-I、TLR3、cGAS等)识别病毒的病原相关分子模式，通过接头蛋白(MAVS、STING等)、信号传递蛋白(TBK1、IKK等)、转录因子(NF-κB、IRF-3等)转录出促炎细胞因子和干扰素(IFN)，其中IFN通过自分泌或旁分泌途径与细胞表面IFN受体(IFNR)结合，激活下游JAK-STAT途径，促使大量干扰素刺激基因的表达，发挥抗病毒作用。IFN是一种分泌性的糖蛋白，家族成员分为三类，即I型、II型和III型IFN，其中I型干扰素IFN-β是机体重要的细胞因子，在抗病毒天然免疫中发挥重要作用。IFN-β是通路激活的效应蛋白和指征蛋白，IFN-β启动子活性则是通路激活的重要指标，因此含IFN-β启动子的报告基因系统成为不可或缺的工具。目前普遍采用的报告基因系统是Promega公司的PGL3萤火虫荧光素酶系统，以此载体为骨架，插入IFN-β启动子，获得可以用于检测IFN-β启动子活性的质粒，用于瞬时转染。但是这一过程繁琐，每次实验都需要转染步骤，并且需要裂解细胞后才能对荧光素酶进行检测。
Gaussia luciferase(Gluc)是近年来发现的荧光素酶家族中最小的成员，能够催化氧化腔肠素，该酶的发射光谱宽，能够发出波长为480nm的蓝色荧光。与萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase，Fluc)和海肾荧光素酶(Renilla Luciferase，Rluc)相比，Gluc的发光强度高，检测灵敏度好，稳定性高，最重要的是Gluc可以分泌到细胞外，无需裂解细胞，便可以直接利用上清进行检测，操作简便。目前，Gluc得到广泛的应用，如哺乳动物细胞培养中的支原体污染检测、蛋白互作和定位研究、siRNA沉默技术、启动子活性监测、肿瘤模型药物的疗效评价、肿瘤发生发展情况实时监测和高通量药物筛选等。
CN104017818A公开了亚细胞定位的炎症小体活性报告系统及其应用，所述系统中包括的7种质粒主要通过将细胞器定位基因、白介素1β前体编码基因(pro-IL-1β)和分泌型荧光素酶(DN-Gluc)顺次克隆至表达载体pcDNA3.1的多克隆位点区域而得到；将系统所包含的各质粒分别转染至靶细胞中，可通过检测细胞外上清液中的荧光素酶活性，对炎症小体的活性进行定量分析，具有高效、快捷和简便等优势，应用于炎症小体相关的药物筛选、分子机制、动物活体研究及相关产品的开发。但是该系统不能用于鉴定IFN通路激活的状态。
因此，有必要构建一种新的报告基因细胞株用于检测IFN通路激活状态。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种报告基因细胞株及其构建方法和应用，所述报告基因细胞株的基因组中整合有IFN-β启动子和报告基因形成的嵌合基因，为检测IFN通路激活提供了简易手段，为进一步研究病毒诱导IFN-β的转录、调控，动态监测IFN-β启动子活性奠定了基础。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种嵌合基因，所述嵌合基因包括IFN-β启动子和报告基因；
所述报告基因为分泌性荧光素酶基因。
报告基因是指表达产物容易被鉴定的基因，其工作原理是将报告基因与调控序列或其他目的基因融合形成嵌合基因，通过检测分析报告基因的表达产物来标定目标基因的表达；常用的报告基因包括显示定位的荧光蛋白基因和用于定量的荧光素酶基因，前者包括绿色荧光蛋白(GFP)基因、红色荧光蛋白(RFP)基因等，后者包括Fluc、Rluc等。
本发明为克服传统的报告基因系统中的荧光素酶无法分泌到细胞外的缺点，采用分泌性荧光素酶基因作为报告基因与IFN-β启动子结合构建嵌合基因，进而构建IFN-β启动子分泌性荧光素酶稳定表达的报告基因细胞株。
优选地，所述报告基因为Gaussia荧光素酶基因。
本发明中，Gaussia荧光素酶(Gluc)属于分泌型荧光素酶，与常用的定量荧光素酶Fluc、Rluc相比，具有诸多优点：测量酶活性时不需要裂解细胞，能够实现对实验对象的连续观察；基因片段小，仅有185个氨基酸残基的单链多肽，不影响载体的转化效率；无细胞毒性，与其他目的片段融合转化细胞，对细胞和动物无影响，可进行活细胞或生物体内实时监测；具有较高的敏感性，半衰期约为6天；利用Gluc的自然分泌性，采用慢病毒载体系统将Gluc转入293T细胞，根据培养基中Gluc的释放情况，能够监测内质网应激的分泌功能。
优选地，所述报告基因位于所述IFN-β启动子的3’端。
优选地，所述IFN-β启动子和所述报告基因之间还包括Kozak序列。
本发明中，为促进嵌合基因的表达翻译，在IFN-β启动子和报告基因之间添加了Kozak序列。
优选地，所述嵌合基因包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列；
SEQ ID NO:1：
aaactactaaaatgtaaatgacataggaaaactgaaagggagaagtgaaagtgggaaattcctctgaatagagagaggaccatctcatataaataggccatacccacggagaaaggacattctaactgcaacctttcgaagcctttgctctggcacaacaggtagtaggcgacactgttcgtgttgtcGCCACCATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACTAA；
其中，小写字母表示IFN-β启动子序列，大写斜体字母表示Kozak序列，大写字母表示Gluc基因。
第二方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括第一方面所述的嵌合基因。
第三方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒为转染有第二方面所述的重组载体和辅助质粒的哺乳细胞。
优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为293T细胞。
第四方面，本发明提供了一种报告基因细胞株，所述报告基因细胞株整合有第一方面所述的嵌合基因。
优选地，所述报告基因细胞株包括第二方面所述的重组载体和/或第三方面所述的重组慢病毒。
第五方面，本发明提供了一种第四方面所述的报告基因细胞株的构建方法，所述方法包括：
构建重组载体，采用所述重组载体与辅助质粒共转染哺乳细胞，构建重组慢病毒；
采用所述重组慢病毒感染宿主细胞，通过杀稻瘟菌素和有限稀释法筛选，得到所述报告基因细胞株。
优选地，所述重组载体的构建方法包括：
将第一方面所述的嵌合基因插入慢病毒载体中，转化感受态细胞，经抗性、测序筛选后得到所述重组载体。
优选地，所述嵌合基因插入慢病毒载体的Spe I和Xba I酶切位点之间。
优选地，所述筛选时加入杀稻瘟菌素的浓度为5～10μg/mL，例如可以是5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL或10μg/mL。
优选地，所述宿主细胞包括A549细胞系。
优选地，所述方法还包括对筛选得到的报告基因细胞株进行新城疫病毒(NDV)和干扰素诱导剂处理的步骤。
优选地，所述干扰素诱导剂包括聚肌胞苷酸，所述聚肌胞苷酸又称为聚肌苷酸或聚胞苷酸，是双链RNA的类似物，一条链内是ploy(I)，另一条链是poly(C)，即poly(I:C)。
优选地，所述新城疫病毒的感染复数为0.5～2MOI，例如可以是0.5MOI、0.6MOI、0.7MOI、0.8MOI、0.9MOI、1.0MOI、1.1MOI、1.2MOI、1.3MOI、1.4MOI、1.5MOI、1.6MOI、1.7MOI、1.8MOI、1.9MOI或2.0MOI，优选为1.0～1.2MOI。
优选地，所述干扰素诱导剂的浓度为1～5μg/mL，例如可以是1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL或5μg/mL，优选为2μg/mL。
NDV感染和外源poly(I:C)处理能够强烈诱导天然免疫应答，通常作为研究IFN-β信号通路的阳性对照，本发明使用NDV和poly(I:C)处理报告基因细胞株IFN-β-Gluc，筛选阳性单克隆细胞。
第六方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的重组载体、第三方面所述的重组慢病毒或第四方面所述的报告基因细胞株中的任意一种或至少两种的组合。
第七方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合基因、第二方面所述的重组载体、第三方面所述的重组慢病毒、第四方面所述的报告基因细胞株或第六方面所述的试剂盒在制备IFN通路激活状态检测试剂中的应用。
第八方面，本发明提供了一种检测IFN通路激活状态的方法，所述方法包括采用接头蛋白和/或信号蛋白处理第四方面所述的报告基因细胞株，采用发光检测仪检测报告基因细胞株的相对光强度。
优选地，所述接头蛋白包括MAVS蛋白和/或STING蛋白。
优选地，所述信号蛋白包括TBK1蛋白和/或IKK蛋白。
根据本发明，MAVS作为重要的接头蛋白与IRF激酶TBK1在激活天然免疫信号通路中具有不可或缺的作用，在通路中激活的受体通过招募接头蛋白，触发一系列的信号级联反应，最终激活转录因子NF-κB和干扰素调节因子产生I型干扰素；NDV的V蛋白能够募集E3泛素连接酶RNF5降解MAVS，抑制干扰素信号通路。本发明将多次传代的报告基因细胞株IFN-β-Gluc细胞经转染MAVS、TBK1，细胞上清中的Gluc活性显著高于对照组，而转染NDV V蛋白后，则显著抑制了细胞上清中的Gluc活性，说明通过转染正向调控或负向调控I型干扰素信号通路的外源质粒，IFN-β-Gluc细胞系均能做出正确应答，为深入研究病毒调控IFN-β信号通路提供了技术支持。
优选地，所述方法还包括采用新城疫病毒感染经接头蛋白和/或信号蛋白处理的报告基因细胞株的步骤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将IFN-β基因启动子以及下游Gluc克隆至慢病毒载体中，包装成慢病毒后感染A549细胞，使用杀稻瘟菌素筛选及有限稀释法稀释培养得到单克隆细胞，经PCR初步筛选得到稳定表达IFN-β-Gluc的A549细胞株，新城疫病毒和poly(I:C)处理单克隆细胞，筛选得到能够高水平诱导Gluc的阳性细胞株；
(2)本发明构建的稳定表达IFN-β-Gluc的A549细胞株的功能通过正向诱导(转染IFN-β信号通路相关蛋白质粒)和反向抑制实验(转染新城疫病毒V蛋白质粒)得到证实，为检测IFN通路激活提供了的简易手段，为进一步研究病毒诱导IFN-β基因的转录、调控，动态监测IFN-β启动子活性，高通量筛选等研究奠定了基础。
附图说明
图1A为pHAGE-IFN-β-Gluc慢病毒质粒构建模式图，图1B为pHAGE-IFN-β-Gluc慢病毒质粒Spe I/Xba I双酶切鉴定；
图2A为稳定表达IFN-β-Gluc单克隆细胞的PCR鉴定，其中，泳道M为DNA Marker，泳道EV为阴性对照，泳道1-15为IFN-β-Gluc单克隆细胞，图2B为NDV或poly(I:C)处理稳定表达IFN-β-Gluc单克隆细胞后的Gluc测定值；
图3A为RIG-I信号通路模式图，图3B为MAVS和TBK1转染稳定表达IFN-β-Gluc单克隆细胞后Gluc测定，图3C为NDV V抑制MAVS诱导的Gluc活性。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
(1)质粒、细胞、病毒、细菌和试剂盒
pHAGE-bsd慢病毒载体由pHAGE_puro(美国Addgene质粒分享平台)改造而来：将杀稻瘟菌素抗性基因替换pHAGE_puro中的嘌呤霉素抗性基因；IFN-β启动子偶联Gluc(IFN-β-Gluc)序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成；pMD2.G、psPAX2来自Addgene质粒共享平台；p3×Flag-CMV-14、pCMV-HA购买自美国Clontech公司，Flag-V、HA-MAVS、HA-TBK1由本实验室采用常规方法构建；
A549、HEK-293T细胞系购买自美国ATCC生物标准品资源中心，用DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)(含10％胎牛血清)，在37℃，5％CO2条件下培养；
新城疫病毒(NDV)Herts/33毒株购买自中国兽医药品监察所；
大肠杆菌DH5α、DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA小提中量试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒及血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)购买自购自北京天根生化科技有限公司。
(2)主要试剂
Spe I和Xba I内切酶为美国NEB公司产品；同源重组试剂盒为苏州金唯智生物科技有限公司产品；PCR Mix为广州东盛生物公司产品；Gaussia Luciferase CellularAssay Kit为美国Abcam公司产品；杀稻瘟菌素(Blastincidin，BSD)、Lipofectamine 2000、氨苄青霉素、Opti-MEM培养基为美国Thermo公司产品；聚凝胺(polybrene)为美国Sigma公司产品；胎牛血清为以色列BI公司产品。
实施例1重组表达载体pHAGE-IFN-β-Gluc的构建
为了获得稳定表达IFN-β-Gluc的慢病毒质粒，分别采用限制性核酸内切酶Spe I和Xba I对载体pHAGE-bsd和合成的IFN-β-Gluc片段(SEQ ID NO:1)进行双酶切，将酶切后的线性载体中的EF-1α启动子和下游CDS插入位点与IFN-β-Gluc片段通过同源重组进行连接，将连接产物转化感受态细胞，经菌液PCR检测阳性菌落，扩大培养并提取质粒，构建过程如图1A所示；
对提取的质粒采用限制性核酸内切酶Spe I和Xba I进行酶切鉴定，酶切产物的电泳结果如图1B所示，经Spe I和Xba I双酶切后生成大小约为6800bp和800bp两条带，与预期结果一致；
将阳性克隆进行测序，测序比对成功后，根据无内毒素质粒大提试剂盒说明书提取质粒，得到构建好的重组表达载体pHAGE-IFN-β-Gluc，-80℃保存备用。
实施例2慢病毒包装
取对数生长期的HEK-293T细胞接种于10cm培养皿，细胞密度约为2×105cells/mL；24h后待细胞密度为80％时，将培养基替换为Opti-MEM；
使用Lipo2000转染构建好的重组表达载体pHAGE-IFN-β-Gluc和辅助质粒，转染量为pMD2.G为12μg、psPAX2为10μg、pHAGE-IFN-β-Gluc为22μg；培养8h，更换培养基为10％FBSDMEM，继续培养24h，观察细胞状态；
分别于第48h、72h各收取上清一次，将两次所得上清混匀，1000rpm离心5min，使用0.22μm微孔滤膜过滤得到慢病毒，-80℃保存备用。
实施例3稳定表达IFN-β-Gluc细胞株的筛选
将A549细胞接种于6孔板中，待第2天生长至60％，进行慢病毒感染；
感染前弃上清，使用无菌PBS清洗细胞1～2次，换为慢病毒液培养，并加入8μg/mLpolybrene辅助感染；24h后更换培养基为含10％FBS的完全培养基；
感染72h后，加入杀稻瘟菌素(BSD)(10μg/mL)进行筛选培养多克隆细胞，约3天后未经感染的对照组细胞全部死亡，感染组细胞有阳性克隆长出；通过有限稀释法挑选单克隆细胞，扩大培养后得到稳定表达IFN-β-Gluc的A549细胞系。
实施例4 IFN-β-Gluc单克隆细胞株的PCR鉴定
收集经亚克隆后的IFN-β-Gluc细胞，使用血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取单克隆细胞基因组DNA；
根据NCBI核酸数据库报道的Gluc全长序列，设计正向引物(SEQ ID NO:2)和反向引物(SEQ ID NO:3)进行PCR扩增，PCR扩增程序如下：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min；反应结束后PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳分析；
SEQ ID NO:2：5'-ATGGGAGTCAAAGTTCTG-3'；
SEQ ID NO:3：5'-TTAGTCACCACCGGCCCC-3'。
如图2A所示，PCR结果显示筛选到15个疑似阳性克隆，Gluc片段整合到细胞基因组中。
将转染空载体的A549细胞和PCR检测阳性单克隆细胞进行计数，使用1个感染复数(MOI＝1)的NDV病毒感染或poly(I:C)(2μg/mL)刺激细胞30h后，使用Gluc检测试剂盒检测上清中的Gluc活性。
如图2B所示，在15株单克隆细胞中，有两株单克隆细胞(#13，#14)经NDV和poly(I:C)刺激后与对照组相比，Gluc的表达显著上调，相比较之下，尽管其他疑似阳性克隆中有较高水平的Gluc表达，但与对照组相比，NDV和poly(I:C)刺激后Gluc的表达未出现显著上调，因此将其舍弃。
对#13和#14单克隆细胞提取细胞基因组进一步测序鉴定，设计正向引物(SEQ IDNO:4)和反向引物(SEQ ID NO:5)，测序结果与Gluc序列一致性达100％，说明外源Gluc序列整合到#13和#14单克隆细胞基因组中。与#14细胞相比，#13细胞的对照组的Gluc表达水平相对较低，且与对照组相比，#13处理组的Gluc表达量呈现极显著提高，因此选择#13细胞进行后续试验。
SEQ ID NO:4：5’-GGCGACACTGTTCGTGTTGT-3’；
SEQ ID NO:5：5’-TTAGTCACCACCGGCCCCCT-3’。
实施例5 IFN-β-Gluc单克隆细胞株荧光素酶活性验证
为进一步验证筛选得到的稳定表达IFN-β-Gluc单克隆细胞的功能，将#13细胞多次传代后，首先通过正向诱导实验验证：MAVS和TBK1是RIG-I信号通路中的重要信号分子，如图3A所示，直接向细胞株转染MAVS和TBK1能够显著诱导下游信号通路的活化，激活IFN-β的表达；转染HA-MAVS、HA-TBK1质粒后，对Gluc荧光酶活性进行检测，HA空载体(HA-vec)作为阴性对照，如图3B显示，与对照组相比，MAVS和TBK1可以显著上调Gluc活性。
进一步通过反向抑制实验验证：NDV的V蛋白能够通过降解MAVS抑制下游信号通路的活化，向细胞株转染HA-MAVS刺激干扰素通路激活，同时转染不同浓度的Flag-V(0、200、400ng)，对Gluc荧光酶活性进行检测，结果显示如图3C所示，上清中Gluc酶活性与Flag-V的转染剂量呈负相关且具有浓度梯度依赖性。
综上所述，本发明成功构建稳定表达IFN-β-Gluc的A549细胞系，为检测IFN通路激活提供了简易手段，为进一步研究病毒调控IFN-β信号通路，动态监测IFN-β启动子活性，高通量筛选等研究奠定了基础。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心)
<120> 一种报告基因细胞株及其构建方法和应用
<130> 20200508
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 752
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaactactaa aatgtaaatg acataggaaa actgaaaggg agaagtgaaa gtgggaaatt 60
cctctgaata gagagaggac catctcatat aaataggcca tacccacgga gaaaggacat 120
tctaactgca acctttcgaa gcctttgctc tggcacaaca ggtagtaggc gacactgttc 180
gtgttgtcgc caccatggga gtcaaagttc tgtttgccct gatctgcatc gctgtggccg 240
aggccaagcc caccgagaac aacgaagact tcaacatcgt ggccgtggcc agcaacttcg 300
cgaccacgga tctcgatgct gaccgcggga agttgcccgg caagaagctg ccgctggagg 360
tgctcaaaga gatggaagcc aatgcccgga aagctggctg caccaggggc tgtctgatct 420
gcctgtccca catcaagtgc acgcccaaga tgaagaagtt catcccagga cgctgccaca 480
cctacgaagg cgacaaagag tccgcacagg gcggcatagg cgaggcgatc gtcgacattc 540
ctgagattcc tgggttcaag gacttggagc ccatggagca gttcatcgca caggtcgatc 600
tgtgtgtgga ctgcacaact ggctgcctca aagggcttgc caacgtgcag tgttctgacc 660
tgctcaagaa gtggctgccg caacgctgtg cgacctttgc cagcaagatc cagggccagg 720
tggacaagat caagggggcc ggtggtgact aa 752
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgggagtca aagttctg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttagtcacca ccggcccc 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggcgacactg ttcgtgttgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttagtcacca ccggccccct 20

Claims (10)

1.一种嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因包括IFN-β启动子和报告基因；
所述报告基因为分泌性荧光素酶基因。
2.根据权利要求1所述的嵌合基因，其特征在于，所述报告基因为Gaussia荧光素酶基因；
优选地，所述报告基因位于所述IFN-β启动子的3’端；
优选地，所述IFN-β启动子和所述报告基因之间还包括Kozak序列；
优选地，所述嵌合基因包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求1或2所述的嵌合基因。
4.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒为转染有权利要求3所述的重组载体和辅助质粒的哺乳细胞；
优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为293T细胞。
5.一种报告基因细胞株，其特征在于，所述报告基因细胞株整合有权利要求1或2所述的嵌合基因；
优选地，所述报告基因细胞株包括权利要求3所述的重组载体和/或权利要求4所述的重组慢病毒。
6.一种权利要求5所述的报告基因细胞株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
构建重组载体，采用所述重组载体与辅助质粒共转染哺乳细胞，构建重组慢病毒；
采用所述重组慢病毒感染宿主细胞，通过杀稻瘟菌素和有限稀释法筛选，得到所述报告基因细胞株；
优选地，所述重组载体的构建方法包括：
将权利要求1或2所述的嵌合基因插入慢病毒载体中，转化感受态细胞，经抗性、测序筛选后得到所述重组载体；
优选地，所述嵌合基因插入慢病毒载体的Spe I和Xba I酶切位点之间；
优选地，所述筛选时加入杀稻瘟菌素的浓度为5～10μg/mL；
优选地，所述宿主细胞包括A549细胞系。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对筛选得到的报告基因细胞株进行新城疫病毒和干扰素诱导剂处理的步骤；
优选地，所述干扰素诱导剂包括聚肌胞苷酸；
优选地，所述新城疫病毒的感染复数为0.5～2MOI；
优选地，所述干扰素诱导剂的浓度为1～5μg/mL。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的重组慢病毒或权利要求5所述的报告基因细胞株中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种权利要求1或2所述的嵌合基因、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的重组慢病毒、权利要求5所述的报告基因细胞株或权利要求8所述的试剂盒在制备IFN通路激活状态检测试剂中的应用。
10.一种检测IFN通路激活状态的方法，其特征在于，所述方法包括采用接头蛋白和/或信号蛋白处理权利要求5所述的报告基因细胞株，采用发光检测仪检测报告基因细胞株的相对光强度；
优选地，所述接头蛋白包括MAVS蛋白和/或STING蛋白；
优选地，所述信号蛋白包括TBK1蛋白和/或IKK蛋白；
优选地，所述方法还包括采用新城疫病毒感染经接头蛋白和/或信号蛋白处理的报告基因细胞株的步骤。
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