CN108303538A - 双向电化学发光显色开关在检测前列腺癌多标记物中的应用 - Google Patents
双向电化学发光显色开关在检测前列腺癌多标记物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种双向电化学发光显色开关在检测前列腺癌标记物中的应用，其中，前列腺癌标记物为PSA、miRNA‑141和肌氨酸。该应用的方法快速便捷，操作简单；使用了发光物质[Ir(df‑ppy)2(pic)]、[Ru(bpy)3]2+，在以TPrA为共反应剂时，无论通过双极电极上的电流是增大还是减小，颜色均可以从青色向红色变化；并且在对三种不同的生物标志物同时检测下，对疾病进行精准诊断；同时三个标记物的检测可以集成在一个芯片上，实现高通量检测，在临床疾病诊断和检验仪器的开发中具有极大的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及电化学仪器在生物技术中的应用，尤其涉及一种双向电化学发光显色开关在检测前列腺癌多标记物中的应用。
背景技术
电致化学发光(ECL)是一种潜在的化学发光形式，其中发光体在电极表面被氧化或还原，并产生发射激发态产物。Ru(II)配合物[Ru(bpy)3]2+由于其在低电压下具有较高的ECL效率，激发态寿命长，易于合成等优点，成为最常用的电化学发光材料。近年来，铱(Ⅲ)配合物作为新型电致化学发光试剂受到广泛关注，通过调节它们的配体，可以实现它们的发光光谱从蓝色到红色分布，并且通过控制HOMO和LUMO水平，能够显示出高的发射量子态，是[Ru(bpy)3]2+的几十倍。
由于Ru(II)和Ir(III)发光体以三正丙胺(TPrA)为共反应剂时，ECL效率较高，且具有多发射波长，因此通过控制外接电压，可以调节相应的电化学发光体的ECL发射颜色。虽然电化学发光体的选择性激发有望为多分析物ECL检测开辟新的途径，但这些年来，在这一领域的应用仍然有限。主要缺点是Ir络合物在水中溶解度低，限制了它们的生物应用。
最近，发明人报道了一种基于闭合式双极电极(BPE)的多色ECL装置在检测在测定前列腺特异性抗原(PSA)上的应用(Anal.Chem.2017,89,8050-8056)。在闭合的BPE系统中，两个电化学储液池空间分离，BPE作为连接两个储液池的唯一导体，将[Ru(bpy)3]2+和[Ir(ppy)3]在有机溶剂中的混合物加入到阳极电解槽中。与三电极体系相似，通过调节BPE电极的界面电位(Δφa)，可以实现电化学发光的选择性激发。通过降低BPE的电阻，阳极端储液池里的[Ru(bpy)3]2+和[Ir(ppy)3]，依次发射出单向变化的绿色，黄色和红色，可以读出系统中法拉第电流的增加，阴极处的反应可通过阳极处的发射颜色读出，这样能够在BPE上检测多种前列腺癌生物标志物。但是，由于在前列腺癌或其他前列腺疾病存在的情况下，其前列腺特异性抗原(PSA)通常会升高，因此只能依赖于PSA值会引起“过度诊断”和“过度治疗”；并且，此方法是通过免疫方法引入PSA及修饰金纳米粒子的PSA二抗，最后银增强溶液沉积在金纳米粒子表面。该方法耗时长，约2.5h，免疫反应操作复杂；更重要的是，使用了发光物质[Ru(bpy)3]2+和铱配合物[Ir(ppy)3]，它们均只有一个发光电位，在TPrA为共反应剂时，随着双极电极上电流的增大，颜色是单向变化；只有当双极电极上的电流是增大时，颜色才可以从绿色向红色发生变化。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种双向电化学发光显色开关在检测前列腺癌多标记物中的应用；通过双向电化学发光显色开关对多种前列腺癌生物标志物的判断效果直观准确，在临床检测设备的开发中具有很大的应用潜力。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明提供如下技术方案：一种双向电化学发光显色开关在检测前列腺癌标记物PSA、miRNA-141和肌氨酸(sarcosine)中的应用。
其中，miRNA-141的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
进一步地，检测前列腺癌多标记物的步骤如下：
(1)并联闭合式双极电极1的修饰：在电极1的阴极上孵育多肽，多肽的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，洗涤后活化末端羧酸，再次洗涤后与Fc-PAMAM聚合物共同孵育，洗涤备用；
(2)并联闭合式双极电极2的修饰：将发夹DNA高温变性，发夹DNA的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，缓慢冷却至室温后与TCEP混合共孵育，加入PBS溶液稀释后加入至电极2的阴极表面孵育、洗涤、用MCH溶液将电极表面封闭后，漂洗备用；
(3)并联闭合式双极电极3的修饰：将L-半胱氨酸加到AuNPs修饰的电极3的阴极上共同孵育后活化L-半胱氨酸的末端羧基，加入SOX(即肌氨酸氧化酶)溶液至阴极表面孵育备用；其中，AuNPs修饰的电极3是指通过上述电沉积方法镀在电极表面的金，因为是它们的大小是纳米级别的，所以又称为金纳米粒子(AuNPs)。
(4)在上述步骤(1)的闭合式双极电极的电极1的阴极中加入PSA溶液、在上述步骤(2)的闭合式双极电极的电极2的阴极中加入miRMA-141的10×DSN缓冲液孵育、洗涤、加入导电电解质待测；在上述步骤(3)的闭合式双极电极的电极3的阴极中加入肌氨酸溶液，孵育后加入导电电解质待测；
(5)对闭合式双极电极的电极1、2的电极施加一个正向的恒电压，然后在三个闭合式双极电极1、2和3的电极两端施加反方向的恒电压，观察并收集闭合式双极电极1、2和3的阳极上产生的发射颜色。
其中，上述步骤(1)、(2)和(3)中所述的闭合式双极电极1、2和3并联，简称BPE阵列，BPE阵列中的三个闭合式双极电极(简称闭合式双极电极1、2和3)的两端均分别与阳极储液池的一端和阴极储液池的一端电性连接，阴阳极储液池的另一端分别各自连接驱动电极的两端，驱动电极与外接电池相连，即阳极储液池的另一端连接驱动电极的阳极，阴极储液池的另一端连接驱动电极的阴极，驱动电极阳极与外接电池正极相连，驱动电极阴极与外接电池负极相连。
优选地，上述步骤(1)中闭合式双极电极1修饰的步骤为：
首先在双极电极阴极上孵育60μL多肽(SEQ ID No：1)，并在4℃下保留12小时。然后，用PBS缓冲液彻底清洗；再将80μL,1.0mg/mL的EDC和0.25mg/mL的NHS加到已修饰好多肽的电极上，在4℃下活化多肽末端羧酸30分钟，接着用PBS洗涤三次；最后将激活的多肽与60μL Fc-PAMAM聚合物在4℃下孵育2小时，洗涤以除去未结合的残渣。
优选地，Fc-PAMAM聚合物的合成方法为：通过PAMAM树枝状聚合物上的部分伯胺与二茂铁羧酸之间的亚胺形成反应来合成。首先将2.0mg咪唑加入到200μL的1mM Fc中，并用1.0M HCl将溶液调节至pH 7.4。然后将20mMEDC和10mM NHS加入到上述溶液中，4℃下活化Fc上的羧基。将混合物在37℃下缓慢搅拌2小时。缓慢加入50μL的4×10-6M PAMAM溶液，并搅拌2小时。之后用截留分子量为12000的透析袋透析Fc-PAMAM溶液以除去杂质。最后收集产物并储存在4℃下以备后用。
优选地，上述步骤(2)中闭合式双极电极2修饰的步骤为：
首先将发夹DNA在95℃下变性2分钟，并在使用前缓慢冷却至室温以形成茎环结构；在发夹DNA固定到电极之前，在微量离心管中将发夹DNA(20μL，50μMmiRNA-141)与10μL,100mM TCEP混合，并在室温25℃，孵育60分钟以防止发卡DNA上形成二硫键；然后用0.1MPBS将混合物稀释至总体积100μL，并取30μL上述溶液加到BPE的阴极上，于37℃孵育下2小时，洗涤后，用1mMMCH溶液将电极表面封闭1小时，温度为4℃，用水漂洗。
其中，发夹DNA为hairpin DNASH-141；所述发夹DNA为在3`端标记了二茂铁(Fc)的发夹DNA，由上海生工生物有限公司合成，标记了二茂铁的发夹DNA序列为：5’-SH-(CH2)6-GCAGTCTACCATCTTTACCAGACAGTGTTATAGACTGC-(CH2)7-Fc-3’。
优选地，上述步骤(3)中闭合式双极电极3修饰的步骤为：
首先取60μL,0.175M的L-半胱氨酸加到AuNPs修饰的BPE的阴极上，孵育4小时，温度为4℃；然后加入2.0mg EDC和1.0mg NHS并在4℃下保持2小时，活化羧基；最后将60μLSOX溶液(1mg/mL)于4℃下在BPE阴极表面孵育20h。其中，SOX又称肌氨酸氧化酶，肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下，生成过氧化氢和甲醛；肌氨酸氧化酶在该反应中作为催化剂，反应式如下：
进一步地，上述步骤(4)中的孵育条件为37℃下孵育30分钟；miRNA-141的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；加入PSA溶液孵育后洗涤中，使用的洗涤溶液为PBS溶液，导电电解质为60μL 1×PBS溶液；miRMA-141的10×DSN缓冲液孵育后洗涤中，使用的洗涤溶液为Tris-HCl溶液，导电电解质为60μL1×Tris-HCl溶液；闭合式双极电极3中的阴极储液池无需洗涤，因为反应得到的过氧化氢，甲醛正好是本发明所需要的电活性物质，BPE阵列3中的阴极储液池的导电电解质为60μL 0.1×PBS溶液。
优选地，miRMA-141的缓冲溶液为0.05U DSN的10×DSN缓冲液，其中，10×DSN缓冲液中包含如下浓度的原料组分：500mM Tris-HCl，50mM MgCl2，10mM DTT，pH为8.0。
进一步地，上述步骤(5)中的收集阳极上产生的发射颜色的仪器为电荷藕合器件图像传感器CCD(Charge Coupled Device)，并使用Matlab软件测量电极上圆形区域的平均RGB值；本发明中采用的两种发光材料[Ir(df-ppy)2(pic)]是青色材料(代表绿色G和蓝色B，并且G和B是相等的)，[Ru(bpy)3]2+是红色材料，代表红色R。
其中，上述步骤(5)中阳极储液池中的溶液均为：[Ir(df-ppy)2(pic)]、
[Ru(bpy)3]2+和TPrA的TBAPF6乙腈溶液；其中，[Ir(df-ppy)2(pic)]、[Ru(bpy)3]2+为电解液，TPrA为共反应剂，TBAPF6乙腈为溶剂；[Ir(df-ppy)2(pic)]、[Ru(bpy)3]2+和TPrA都溶解在含0.1M TBAPF6的乙腈溶液中；上述步骤(5)中正方向的恒电压为5.0V，所述反方向的恒电压为7.5V。
优选地，阳极储液池中加入[Ir(df-ppy)2(pic)]的浓度为2.5mM，[Ru(bpy)3]2+的浓度为0.125mM，TPrA的浓度为37.5mM。使用发光物质[Ir(df-ppy)2(pic)]、[Ru(bpy)3]2+，它们在TPrA为共反应剂时，由于[Ir(df-ppy)2(pic)]有两个发光电位，而[Ru(bpy)3]2+的发光电位位于两个发光电位中间，因而随着双极电极上电流的增大，发光颜色从青色，红色再向青色变化，颜色是双向变化；无论双极电极上的电流是增大还是减小，颜色都可以从青色向红色发生变化。
进一步地，上述阴极储液池中的主要物质在每个阶段是不一样的：在传感器构建阶段，阴极池中主要物质是：第一排阴极池(BPE阵列1)中主要物质是：被剪切后的多肽和未参与反应的多肽(SEQ ID No：1)(PSA只剪切部分多肽)；第二排阴极池中(BPE阵列2)主要物质是：被剪切后的发卡DNA的茎部和未参与反应的发卡DNA(DSN酶只剪切部分发卡DNA)；第三排阴极池(BPE阵列3)中主要物质是：肌氨酸和肌氨酸氧化酶的产物---过氧化氢，甲醛，氨基乙酸和未参与反应的肌氨酸氧化酶；而在检测阶段(即：通电源，使电极获得ECL颜色信号阶段)，阴极池中主要物质是[Ir(df-ppy)2(pic)]、[Ru(bpy)3]2+和TPrA的含0.1MTBAPF6的乙腈溶液。
优选地，为了保护电极的阴极(驱动电极和BPE)免受负电位的损害，将金膜通过原位沉积到电极上，方法为：在阴极和阳极的共6个储液槽中加入30μL的HAuCl4(2.4mM)，然后施加驱动电压(5.0V)300s，最后用水冲洗电极并在空气中干燥。
有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点为：只需将PSA特异性识别的肽链事先修饰到电极上，之后再和PSA和孵育25min即可检测，快速便捷，操作简单；使用了发光物质[Ir(df-ppy)2(pic)]、[Ru(bpy)3]2+，它们在TPrA为共反应剂时，由于铱配合物[Ir(df-ppy)2(pic)]有两个发光电位，而[Ru(bpy)3 ]2+的发光电位位于上述两个发光电位中间，因而随着双极电极上电流的增大，发光颜色从青色，红色再向青色变化，颜色是双向变化，即无论双极电极上的电流是增大还是减小，颜色都可以从青色向红色发生变化；三种不同类型的标志物(抗原-PSA、mRNA和小分子-肌氨酸)，不易误诊，避免假阳性；并且三个标记物的检测可以集成在一个芯片上，高通量，在临床检测设备的开发中具有很大的应用潜力。
附图说明
图1为闭合式BPE的工作原理示意图；
图2为双向电化学发光显色开关的检测原理示意图；
图3A为PSA的浓度对双向电化学发光显色开关显色情况的影响示意图；
图3B为miRNA-141的浓度对双向电化学发光显色开关显色情况的影响示意图；
图3C为肌氨酸的浓度对双向电化学发光显色开关显色情况的影响示意图；
图4A为5ng/ml PSA的重现性实验结果示意图；
图4B为10-14M mRNA-141的重现性实验结果示意图；
图4C为10-6M肌氨酸的重现性实验结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。出特别指出的以外，本发明所用原料及试剂等均可以通过常规商业购买或通过现有技术制备获得。
其中，[Ru(bpy)3]2+(三(2,2'-联吡啶基)二氯化钌(II)六水合物)，[Ir(df-ppy)2(pic)](双(4,6-二氟苯基吡啶-N,C2)吡啶甲酰合铱)，乙腈，三丙胺(TPrA)，六氟磷酸四丁基铵(TBAPF6,99.5％)，PAMAM树枝形大分子(乙二胺核，4.0代)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP),氯金酸(HAuCl4)，6-巯基-1-己醇(MCH)购自Sigma-Aldrich(澳大利亚)。二茂铁羧酸购自阿拉丁网站(http://www.aladdin-e.com/)。前列腺特异性抗原(PSA)获自上海领潮生物科技有限公司。咪唑购自国药化学公司。0.1M磷酸盐缓冲溶液：0.1M NaH2PO4，0.1M Na2HPO4和0.1M KCl(pH 7.4)组成，购自江苏凯基生物技术有限公司。多肽(SEQ ID No：1)购自上海强耀生物科技公司。DSN和10×DSN主缓冲液(500mM Tris-HCl，50mM MgCl2，10mM DTT，pH 7.4)购自深圳博奥生物科技有限公司。HPLC纯化的miRNA-141和发夹DNA(SEQ ID No：2)(hairpinDNASH-141)购自上海生工生物技术有限公司。肌氨酸和SOx肌氨酸氧化酶(冻干粉，25-50单位/mg)来自上海源叶生物技术有限公司。L-半胱氨酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为C108237-100g。
实施例1双向电化学发光显色开关(ECL)的显色度检验
双向电化学发光显色开关的制作：用画图软件绘制出所需的电极图形，再将该图形用丝网印刷技术和混法刻蚀方法转移至氧化铟锡导电玻璃(ITO玻璃)上。然后将带有检测池的聚二甲基硅氧烷(PDMS)与上述带有电极图形的导电玻璃相键合，并使检测池与检测电极对齐。使用由ITO玻璃和PDMS模具构成的闭合式BPE，闭合式BPE的两端分别与阳极储液池和阴极储液池电性连接；阳极储液池中加入(2.5mM[Ir(df-ppy)2(pic)]/0.125mM[Ru(bpy)3]2+)作为ECL的发光试剂；在阴极储液池中加入不同浓度的二茂铁；制成待测试的双向电化学发光显色开关，其中闭合式BPE的工作原理如图1所示。
双向电化学发光显色开关的测试：首先外接一个5.0V的电压将二茂铁(Fc)氧化为Fc+，之后立即施加7.5V的反向电势。BPE阳极的照片用CCD拍摄，同时记录系统的总电流(itot)。如表1所示，随着二茂铁浓度的增加，该系统中总电流增加，同时ECL颜色从深蓝绿色变为深粉红色，红色，浅粉色，灰色和浅蓝绿色。表1-双向电化学发光显色开关(ECL)中二茂铁浓度对ECL颜色的影响
实施例2双向电化学发光显色开关(ECL)检验前列腺癌多标志物
将实施例1中制作得到的双向电化学发光显色开关中的闭合式BPE替换为三个并联闭合式BPE；各闭合式BPE的两端均分别依次与一个阳极储液池和一个阴极储液池电性连接。
BPE阵列阴极端的保护：所有的储液池都装有60μL的HAuCl4(2.4mM)，然后施加驱动电压(5.0V)300s，最后用水冲洗电极并在空气中干燥。
BPE阵列的修饰与检验：先将三个BPE阵列并联，检测原理如图2所示。
(1)BPE阵列1的PSA修饰：首先在双极电极阴极上孵育60μL的多肽(SEQID No：1)，并在4℃下保留12小时。然后，用PBS缓冲液彻底清洗。其次，将80μL1.0mg/mL的EDC和0.25mg/mL的NHS加到已修饰好多肽的电极上，在4℃下活化多肽末端羧酸30分钟，接着用PBS洗涤三次。将激活的多肽与60μLFc-PAMAM聚合物在4℃下孵育2小时，洗涤以除去未结合的残渣。
(2)BPE阵列2的miRNA-141修饰：将发夹DNA(SEQ ID No：2)在95℃下变性2分钟，并在使用前缓慢冷却至室温以形成茎环结构。在发夹DNA固定到电极之前，在微量离心管中将发夹DNA(20μL，50μM miRNA-141)与10μL100mM TCEP混合，并在室温下孵育60分钟以防止发卡DNA上形成二硫键。然后用0.1M PBS将混合物稀释至总体积100μL，并取30μL上述溶液加到BPE的阴极上，于37℃孵育下2小时。洗涤后，用1mM MCH溶液将电极表面封闭1小时，并用水漂洗。
(3)BPE阵列3的肌氨酸修饰：取60μL，0.175M L-半胱氨酸加到AuNPs修饰的BPE的阴极上，孵育4小时。然后加入2.0mg EDC和1.0mg NHS并保持2小时，活化羧基。最后将60μLSOX溶液(1mg/mL)于4℃下在BPE阴极表面孵育20h，并用PBS冲洗。
(4)加入待检测的前列腺癌标志物：在BPE阵列1、2和3的阴极储存池中分别加入不同浓度的PSA、miRNA-141和肌氨酸：在第一排BPE阴极储液池中加入60μL不同浓度的PSA溶液，37℃下孵育30分钟，随后充分洗涤；同时，在第二排BPE阴极储液池中加入60μL含有不同浓度的miRMA-141和0.05UDSN的10×DSN缓冲液(500mM Tris-HCl，50mM MgCl2，10mM DTT，pH8.0)，在37℃下孵育30分钟。然后清洗电极以除去未反应的残渣。最后，在检测前，将60μL不同浓度的肌氨酸溶液加到第三排BPE的阴极储液池中。最后，分别在三个BPE的阴极储液池里从上到下依次加入60μL1×PBS，1×Tris-HCl和0.1×PBS溶液，阳极储液池里加入60μL2.5mM[Ir(df-ppy)2(pic)]/0.125mM[Ru(bpy)3]2+和37.5mM TPrA的0.1M TBAPF6乙腈溶液；其中，PSA溶液的不同浓度为0、1、3、4、5、7、9、10、12.5、25ng/mL；miRMA-141的不同浓度为0、10-15、10-14、2×10-14、5×10-14、10-13、10-12、10-11、10-10、10-9M；肌氨酸溶液的不同浓度为0、10-7、5×10-7、10-6、5×10-6、10-5、5×10-5、10-4、5×10-4、10-3M。
(5)ECL图像的采集：将处理好的芯片置于直筒显微镜的下方，调节焦距，使双极电极芯片在显微镜的视野里清晰可见。连接好CHI660A型电化学工作站和各导线，首先对阵列的前两排电极施加一个5.0V的恒电压使得Fc氧化为Fc+。之后，反方向的7.5V恒电位施加在阵列电极两端，启动Image J软件，用CCD收集BPE阳极上产生的ECL。
(6)RGB分析：用Matlab软件来自动裁剪和分析图像，图像被裁剪到包含发射电极区域的最小圆形区域，然后使用Matlab中内置的“测量-RGB值”功能测量电极上圆形区域的平均RGB值。
实验结果表明：随着加入PSA浓度的增加，R/G值随之上升，即颜色开关中颜色变化趋势为红色，并且红色随着浓度变化逐渐加深，说明对于第一排BPE(BPE1)，在阴极修饰了由Fc-PAMAM标记的特异性多肽(5’-SH-(CH2)6-GCAGTCTACCATCTTTACCAGACAGTGTTATAGACTGC-(CH2)7-Fc-3’)；与PSA孵育30min后，多肽被裂解，导致BPE阴极表面的二茂铁离去，相应的法拉第电流减小，红色随着浓度变化逐渐加深，如图3A所示。
同样地，miRNA-141中，对于第二排BPE(BPE2)，3`端标记了Fc的发夹DNA探针在阴极处自组装。随着miR-141的加入，发夹被打开，导致RNA/DNA双链体的形成，并且DSN随后切割双链体以循环miRNA-141的靶标，其导致电流的减小，红色随着浓度变化逐渐加深,如图3B所示。
对于肌氨酸组，肌氨酸氧化酶(SOD)修饰在其阴极，作为催化剂。在反应池中加入一种肌氨酸，将其氧化成过氧化氢，氨基乙酸和HCHO，这三种物质在阴极还原，促进电流流过BPE，红色随着浓度变化逐渐加深，如图3C所示。
由于[Ir(df-ppy)2(pic)]和[Ru(bpy)3]2+的混合物在电位的增加和减少都呈现由蓝绿色变为红色，我们用它们来观察这些生物标志物的截止值；临床中认为血清中的PSA大于4.0ng/ml或者miRNA-141高于～10-14M，或者尿液中肌氨酸的浓度为～10-6M会得前列腺癌；因而血清中的PSA，miRNA-141和尿液中肌氨酸的截止值分别为4.0ng/ml，～10-14M和～10-6M。发明中也选用这样的浓度作为浓度开关。同时，使用发光物质[Ir(df-ppy)2(pic)]、[Ru(bpy)3]2+，它们在TPrA为共反应剂时，由于[Ir(df-ppy)2(pic)]有两个发光电位，而[Ru(bpy)3]2+的发光电位位于两个发光电位中间，因而随着双极电极上电流的增大，发光颜色从青色，红色再向青色变化，颜色是双向变化；即无论双极电极上的电流是增大还是减小，颜色都可以从青色向红色发生变化。
实验结果进一步表明：当高于PSA在4.0ng/ml，miRNA-141在～10-14M，肌氨酸的浓度在～10-6M时，三者颜色均从青色向红色变化。在BPE阵列1、2和3的阴极储存池中分别加入4.0ng/ml PSA，20fM miRNA-141和1.0μM肌氨酸后，ECL发射的颜色从蓝绿色变为粉红色。随着浓度的增加，颜色变深。需要说明的是，从表面完全去除电活性Fc后，BPE阵列1和BPE阵列2处的ECL被设定为红色发射，因此，在极高浓度的PSA和microRNA下，ECL发射开关不会被反转。类似地，对于BPE阵列3，在优化的条件下，加入1.0mM肌氨酸(尿浓度不可达高浓度)后，ECL发射红色。
实施例3双向电化学发光显色开关检验前列腺癌多标志物的重现性
用RGB分析检测多重生物标记传感器的重现性，并应用R/G值进行评估。在5ng/mlPSA，10-14M mRNA-141和10-6M肌氨酸分别使用六个电极(Electrode)测量的R/G值(R/GValue)及其相对标准偏差。相对标准偏差分别为6.5％、5.9％和4.0％；并且该方法重现性好；5ng/ml PSA的重现性实验结果见图4A；10-14MmRNA-141的重现性实验结果见图4B；10-6M肌氨酸的重现性实验结果见图4C。
SEQUENCE LISTING
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Cys His Ser Ser Lys Leu Gln Lys
1 5
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gcagtctacc atctttacca gacagtgtta tagactgc 38
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 3
uaacacuguc ugguaaagau gg 22
Claims (10)
1.一种双向电化学发光显色开关在检测前列腺癌标记物中的应用，其特征在于：所述前列腺癌标记物为PSA、miRNA-141和肌氨酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测前列腺癌多标记物的步骤如下：
(1)并联闭合式双极电极中电极1的修饰：在电极1的阴极上孵育多肽，多肽的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，洗涤后活化末端羧酸，再次洗涤后与Fc-PAMAM聚合物共同孵育，洗涤备用；
(2)并联闭合式双极电极中电极2的修饰：将发夹DNA高温变性，发夹DNA的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，冷却至室温后与TCEP混合共孵育，加入PBS溶液稀释后加入至电极2的阴极表面孵育、洗涤、用MCH溶液将电极表面封闭后，漂洗备用；
(3)并联闭合式双极电极中电极3的修饰：将L-半胱氨酸加到电极3的阴极上共同孵育后，活化L-半胱氨酸的末端羧酸，加入SOX溶液至电极3的阴极表面孵育备用；
(4)在上述步骤(1)的电极1的阴极中加入PSA溶液孵育、洗涤，加入导电电解质待测；在上述步骤(2)的电极2的阴极中加入miRNA-141的10×DSN缓冲液孵育、洗涤，加入导电电解质待测；在上述步骤(3)的电极3的阴极中加入肌氨酸溶液，孵育后加入导电电解质待测；
(5)对电极1、2的阴极和阳极施加正方向的恒电压，然后在电极1、2和3的阴极和阳极施加反方向的恒电压，观察并收集电极1、2和3的阳极上产生的发射颜色。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(1)、(2)和(3)中，所述闭合式双极电极1、2和3的两端均分别各自与一个阳极储液池和一个阴极储液池电性连接，阳极储液池的另一端和阴极储液池的另一端分别各自连接驱动电极的两端，驱动电极与外接电池相连。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，孵育多肽的条件为温度4℃下保留12小时；共同孵育多肽与Fc-PAMAM聚合物的条件为温度4℃下孵育2小时；活化末端羧酸的时间为30分钟。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，发夹DNA高温变性的条件为温度95℃下变性2分钟；与TCEP混合共孵育的条件为室温下60分钟；阴极表面孵育的条件为温度37℃孵育下2小时；用MCH溶液封闭电极表面的温度为4℃，时间为1小时。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(3)中，L-半胱氨酸加到电极3的阴极上孵育的温度为4℃，时间为4小时；活化末端羧酸的时间为2小时；SOX溶液于在电极3的阴极表面孵育的条件为温度4℃下20小时。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(1)和(3)中，所述活化末端羧酸所用的试剂均为EDC溶液和NHS溶液的混合物，反应温度均为4℃。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(4)中，miRNA-141的核苷酸序列如SEQID No：3所示；电极1中阴极的导电电解质为PBS溶液；电极2中阴极的导电电解质为Tris-HCl溶液；电极3中阴极的导电电解质为0.1×PBS溶液。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(5)中，所述阳极中的溶液均为：[Ir(df-ppy)2(pic)]、[Ru(bpy)3]2+和TPrA混合溶液；所述正方向的恒电压为5.0V，所述反方向的恒电压为7.5V。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(5)中，所述阳极储液池和阴极储液池中的溶液均包括HAuCl4溶液。
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