CN110412021B - 一种共享双性电极阴极的电化学发光微流控芯片及其应用 - Google Patents

一种共享双性电极阴极的电化学发光微流控芯片及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种共享双性电极阴极的电化学发光微流控芯片及其应用，芯片上的一体化双性电极分出若干分支，其中的一个分支为双性电极阴极，其他的分支为双性电极阳极；在一体化双性电极的四周分布着驱动电极的正、负极；所述双性电极阴、阳极与对应的驱动电极正、负极通过反应池连通；所述双性电极阳极的个数至少为两个。现有技术在单元检测多色电化学发光检测时(反应体系不同导致发光不同)，多色发光叠加在同一C‑BPE阳极，加大了检测的困难，降低了准确性。本发明微流控芯片的多色ECL发生在不同的C‑BPE阳极上，克服了该缺陷。

Description

一种共享双性电极阴极的电化学发光微流控芯片及其应用
技术领域
本发明属于微流控分析领域，具体涉及一种共享双性电极阴极的电化学发光微流控芯片及其应用。
背景技术
微流控芯片能把大部分生化分析过程集成到一块芯片上完成，且具有低消耗样品和试剂的优点，因此它在生物、物理、化学、医学等领域展现出巨大应用潜力，已经发展成为一个高度交叉学科的新型研究领域。
近几年来，闭合式双性电极(C-BPE)-电化学发光(ECL)芯片取得了一定发展，从起初的单一芯片一元检测到后来的阵列芯片多元检测，绝大部分芯片需要一对驱动电极对应着一对C-BPE阴极和阳极，比如文献(Anal.Chem.2015,87,530-537)所公开的芯片。这样的芯片在检测时，C-BPE阴极和阳极所在的微通道都要加入反应液，加液次数和加液量都是由C-BPE阴极和阳极的个数决定的(加液次数为C-BPE的个数乘以2)。
文献(Anal.Chim.Acta,2017,983,96-102)公开了一种可以同时检测6种样品的微流控芯片，其电极由6个工作电极和6个对电极组成，每一个半圆环型对电极围绕着对应的工作电极。该芯片由工作电极和对电极共同驱动，相比于带有双性电极的芯片，它需要使用到较昂贵的实验仪器(如恒电位仪)，电子转移效率低，特别是无法对每个工作电极进行独立控制。
文献(Anal.Chem.2016,88,2884-2890)报道一种芯片是由两个铟锡氧化物(ITO)材料制成的C-BPE阵列和三个分开的、由聚二甲基硅氧烷(PDMS)加工而成的储液池阵列组成，储液池中分别填充缓冲液、三联吡啶钌/三丙胺(Ru(bpy)3 2+/TPA)混合液和鲁米诺(Luminol)溶液，两个C-BPE都作为ECL报告平台。该芯片的两个C-BPE阳极上ECL响应是在不同的支持反应池环境下得到的，比如两个C-BPE阴极储液池中溶液成分的不同可能会影响对应阳极上ECL响应。另外，该芯片上两个C-BPE是由同一电压驱动的，导致无法保证两种ECL体系同时达到最优电压；两个C-BPE以串联方式耦合、相互影响，因此检测的准确性会受到一定程度影响。
有些研究小组还提出了一种多色C-BPE-ECL芯片，例如文献(Anal.Chem.2017,89,8050-8056)报道了一种通过调节C-BPE两极处的界面电位来实现ECL选择性激发，实现了同一空间(双性电极阳极)上多色ECL。然而，同一空间上的多色ECL不仅增加了发光检测的难度(因为要检测不同颜色ECL的强度)，而且还降低了检测的准确度(会存在相互干扰)。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种共享双性电极阴极的电化学发光微流控芯片，该芯片着眼于解决现有技术的以下几个缺陷：
1、加样次数多和加样量大。本发明采用共享双性电极阴极后，加样次数由目前的“C-BPE的个数乘以2”减少为“C-BPE的个数加1”，次数减少了近一半。
2、多元检测时，各个C-BPE阳极所对应的支持反应池反应液不相同，影响了检测准确性。对同种物质的不同浓度进行检测时，支持反应池环境需要相同。本发明微流控芯片共享C-BPE阴极，各C-BPE阳极所对应的支持反应池反应液是一样的。
3、多元检测时，各个C-BPE的驱动电压相同，无法针对各个检测对象调节驱动电压。本发明微流控芯片的各个驱动电极阴极独立放置，可以在与电源连接时增加或减少电阻，从而调节各个C-BPE检测单元的驱动电压。
4、在单元检测多色电化学发光检测时(反应体系不同导致发光不同)，多色发光叠加在同一C-BPE阳极，加大了检测的困难，降低了准确性。本发明微流控芯片的多色ECL发生在不同的C-BPE阳极上，因此该缺陷不存在。
本发明的另一目的在于提供上述的微流控芯片在多元检测中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种共享双性电极阴极的电化学发光微流控芯片，其一体化双性电极分出若干分支，其中的一个分支为双性电极阴极，其他的分支为双性电极阳极；
与双性电极阴、阳极一一对应，在一体化双性电极的四周分布着驱动电极的正、负极(或称阳、阴极)；
所述双性电极阴、阳极与对应的驱动电极正、负极通过反应池(或称微通道、加液池)连通；其中，双性电极阴极所在的反应池称为支持反应池，双性电极阳极所在的反应池称为报告反应池；
所述双性电极阳极的个数至少为两个；
所述双性电极阳极的个数为两个或七个；
进一步地，在驱动电极的正极与各个负极形成的回路中，可以增加或减少各个回路的电阻，以调节各个回路的电压，为多元检测和多色电化学发光检测提供最合适电压；
进一步地，所述驱动电极的各个负极可以互相连接；
进一步地，本发明所述微流控芯片的衬底可以采用布、纸、导电玻璃或聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
本发明的微流控芯片可以采用现有技术的方法制得，譬如采用中国发明专利ZL201410494915.2、ZL 201610753106.8中公开的方法，所不同的仅是反应池和电极的形状与相对位置。
本发明所述的共享双性电极阴极的电化学发光微流控芯片可以用于多元检测，检测对象包括葡萄糖、尿酸、抗坏血酸、多巴胺等。
本发明所述的共享双性电极阴极的电化学发光微流控芯片可以用于检测不同浓度的同一物质。
本发明所述的共享双性电极阴极的电化学发光微流控芯片可以用于多色电化学发光检测中；
所述的共享双性电极阴极的电化学发光微流控芯片可以用于葡萄糖的多色电化学发光检测中；
所述用于葡萄糖的多色电化学发光检测中，多个双性电极阳极及其报告反应池分别采用Ru(bpy)3 2+/TPA和Luminol体系；
具体地，是在多个报告反应池中分别加入Ru(bpy)3 2+/TPA和Luminol，支持反应池加入含有电解质的缓冲液，在多个双性电极阳极上预固定葡萄糖氧化酶(GOD)，当加入含有葡萄糖的检测液后，葡萄糖在GOD作用下生成过氧化氢，生成的过氧化氢会淬灭Ru(bpy)3 2+/TPA体系的ECL发光强度，从而能实现定量检测葡萄糖；生成的过氧化氢还会作为共反应物促进Luminol体系的ECL发光强度，从而能实现定量检测葡萄糖。
在上述的Ru(bpy)3 2+/TPA体系中，ECL波长为620nm(橙红色)；在Luminol体系中，ECL的波长为425nm(蓝紫色)。两种ECL体系所需的最优条件通常是不同的，而本发明微流控芯片的报告反应池彼此分离，互不干扰。因此，C-BPE阳极参数和阳极上的氧化反应可以同时保证最优的pH值、发光试剂浓度、酶浓度等。
Luminol体系的最优电压要大于Ru(bpy)3 2+/TPA体系的最优电压，因此在其电路上连接一个变阻箱，从而使得在一个直流电源驱动下芯片上两种ECL发光体系可以同时取得最优电压。综上，本发明芯片两种发光体系能够在相同的支持反应池环境和同时最优条件下，实现两种ECL体系的葡萄糖检测。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本专利首次发明了一种共享双性电极阴极的C-BPE-ECL芯片，它克服了阵列方法进行高通量、多元检测的一些缺点。
2、与现有微流控C-BPE-ECL方法相比，本发明方法可在相同的支持反应池环境下以及同时保证最佳优化条件进行多元同时检测，因此具有精确度高、所需试剂种类少、样品消耗体积小等优点。
3、本发明发展了不同空间的双色ECL应用，其操作流程简单，适合非专业人员和贫瘠地区处使用。
4、本发明方法从加样到完成多样品分析仅需2min左右，可实现快速、定量检测。
5、本发明方法的检测体系能直接在芯片上定量检测不同浓度或不同种类的靶标(如葡萄糖等)，这在环境监测、食品安全检测、疾病诊断等领域具有极其重要的意义。
附图说明
图1是芯片A的结构示意图；其中，1-双性电极阴极，2,3-双性电极阳极，4-驱动电极正极，5,6-驱动电极负极，7-支持反应池，8,9-报告反应池，10-蜡坝。
图2是芯片A双色ECL检测的原理图。
图3是芯片B的结构示意图；
图4是芯片C的结构示意图；
其中，1：支持反应池，2-8：报告反应池。
图5是芯片A上C-BPE阳极基于Ru(bpy)3 2+/TPA体系检测不同浓度葡萄糖时的分析曲线图。
图6是芯片A上C-BPE阳极基于Luminol体系检测不同浓度葡萄糖时的分析曲线图。
图7是芯片B在相同浓度葡萄糖下7个阳极上ECL强度柱状图。
图8是芯片B在不同浓度葡萄糖下7个阳极上ECL强度柱状图。
图9是芯片C在相同浓度葡萄糖下7个阳极上ECL强度柱状图。
图10是芯片C在不同浓度葡萄糖下7个阳极上ECL强度柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种共享双性电极阴极的ECL微流控芯片(本实施例中称为芯片A)，其制作和检测应用过程分别如下：
(1)使用Adobe Illustrator CS5绘图软件设计芯片A的构型，采用碳丝网印刷技术制作布芯片电极(即驱动电极和C-BPE)，蜡丝网印刷技术制作构成布芯片反应池的坝。
所得芯片的结构如图1所示，芯片上一体化双性电极分出三个分支，其中的一个分支为双性电极阴极1，其他的两个分支为双性电极阳极2和3；
与双性电极阴、阳极一一对应，在一体化双性电极的四周分布着驱动电极的正极4、负极5和6；
所述双性电极阴、阳极与对应的驱动电极正、负极通过反应池(或称微通道、加液池)连通；其中，双性电极阴极所在的反应池称为支持反应池7，双性电极阳极所在的反应池称为报告反应池8和9；反应池由蜡坝10围成。
(2)芯片A的C-BPE阳极a(左边)和b(右边)上分别预固定4U/μL和4.5U/μL的GOD，在室温下干燥10分钟，并密封放置在4℃冰箱中。
C-BPE阳极a和b上预固定GOD的过程是：首先用pH值为7.2的PBS溶液配制10U/μLGOD溶液，接着将PBS稀释后的不同浓度GOD溶液滴涂到C-BPE阳极a和b上，数秒后即完成预固定工作。
(3)芯片A固定到塑料支架上，并将其放进暗箱中，C-BPE阳极a和b放置在CCD所能拍摄的视野范围内，调节CCD相关参数，使成像最清晰。芯片A报告反应池a(左边)中加入Ru(bpy)3 2+/TPA和待测葡萄糖的混合液，报告反应池b(右边)中加入Luminol和待测葡萄糖混合液，支持反应池中加入10×PBS缓冲液，等待1.5分钟的反应时间，启动CCD自动拍照功能，接通稳压电源用于触发ECL反应、与此同时CCD实时采集C-BPE阳极a和b上的ECL发光图。
图2是芯片A双色ECL检测的原理图。Luminol体系的最优电压要大于Ru(bpy)3 2+/TPA体系的最优电压，因此在其电路上连接一个变阻箱，从而使得在一个直流电源驱动下芯片上两种ECL发光体系可以同时取得最优电压。
(4)实验优化参数包括C-BPE阳极a和b宽度、C-BPE阴极宽度、驱动电压、变阻箱阻值、Ru(bpy)3 2+浓度、TPA浓度、Luminol浓度、报告反应池a和b中反应溶液pH值、C-BPE阳极a和b上修饰的GOD浓度，其对应的优化值分别是3mm和3mm、3mm、7V、7.5KΩ、2.5mM、3mM、1.5mM、7.5和10.5、4U/μL和4.5U/μL。实验过程中每个反应池溶液的总体积都为25uL。
(5)通过Matlab R2012a(MathWorks company,USA)和Origin 7.0(MicrocalSoftware Inc.,Newark,USA)软件对成像数据作进一步分析处理。
在芯片A的C-BPE阳极a上，Ru(bpy)3 2+/TPA体系定量检测葡萄糖的动态曲线如图5所示。葡萄糖浓度由10μM增加到1000μM时，ECL强度淬灭值逐渐增大，并且浓度对数值与ECL强度淬灭值呈一定线性相关，线性方程可表达为Y＝12.275X-18.5，相关系数的平方为0.9852。检测限采用的计算方法是：XL＝Xb+3Sb(Xb为空白对照时平均ECL强度淬灭值，Sb为空白对照的标准偏差)(五次重复实验)，通过所得的XL值对应的葡萄糖浓度得到检测限为38.18μM。
在芯片A的C-BPE阳极b上，Luminol/过氧化氢体系定量检测葡萄糖的动态曲线如图6所示。葡萄糖浓度由10μM增加到10000μM，ECL强度逐渐增大，并且浓度对数值与ECL强度值呈一定线性相关，线性方程可表达为Y＝53.32X-68.99，相关系数的平方为0.9873。检测限采用的计算方法是：XL＝Xb+3Sb(Xb为空白对照时平均ECL强度值，Sb为空白对照的标准偏差)(五次重复实验)，通过所得的XL值对应的葡萄糖浓度得到检测限为42.2μM。
实施例2
一种共享双性电极阴极的ECL微流控芯片(本实施例中称为芯片B)，在芯片A的基础上，芯片B增加了C-BPE阳极数目，制作和检测过程与芯片A相似。
图3是芯片B的结构示意图，有7个报告反应池2-8和1个支持反应池1。
设置若干实验组考察芯片B上同时检测相同浓度葡萄糖时的ECL强度，在芯片的C-BPE阳极a-g(依次对应报告反应池2-8)修饰4.5U/μL的GOD，报告反应池2-8分别加入含1mMLuminol和0.4mM葡萄糖的混合溶液，而支持反应池1添加10×PBS缓冲液。实验进行五次重复，ECL强度值与葡萄糖浓度关系如图7所示。从图7可以看出，7个C-BPE阳极上ECL强度值大致相同，因此它们是以并联关系良好耦合的。
设置若干实验组考察芯片B在多元检测中的应用，C-BPE阳极a-g修饰4.5U/μL的GOD，报告反应池2-8分别加入含1mM Luminol和不同浓度葡萄糖的混合溶液(对应葡萄糖浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、1、2、3mM)，而支持反应池1添加10×PBS缓冲液。实验进行五次重复，ECL强度值与葡萄糖浓度关系如图8所示。从图8可以看出：随着葡萄糖浓度增加，C-BPE阳极上ECL强度值与葡萄糖浓度大致成线性关系。因此，芯片B可以同时检测7种不同浓度葡萄糖。
实施例3
一种共享双性电极阴极的ECL微流控芯片(本实施例中称为芯片C)，是在芯片B的基础上做了改进；
图4是芯片B的结构示意图，有7个报告反应池2-8和1个支持反应池1。
芯片B用于多元检测时，8根导线需要同时连接上才能驱动C-BPE工作。为了使芯片操作更加简单、高效，而且不影响芯片B功能的情况下，把芯片B的7个驱动电极负极用一环状电极连接起来即可得芯片C。
芯片C用于多元检测时，仅需2根导线连接上就能驱动C-BPE工作，稳压电源负极连接到反应池5向着外围的驱动电极负极位置处，而正极连接到驱动电极正极；芯片传感界面制作、实验操作、过程优化与芯片B类似。
设置若干实验组考察芯片C上同时检测相同浓度葡萄糖时ECL强度，在芯片上C-BPE阳极a-g(依次对应报告反应池2-8)修饰4.5U/μL的GOD，报告反应池2-8分别加入含1mMLuminol和0.4mM葡萄糖的混合溶液，而支持反应池1添加10×PBS缓冲液。实验进行五次重复，ECL强度值与葡萄糖浓度关系如图9所示。从图9可以看出：7个C-BPE阳极上ECL强度值大致相同，因此它们也是以并联关系良好耦合的。
设置若干实验组考察芯片C在多元检测中的应用，C-BPE阳极a-g修饰4.5U/μL的GOD，报告反应池2-8分别加入含1mM Luminol和不同浓度葡萄糖的混合溶液(对应葡萄糖浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、1、2、3mM)，而支持反应池1添加10×PBS缓冲液。实验进行五次重复，ECL强度值与葡萄糖浓度关系如图10所示。从图10可以看出：随着葡萄糖浓度增加，C-BPE阳极上ECL强度值与葡萄糖浓度大致成线性关系。因此，芯片C可以同时检测7种不同浓度葡萄糖。
芯片C相比较于芯片B，实验操作更简单、方便。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种微流控芯片，其特征在于：芯片上的一体化双性电极分出若干分支，其中的一个分支为双性电极阴极，其他的分支为双性电极阳极；
与双性电极阴、阳极一一对应，在一体化双性电极的四周分布着驱动电极的正、负极；
所述双性电极阴、阳极与对应的驱动电极正、负极通过反应池连通；其中，双性电极阴极所在的反应池称为支持反应池，双性电极阳极所在的反应池称为报告反应池；所述的报告反应池彼此分离，互不干扰；
所述双性电极阳极的个数至少为两个；
在驱动电极的正极与各个负极形成的回路中，增加或减少各个回路的电阻，以调节各个回路的电压。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述驱动电极的各个负极互相连接。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片的衬底采用布、纸、导电玻璃或聚二甲基硅氧烷。
4.权利要求1-3任一项所述的微流控芯片在多元检测中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的微流控芯片在检测不同浓度的同一物质中的应用。
6.权利要求1-3任一项所述的微流控芯片在多色电化学发光检测中的应用。
7.权利要求1-3任一项所述的微流控芯片在葡萄糖的多色电化学发光检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述多个双性电极阳极及其报告反应池分别采用Ru(bpy)3 2+/TPA和Luminol体系。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：在多个报告反应池中分别加入Ru(bpy)3 2+/TPA和Luminol，支持反应池加入含有电解质的缓冲液，在多个双性电极阳极上预固定葡萄糖氧化酶，当加入含有葡萄糖的检测液后，葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下生成过氧化氢，生成的过氧化氢会淬灭Ru(bpy)3 2+/TPA体系的ECL发光强度，实现定量检测葡萄糖；生成的过氧化氢还会作为共反应物促进Luminol体系的ECL发光强度，实现定量检测葡萄糖。
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