CN104941705A - 三碳电极电致化学发光布基微流控芯片及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三碳电极电致化学发光布基微流控芯片及其制备方法和用途，该芯片由以下步骤制得：设计反应池形状和电极图案，然后制成反应池网板和电极网板；电极为三碳电极，包括工作电极、对电极和参比电极；将反应池形状网印到布上，将电极图案也网印到同一块布上，晾干，制得三碳电极电致化学发光布基微流控芯片。本发明首次将电极网印加工方法应用到布基微流控芯片上，该加工方法的优点之一是不需要昂贵、复杂的仪器设备，另一重要优点是可以批量加工出反应池和电极的布基微流控芯片。本发明中电极是三碳电极，跟传统的三电极体系相比，不仅制作成本低廉，而且可一次性使用，无需复杂的抛光预处理。
Description
技术领域
本发明属于微流控分析领域，具体涉及一种三碳电极电致化学发光布基微流控芯片及其制法和用途。
背景技术
2011年以来，微流控布基分析装置(或称为布基微流控芯片)得到一定程度的发展。相比于早些时候发展起来的微流控纸基分析装置，布基微流控芯片具有如下几个鲜明的优点：(1)布材料价格很低廉，几乎能生产于世界上每个地方，属于可再生、可循环资源；(2)反应试剂等生化材料易于通过涂层、印染或者浸染等方式对布材料进行改性；(3)布能用来过滤或者分离样品；(4)布是一种生物可降解材料，可直接抛弃，或者通过焚烧方式进行安全处理；(5)布材料弹性好、机械强度大、耐用，而且具有良好的“湿强”；(6)布材料具有良好的多孔毛细特性，无需任何外界泵就能执行侧向流测试，且能获得纸材料无可比拟的吸液速度。
目前，用于布基微流控芯片的检测方法比较少，已报道的有比色分析法、电化学分析法和化学发光分析法。
比色分析法是布基微流控芯片检测中较为常用的一种分析方法。Bhandari等人(Lab Chip,2011,11:2493-2499)和Bagherbaigi等人(Anal.Methods,2014,6:7175-7180)将布基微流控芯片比色分析用于免疫检测；Baysal等人将布基微流控芯片比色分析用于过氧化氢检测(Sens.Actuators B-Chem.,2015,208:475-484)；Nilghaz等人(Lab Chip,2012,12:209-218；Microfluid.Nanofluid.,2015,DOI:10.1007/s10404-015-1545-9)以及Zhang等人(Lab Chip,2015,15:1598-1608)分别将比色分析法与布基微流控芯片相结合实现葡萄糖和蛋白质检测；Baysal等人将布基微流控芯片比色分析法用于检测PBS中乳酸(Text.Res.J.,2014,84:1729-1741；Appl.Mech.Mat.,2014,490-491:274-279)。比色分析法操作相对简单，一般通过照相机或扫描仪来记录颜色强度，并经过相关软件将颜色强度变成灰度值来定量待测样品。
最近，Malon等人在布基微流控芯片上采用循环伏安法检测唾液中乳酸(Analyst,2014,139,3009-3016)，电化学分析法具有微小化、信号稳定以及检测限低等优点。
另外，Zhang等人最近开发出一种布基微流控芯片化学发光分析法，并成功用于肉制品中过氧化氢的检测，取得了较为满意的结果(Biosens.Bioelectron.,2015,72,114-120)。该分析技术无需外界光源，仪器设备简单，且具备高灵敏度，低背景信号以及高信噪比等优点。
电致化学发光是电化学和化学发光结合的产物。电致化学发光是在黑暗中进行，相比于比色分析法，背景信号低甚至接近零。相比于化学发光分析法，电致化学发光不仅具备高灵敏度和宽线性范围，而且可以通过电压对反应时间和空间进行灵活控制。相比于电化学分析法，电致化学发光也常常具有信号生成迅速快、采集的光信号可用光电倍增管等方式放大、检测动态范围宽且灵敏度高等优点。然而，到目前为止，电致化学发光分析法与布基微流控芯片相结合的传感方法还没有被报道过。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种三碳电极电致化学发光布基微流控芯片的制备方法，其芯片加工和电极制备简单、廉价和环保。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制备得到的三碳电极电致化学发光的布基微流控芯片，该芯片结合了三电极电化学、化学发光以及布基微流控芯片各自技术的优势，其芯片衬底和电极材料的价格极其低廉。
本发明的再一目的在于提供上述的三碳电极电致化学发光的布基微流控芯片在成像传感中的应用，该芯片所要求仪器设备价格便宜、操作简单、可便携。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种三碳电极电致化学发光布基微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用绘图软件设计反应池形状和电极图案，然后制成反应池网板和电极网板；反应池形状如说明书附图1所示；电极图案如说明书附图2所示，电极为三碳电极，包括工作电极、对电极和参比电极；
(2)将布片置于反应池网板下方，使布片和网板紧贴，并在反应池网板上涂蜡；接着，将布片与反应池网板一起在80-90℃下加热数秒，过后将布片从反应池网板上取下并冷却至室温，该布片即为反应池芯片；
(3)将电极网板放置于反应池芯片上方，使电极网板上电极图案的中心与芯片上反应池的中心对齐，并使反应池芯片和电极网板紧贴，然后在电极网板上面网印导电碳浆，接着将布芯片与电极网板分开，室温下晾干电极，使电极电阻趋于稳定，制得三碳电极电致化学发光布基微流控芯片；
所述绘图软件为Adobe Illustrator CS5；
所采用的布片为全棉布。
由上述方法制得的三碳电极电致化学发光布基微流控芯片可用于检测三丙胺(TPA)、H2O2或葡萄糖；
检测过程包括以下步骤：
(1)把芯片固定到支架上，并将支架放进暗箱中，芯片反应池中工作电极对准CCD配置的宏观镜头，调节CCD相关参数，使成像最清晰；
(2)往芯片反应池中加入检测工作液，等待3～5秒钟，启动CCD自动成像功能以采集电致化学发光图像，紧接着启动恒电位仪触发电致化学发光；改变检测物浓度，记录不同浓度下发光成像数据；
(3)通过Matlab R2012a(MathWorks company,USA)和Origin 7.0(Microcal Software Inc.,Newark,USA)软件对成像数据作分析处理；
上述步骤中，对于不同的检测物其检测工作液是不同的：
对于TPA，其检测工作液由8mM三联吡啶钌溶液(pH值7.4的PBS溶液配制)和TPA溶液(溶剂是pH值为7.4的PBS溶液)等体积混合而成；检测过程中，三联吡啶钌浓度保持不变，只改变TPA浓度；另外，循环伏安法设置扫描电位为0V到1.2V到0V，扫描速率为50mV/s。
对于H2O2，检测工作液由5mM鲁米诺溶液(溶剂是0.1M NaOH溶液)与H2O2溶液(溶剂是0.1M NaOH溶液)等体积混合而成；检测过程中，鲁米诺浓度保持不变，只改变H2O2浓度；另外，循环伏安法设置扫描电位为-0.5V到1V到-0.5V，扫描速率为100mV/s。
对于葡萄糖，检测工作液由5mM鲁米诺溶液(溶剂是0.1M NaOH溶液)与葡萄糖溶液(溶剂为pH值7.4的PBS溶液或pH值6.0的人工尿)等体积混合而成；当芯片用于检测葡萄糖时，其工作电极首先要预固定葡萄糖氧化酶，接着再往反应池中加入检测工作液；检测过程中，鲁米诺浓度保持不变，只改变葡萄糖浓度；循环伏安法设置扫描电位为-0.5V到1V到-0.5V，扫描速率为100mV/s；
人工尿的配制方法是：2.427g尿素，0.034g尿酸，0.090g肌酸酐，0.297g柠檬酸钠二水合物，0.634g氯化钠，0.450g氯化钾，0.161g氯化铵，0.089g氯化钙二水合物，0.100g七水硫酸镁，0.034g碳酸氢钠，0.003g草酸钠，0.258g硫酸钠，0.100g磷酸二氢钠一水合物和0.011g磷酸氢二钠先溶解于一定体积的去离子水中，接着用去离子水定容于200mL，最后用1M的HCl调pH值至6.0；
芯片工作电极上预固定葡萄糖氧化酶的过程是：首先用pH值6.8的PBS溶液配制活力单位为1units/μL葡萄糖氧化酶溶液；接着将3μL酶溶液滴加到工作电极正中心，数秒后即完成预固定工作。
所述的CCD是指便携式CCD数字成像设备，是广州市明美科技有限公司产品，型号为MC15；
所述的恒电位仪为上海辰华仪器有限公司产品，型号为CHI 1242B。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明首次将电致化学发光、布基微流控芯片技术进行有机集成，从而构建一种简单、廉价、可便携式传感器。
2、本发明首次将电极网印加工方法应用到布基微流控芯片上，该加工方法的优点之一是不需要昂贵、复杂的仪器设备，另一重要优点是可以批量加工出反应池和电极的布基微流控芯片。
3、本发明中电极是三碳电极，跟传统的三电极体系相比，不仅制作成本低廉，而且可一次性使用，无需复杂的抛光预处理。
4、本发明方法与现有的布基微流控化学发光技术相比，不仅检测灵敏度高得多，而且所需试剂种类少、样品消耗体积小。
5、本发明所描述的方法操作流程简单，不需要专业人员操作。
6、本发明方法减少了对环境的污染，样品分析完成后芯片可通过燃烧方法处理掉。
7、本发明方法从加样到完成样品分析仅需30s左右，可实现快速、定量检测。
8、本发明方法的检测体系具有稳定性好、检测灵敏度高、易于控制等优点，能直接或者间接在布芯片上定量检测过氧化氢和葡萄糖，这在环境监测、食品安全检测、疾病诊断等领域有极其重要的研究意义。
附图说明
图1是反应池形状。
图2是电极设计图案：其中1为工作电极(WE)，2为参比电极(RE)，3为对电极(CE)。
图3是电致化学发光布基微流控芯片实物图：其中1为工作电极(WE)，2为参比电极(RE)，3为对电极(CE)，4为疏水区，5为亲水池。
图4是布基微流控芯片电致化学发光检测装置示意图：其中1为暗箱，2为电脑(PC)，3为恒电位仪，4为USB线。
图5是布基微流控芯片电致化学发光定量检测TPA可行性验证。
图6是不同浓度TPA检测的成像传感图。
图7是不同浓度TPA检测的分析曲线图。
图8是布基微流控芯片电致化学发光定量检测H2O2可行性验证。
图9是不同浓度H2O2检测的成像传感图。
图10是不同浓度H2O2检测的分析曲线图。
图11是PBS中不同葡萄糖检测的成像传感图。
图12是PBS中不同葡萄糖检测的分析曲线图。
图13是人工尿中不同葡萄糖检测的成像传感图。
图14是人工尿中不同葡萄糖检测的分析曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种三碳电极电致化学发光布基微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用Adobe Illustrator CS5绘图软件设计反应池形状(弦月形)，反应池形状如图1所示，图1中白色区域为反应池(也叫亲水区、亲水池)，然后制成300目网纱的反应池网板；使用Adobe Illustrator CS5绘图软件设计电极图案，如图2所示：工作电极为圆形，对电极和参比电极为半环形，然后制成300目网纱的电极网板。
(2)剪一块宽为80mm、长为110mm的布片，该布片为白色平纹棉布，每平方厘米大约有10.7毫克、每英寸宽大约有96根线(每米线大约14.3毫克)。
(3)将布片置于反应池网板下方，使布和网板紧贴，用绿色蜡笔在网板上涂蜡，并用平滑碾磨勺用力均匀碾磨。接着，将布与反应池网板一起放在加热板上(带棉布的一面朝向加热板)，在85℃的条件下加热5s。加热完成后，网板与布一起被从加热板上取下，并彼此分开、室温下冷却，从而制成布基微流控芯片。制成的芯片中亲水区域(即反应池)呈现白色(和原始布颜色一致)，而疏水区域呈现绿色。
(4)将电极网板放置于布基微流控反应池芯片上方，使电极网板上工作电极图案的中心与芯片上布反应池的中心对齐，并保持两者紧贴。然后，在电极网板上网印导电碳浆(≤60Ω/square)，然后将布芯片与电极网板分开，室温下晾干电极，使电极电阻趋于稳定，制成的布基微流控芯片如图3所示。
所述的设计图案是用软件Adobe Illustrator CS5设计；所述的布基微流控反应池为弦月形，电极为碳电极(包括圆形工作电极和半环形对电极和半环形参比电极)。
实施例2
实施例1的三碳电极电致化学发光布基微流控芯片定量检测TPA，检测过程如下：
(1)首先把芯片固定到疏水性聚乙烯支架上，并将支架放进暗箱中，芯片反应池中工作电极对准CCD(型号为MC15)配置的宏观镜头(型号M1614-MP)，调节CCD相关参数，使成像最清晰，成像检测装置如图4所示。
(2)往反应池中加入检测工作液11μL，等待3～5s，启动CCD自动成像功能以采集电致化学发光图像，紧接着启动恒电位仪(型号CHI 1242B)触发电致化学发光，记录发光成像数据。
(3)通过Matlab R2012a(MathWorks company,USA)和Origin 7.0(Microcal Software Inc.,Newark,USA)软件对成像数据作进一步分析处理。
检测TPA工作液是由浓度为8mM三联吡啶钌溶液(由pH 7.4PBS配制)和不同浓度TPA溶液(由pH 7.4PBS稀释98％TPA得到)等体积混合而成。
首先验证定量检测TPA的可行性，设置工作液中TPA浓度为0、0.25和2.5mM，循环伏安法扫描电位和速率分别为0～1.2V和50mV/s。
图5中实线为0mM TPA发光曲线，点线与虚线分别为0.25mM和2.5mMTPA发光曲线。比较点线与虚曲发光值可看出：随着TPA浓度由0.25mM增加到2.5mM，其发光值在电压约为0.9V时显著地从3.5增加到16.6，表明该方法具有定量分析TPA的可行性。
由图5插入图可进一步看出：在反应大约25s左右发光强达到最大，表明该方法具有快速定量TPA的能力。
设置若干实验组进一步考察该方法定量检测TPA的灵敏度，其中待检TPA浓度分别为0、2.5、6、25、100、250、1000、2500μM。各实验组的电致化学发光成像图五次重复如如图6所示，其发光值与TPA浓度对数关系如图7所示。
由图6和图7可以看出电致化学发光值(用y表示)与TPA浓度对数值(用x表示)呈一定的线性关系，线性方程可表达为y＝0.13+4.13x，相关系数为0.9978。检测限采用的计算方法是：XL＝Xb+3Sb(Xb为空白对照的平均电致化学发光强度值，Sb为空白对照的标准偏差)(五次重复实验)，通过所得的XL值对应的TPA浓度得到检测限。该方法的TPA检测限为1.265μM。
实施例3
实施例1的三碳电极电致化学发光布基微流控芯片定量检测H2O2，其检测过程与实施例2相同。
检测H2O2工作液是由浓度为5mM鲁米诺溶液(由0.1M NaOH溶液配置)和不同浓度H2O2溶液(由0.1M NaOH溶液稀释30％H2O2得到)等体积混合而成。
首先验证定量检测H2O2的可行性，设置工作液中H2O2浓度为0、0.5和2mM，循环伏安法扫描电位和速率分别为-0.5～1V和100mV/s。
图8中实线为0mM H2O2发光曲线，点线与虚线分别为0.5mM和2mMH2O2发光曲线。比较点线与虚曲发光值可看出：随着H2O2浓度由0.5mM增加到2mM，其发光值在电压约为0.6V时显著地从7.4增加到13.6，表明该方法具有定量分析H2O2的可行性。
由图8插入图可进一步看出：在反应大约11s左右发光强度达到最大，表明该方法具有快速定量H2O2的能力。
设置若干实验组进一步考察该方法定量检测H2O2的灵敏度，其中待检H2O2浓度分别为0、0.05、0.1、0.5、1、2mM。各实验组的电致化学发光成像图五次重复如如图9所示，其发光值与H2O2浓度关系如图10所示。
由图9和图10可以看出电致化学发光值(用y表示)与H2O2浓度(用x表示)呈一定的线性关系，线性方程可表达为y＝0.87+7.12x，相关系数为0.9737。检测限采用的计算方法是：XL＝Xb+3Sb(Xb为空白对照的平均电致化学发光强度值，Sb为空白对照的标准偏差)(五次重复实验)，通过所得的XL值对应的浓度得到H2O2检测限。该方法的H2O2检测限为27μM。
实施例4
实施例1的三碳电极电致化学发光布基微流控芯片定量检测葡萄糖时，除芯片工作电极上预固定葡萄糖氧化酶不一样之外，其它均与实施例3中检测过氧化氢的条件相同，这些条件包括测试过程及扫描电位。
(a)芯片工作电极上预固定葡萄糖氧化酶过程为：首先用pH值6.8的PBS溶液配制活力单位为1units/μL葡萄糖氧化酶溶液；接着将3μL酶溶液滴加到工作电极正中心，数秒后将芯片放置于4℃冰箱晾干保存以备用。
(b)人工尿配制过程：2.427g尿素，0.034g尿酸，0.090g肌酸酐，0.297g柠檬酸钠二水合物，0.634g氯化钠，0.450g氯化钾，0.161g氯化铵，0.089g氯化钙二水合物，0.100g七水硫酸镁，0.034g碳酸氢钠，0.003g草酸钠，0.258g硫酸钠，0.100g磷酸二氢钠一水合物和0.011g磷酸氢二钠先溶解于一定体积的去离子水中，接着用去离子水定容于200mL，最后用1M的HCl调pH值至6.0。
(c)检测葡糖糖工作液是由浓度为5mM鲁米诺溶液(pH 7.4PBS稀释鲁米诺配制得到)和不同浓度葡萄糖(由pH 7.4PBS配制得到)等体积混合而成。
设置若干实验组进一步考察该方法定量检测PBS中葡萄糖的灵敏度，其中工作液中葡萄糖浓度分别为0、0.5、1、3、10mM。各实验组的电致化学发光成像图五次重复如图11所示，其发光值与PBS中葡萄糖浓度关系如图12所示。由图11和图12可以看出电致化学发光值(用y表示)与PBS中葡萄糖浓度(用x表示)呈一定的线性关系，线性方程可表达为y＝0.05+0.28x，相关系数为0.9757。采用的计算方法是：XL＝Xb+3Sb(Xb为空白对照的平均电致化学发光强度值，Sb为空白对照的标准偏差)(五次重复实验)，通过所得的XL值对应的浓度得到葡萄糖检测限。该方法的PBS中葡萄糖检测限为0.032mM。
(d)检测人工尿葡糖糖工作液是由浓度为5mM鲁米诺溶液(pH 7.4PBS稀释鲁米诺配制得到)和不同浓度葡萄糖(由pH 6.0人工尿配制得到)等体积混合而成。
设置若干实验组进一步考察该方法定量检测人工尿中葡萄糖的灵敏度，其中工作液中葡萄糖浓度分别为0、0.5、1、3、10mM。各实验组的电致化学发光成像图五次重复如图13所示，其发光值与人工尿中葡萄糖浓度关系如图14所示。
由图13和图14可以看出电致化学发光值(用y表示)与人工尿中葡萄糖浓度(用x表示)呈一定的线性关系，线性方程可表达为y＝0.03+0.26x，相关系数为0.9965。采用的计算方法是：XL＝Xb+3Sb(Xb为空白对照的平均电致化学发光强度值，Sb为空白对照的标准偏差)(五次重复实验)，通过所得的XL值对应的浓度得到人工尿中葡萄糖检测限。该方法的人工尿中葡萄糖检测限为0.038mM。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种三碳电极电致化学发光布基微流控芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)使用绘图软件设计反应池形状和电极图案，然后制成反应池网板和电极网板；反应池形状如说明书附图1所示；电极图案如说明书附图2所示，电极为三碳电极，包括工作电极、对电极和参比电极；
(2)将布片置于反应池网板下方，使布片和网板紧贴，并在反应池网板上涂蜡；接着，将布片与反应池网板一起在80-90℃下加热数秒，过后将布片从反应池网板上取下并冷却至室温，该布片即为反应池芯片；
(3)将电极网板放置于反应池芯片上方，使电极网板上电极图案的中心与芯片上反应池的中心对齐，并使反应池芯片和电极网板紧贴，然后在电极网板上面网印导电碳浆，接着将布芯片与电极网板分开，室温下晾干电极，制得三碳电极电致化学发光布基微流控芯片。
2.根据权利要求1所述的三碳电极电致化学发光布基微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述绘图软件优选Adobe Illustrator CS5。
3.根据权利要求1所述的三碳电极电致化学发光布基微流控芯片的制备方法，其特征在于：所采用的布片优选全棉布。
4.一种三碳电极电致化学发光布基微流控芯片，其特征在于：是由权利要求1-3任一项所述的方法制得。
5.权利要求4所述的三碳电极电致化学发光布基微流控芯片在检测三丙胺、H2O2或葡萄糖中的应用。
6.根据权利要求5所述的三碳电极电致化学发光布基微流控芯片在检测三丙胺、H2O2或葡萄糖中的应用，其特征在于，所述检测包括以下步骤：
(1)把芯片固定到支架上，并将支架放进暗箱中，芯片反应池中工作电极对准CCD配置的宏观镜头，调节CCD相关参数，使成像最清晰；
(2)往芯片反应池中加入检测工作液，等待3～5秒钟，启动CCD自动成像功能以采集电致化学发光图像，紧接着启动恒电位仪触发电致化学发光；改变检测物浓度，记录不同浓度下发光成像数据；
(3)通过Matlab R2012a和Origin 7.0软件对成像数据作分析处理。
7.根据权利要求6所述的三碳电极电致化学发光布基微流控芯片在检测三丙胺、H2O2或葡萄糖中的应用，其特征在于：检测三丙胺时，其检测工作液由8mM三联吡啶钌溶液和TPA溶液等体积混合而成；检测过程中，三联吡啶钌浓度保持不变，只改变TPA浓度；另外，循环伏安法设置扫描电位为0V到1.2V到0V，扫描速率为50mV/s。
8.根据权利要求6所述的三碳电极电致化学发光布基微流控芯片在检测三丙胺、H2O2或葡萄糖中的应用，其特征在于：检测H2O2时，检测工作液由5mM鲁米诺溶液与H2O2溶液等体积混合而成；检测过程中，鲁米诺浓度保持不变，只改变H2O2浓度；另外，循环伏安法设置扫描电位为-0.5V到1V到-0.5V，扫描速率为100mV/s。
9.根据权利要求6所述的三碳电极电致化学发光布基微流控芯片在检测三丙胺、H2O2或葡萄糖中的应用，其特征在于：检测葡萄糖时，检测工作液由5mM鲁米诺溶液与葡萄糖溶液等体积混合而成；其工作电极首先要预固定葡萄糖氧化酶，接着再往反应池中加入检测工作液；检测过程中，鲁米诺浓度保持不变，只改变葡萄糖浓度；循环伏安法设置扫描电位为-0.5V到1V到-0.5V，扫描速率为100mV/s。
10.根据权利要求9所述的三碳电极电致化学发光布基微流控芯片在检测三丙胺、H2O2或葡萄糖中的应用，其特征在于，芯片工作电极上预固定葡萄糖氧化酶的过程是：首先用pH值6.8的PBS溶液配制活力单位为1units/μL葡萄糖氧化酶溶液；接着将3μL酶溶液滴加到工作电极正中心，数秒后即完成预固定工作。
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