CN107807161A - 纳米针电极在超高密度电化学传感分析中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了纳米针电极在超高密度电化学传感分析中的应用，在应用中，以纳米针电极阵列作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为辅助电极，采用电压转换模式使ECL体系在纳米针尖端实现局部ECL信号，利用纳米针针尖的发光强度定量超高密度电化学实验目标分子，其中，所述纳米针电极阵列的电极密度为1.6×103～4×103，纳米针针尖的直径为700～750nm，针尖底部的直径为1～4μm，纳米针的高度为2～8μm。本发明首次提出了具有局部ECL的纳米针电极作为超高密度阵列电化学传感用于H2O2、葡萄糖、乳酸和胆碱的检测，且重现性好，通过在纳米阵列电极上修饰多个氧化酶和受体，可以实现单个阵列用于复杂生物体系中数百个分子的超高密度分析。
Description
技术领域
本发明属于化学分析领域，具体地涉及纳米针电极在超高密度电化学传感分析中的应用。
背景技术
微阵列是指将探针在固体载体上进行点样，用于并行处理和检测复杂样品中的分析物。微阵列因其具有高通量的特点已广泛应用于分子生物学和基因组学等领域。传统的微阵列每平方毫米大约50个点，平均粒径100μm，随着技术不断提升，超高密度阵列不断涌现，其定义为每平方毫米含有1000以上元素。电化学分析作为一种高灵敏、高选择性和无标记检测的方法，是阵列的主要应用方法之一。然而，由于电压和电化学信号的记录需要接触焊盘和阵列中的连接线，因此，实现超高密度电化学微阵列极具挑战。
ECL是电化学产生的中间体在电极上产生的发光，可以利用CCD进行成像。成像的发光强度表示了分子在电极上电化学反应产生的空间分布。假设ECL图像中的一个像素对应一个微电极，那么整个电极表面可以被视为具有极高密度的组装电极。在电极上施加电压只需要一个焊盘，避免了电极阵列制造的复杂性。因此，基于ECL的检测应该提供一种特定的策略来实现超高密度电化学分析。然而，在ECL过程中产生的中间体具有相对长的寿命(～微秒)和较大的扩散距离(～微米)导致相邻区域光信号的重叠，从而影响电化学定量的准确性10。因此，电极上产生局域光斑对物质进行定量对于实现超高密度ECL传感阵列是至关重要的。目前，已经开发了基于电场中的导线极化的双极电极阵列，在电极的一端产生信号以实现局部发光。据文献报道，离子追踪强调为106/mm2的纳米尺寸多通道PET膜作为双极电极阵列用于H2O2的ECL传感分析。另外，密度大于104fiber/mm2光纤束被各向异性地刻蚀并覆盖金。金的尖端裸露的部分(直径为1μm)产生局部的光信号。这两个主要的突破表明了局部ECL生产超高密度电化学传感阵列应用的可行性。进一步将电极制造成芯片并降低施加电压以避免溶液中的高电流使超高密度电化学传感用于生物样品例如细胞和组织的分析。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的技术问题，本发明提供了纳米针电极在超高密度电化学传感分析中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提出了纳米针电极在超高密度电化学传感分析中的应用，在应用中，以纳米针电极阵列作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为辅助电极，采用电压转换模式使ECL体系在纳米针尖端实现局部ECL信号，利用纳米针针尖的发光强度定量超高密度电化学实验目标分子，其中，所述纳米针电极阵列的电极密度为1.6×103～4×103，纳米针针尖的直径为700～750nm，针尖底部的直径为1～4μm，纳米针的高度为2～8μm。
本发明适用于多种ECL体系，优选地，所述ECL体系为L012/H2O2体系或Ru(bpy)3 2+/TPA体系。
具体地，当所述ECL体系为L012/H2O2体系时，采用1.0V，2s和-1.0V，0.5s的电压转换模式产生ECL信号；当ECL体系为Ru(bpy)3 2+/TPA体系时，采用1.3V，2s和-1V，0.5s的电压转换模式产生ECL信号。
本发明的检测体系适用多种目标分子，优选地，所述目标分子为H2O2、葡萄糖、乳酸或胆碱中的任意一种。
具体地，当目标分子为葡萄糖、乳酸或胆碱中的任意一种时，分别将对应的葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆碱氧化酶连接到纳米针电极阵列上，用PBS对电极清洗之后，将电极分别置于含有200μM L012和不同浓度的葡萄糖、乳酸或胆碱的PBS中进行成像并记录。
更具体地，葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆碱氧化酶连接到纳米针电极阵列上的方法为：用nafion对电极进行预处理使电极表面引入负电荷，然后，将电极置于含有葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆碱氧化酶的PBS中，使带正电荷的葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆碱氧化酶和负电荷的nafion之间通过静电吸附作用将葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆碱氧化酶固定在电极上。
有益效果：本发明首次提出了具有局部ECL的纳米针电极作为超高密度阵列电化学传感用于H2O2、葡萄糖、乳酸和胆碱的检测。纳米针的发光强度相对标准偏差小于5.7％，表明该阵列电极具有良好的重现性。在概念上，电极的密度为1.6×103电极/mm2，通过将纳米针之间的距离减少到约15μm可以将电极密度增大至4×10 3电极/mm2。通过在纳米阵列电极上修饰多个氧化酶和受体，可以实现单个阵列用于复杂生物体系中数百个分子的超高密度分析。此外，纳米针电极局部ECL的实现为发光探针局部行为的高通量研究提供了特定的平台，从而便于更好的理解ECL机理。
附图说明
图1中:(A)ECL成像装置；(B)明场；(C)纳米针电极SEM表征图；(D)单个纳米针电极的SEM图；
图2中：(A)纳米针电极在200μM L012和2mM H2O2中的ECL成像图；(B)划线处纳米针电极针尖和平面区域的强度；(C)纳米针电极在10mMRu(bpy)32+和200mM TPA中的ECL成像图；(D)划线处纳米针电极针尖和平面区域的强度；
图3中：纳米针电极成像光斑图(A)聚焦在针尖；(B)虚焦(3mm)；(C)虚焦(-3mm)。只有在聚焦准确是才能得到清晰的光斑图，表明光斑的产生并非来源于虚焦；
图4中：(A)鲁米诺在纳米针电极上扩散模拟图；曲线a、b、c分别代表纳米针尖端、底部和高度。为了简化模拟，只考虑电极上的一个针尖。湿法刻蚀后，高度分别为2、4、6、8μm(c)的纳米针针尖尺寸均为700nm(a)，底部分别为1、2、3、4μm(b)；整个表面都是导电的(d)；图B代表平面电极和不同高度纳米针电极的电流密度；
图5中：A-D为纳米针电极对不同过氧化氢浓度的发光成像图；(E)光强度与H2O2浓度之间的相关性。误差棒代表625个纳米针电极的相对偏差；
图6中(A)纳米针电极针尖在200μM L012和0.5,1,2and 5mM H2O2中的发光强度；(B)625个纳米针电极针尖尺寸，误差棒代表标准偏差；
图7中：A-C为葡萄糖氧化酶修饰的纳米针电极在200μM L012和(A)0.5、(B)1、(C)5mM葡萄糖溶液中的成像图；(D)纳米针电极在不同葡萄糖浓度中的发光强度；(E)葡萄糖氧化酶修饰的纳米针电极分别在PBS、乳酸、葡萄糖和含有葡萄糖的混合物中的发光强度；
图8为光强度与不同葡萄糖浓度之间的相关，误差棒代表625个纳米针电极的相对偏差；
图9为纳米针电极阵列的制造过程；
图10：(A)乳酸氧化酶修饰的纳米针电极在5mM乳酸存在时的发光成像图；(B)乳酸氧化酶修饰的纳米针电极在乳酸存在与否时的强度对比图；(C)胆碱氧化酶修饰的纳米针电极在5mM胆碱存在时的发光成像图；(D)胆碱氧化酶修饰的纳米针电极在胆碱存在与否时的强度对比图。
具体实施方式
根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解的是，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
纳米针电极阵列的制造及ECL成像。
(1)纳米针电极阵列的制备。
纳米针电极阵列的制备依照已有文献报道的方法，如图9所示。(Alves,M.A.R.；Takeuti,D.F.；Braga,E.S.Microelectronics J.2005,36,51–54；Han,J.；Lu,S.；Li,Q.；Li,X.；Wang,J.；Sens.Actuators A Phys.2009,152,75–79.)，4英寸，p型，<100>硅片，电阻率为1-20Ω·cm，厚度500mm，用标准RCA清洁并热氧化以产生200nm的SiO2层。光刻模板是由光刻蚀产生的，并由反应离子刻蚀转移到SiO2。反应离子刻蚀之后，用丙酮和异丙醇清洗片子，然后用氮气吹扫以除去光刻胶残留。接着，用40％的KOH溶液在80℃条件下对硅片进行湿法刻蚀7min。在刻蚀过程中，SiO2作为掩模。刻蚀之后，用腐蚀液(3:1H2SO4:H2O2)和0.49％HF清洗片子以除去SiO2和一些其他的残留物。最后，在片子上镀一层10nmTi和100nmAu，完成纳米针电极阵列的制作。需要注意的是腐蚀液具有高度腐蚀性，能与大多数有机物发生剧烈反应。处理腐蚀液时应特别小心。
如图1B-D所示，明场图和SEM图表明针尖和底部的直径分别为750nm和3μm，从顶端到底部的高度是6μm。相邻纳米针中心之间的距离设定为50μm，因此，阵列中的电极密度为1.6×103spots/mm2。类似地，通过在初始加工过程中降低微柱的高度制备高度为2μm和4μm的另外两个纳米针电极。
(2)纳米针电极阵列的电致化学发光成像。
光学成像装置由10X物镜(Olympus，Japan)，镜筒和EM-CCD(Evolve,Photometrics,Tucson,AZ)组成。纳米针电极阵列作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为辅助电极。采用1.0V和-1.0V电压转换模式使L012/H2O2在电极上产生ECL信号。
实验中，在H2O2存在下，观察到鲁米诺在纳米针电极上产生的ECL信号。根据我们以前的用于鲁米诺ECL成像的电压模式，含有200μM L012和2mM H2O2的PBS中，采用1.0v(2s)和-1.0V(0.5s)转换模式产生ECL信号。选择具有较高发光强度的鲁米诺类似物L012来说明鲁米诺ECL。图2A中的发光图像高度为6μm的所有纳米针尖上呈现的明亮的发光点，表明了局部ECL的可视化。如图2B所示，尖端处的发光强度比在周围平面电极上观察到的发光强度平均高1.75倍。该结果小于模拟的氧化电流密度，原因可能是简化的模拟和试验中不完全发光信号采集造成的。Ru(bpy)3 2+/TPA作为另一种典型的发光探针用于纳米针阵列的成像实验，在正电压下，该体系发射红光(Deiss,F.；LaFratta,C.N.；Symer,M.；Blicharz,T.M.；Sojic,N.；Walt,D.R.J.Am.Chem.Soc.2009,131,2260–2267)。如图2C和2D所示，对电极连续施加1.3v(2s)和-1(0.5s)的电位，针尖处的光强度是平面电极的2.16倍，为尖端增强ECL提供了依据。625个针尖的发光强度相对标准偏差为2.7％。结果表明，纳米针尖端的局部ECL可以在多个ECL体系中实现。因此，局部发光可视化为超高密度电化学实验提供了可行性。
纳米针尖端的光斑尺寸为12.9±1.4μm，大于尖端尺寸。尺寸的增大是由于在电化学反应过程中鲁米诺中间体和含氧物质的扩散。另外提供了更多的讨论来排除纳米针尖处的光斑聚焦硬性的可能性(如图3所示，只有在聚焦准确是才能得到清晰的光斑图，表明光斑的产生并非来源于虚焦)。626个纳米电极(25×25)发光强度的相对标准偏差为2.65％，表明纳米针电极局部发光用于电化学实验具有良好的重现性。纳米针高度降低到2或4μm时，由于在短的尖端上鲁米诺的扩散相对较慢，使尖端的局部发光区分度降低。相反，纳米针高度的不断增加会产生更多尖端增加的ECL，然而，在制造过程中，较高的纳米针需要较大直径的微柱，导致纳米针密度降低。因此，阵列中纳米针的高度选择为6μm。
为了支持纳米针尖端处更多发光信号产生的现象，使用Comsol软件对鲁米诺(典型的发光探针)到纳米针的扩散进行模拟如图4所示(Zhang,B.；Zhang,Y.；White,H.S.AnalChem.2006,78,477–483.)。为了简化模拟，仅考虑了电位为0.6V时从鲁米诺到氧化态的电子转移(即3-氨基邻苯二甲酸酯)。如预期的那样，图4B表明纳米尺寸尖端的鲁米诺的模拟氧化电流密度比平面的氧化电流密度高4倍，证实了鲁米诺在尖端的传质增强。由于发光强度是通过在过电位下将鲁米诺传导到电极来控制的，所以尖端处的鲁米诺流量会增加，从而产生增强的光信号。当针尖高度从6μm缩短到2μm时，氧化电流密度的增强减弱。这个结果为鲁米诺自由基在长的纳米针的扩散更显著，促进局部的ECL的产生。
在电化学传感中，经典的检测方法包括利用相应的氧化酶将生物分子转化为具有电化学活性的H2O2，在电极上发生氧化以提供电子。纳米阵列电极在含有200μM L012和不同浓度的H2O2中进行成像，如图5所示。
在所有纳米针尖处可以观察到局部ECL光斑，光斑的强度与H2O2浓度呈正相关，如图6A所示。所有纳米针电极发光强度的相对标准偏差少于3.2％，表明了基于ECL的纳米针电极实验具有良好的检测精度和重复性。图6B展示了不同H2O2浓度对应的光斑尺寸大小相似，证实了在电化学反应期间中间体扩散层的存在。所有的尺寸限制在15um内，表明电极密度高达4×103spot/mm2，可以用于生物分析。
(3)纳米针电极在超高密度电化学传感分析中的应用。
为了证明超高密度电化学传感分析，选择经典的生物分子葡萄糖用于纳米电极实验的目标分子。为了将葡萄糖氧化酶连接到纳米针电极阵列上，用0.5％的nafion乙醇溶液对电极进行预处理(滴加到电极表面)使电极表面引入负电荷。然后，将电极置于含有葡萄糖氧化酶的PBS(pH4.0，10mM)中，使带正电荷的葡萄糖氧化酶和负电荷的nafion之间通过静电吸附作用将葡萄糖氧化酶固定在电极上。用PBS对电极清洗之后，将电极分别置于含有200μM L012和不同葡萄糖浓度(0.5-5mM)PBS中进行成像并记录，结果如图7A-C所示。纳米针上所得到的光斑是由于葡萄糖氧化酶与葡萄糖反应产生了H2O2。图7D和图8显示发光强度和葡萄糖浓度呈正相关，表明了我们的纳米针电极阵列可以用于葡萄糖的检测。其相对标准偏差小于5.7％，证实了该实验具有良好的重现性。此外，我们还分别利用胆碱氧化酶和乳酸氧化酶对纳米针尖电极阵列进行修饰，进而成功的对胆碱和乳酸进行了检测，如图10所示。其中，图(A)乳酸氧化酶修饰的纳米针电极在5mM乳酸存在时的发光成像图；(B)乳酸氧化酶修饰的纳米针电极在乳酸存在与否时的强度对比图；(C)胆碱氧化酶修饰的纳米针电极在5mM胆碱存在时的发光成像图；(D)胆碱氧化酶修饰的纳米针电极在胆碱存在与否时的强度对比图。
为了实现对具有多种分析物的生物样品高通量分析，必须将纳米针电极阵列对非靶物质的非特异性响应最小化，即纳米针电极阵列具有良好的特异性。实验中，将葡萄糖氧化酶修饰的阵列电极置于含有乳酸的溶液中进行检测，结果如图7E所示，纳米针上没有发现明显的信号增强，保证了纳米电极阵列的特异性。另外，通过对比只有葡萄糖和含有葡萄糖和乳酸盐的混合物的检测结果测定纳米阵列电极反应的准确性。如图7E，在混合物中的检测的光信号仅增加了7.5％，证实了该检测方法的准确性。
本发明实现了纳米针电极的局部电化学发光可视化，从而达到了超高密度电化学传感分析的目的。施加在电极上用于产生ECL的电压很小，因此适用于生物样品分析。所获得的纳米尺寸针尖的局部发光信号归因于，与针尖周围的平面区域相比，发光体在针尖处的传质速率得到了增强，从而在针尖处获得更强的发光信号。由于过电位下，扩散过程主导了微/纳米电极的电化学速率，因此，与周围微米尺寸的平面电极上相比，应该有更多的发光体在纳米针尖处被氧化，导致光斑在针尖产生。与微米级的平面电极相比，溶液中的物质扩散到纳米尺寸的针尖的传递速率增强。纳米针之间的距离可以通过微加工过程控制到几微米，因此，针尖的发光强度可以用于定量超高密度电化学实验目标分子。光斑的尺寸限制在15μm内使得电化学分析的密度大于4×103spots/mm2。针尖的发光强度与H2O2浓度之间的正相关性为利用纳米针电极用于电致化学发光(ECL)定量分析提供了可行性依据。进一步在电极表面修饰葡萄糖氧化酶，通过尖端发光信号可以对葡萄糖的浓度在0.5-5mM范围进行定量，这一结果表明该纳米针尖电极可以进一步应用于复杂生物体系中多个分子的检测。本文中成功实现的局部ECL为发展超高密度的电化学阵列无需复杂的芯片设计提供了策略。
Claims (6)
1.纳米针电极在超高密度电化学传感分析中的应用，其特征在于，在应用中，以纳米针电极阵列作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为辅助电极，采用电压转换模式使ECL体系在纳米针尖端实现局部ECL信号，利用纳米针针尖的发光强度定量超高密度电化学实验目标分子，其中，所述纳米针电极阵列的电极密度为1.6×103～4×103，纳米针针尖的直径为700～750nm，针尖底部的直径为1～4μm，纳米针的高度为2～8μm。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ECL体系为L012/H2O2体系或Ru(bpy)3 2+/TPA体系。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述ECL体系为L012/H2O2体系时，采用1.0V，2s和-1.0V，0.5s的电压转换模式产生ECL信号；当ECL体系为Ru(bpy)3 2+/TPA体系时，采用1.3V，2s和-1V，0.5s的电压转换模式产生ECL信号。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述目标分子为H2O2、葡萄糖、乳酸或胆碱中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，当目标分子为葡萄糖、乳酸或胆碱中的任意一种时，分别将对应的葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆碱氧化酶连接到纳米针电极阵列上，用PBS对电极清洗之后，将电极分别置于含有200μM L012和不同浓度的葡萄糖、乳酸或胆碱的PBS中进行成像并记录。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆碱氧化酶连接到纳米针电极阵列上的方法为：用nafion对电极进行预处理使电极表面引入负电荷，然后，将电极置于含有葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆碱氧化酶的PBS中，使带正电荷的葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆碱氧化酶和负电荷的nafion之间通过静电吸附作用将葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆碱氧化酶固定在电极上。
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