CN106546578B - 含蜡坝的重力/毛细流布芯片及其在葡萄糖传感中的应用 - Google Patents

含蜡坝的重力/毛细流布芯片及其在葡萄糖传感中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种流路上含蜡坝的重力/毛细流布芯片及其在葡萄糖传感中的应用，该布芯片分为疏水区和亲水区，亲水区又分为上样区、检测区和流路区三个部分；流路区靠近检测区的一端分布一个疏水性蜡坝；在使用时，该布芯片沿检测区与流路区的交界弯折后紧贴放置在一个支架上，该支架的倾斜面与水平面形成一个夹角，放置后上样区和流路区在支架倾斜面上，检测区在支架的水平部分上。本发明方法与现有的纤维材质(纸、布、线)微装置化学发光相比，通过流路上蜡坝的疏水特性将酶溶液与待检液围在检测区，一方面使溶液不进入流路区污染纤维通道，另一方面保证足够时间进行孵育反应，极大地丰富了背景技术所提到的布芯片化学发光方法的应用范围。

Description

含蜡坝的重力/毛细流布芯片及其在葡萄糖传感中的应用
技术领域
本发明属于芯片检测领域，具体涉及一种流路上含蜡坝的重力/毛细流布芯片及其在葡萄糖传感中的应用。
背景技术
人体液(如血液和尿)中葡萄糖含量是人体疾病的重要指标。多年来，人们为了探究更有效的葡萄糖检测方法，付出了大量努力，并取得了一定的成果。总的来说，大部分葡萄糖传感器都是基于电化学方法。然而，电化学发光仍然面临着一些问题和挑战：(1)电极直接与样品接触会造成电极污染，从而使信号不稳定、重复率差、电极寿命缩短；(2)身体中一些物质(如尿酸、抗坏血酸)可能会与葡萄糖和氧发生氧化酶催反应，干扰葡萄糖检测，减少检测特异性。
化学发光作为一种替代电化学的检测方法，具备操作简单、灵敏度高、检测速度快、能耗少、无需外界激发光源以及和微加工技术兼容性好等优点，因此近年来它已发展成为一种具有吸引力的检测方法。
传统化学发光方法检测葡萄糖通常在大型装置中进行，这样的体系通常需要消耗大量的试剂和样品、涉及复杂的操作步骤、所需分析时间较长。另外，这些化学发光系统经常需要庞大、复杂的外围设备，因此很难应用在即时、现场测试中。
为了克服这些缺陷，研究者们已开发出基于微流控芯片技术的葡萄糖传感器。然而，这些微流控芯片化学发光方法中经常涉及复杂的芯片加工过程、高成本的芯片衬底材料以及昂贵的外围设备(如阀/泵、连接管道、化学发光分析仪或含数据转换模块的光敏二极管等)。这些严重限制其在成本低、紧凑、可便携的仪器中使用。因此，迫切需要新的化学发光方法来克服这些重要的局限。
自2011年以来，布芯片已经得到迅速的发展，在开发简单、低成本的芯片上诊断分析具有显著的潜力。目前为止，一些加工方法已用于布芯片制作，包括编制法、蜡转印法、蜡网印法、紫外光刻法。在这些方法中，本课题组提出的蜡网印法具有简单、成本低、速度快以及易于在布上构建微流控通道等优点。所制备的布芯片能兼具布条测试和复杂芯片实验室装置的各自优势，因此已成为新一类的微流控芯片系统。
目前，几个检测方法已和布芯片结合，如比色法、电化学法、电化学发光法、电泳分离法。最近，本课题组已提出一种简单，低成本的布芯片化学发光方法，并用于过氧化氢(H2O2)传感，检测限为0.46mM(Biosensors and Bioelectronics,2015,72,114-120)。基于葡萄糖氧化酶(GOD)能催化葡萄糖氧化反应产生H2O2，该布芯片化学发光方法有用来定量检测葡萄糖的潜力。
然而，为实现这样的葡萄糖传感应用，上述方法仍面临着一些局限和挑战：
(1)葡萄糖氧化产生H2O2的反应过程与鲁米诺(Luminol)的发光反应过程需要实现有机耦合；
(2)上述的两步反应过程要实现在单层布芯片上，从而无需复杂、冗长的多层布芯片层叠过程；
(3)基于每摩尔葡萄糖能产生一摩尔H2O2，布芯片化学发光H2O2检测灵敏度需要改善以满足低量葡萄糖定量检测的要求；
(4)布芯片上通过多孔纤维素的液体输运通常是非可控的、重复性差，因而改善布芯片上液体输运也许显得很重要。
发明内容
为了克服现有技术的局限，本发明的首要目的在于提供一种流路上含蜡坝的重力/毛细流布芯片，该布芯片通过流路上的疏水蜡坝巧妙地使两步反应能够在单一布芯片上进行；通过流路上重力/毛细流的流体驱动方式实现一反应溶液迅速越过蜡坝与另一反应溶液混合以进行第二步反应。
本发明的另一目的在于提供上述重力/毛细流布芯片的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述重力/毛细流布芯片在葡萄糖传感中的应用，该布芯片可以实现人尿和血清样品中葡萄糖的灵敏、快速检测，具有反应时间可控、选择性高且发光稳定等明显优点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种流路上含蜡坝的重力/毛细流布芯片，该布芯片分为疏水区和亲水区，亲水区又分为上样区、检测区和流路区三个部分；在流路区靠近检测区的一端分布一个疏水性蜡坝；在使用时，该布芯片沿检测区与流路区的交界弯折后紧贴放置在一个支架上，该支架的倾斜部分(即支架倾斜面)与水平面形成一个夹角，放置后上样区和流路区在支架倾斜面上，检测区在支架的水平部分上；
疏水性蜡坝的首要作用是防止第一步反应时检测区中的溶液流到流路区，导致第一步反应完全失败；其次，在第二步反应时防止上样区溶液经流路区以过快的流速流到检测区而造成不利影响；
所述的检测区优选为圆形、直径为8mm；上样区优选为正方形、边长为4mm；流路区优选为长方形、长度/宽度为10mm/3mm；蜡坝宽度优选为0.25mm；
所述支架的倾斜面和水平部分上与布芯片亲水区域对应的位置是被掏空的，以保证充分的重力/毛细流动；
设支架倾斜面与水平面形成的夹角为θ，须满足0°＜θ＜90°，夹角优选20°-60°，特别优选50°。
上述重力/毛细流布芯片的制备方法，包括以下步骤：
设计亲水区各部分的形状，然后制成网板；将网板压在布片上，并在网板上涂蜡，蜡透过网板印在布片上；接着将布与网板一起置于加热板上加热(布的一面朝向加热板)；加热后，将布片和网板从加热板上取下，将布片剥离得到布芯片。
所选的布片优选为白色、全棉布；网板优选为300目聚酯网板；
所述的加热板上加热时优选150℃加热3s。
上述的重力/毛细流布芯片可以用于葡萄糖传感，包括以下步骤：
(1)含布芯片的支架放入暗箱中的适当位置处，调节CCD相关参数和焦距，使成像最清晰；往检测区滴加10μL酶溶液，紧接着再滴加10μL含葡萄糖的待检液；由于流路区中疏水蜡坝的阻隔，酶溶液和待检液能够被围在布芯片检测区中进行孵育反应数分钟，从而使得GOD氧化葡萄糖产生H2O2；
所述酶溶液的配制方法是：用pH值为6.00-9.00的PBS(phosphate buffersolution)缓冲液配制GOD(葡萄糖氧化酶)溶液和辣根过氧化物酶(HRP)溶液，然后等体积混合这两种溶液得到酶溶液，其中GOD和HRP浓度分别为0.005-0.5U/μL和0.3-0.9μg/μL；
所述含葡萄糖的待检液其配制方法是：用pH值为6.00-9.00的PBS缓冲液配制一定量的葡萄糖，即得待检液；
所述的PBS缓冲液，pH值优选7.00-8.00，特别优选7.50；
所述的酶溶液中，GOD浓度优选0.1-0.5U/μL，特别优选0.1U/μL；HRP浓度优选0.6-0.9μg/μL，特别优选0.6μg/μL；
所述的孵育反应在室温下进行，优选孵育反应时间为5min；
(2)检测区孵育反应完毕后，40μL底液被滴加到上样区，在重力和布纤维毛细力作用下，底液在流路区迅速流动并越过蜡坝与检测区中的反应溶液充分混合，从而触发化学发光反应；发光信号由CCD相机视频成像采集；通过VGIF(http://video-to-gif.watermark-software.com/)、Adobe Photoshop CS4、Matlab R2012a(MathWorkscompany,USA)开发的图像自动处理程序以及Origin7.0(Microcal Software Inc.,Newark,USA)对成像数据进行分析；
所述的底液配制方法是：用pH值为6.50-10.00的TBS(Tris-HCl buffersolution)缓冲液配制Luminol溶液和对碘苯酚(PIP)溶液，然后等体积混合这两种溶液得到底液，其中Luminol和PIP浓度分别为0.75-2.25mM和0-0.45mM；
所述TBS缓冲液的pH值优选7.00-9.00，特别优选8.00；
底液中，Luminol浓度优选1.25-1.75mM，特别优选1.5mM；PIP浓度优选0.2-0.4mM，特别优选0.3mM。
本发明巧妙地将布芯片、重力/毛细力流体驱动、流路上蜡坝限流、GOD分解葡萄糖成葡萄糖酸和H2O2、HRP催化H2O2氧化Luminol的化学发光等技术有机集成，实现一种布芯片化学发光葡萄糖传感方法。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明首次实现了布芯片化学发光葡萄糖传感方法。
2、本发明首次通过流路上集成蜡坝和重力/毛细流实现单一布芯片上两步反应(上样区和检测区用蜡坝分离)，极大地丰富了背景技术所提到的布芯片化学发光方法的应用范围。
3、本发明方法与传统的化学发光检测方法相比，不需要价格昂贵的泵装置来驱动底液流动。本发明仅通过布纤维自然的毛细力和液体自然的重力来驱动底液在通道内快速流动；底液越过蜡坝与检测区中的反应液充分混合、稳定发光。
4、本发明方法与现有的纤维材质(纸、布、线)微装置化学发光相比，通过流路上蜡坝的疏水特性将酶溶液与待检液围在检测区，一方面使溶液不进入流路区污染纤维通道，另一方面保证足够时间进行孵育反应。
5、本发明方法使用的芯片与传统衬底(如硅、玻璃、聚合物等)的芯片相比，布芯片材料具有廉价、普遍、用户友好、生物兼容性好、可废弃等优点，而且其蜡网印加工方法简单、快速、便宜、环保、并可批量生产。
6、本发明方法中，酶溶液和葡萄糖待测液在检测区孵育反应完毕后，立即将底液滴加到上样区以触发化学发光反应，底液经流路区和蜡坝流到检测区大约4s，完成检测分析时间少于5.5min,因此从葡萄糖待测液滴加到检测的分析速度相当快。
7、本发明方法能减少对环境的污染，样品分析完成后布芯片可通过燃烧方法处理掉。
8、本发明方法所需的操作流程简单，不需要专业人员。
9、本发明方法的检测体系具有稳定性好、检测灵敏度高、易于控制和操作、能直接在布芯片上定量检测实际样品如人血清和尿中的葡萄糖，样品不需要复杂处理，这在疾病诊断和临床应用等领域有极其重要的研究意义。
附图说明
图1是布芯片的平面图；其中，1-上样区，2-流路区，3-蜡坝，4-检测区，5-疏水区，6-弯折处。
图2是布芯片的使用状态示意图；其中，1-布芯片，2-弯折处，3-支架，4-夹角。
图3是布芯片上底液在流路区流动时间与布芯片流路区倾斜角之间的关系曲线图。
图4是布芯片化学发光强度与流路区倾斜角之间的关系曲线图。
图5是不同倾斜角下布芯片化学发光强度与反应时间之间的关系曲线图。
图6是布芯片化学发光强度与PIP浓度之间的关系曲线图。
图7是布芯片化学发光强度与缓冲液pH值之间的关系曲线图。
图8是布芯片化学发光强度与Luminol浓度之间的关系曲线图。
图9是布芯片化学发光强度与GOD浓度之间的关系曲线图。
图10是布芯片化学发光强度与HRP浓度之间的关系曲线图。
图11是布芯片化学发光强度与孵育反应时间之间的关系曲线图。
图12是布芯片化学发光强度与葡萄糖浓度之间的关系曲线图(内插图为数据线性拟合曲线图)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种流路上含蜡坝的重力/毛细流布芯片，其制备方法包括如下步骤：
设计如图1所示的亲水区形状，然后制成300目的聚酯网板(由广州联畅印刷器材店加工制成)；将网板压在一块白色、全棉布片上，并用黑色蜡笔在网板上涂蜡，且进一步用平滑碾磨勺均匀用力研磨，蜡透过网板印在布片上；接着将布与网板一起置于温度设置为150℃的加热板(型号YH-946B)上加热3s(布的一面朝向加热板)使蜡渗透在布片中形成疏水区(其他区域为亲水区)；加热后，将布片和网板从加热板上取下，将布片剥离以得到布芯片。
制成的布芯片如图1所示，分为疏水区5和亲水区，亲水区又分为上样区1、检测区4和流路区2三个部分；在流路区2靠近检测区4的一端分布一个疏水性蜡坝3。
在使用时，该布芯片1沿检测区与流路区的交界弯折后紧贴放置在一个支架3上(如图2所示)，该支架3的倾斜部分(即支架倾斜面)与水平面形成一个夹角4，放置后上样区和流路区在支架倾斜面上，检测区在支架的水平部分上。
检测区为圆形、直径8mm；上样区为正方形、边长4mm；流路区为长方形、长度/宽度为10mm/3mm；蜡坝宽度为0.25mm。
实施例2
实施例1所述的流路上含蜡坝的重力/毛细流布芯片用于葡萄糖传感，包括以下步骤：
(1)含布芯片的支架放入暗箱中的适当位置处，调节CCD相机(型号MC15)相关参数(如曝光时间、蓝色光增益等)和焦距，使成像最清晰；往检测区滴加10μL酶溶液，紧接着再滴加10μL含葡萄糖的待检液；由于流路区中疏水蜡坝的阻隔，酶溶液和待检液能够被围在布芯片检测区中进行孵育反应5分钟，从而使得GOD氧化葡萄糖产生H2O2；
所述酶溶液的配制方法是：用pH值为6.00-9.00的PBS缓冲液配制GOD溶液和HRP溶液，然后等体积混合这两种溶液得到酶溶液，其中GOD和HRP浓度分别为0.005-0.5U/μL和0.3-0.9μg/μL；
所述含葡萄糖的待检液其配制方法是：用pH值为6.00-9.00的PBS缓冲液配制一定量的葡萄糖，即得待检液；
(2)检测区孵育反应完毕后，40μL底液被滴加到上样区，在重力和布纤维毛细力作用下，底液在流路区迅速流动并越过蜡坝与检测区中的反应溶液充分混合，从而触发化学发光反应；发光信号由CCD相机视频成像采集，保存为WMV格式；通过VGIF(http://video-to-gif.watermark-software.com/)软件处理暗箱关闭至化学发光结束期间的成像视频，每100ms截取一张图片，保存BMP格式；这些图片通过Adobe Photoshop CS4软件将发光区域截取出来，保存TIF格式；所获得的批量图片经过Matlab R2012a(MathWorks company,USA)开发的图像自动处理程序来分析，从而得到发光强度(即灰度值)最大的图片。最后，采用Origin7.0(Microcal Software Inc.,Newark,USA)对成像数据进行分析。
所述的底液配制方法是：用pH值为6.50-10.00的TBS缓冲液配制Luminol溶液和PIP溶液，然后等体积混合这两种溶液得到底液，其中Luminol和PIP浓度分别为0.75-2.25mM和0-0.45mM。
现以待测液葡萄糖浓度5mM，酶溶液中GOD浓度0.5U/μL、HRP浓度0.5μg/μL，PBS缓冲液pH值6.80，底液中Luminol浓度1.5mM、PIP浓度0.2mM，TBS缓冲液pH值10.0，孵育反应时间5min为例，采用实施例1的布芯片来测试底液在流路区流动时间与布芯片流路区倾斜角之间的关系(图3)、化学发光强度与布芯片流路区倾斜角之间的关系(图4)以及不同倾斜角下化学发光强度与反应时间之间的关系(图5)。
从图3可以看出：布芯片流路区倾斜角度为20°时，流动时间长达34s；倾斜角度稍微增大到30°时，流动时间急剧缩短到11s。这种现象发生的可能原因是重力流已发展成为促使底液快速越过蜡坝的主要方式。随着斜角度进一步增大为40°-60°时，流动时间大约为2-5s，这表明采用的倾斜角度基本上达到饱和状态。因此，布芯片能够为化学发光葡萄糖传感提供相当快的液流速度。
从图4可以看出：当布芯片流路区倾斜角度从20°变化到60°时，化学发光强度值轻微从106.3变化119.2，这意味着化学发光强度几乎不依赖于倾斜角度。这种现象的可能解释是：由于布芯片很薄，底液一旦越过蜡坝，其成分就能够与检测区中溶液成分快速混合，从而每个倾斜角度下具有相似化学发光强度。
从图5可以看出：在每个倾斜角度下，底液一旦触发化学反应后，化学发光信号能在1s内达到最大值，紧接着逐渐下降。
因此，本发明的布芯片化学发光葡萄糖传感具有一个快的分析速度。鉴于其发光强度较大且流动时间较短，本发明方法优选倾斜角度为50°。
实施例3
对影响实施例2中布芯片化学发光葡萄糖传感发光强度的若干重要因素(酶溶液中GOD、HRP浓度，底液中Luminol、PIP浓度，缓冲液pH值，孵育反应时间)进行优选
a)优选PIP浓度
1、待测液葡萄糖浓度5mM，酶溶液中GOD浓度0.1U/μL、HRP浓度0.6μg/μL，PBS缓冲液pH值7.50，底液中Luminol浓度1.5mM、PIP浓度待定，TBS缓冲液pH值8.00，孵育反应时间5min。
2、设置若干实验组：PIP浓度设置为几个不同值(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM、0.4mM、0.45mM)。
3、步骤和其他材料均与实施例2相同，测试结果如图6所示。
从实验结果可以看出：当PIP浓度为0mM时，化学发光强度很低；在一定浓度范围(0.2-0.4mM)内，化学发光强度较大且趋于稳定，继续增加浓度到0.45mM发光明显减弱。产生这种现象的可能原因是PIP浓度增高导致非辐射跃迁增加，从而导致发光减弱。基于这样的事实，本发明方法PIP浓度优选为0.3mM。
b)优选缓冲液pH值
1、待测液葡萄糖浓度5mM，酶溶液中GOD浓度0.1U/μL、HRP浓度0.6μg/μL，PBS缓冲液pH值待定，底液中Luminol浓度1.5mM、PIP浓度0.3mM，TBS缓冲液pH值待定，孵育反应时间5min。
2、设置若干实验组：PBS缓冲液pH值设置为几个不同值(6.00、6.50、7.00、7.50、8.00、8.50、9.00)；TBS缓冲液pH值设置为几个不同值(6.50、7.00、7.50、8.00、8.50、9.00、9.50、10.00)。
3、步骤和其他材料均与实施例2相同，测试结果如图7所示。
从实验结果可以看出：当配制酶溶液和葡萄糖待检液的PBS缓冲液pH值为7.50时，布芯片化学发光强度最大；pH值超过7.50时，化学发光强度随pH值增大而下降。相似地，配置底液的TBS缓冲液pH值为8.00时，布芯片化学发光强度最大；pH值大于8.00时，化学发光强度随pH值增大而下降。因此，本发明方法PBS缓冲液和TBS缓冲液pH值分别优选为7.50和8.00。
c)优选Luminol浓度
1、待测液葡萄糖浓度5mM，酶溶液中GOD浓度0.1U/μL、HRP浓度0.6μg/μL，PBS缓冲液pH值7.50，底液中Luminol浓度待定、PIP浓度0.3mM，TBS缓冲液pH值8.00，孵育反应时间5min。
2、设置若干实验组：Luminol浓度设置为几个不同值(0.75mM、1.0mM、1.25mM、1.5mM、1.75mM、2.0mM、2.25mM)。
3、步骤和其他材料均与实施例2相同，测试结果如图8所示。
从实验结果可以看出：当鲁米诺浓度从0.75mM增加到1.5mM时，化学发光强度几乎呈线性增长；当鲁米诺浓度继续增加为1.75-2.25mM时，化学发光强度呈逐渐下降。因此，鲁米诺浓度优选为1.5mM。
d)优选GOD浓度
1、待测液葡萄糖浓度5mM，酶溶液中GOD浓度待定、HRP浓度0.6μg/μL，PBS缓冲液pH值7.50，底液中Luminol浓度1.5mM、PIP浓度0.3mM，TBS缓冲液pH值8.00，孵育反应时间5min。
2、设置若干实验组：GOD浓度设置为几个不同值(0.005U/μL、0.025U/μL、0.05U/μL、0.1U/μL、0.2U/μL、0.3U/μL、0.4U/μL、0.5U/μL)。
3、步骤和其他材料均与实施例2相同，测试结果如图9所示。
从实验结果可以看出：当GOD浓度从0.005U/μL变化至0.1U/μL时，化学发光强度几乎成线性增加；当其浓度超过0.1U/μL，化学发光强度趋于稳定。因此，GOD浓度优选为0.1U/μL。
e)优选HRP浓度
1、待测液葡萄糖浓度5mM，酶溶液中GOD浓度0.1U/μL、HRP浓度待定，PBS缓冲液pH值7.50，底液中Luminol浓度1.5mM、PIP浓度0.3mM，TBS缓冲液pH值8.00，孵育反应时间5min。
2、设置若干实验组：HRP浓度设置为几个不同值(0.3μg/μL、0.4μg/μL、0.5μg/μL、0.6μg/μL、0.7μg/μL、0.8μg/μL、0.9μg/μL)。
3、步骤和其他材料均与实施例2相同，测试结果如图10所示。
从实验结果可以看出：当HRP浓度从0.3μg/μL变化至0.6μg/μL时，化学发光强度几乎成线性增加；当其浓度超过0.6μg/μL，化学发光强度趋于稳定。因此，HRP浓度优选为0.6μg/μL。
f)优选孵育反应时间
1、待测液葡萄糖浓度5mM，酶溶液中GOD浓度0.1U/μL、HRP浓度0.6μg/μL，PBS缓冲液pH值7.50，底液中Luminol浓度1.5mM、PIP浓度0.3mM，TBS缓冲液pH值8.00，孵育反应时间待定。
2、设置若干实验组：孵育反应时间设置为几个不同值(0min、1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、9min)。
3、步骤和其他材料均与实施例2相同，测试结果如图11所示。
从实验结果可以看出：在一定范围内(0-5min)，化学发光强度随着孵育反应时间增长而增强；当孵育反应超过5min后，随着孵育反应时间增长，发光强度趋于不变。因此，孵育反应时间优选为5min。
实施例4
以实施例3摸索的一些优选条件进行布芯片化学发光葡萄糖传感
1、采用实施例3优选的参数：当葡萄糖浓度小于/等于5mM时，酶溶液中GOD浓度0.1U/μL、HRP浓度0.6μg/μL；当葡萄糖浓度大于5mM时，酶溶液中GOD浓度0.4U/μL、HRP浓度0.9μg/μL，PBS缓冲液pH值7.50，底液中Luminol浓度1.5mM、PIP浓度0.3mM，TBS缓冲液pH值8.00，孵育反应时间5min。
2、设置若干实验组：待测液葡萄糖浓度设置为几个不同值(0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM、50mM、100mM)。
3、步骤和其他材料均与实施例2相同，测试结果如图12所示。
从实验结果可以看出：化学发光强度随着葡萄糖浓度升高而增大。在葡萄糖浓度从0.1mM变化到5mM时，化学发光强度与葡萄糖浓度对数呈一线性关系；在葡萄糖浓度较高(10-100mM)时，化学发光强度与葡萄糖浓度对数呈另一线性关系。
根据图12所示的低浓度下葡萄糖校正曲线(Y＝95.941X+97.843)，以及未加葡萄糖时的空白值加上其标准偏差三倍作为化学发光强度，算出本发明方法葡萄糖检测极限为0.0948mM。另外，从图12能看出本发明方法可以实现较宽范围的葡萄糖定量检测，且具有良好的线性。
实施例5
用实施例1中的布芯片检测人血清和尿样中葡萄糖水平，包括以下步骤：
1、采用实施例3优选的参数：酶溶液中GOD浓度0.1U/μL、HRP浓度0.6μg/μL，PBS缓冲液pH值7.50，底液中Luminol浓度1.5mM、PIP浓度0.3mM，TBS缓冲液pH值8.00，孵育反应时间5min。
2、设置若干实验组：取广州市第一人民医院提供的、由其用己糖激酶法检测得葡萄糖水平为12.73mM、6.01mM、11.04mM、7.83mM、11.05mM的临床血清样品，用pH值7.50的PBS缓冲液稀释10倍，然后取其10μL作为待测液；取广州市第一人民医院提供的、由其用葡萄糖氧化酶法检测得葡萄糖水平为56mM、11mM、28mM的临床尿样品，用pH值7.50的PBS缓冲液稀释10倍，然后取其10μL作为待测液。
3、步骤和其他材料均与实施例2相同。
通过本发明方法测得5个临床血清样品中葡萄糖水平分别为12.86±0.56mM、6.04±0.38mM、11.46±0.55mM、7.87±0.42mM、11.58±0.58mM；3个临床尿样品中葡萄糖水平分别为56.79±2.74mM、11.21±0.42mM、28.06±1.12mM。从这些结果可以看出：对于两个实际样品中葡萄糖水平，本方明方法测得的结果接近于临床上传统比色法测得的结果。因此，本方明方法也许有潜力发展成为传统方法的替代方法。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.流路上含蜡坝的重力/毛细流布芯片在葡萄糖传感中的应用，其特征在于包括以下步骤：
（1）含布芯片的支架放入暗箱中的适当位置处，调节CCD相机相关参数和焦距，使成像最清晰；往检测区滴加10 μL酶溶液，紧接着再滴加10 μL含葡萄糖的待检液；由于流路区中疏水蜡坝的阻隔，酶溶液和待检液能够被围在布芯片检测区中进行孵育反应数分钟，从而使得GOD氧化葡萄糖产生H2O2；
（2）检测区孵育反应完毕后，40 μL底液被滴加到上样区，在重力和布纤维毛细力作用下，底液在流路区迅速流动并越过蜡坝与检测区中的反应溶液充分混合，从而触发化学发光反应；发光信号由CCD相机视频成像采集；通过VGIF、Adobe Photoshop CS4、MatlabR2012a开发的图像自动处理程序以及Origin7.0对成像数据进行分析；
所述的布芯片分为疏水区和亲水区，亲水区又分为上样区、检测区和流路区三个部分；流路区靠近检测区的一端分布一个疏水性蜡坝；在使用时，该布芯片沿检测区与流路区的交界弯折后紧贴放置在一个支架上，该支架的倾斜面与水平面形成一个夹角，放置后上样区和流路区在支架倾斜面上，检测区在支架的水平部分上。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述布芯片的检测区为圆形，上样区为正方形，流路区为长方形。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述布芯片，其支架的倾斜面和水平部分上与布芯片亲水区域对应的位置是被掏空的。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述布芯片，其支架倾斜面与水平面形成的夹角为θ，须满足0°＜θ＜90°。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（1）中所述酶溶液的配制方法是：用pH值为6.00-9.00的PBS缓冲液配制GOD溶液和HRP溶液，然后等体积混合这两种溶液得到酶溶液，其中GOD 和HRP浓度分别为0.005-0.5 U/μL和0.3-0.9 μg/μL。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（1）中所述含葡萄糖的待检液其配制方法是：用pH值为6.00-9.00的PBS缓冲液配制一定量的葡萄糖，即得待检液。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所述的底液其配制方法是：用pH值为6.50-10.00的TBS缓冲液配制Luminol溶液和PIP溶液，然后等体积混合这两种溶液得到底液，其中Luminol 和PIP浓度分别为0.75-2.25 mM和0-0.45 mM。
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