CN104359898A - 一种检测过氧化氢的底物预固定布基微流控化学发光方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测过氧化氢的底物预固定布基微流控化学发光方法，该方法包括以下步骤：制作布基微流控芯片；将化学发光底液滴加到芯片检测区，然后在2～8℃下避光晾干储存；在芯片进样区滴加样品溶液，若样品中含有H₂O₂，则化学发光反应被触发，经CCD数字成像设备采集获得发光图像，并通过Matlab和Image J软件对图像进行处理。本发明方法的化学发光体系具有稳定性好、检测灵敏度高、动态范围宽等优点，能直接或者间接测定过氧化氢，这在环境监测、食品安全检测、生物化学、临床疾病诊断等领域有极其重要的研究意义。

Description

一种检测过氧化氢的底物预固定布基微流控化学发光方法

技术领域

本发明属于微流控分析领域，具体涉及一种检测过氧化氢的底物预固定布基微流控化学发光方法。

背景技术

过氧化氢是生物体系中的一种重要物质，它严重影响细胞新陈代谢，在许多酶促反应、蛋白积聚和抗原-抗体识别过程中也伴随着过氧化氢的产生和消耗。食品加工过程中，经常有一些不法商家用廉价的工业过氧化氢杀菌和漂白食品，使卖相变得更好，但人体摄入工业过氧化氢会导致多方面的危害，会使人体抵抗力下降，诱发基因突变，引起肠胃、心肺等部位多种疾病的发生。目前，国家已明令禁止在食品加工中使用工业过氧化氢。因此，采用化学发光体系定量测定过氧化氢，在环境监测、食品安全检测、生物化学、临床疾病诊断等领域有极其重要的研究意义。

1990年，Manz和Widmer等人首次提出微流控全分析系统(MiniaturizedTotal Analysia Systems,μTAS)概念以来，基于微流控芯片的生化分析技术得到了非常快速的发展，已从理论层次开始真正走向实际应用层面。

与传统实验室生化分析技术相比，微流控芯片技术具备一些明显的优势：装置体积小、分析效率高、样品和试剂消耗量少，尤其适合家庭或者现场检测。微流控芯片是μTAS的核心，其研究主要包括芯片的材料选择、加工方法、表面修饰，功能集成等。

当前，全球经济发展严重不平衡，微流控芯片的价格直接成为其能否被广泛接受应用的关键。因此，为了降低芯片成本，寻找一种廉价芯片加工材料已成为从事微流控芯片科研工作者的主要研究内容之一。目前，微流控芯片的加工材料主要有硅片、石英、玻璃、陶瓷以及塑料等。但是，基于这些材料的芯片造价普遍高、加工工艺复杂，因此它们广泛应用仍然受到一定程度的限制。

基于棉纤维的亲水性，2009年，Shen研究组提出以廉价棉线作为衬底材料来加工微流控装置(ACS Appl.Mater.Interfaces，2010，2，1–6)。

采用疏水线和亲水线，Bhandari等人通过纺织编织技术来构建具有一定疏水、亲水图案的布基微流控免疫分析芯片(Lab on a Chip,2011,11,2493-2499)。

采用类似的编织技术，Breedveld研究小组将亲水棉线和疏水棉线编织在一起以构建两性分子微流体控制的布基装置(ACS Appl.Mater.Intrefaces，2011，3，3796-3803)。

最近，Nilghaz等人提出一种蜡转印技术来加工布基微流控分析芯片(Lab ona Chip,2012,12,209-218)。

棉材料属于有机纤维，是现实生活中最常见的服装加工底料、植物栽种提取、处理工艺过程简单快速、适合大批量生产，比传统的玻璃、硅微流控芯片性价比高。因此，基于棉布材料的微流控芯片在分析化学、环境监测、生物医学等领域也许会表现出极大的应用潜力。

到目前为止，几乎所有的线基或者布基微流控装置都采用比色检测方法，极少数也采用了电化学或者颜色变化长度等检测方法。然而，化学发光检测和布基微流控技术相结合的传感方法还没有报道过。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测过氧化氢的底物预固定布基微流控化学发光方法，该方法将化学发光与布基微流控技术相结合，开发出了一种成本低廉、实用性广的布基微流控化学发光检测方法，实现了对肉制品中H₂O₂的检测。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测过氧化氢的底物预固定布基微流控化学发光方法，包括以下步骤：

(1)制作布基微流控芯片

设计进样区、检测区和微流控通道的图案，然后制成含有该图案的网纱网板；将布片置于网纱网板下方，并在网纱网板上涂蜡；将布与网纱网板一起加热5-10秒(带有布的一面朝向热源)；将布从网纱网板上取下并冷却至室温，得到布基微流控芯片；

所述的设计图案是用软件Adobe Illustrate CS5设计；

所采用的布片是灯芯绒全棉布，这种布料亲水性能较好，无需亲水性预处理便可直接用于芯片加工；

(2)化学发光底液预先固定于芯片检测区

将鲁米诺(Lumiol)溶液、辣根过氧化物酶(HRP)溶液、对碘苯酚(PIP)溶液按体积比1:1:1混合，得到化学发光底液；在检测前，将化学发光底液滴加到芯片检测区，然后在2～8℃下避光晾干储存；

所述鲁米诺溶液的浓度优选3×10^-3mol/L，辣根过氧化物酶溶液的浓度优选0.8mg/mL；

所采用的化学发光底液能在-20℃下较长时间保存完好，并可直接使用，这一定程度上解决了传统化学发光底液由A液和B液组成并分开保存的缺点。此外，采用的化学发光底液容易配制、操作简单。

(3)进样检测

将样品碾碎，用pH值为10的TE缓冲液侵泡10min，静置后所得上清液为样品溶液；在芯片进样区滴加样品溶液，若样品中含有H₂O₂，则化学发光反应被触发，经CCD数字成像设备采集获得发光图像，并通过Matlab和Image J软件对图像进行处理；本发明的布基微流控化学发光成像传感装置的组成示意图如图1所示；

所述的CCD数字成像设备是广州市明美科技有限公司产品，型号为MC15。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明方法与传统的、广泛使用的流动注射化学发光相比，无需采用任何价格昂贵的注射泵来驱动液体流动。本方法仅通过布材料的线中和线间纤维空隙的毛细力来驱动液体流动。

2、本发明方法所使用的布材料不仅价格低廉，而且亲水性好，因此无需亲水预处理便可直接进行芯片加工，从而进行样品分析。

3、本发明方法所需芯片加工不需要复杂的大型设备，仅需要布材料、蜡笔、网板以及加热板。布材料和蜡都很廉价，蜡是一般文具店都能购买到的蜡笔。

4、本发明方法中，可直接使用化学发光底液预处理布基微流控芯片的检测区，这样的芯片可批量储存，显著提高样品分析效率。

5、本发明的方法中，样品从进样区经布通道流到检测区的时间约3s，化学发光被触发后整个反应过程持续约25s，因此完成样品成像传感分析仅需30s左右，因此从进样到检测的分析速度极快。本发明方法适用于食品中残留H₂O₂的定量分析。

6、本发明所描述的方法操作流程简单，不需要专业人员操作。

7、本发明的方法减少了对环境的污染，样品分析完成后布芯片可通过燃烧的方法处理掉。

8、本发明方法的化学发光体系具有稳定性好、检测灵敏度高、动态范围宽等优点，能直接或者间接测定过氧化氢，这在环境监测、食品安全检测、生物化学、临床疾病诊断等领域有极其重要的研究意义。

附图说明

图1是本发明的布基微流控化学发光成像传感装置的组成示意图。

图2是布基微流控芯片亲水区域的图案。

图3是布基微流控芯片的实物图。

图4是布基微流控芯片的通道尺寸与吸液特性的测试结果图。

图5是样品溶液pH值与发光强度的关系图。

图6是Lumiol浓度与发光强度的关系图。

图7是HRP浓度与发光强度的关系图。

图8是纯H₂O₂样品中H₂O₂浓度与发光强度的关系图。

图9是鸡爪样品中H₂O₂浓度与发光强度的关系图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

一种检测过氧化氢的底物预固定布基微流控化学发光方法，包括以下步骤：

(1)制作布基微流控芯片

a)化学发光芯片图案设计

芯片图案采用进样区(4mm×4mm)和检测区(直径8mm)分开，并通过微通道(宽度：3mm、4mm、5mm；长度：5mm、10mm、15mm)连接(如图2所示)。这样的化学发光芯片图案设计的优势包括：(1)利用布纤维的毛细力驱动流体流动来实现流动注射化学发光；(2)进样区和检测区分开，一方面便于检测区处理，另一方面便于进样，能实现无污染自动进样；(3)利用溶液从进样区流到检测区的时间间隔来灵活地实现布基微流控化学发光CCD图像采集。

b)布基微流控芯片的制作过程

1、采用Adobe Illustrate CS5软件设计如图2所示的图案，基于这些图案制作出相对应的300目网纱网板；

2、将一个网板压在合适尺寸的全棉灯芯绒布上(两者紧贴)，用绿色蜡笔在网板上涂蜡，并用平滑碾磨勺均匀用力碾磨；

3、将附着有棉布的网板置于加热板加热(85℃加热5s)，带棉布的一面朝向加热板；

4、加热完成后，从网板上取下布，室温冷却，制成的布基微流控芯片包括亲水区域(进样区、微通道以及检测区)和疏水区域(如图3所示)。

c)不同通道尺寸的布基微流控芯片吸液性能测试

在上述不同尺寸微通道的芯片进样区滴加30μl胭脂红溶液，通过电子秒表记录胭脂红溶液从进样区出口流到检测区入口所需要的时间，每个实验重复5次做统计，其测试结果如图4所示。微通道长度一定时，通道越宽，溶液流过它所需要的时间就越短；宽度一定时，通道越短，溶液流过它所需要的时间也就越短。

基于试剂消耗量以及手动操作CCD采集图像所需的时间，本发明方法优选通道长度为10mm，宽度为3mm的布芯片作生化检测。

(2)化学发光底液预先固定于芯片检测区

将一定浓度的Lumiol、HRP、PIP按体积比1:1:1混合，将5μl配制好的化学发光底液直接用移液枪均匀滴加到布芯片上的圆形检测区，然后2-8℃避光晾干储存。

检测区预固定化学发光底液的布基微流控芯片可直接用于样品检测，大大降低了分析时间，显著提高了分析效率。

(3)对影响布基微流控化学发光的若干重要因素(样品pH值、化学发光底液浓度)的优选

a)优选样品溶液pH值

1、化学发光底液成分:Lumiol浓度为3×10^-3mol/L，PIP浓度为4×10^-4mol/L，HRP浓度为0.8mg/mL，三者以体积比1:1:1混合。

2、设置若干实验组：用TE缓冲液(pH值为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0)来稀释30％H₂O₂，使其浓度成为5×10^-3mol/L，然后取25μl加入芯片进样区。

3、关闭暗箱门，操作CCD相机进行化学发光图像采集，通过Matlab、ImageJ、Origin软件对采集的图像进行分析，测试结果如图5所示。

从实验结果可以看出：当缓冲液pH值为10，布基微流控化学发光强度最大，pH值超过10时，发光强度随pH值增大而下降。

b)优选底液中Lumiol浓度

1、设置若干实验组：化学发光底液中Lumiol的浓度设置为几个不同值(1.5×10^-3mol/L、2×10^-3mol/L、2.5×10^-3mol/L、3×10^-3mol/L、3.5×10^-3mol/L、4×10^-3mol/L)，PIP浓度为4×10^-4mol/L，HRP浓度为0.8mg/mL，三者以体积比1:1:1混合。

2、用TE缓冲液(pH 10.0)配制H₂O₂浓度为5×10^-3mol/L，然后取其25μl加入芯片进样区。

3、关闭暗箱门，操作CCD相机进行化学发光图像采集，通过Matlab、ImageJ、Origin软件对采集的图像进行分析，测试结果如图6所示。

从实验结果可以看出：Lumiol浓度为3×10^-3mol/L时布基微流控化学发光强度最大，其浓度超过3×10^-3mol/L时，随着浓度增大，发光强度反而减小。

c)优选底液中HRP浓度

1、设置若干实验组：化学发光底液中HRP浓度设置为几个不同值(0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL)，Lumiol浓度为3×10^-3mol/L，PIP浓度为4×10^-4mol/L，三者以体积比1:1:1混合。

2、用TE缓冲液(pH 10.0)配制H₂O₂浓度为5×10^-3mol/L，然后取其25μl加入芯片进样区。

3、关闭暗箱门，操作CCD相机进行化学发光图像采集，通过Matlab、ImageJ、Origin软件对采集的图像进行分析，测试结果如图7所示。

从实验结果可以看出：在一定范围内，随着酶浓度增加，化学发光强度几乎成线性增加；当其浓度超过0.8mg/mL，化学发光强度趋于稳定。考虑到酶用量很大程度影响着检测成本，本发明方法底液中酶浓度优选为0.8mg/mL。

综合(a)，(b)及(c)优选过程，本发明方法中优选的反应试剂浓度为：Lumiol浓度为3×10^-3mol/L，HRP浓度为0.8mg/mL，三者以体积比1:1:1混合，-20℃避光保存。另外，用pH 10.0的TE缓冲液稀释配制H₂O₂溶液。

(4)布基微流控芯片定量检测纯H₂O₂样品和3％(V/V)H₂O₂浸泡过的鸡爪样品

a)纯H₂O₂样品检测

1、用pH 10.0TE缓冲液将30％H₂O₂稀释成不同浓度(0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L)，以此作为待测样品。

2、取不同浓度的25μL待测样品添加到芯片的进样区中。

3、关闭暗箱门，操作CCD相机进行化学发光图像采集，通过Matlab、ImageJ、Origin软件对采集的图像进行分析，结果见图8。

根据图8所示H₂O₂的校正曲线和未加样品时的空白值加上其相对偏差三倍作为发光强度值，算出本发明方法对过氧化氢的检测限为0.46mmol/L。

结合图4芯片吸液性能测试结果可知：当使用的布芯片通道长为10mm，宽为3mm时，样品从进样区经布通道流到检测区的时间约3s，化学发光被触发后整个反应过程持续约25s，因此完成样品成像传感分析仅需30s左右，具有较高的分析速度。

从图8可以看出，本发明的方法可以实现H₂O₂定量检测，且具有较好的线性。

b)3％(V/V)H₂O₂浸泡过的模拟鸡爪样品检测

1、未经任何处理的新鲜鸡爪采用超纯水清洗晾干，然后取其少量并用3％H₂O₂来侵泡，记录侵泡时间(本发明中取侵泡时间分别为6、12、18、24、30、32h)。

2、取侵泡不同时间的鸡爪，清水冲洗数秒，称取5g样品搅碎。

3、用50mL pH值为10的TE缓冲液侵泡搅碎过的样品10min，浸泡过程中保持充分震荡。静置一段时间后，直接取其上层清液作为待测溶液，并取其25μL加入到进样区。

4、关闭暗箱门，操作CCD相机进行化学发光图像采集，通过Matlab、ImageJ、Origin软件对采集的图像进行分析，结果如图9所示。

图9根据侵泡不同时间模拟样品的发光强度值，并结合图8的H₂O₂的校正曲线可以估算出不同侵泡时间样品中对应H₂O₂的浓度。本实施例发现侵泡超过24h后，随着侵泡时间增加，发光强度趋于不变，说明样品中H₂O₂含量趋于饱和。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种检测过氧化氢的底物预固定布基微流控化学发光方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)制作布基微流控芯片

设计进样区、检测区和微流控通道的图案，然后制成含有该图案的网纱网板；将布片置于网纱网板下方，并在网纱网板上涂蜡；将布与网纱网板一起加热5-10秒；将布从网纱网板上取下并冷却至室温，得到布基微流控芯片；

所采用的布片是灯芯绒全棉布；

(2)化学发光底液预先固定于芯片检测区

将鲁米诺溶液、辣根过氧化物酶溶液、对碘苯酚溶液按体积比1:1:1混合，得到化学发光底液；在检测前，将化学发光底液滴加到芯片检测区，然后在2～8℃下避光晾干储存；

所述鲁米诺溶液的浓度为3×10^-3mol/L，辣根过氧化物酶溶液的浓度为0.8mg/mL；

(3)进样检测

将样品碾碎，用pH值为10的TE缓冲液侵泡10min，静置后所得上清液为样品溶液；在芯片进样区滴加样品溶液，若样品中含有H₂O₂，则化学发光反应被触发，经CCD数字成像设备采集获得发光图像，并通过Matlab和Image J软件对图像进行处理。

2.根据权利要求1所述的检测过氧化氢的底物预固定布基微流控化学发光方法，其特征在于：所述的设计图案是用软件Adobe Illustrate CS5设计。