CN104004850A - 一种纸基微流控芯片增强型化学发光基因传感方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，该方法包括如下步骤：1、将网印板压在层析纸上，涂蜡，然后加热，层析纸从网印板上自然脱落，晾干；2、设计捕捉探针和信号探针；3、纸基微流控芯片的预处理；4、将待测DNA样品与捕捉探针孵育，加入信号探针与待测DNA样品杂交反应，再加入HRP-SA孵育；最后，加入底液触发增强型化学发光，发光信号由一台CCD数字成像设备成像采集。相比于昂贵且复杂的光学成像系统，本发明采用简单的CCD设备进行成像检测；将增强型化学发光体系和生物素-链霉亲和素亲和放大体系相结合，极大地提高了纸基微流控芯片化学发光的检测灵敏度，检测限可达6.3×10-2pmol/L。

Description

一种纸基微流控芯片增强型化学发光基因传感方法
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种纸基微流控芯片增强型化学发光检测单增李斯特菌hlyA基因的方法。
背景技术
基因是一个功能性的DNA分子片段，是遗传信息的基本单位，是所有物种最基本的决定性因素。基因检测是指通过一定的检测方法对靶核酸分子进行检测，并分析靶核酸分子致病基因、疾病易感性基因等情况的一种技术。单核细胞增生李斯特菌(本文有些地方简称“单增李斯特菌”)作为一种重要的食源性致病菌可引起人和动物感染疾病，它是由多种毒力因子组成。自从1985年Parrisius小组报道李斯特菌溶胞素以来，已有很多证据证明单核细胞增生李斯特氏菌溶血素LLO是主要的致病因素，LLO是由hlyA基因编码并且只存在于致病性菌株中。
目前为止，一些研究小组已经研制了相关的基因检测方法：电致化学发光法、电化学法、荧光分析法、比色分析法等。相比于这些检测方法，化学发光法具有低噪声、灵敏度高、需要的检测设备简单等优点，因此它成为一种强大的分析技术被广泛运用于各种基因检测和免疫分析中。
自2007年以来，纸基微流控芯片已经得到非常迅速的发展。鉴于纸的普遍性、兼容性、毛细特性，它常常被用来进行微流体处理和样品分析。相比于其它衬底材料的微流控芯片，纸基微流控芯片能够实现便携、低成本、快速、现场检测。到目前为止，一些加工方法已用于纸基微流控芯片制作，比如：照相平板加工法、等离子处理法、剪纸法、蜡转染法、喷墨印刷法等。相比于这些加工方法，蜡网印加工法的优势在于：制作容易、成本低、且所需设备简单。
基于鲁米诺-过氧化氢的化学发光体系是一种应用非常广泛的发光体系。由于辣根过氧化物酶稳定性好、比活度高、特异性强，它常常被用作鲁米诺-过氧化氢化学发光体系的催化剂。然而，大分子间的空间位阻、发光强度低且衰减迅速等因素使得辣根过氧化物酶-鲁米诺-过氧化氢发光体系稳定性差且灵敏度低。
纸基微流控作为一种新发展起来的检测平台，应用于DNA检测的研究还特别少。就目前而言，仅Yu等人在这方面做了相关研究。Yu等人将传统纸基蜡网印方法应用于纸基反应池制作；然后在网印好的反应池上进行处理及标记；通过DNA杂交的原理对靶DNA进行杂交捕获；再通过引入标记有信号物质的信号探针与靶DNA杂交来放大信号，其中他们的信号物质为碳量子点吸附的纳米多孔金；最后通过高锰酸钾底液触发化学发光。
该方法的缺陷在于：
(1)靶DNA长度低于50bp；靶DNA长度越长，应用范围越广，低于50bp显然应用的范围很窄；
(2)蜡网印方法中加热过程为130℃(150s)，该温度过高、时间过长，会导致纸张性能发生改变，不利于其后的检测反应；
(3)冲洗在反应池中进行，这会导致冲洗不干净，且多次冲洗会导致试剂交叉污染；
(4)所采用的信号物质——碳量子点吸附的纳米多孔金，其合成过程比较复杂，并且信号物质标记信号探针的过程繁杂，时间较长；
(5)采用微弱发光分析仪对化学发光信号进行采集分析，虽然能实现较低灵敏度检测，但是该分析仪价格昂贵、导致检测成本高，并且不具备高通量检测的能力。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，该方法操作简便、灵敏度和特异性高，实现了对李斯特菌食品致病菌的检测。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，包括如下步骤：
(1)制作纸基微流控芯片
如图1所示，将网印板压在层析纸上(两者紧贴)，然后在网印板上涂蜡，蜡透过网印板将层析纸浸润；接着，将附着层析纸的网印板置于加热板上加热，带层析纸的一面朝向加热板；加热后，层析纸从网印板上自然脱落，室温冷却晾干。制成的纸基微流控芯片其上面会有一个个的反应池。网印板可通过加热擦拭去除多余的蜡。
所述的层析纸是Whatman1号层析纸，大小优选200mm×200mm。
所述的网印板优选200目尼龙网印版，反应池直径优选4mm，冲洗通道优选长4mm、宽2mm。
所述的将网印板置于加热板上加热，优选100℃加热5s。
(2)设计捕捉探针和信号探针
本发明方法所选取的目标序列(本文有些地方也称为“靶DNA”)是hlyA基因的198bp长链特异性片段(在本文中的代号是S2，其序列如SEQ ID NO.1所示)；所设计的捕捉探针(S1)其序列如SEQ ID NO.2所示，其3’端连接氨基；信号探针(S3)的序列如SEQ ID NO.3所示，其3’端连接生物素。
所设计的捕捉探针为31bp，其中22个连续碱基与靶DNA完全互补配对；设计的信号探针为18bp，与靶DNA的另一段序列完全互补配对。
(3)纸基微流控芯片的预处理
将5μL0.3mol/L高碘酸钠溶液滴入纸基微流控芯片的反应池中；置于暗室中反应1h，采用Tris–HCl缓冲液冲洗4次；然后，将5μL5×10-7mol/L捕捉探针加入反应池中，孵育30min，采用40μL Tris–HCl缓冲液冲洗4次；最后，将5μL0.5mg/mL NaCNBH3加入反应池中，孵育10min，采用40μL Tris–HCl缓冲液冲洗4次，室温晾干。
(4)上样后的分析检测
将5μL待测DNA样品加入反应池与捕捉探针进行杂交反应，孵育30min，采用Tris–HCl缓冲液冲洗4次；接着，将5μL5×10-7mol/L信号探针加入反应池与待测DNA样品杂交反应，孵育30min，采用Tris–HCl缓冲液冲洗4次；然后，将10μL HRP-SA(辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素)加入反应池，孵育40min，采用Tris–HCl缓冲液冲洗4次；最后，将10μL底液加入反应池，触发增强型化学发光，发光信号由一台CCD(电荷耦合器件Charge CoupledDevice)数字成像设备成像采集；
若待测DNA样品的化学发光强度值大于1，说明待测DNA样品中含有hlyA基因；若待测DNA样品的化学发光强度值小于或等于1，说明待测DNA样品中不含有hlyA基因；根据实验发现，空白对照的化学发光强度值都小于或等于1。所述的空白对照是不含有hlyA基因的DNA样品。
化学发光强度＝平均灰度值；
平均灰度值由系统自带的图像分析软件计算出；
所述的CCD数字成像设备是广州市明美科技有限公司产品，型号为MC15。本发明中增强型化学发光成像系统所采用的图像分析软件V 1.0为广州明美科技有限公司开发。
所述的待测DNA样品，是将待测菌株进行培养，然后提取DNA，用引物进行目标序列的PCR扩增，扩增产物在95℃水浴中加热5min，将双链靶DNA热变性成单链靶DNA，得到待测DNA样品；所述的菌株培养、DNA提取和PCR扩增都用现有技术的方法即可。
所述的引物序列如下：
Lis-F：5'-GCCGT AAGTG CGAAA TC-3'(SEQ ID NO.4)
Lis-R:5'-ATAGG CAATG GGAAC TCC-3'(SEQ ID NO.5)
所述的底液由鲁米诺、过氧化氢、对碘苯酚和水组成；底液的pH值是7.5～9.0，pH值优选8.2；底液中鲁米诺的浓度是5×10-4mol/L，过氧化氢的浓度是4×10-3mol/L，对碘苯酚的浓度是1×10-4mol/L～1×10-3mol/L，优选4×10-4mol/L。
步骤(3)和(4)中有多次冲洗过程。为了实现高效率的冲洗，在反应池的两边设计了两个冲洗通道。在非冲洗过程中，通道与反应池通过蜡隔离方式保持一定距离，保证反应液集聚在反应池内不扩散，确保反应顺利进行；一旦开始冲洗，两边的冲洗通道通过折纸方法与反应池相连接，然后在一边的矩形池内滴入缓冲液，待缓冲液流过反应池到另一边的矩形池时用足量吸液纸吸走液体。这样反复几次，反应池内的多余反应试剂将被冲洗干净；冲洗完成后冲洗通道与反应池分开。相比于直接在反应池中的冲洗方法，这种方法能够避免多次冲洗造成的试剂污染，提高冲洗效率。
本发明的基本原理是：通过高碘酸钠处理纸基微流控芯片反应池产生大量醛基，醛基化的反应池与氨基化的捕捉探针通过形成希夫碱固定结合，氰基硼氢化钠用来稳定共价键；加入待测DNA样品与捕捉探针置于37℃下杂交反应30min；在反应池加入生物素标记的信号探针。与待测DNA样品进行杂交，37℃孵育30min；加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37℃孵育40min，通过生物素-链霉亲和素的亲和作用，将化学发光所需的酶引入检测体系中，同时放大检测信号；加入含有鲁米诺、过氧化氢、对碘苯酚的底液来触发增强型化学发光，对碘苯酚的增强作用使得增强型化学发光强度相对于无增强型化学发光在衰减缓慢的同时增强了1000倍以上；通过一台CCD数字成像设备对发光信号进行成像、采集与分析。
生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合而形成生物素衍生物，这不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比活度高，具有多价性；亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。生物素-链霉亲和素亲和放大体系应用到当前化学发光检测体系中，不仅能够增强体系的检测灵敏度，而且还具有非常高的特异性。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)相比于传统的蜡网印加工方法，本发明的改良蜡网印加工方法运用于纸基微流控芯片制作过程中能够更长时间将反应液稳定在反应池中而不往四周扩散，参见图7；形成的亲水反应区更精细；而且，改良蜡网印加工方法制作工艺简单且极大地缩短了加热时间。
(2)背景技术所提到的文献，其制作纸基芯片是涂蜡后，将纸撕下来单独加热；本发明是涂蜡后将吸附有纸的网版一起加热，如此能够将更多的蜡透过网版融在纸上，使得网印效果更好。
(3)相对于其它衬底材料的微流控芯片，本发明的纸基微流控芯片材料更加普遍通用、成本低、且充分利用了纸纤维素的物理化学性质。
(4)相比于其它昂贵且复杂的光学成像系统，本发明采用简单的CCD设备进行成像检测；并且将增强型化学发光体系和生物素-链霉亲和素亲和放大体系相结合，极大地提高了纸基微流控芯片化学发光的检测灵敏度，检测限可达6.3×10-2pmol/L。
(5)相对于其它基因传感方法常常检测短片段的核酸序列，本发明的纸基微流控芯片检测的靶DNA序列长达198bp，极大地提高了检测方法应用上的广泛性。
(6)相对于其它基因传感方法常常检测过滤纯化后的核酸序列，本发明的纸基微流控芯片检测的DNA样品是非过滤纯化的，这简化了检测过程和提高应用上的广泛性。
附图说明
图1是本发明的纸基微流控芯片的制作过程示意图。
图2是实施例1的发光信号检测结果图；其中，a是待测DNA样品的，b是空白对照的。
图3是本发明方法中化学发光强度与对碘苯酚浓度的关系图。
图4是本发明方法中化学发光强度与底液pH值的关系图。
图5是本发明方法中化学发光强度与靶DNA浓度的关系图。
图6是实施例6中不同核酸序列组合的化学发光强度。
图7是本发明方法制作的纸基微流控芯片与文献方法制作的芯片其反应池中模拟液的扩散效果图；其中，上排是本发明的，下排是文献方法的。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，包括如下步骤：
(1)制作纸基微流控芯片
如图1所示，将200目尼龙网印版(直径4mm，冲洗通道长4mm、宽2mm)压在200mm×200mm Whatman1号层析纸上(两者紧贴)，然后在网印板上涂蜡，蜡透过网印板将层析纸浸润；然后，将附着层析纸的网印板置于加热板上加热(100℃加热5s)，带层析纸的一面朝向加热板；加热后，层析纸从网印板上自然脱落，室温冷却晾干。制成的纸基微流控芯片其上面会有一个个的反应池。
(2)设计捕捉探针和信号探针
捕捉探针的序列如SEQ ID NO.2所示，信号探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
(3)纸基微流控芯片的预处理
将5μL0.3mol/L高碘酸钠溶液滴入纸基微流控芯片的反应池中；置于暗室中反应1h，采用Tris–HCl缓冲液冲洗4次；然后，将5μL5×10-7mol/L捕捉探针加入反应池中，孵育30min，采用40μL Tris–HCl缓冲液冲洗4次；最后，将5μL0.5mg/mL NaCNBH3加入反应池中，孵育10min，采用40μL Tris–HCl缓冲液冲洗4次，室温晾干。
(4)上样后的分析检测
将5μL待测DNA样品(含有hlyA基因)加入反应池与捕捉探针进行杂交反应，孵育30min，采用Tris–HCl缓冲液冲洗4次；接着，将5μL5×10-7mol/L信号探针加入反应池与待测DNA样品杂交反应，孵育30min，采用Tris–HCl缓冲液冲洗4次；然后，将10μL HRP-SA(辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素)加入反应池，孵育40min，采用Tris–HCl缓冲液冲洗4次；最后，将10μL底液加入反应池，触发增强型化学发光，发光信号由一台CCD数字成像设备成像采集；
所述的底液由鲁米诺、过氧化氢、对碘苯酚和水组成，其中鲁米诺的浓度是5×10-4mol/L，过氧化氢的浓度是4×10-3mol/L，对碘苯酚的浓度是4×10-4mol/L。
发光信号检测结果如图2所示，待测DNA样品的化学发光强度值为5.414，空白对照(不含有hlyA基因)的化学发光强度值为0.474，说明待测DNA样品中含有hlyA基因。
实施例2
一种纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，其步骤和材料均与实施例1相同。设置了若干实验组，底液中对碘苯酚的浓度分别是1×10-2mol/L、1×10-3mol/L、4×10-4mol/L、1×10-4mol/L、1×10-5mol/L。
各实验组的化学发光强度值如图3所示。
可以看出：对碘苯酚的增强作用存在阈值。当对碘苯酚浓度较低时，几乎对发光没有增强作用，当高于一个阈值(1×10-4mol/L)时，增强发光作用开始；在一定的浓度范围(1×10-4mol/L～1×10-3mol/L)内，发光趋于稳定，继续增加浓度到一个较大阈值(1×10-3mol/L)时，发光明显减弱。产生这种现象的可能原因是对碘苯酚浓度增高导致非辐射跃迁增加，从而导致发光减弱。
通过实验研究，发现本发明方法中对碘苯酚增强作用的浓度范围大致为1×10-4mol/L～1×10-3mol/L，在浓度为4×10-4mol/L时发光比较稳定。因此，所述方法的最佳对碘苯酚浓度为4×10-4mol/L。
实施例3
一种纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，其步骤和材料均与实施例1相同。
由于辣根过氧化物酶催化作用的最佳pH值是中性或者弱酸性，而鲁米诺化学发光在pH值为10.0左右时量子产率最高，因此，需要选择一个能平衡两者关系的pH值。
设置若干实验组，底液的pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.2、8.5、9.0、10.0。
各实验组的化学发光强度值如图4所示。
可以看出，可接受的pH值是7.5～9.0，小于7.0和大于10.0的基本没有发光。底液pH值为8.2时化学发光强度值最大且比较稳定。
实施例4
一种纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，其步骤和材料均与实施例1相同。
设置若干实验组，其中待测DNA样品中靶DNA(hlyA基因)的浓度分别为1.9×10-1pmol/L、1.9×100pmol/L、1.9×101pmol/L、1.9×102pmol/L、1.9×103pmol/L、1.9×104pmol/L。
各实验组的化学发光强度值如图5所示。
由图可知，化学发光强度随着靶DNA浓度升高而升高。
靶DNA浓度的对数与化学发光强度呈一定线性关系。
检测限采用的计算方法是：XL＝3Xb+Sb(Xb为空白对照的平均化学发光强度值，Sb为空白对照的标准偏差)(10次重复实验)，通过所得的XL值对应的靶浓度得到检测限。
本方法的检测限为6.3×10-2pmol/L。
实施例5
一种纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，其步骤和材料均与实施例1相同。
为了证明本发明方法对靶DNA特异性检测，设计了单碱基变化的捕捉探针S4(其序列如SEQ ID NO.6所示，其3’端连接氨基)和单碱基变化的信号探针S5(其序列如SEQ ID NO.7所示，其3’端连接生物素)，然后探究不同组合的核酸序列与化学发光强度之间的关系，组合如下：
组合A：捕捉探针S1+S2+信号探针S3(这是本发明所采用的方法)
组合B：单碱基变化的捕捉探针S4+S2+信号探针S3(这个式子表示的意思是用S4替代本发明方法的S1；组合C和D的意思与此类似)
组合C：捕捉探针S1+S2+单碱基变化的信号探针S5
组合D：单碱基变化的捕捉探针S4+S2+单碱基变化的信号探针S5
组合E：捕捉探针S1+E.coli(单链大肠杆菌PCR扩增产物)+信号探针S3
各组合的化学发光强度如图6所示。
由图可知，非完全互补配对的化学发光强度(组合B、C、D、E)仅仅是完全互补配对的(组合A)20％左右。这证明了本发明的方法可以实现对单增李斯特菌hlyA基因的特异性片段进行特异性检测。
实施例6
用实施例1步骤(1)的方法所制成的纸基微流控芯片，与采用文献方法制得的纸基芯片，进行对比实验。
文献：《Facile and sensitive paper-based chemiluminescence DNA biosensorusing carbon dots dotted nanoporous gold signal amplification label》Wang,Y.H.,Wang,S.M.,Ge,S.G.,Wang,S.W.,Yan,M.,Zang,D.J.,Yu,J.H.,2013.Analytical Methods5,1328–1336.
两者同时滴入同样体积的液体，观察液体在反应池中的扩散情况。结果如图7所示。
在长达40min孵育时间里，本发明的改良蜡网印方法得到的反应池能够保证大量的反应液集聚在反应池中，只在孵育30～40min左右看到周边有很小一圈浸湿的痕迹；而文献方法制得的反应池中的反应液在滴入10min开始，池中的液体快速向外扩散，到达30min左右，池中已经没有明显反应液残留，液体基本已经扩散到了池周边区域。
可见，本发明的改良蜡网印加工方法运用于纸基微流控芯片制作过程中能够更长时间将反应液稳定在反应池中而不往四周扩散，文献方法所制得的芯片达不到这个效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制作纸基微流控芯片
将网印板压在层析纸上，然后在网印板上涂蜡，将附着层析纸的网印板置于加热板上加热，带层析纸的一面朝向加热板；加热后，层析纸从网印板上自然脱落，室温冷却晾干；
所述的将网印板置于加热板上加热，是100℃加热5s；
(2)设计捕捉探针和信号探针
捕捉探针的序列如SEQ ID NO.2所示，其3’端连接氨基；信号探针的序列如SEQ ID NO.3所示，其3’端连接生物素；
(3)纸基微流控芯片的预处理
将5μL0.3mol/L高碘酸钠溶液滴入纸基微流控芯片的反应池中；置于暗室中反应1h，采用Tris–HCl缓冲液冲洗4次；然后，将5μL5×10-7mol/L捕捉探针加入反应池中，孵育30min，采用40μL Tris–HCl缓冲液冲洗4次；最后，将5μL0.5mg/mL NaCNBH3加入反应池中，孵育10min，采用40μL Tris–HCl缓冲液冲洗4次，室温晾干；
(4)上样后的分析检测
将5μL待测DNA样品加入反应池与捕捉探针进行杂交反应，孵育30min，采用Tris–HCl缓冲液冲洗4次；接着，将5μL5×10-7mol/L信号探针加入反应池与待测DNA样品杂交反应，孵育30min，采用Tris–HCl缓冲液冲洗4次；然后，将10μL HRP-SA加入反应池，孵育40min，采用Tris–HCl缓冲液冲洗4次；最后，将10μL底液加入反应池，触发增强型化学发光，发光信号由一台CCD数字成像设备成像采集；
若待测DNA样品的化学发光强度值大于1，说明待测DNA样品中含有hlyA基因；若待测DNA样品的化学发光强度值小于或等于1，说明待测DNA样品中不含有hlyA基因；
化学发光强度值＝平均灰度值
平均灰度值由系统自带的图像分析软件计算出；
所述的底液由鲁米诺、过氧化氢、对碘苯酚和水组成；底液的pH值是7.5～9.0，底液中对碘苯酚的浓度是1×10-4mol/L～1×10-3mol/L。
2.根据权利要求1所述的纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，其特征在于：步骤(4)所述的待测DNA样品，是将待测菌株进行培养，然后提取DNA，用引物进行目标序列的PCR扩增，扩增产物在95℃水浴中加热5min，将双链靶DNA热变性成单链靶DNA，得到待测DNA样品。
3.根据权利要求2所述的纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，其特征在于：所述的引物序列如下：
Lis-F：5'-GCCGT AAGTG CGAAA TC-3'
Lis-R：5'-ATAGG CAATG GGAAC TCC-3'。
4.根据权利要求1所述的纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，其特征在于：步骤(4)中，底液的pH值为8.2。
5.根据权利要求1所述的纸基微流控芯片增强型化学发光检测hlyA基因的方法，其特征在于：步骤(4)的底液中，鲁米诺的浓度是5×10-4mol/L，过氧化氢的浓度是4×10-3mol/L，对碘苯酚的浓度是4×10-4mol/L。
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