CN110596085B - 一种基于距离量测的非消耗型纸芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于距离量测的非消耗型纸芯片及其制备方法,该纸芯片两端分别设置有加样区和检测区,在加样区与检测区之间设置有显色区,所述显色区用于填充水溶性染料,该纸芯片可用于检测miRNA,而水溶性染料不与miRNA反应。本发明通过采用不与待测物反应的水溶性染料作为显色试剂使得检测过程中显色试剂不发生消耗,色带均匀;若在纸芯片上原位生长具有良好疏水性能的MOF材料可使得纸芯片具有均匀的疏水性能,色带末端平整,可以提高检测准确度。
Description
技术领域
本发明属于生化分析与生物传感技术领域,尤其涉及一种基于距离量测的非消耗型纸芯片及其制备方法和应用。
背景技术
纸芯片(μPAD)又叫纸上实验室(lab on a Paper),2007年由哈佛大学Whitesides课题组首次提出,因其成本低廉、制备简单、使用方便、生物相容性好、无需额外动力泵驱动液体流动等众多优点而受到广泛关注,并被应用于食品安全分析、环境监测以及生物医药分析等多个行业。为了满足不同情况下检测的需求,多种基于纸芯片的检测方法被广泛报道,主要有比色法、荧光法、生物发光法、电化学法、质谱法等。比色法通过肉眼观察颜色强度的变化进行检测,通用于对目标物进行定性或半定量分析,虽然可以进一步结合拍照/扫描并使用imageJ等图像处理软件实现定量分析,但会受到拍摄距离、拍摄角度、光线强弱等多种因素干扰而影响检测准确性。荧光法、生物发光法、电化学法、质谱法等具有较高的检测灵敏度,但需要额外的检测仪器和专业的操作人员,不利于结果的快捷输出。
基于距离量测的纸芯片检测方法,通过肉眼读取显色信号的长度,实现对目标物的定量分析,可很好弥补现有方法的缺陷。例如Charles S.Henry利用距离量测的方法在纸芯片上实现了钾离子的定量检测,Zhang利用距离量测策略发展了核酸适配体免仪器定量分析方法。
目前基于距离量测的纸芯片一般都是在纸上设置加样区和检测区,并在检测区中填充能够与待测溶液反应的显色试剂(一般为无色),使用时在加样区滴加待测溶液,待测溶液中的待测分子与显色试剂发生反应生成有色物质(或者显色试剂与待测溶液中的其他物质发生反应生成有色物质),随着待测溶液在纸上的迁移以及反应的进行而形成色带。这种纸芯片存在如下缺点:1、检测过程中,含有待测分子的溶液在纸上流动,检测区域的显色试剂不断消耗而浓度逐渐减小,导致产生的色带颜色逐渐变浅,难于准确获得长度信息;2、由于检测区前后端显色剂与待测分子反应时间差异大,导致检测区域显色条带不均匀,增加读数误差;3、检测的灵敏度相对较低;4、芯片需要在检测区域均匀沉积能发生显色反应的显色试剂,制备难度大。
发明内容
本发明的目的在于解决纸芯片检测过程中由于显色试剂发生反应被消耗而出现显色不均匀的问题,提供一种基于距离量测的非消耗型纸芯片,在检测过程中显色试剂不被消耗,检测区的显色条带颜色均匀。
本发明所提供的一种基于距离量测的非消耗型纸芯片两端分别设置有加样区和检测区,在加样区与检测区之间设置有显色区,所述显色区用于填充水溶性染料。
进一步,所述纸芯片中原位生长有MOF材料。
进一步,所述MOF材料为沸石型咪唑框架材料。
进一步,所述沸石型咪唑框架材料为ZIF-8。
本发明还提供上述基于距离量测的非消耗型纸芯片的制备方法,包括以下步骤:
将纸张切割成所需形状,在纸张两端分别设置加样区和检测区,在加样区与检测区之间设置有显色区,并在显色区填充水溶性染料。
进一步,在将纸张切割成所需形状步骤前还包括步骤:将纸张浸泡在合成MOF材料的前驱体溶液中,前驱体溶液发生反应使得纸张上原位生长上MOF材料。
进一步,所述前驱体含有乙酸锌和2-甲基咪唑。
进一步,所述乙酸锌与2-甲基咪唑反应生成ZIF-8的反应温度为0~40℃。
本发明还提供一种利用上述基于距离量测的非消耗型纸芯检测miRNA的方法,包括以下步骤:
1)将不含待测miRNA的空白对照溶液和系列不同浓度的经滚环扩增的含待测miRNA的标准溶液分别滴加到上述基于距离量测的非消耗型纸芯片的加样区,分别记录检测区中水溶性染料的流动长度L0和Lt,以L0/Lt值与标准溶液浓度之间的关系做出标准曲线;
2)将经滚环扩增的待测miRNA溶液滴加到上述基于距离量测的非消耗型纸芯片的加样区,记录检测区中水溶性染料的流动长度,根据该流动长度和标准曲线即可得待测miRNA溶液的浓度。
进一步,所述miRNA为miR-221或miR-222。
相对于现有技术,本发明通过在纸芯片加样区和检测区之间设计显色区,并填充不与待测物反应的水溶性染料,检测过程中水溶性染料不会被消耗,水溶性染料的颜色在检测过程中不会发生变化,从而可以形成颜色均匀的色带。另外,由于纸芯片的外壁疏水性强,而内部通道中的纤维亲水性强,则待测溶液和水溶性染料在纸芯片外壁和内部通道中的流动速度不同,从而会产生色带端部参差不齐的现象,导致检测结果误差较大。本发明还通过在纸芯片上原位生长有具有良好的疏水性能MOF材料,使得纸芯片的内部与边缘具有相同的疏水性,保证待测溶液和水溶性染料在纸芯片的外壁和内部通道中具有相同的流动速度,在检测区形成的色带末端平整,提高了检测准确度。
附图说明
图1为实施例1的非消耗型纸芯片结构示意图;
图2为实施例2的非消耗型纸芯片结构示意图;
图3为ZIF-8@Paper-4、ZIF-90@Paper和ZIF-92@Paper以及没有修饰任何MOF材料的非消耗型纸芯片的XRD图谱;
图4为实施例4的检测原理图,其中a表示PCR管,b表示待测miRNA,c表示环状哑铃型扩增模板,d表示BSA,e表示dNTP,f表示phi29聚合酶;
图5为环状哑铃型扩增模板的电泳测试图,图中a、b分别表示miR-221、miR-222的环形哑铃型扩增模板,1表示未经酶处理,2表示经T4连接酶处理,3表示T4连接酶和核酸外切酶处理;
图6为不同浓度miRNA扩增曲线图,图中a为miR-221,b为miR-222;
图7为miR-221溶液和miR-222溶液的电泳测试图,图中a为miR-221,a中1表示DNAmarker,2~4依次表示miR-221溶液浓度为0、20、10pM;b为miR-222,b中1~3依次表示miR-222溶液浓度为1、20、0pM;
图8为Paper-1.5、Paper-2.0、Paper-2.5、Paper-3.0、Paper-3.5对miR-221溶液的检测结果;
图9为miR-221溶液在Paper-2.0和ZIF-8@Paper-4中的检测结果及miR-221溶液在纸芯片中的接触角,其中a、c表示Paper-2.0,b、d表示ZIF-8@Paper-4;
图10为不同体积的miR-221溶液在Paper-2.0中的检测结果;
图11为将miR-221溶液滴加到ZIF-8@Paper-1、ZIF-8@Paper-2、ZIF-8@Paper-3和ZIF-8@Paper-4中的结果图,其中a~d依次表示ZIF-8@Paper-1、ZIF-8@Paper-2、ZIF-8@Paper-3和ZIF-8@Paper-4;
图12为ZIF-8@Paper-1、ZIF-8@Paper-2、ZIF-8@Paper-3和ZIF-8@Paper-4的SEM图,其中a、b表示ZIF-8@Paper-1、c、d表示ZIF-8@Paper-2,e、f表示ZIF-8@Paper-3,g、h表示ZIF-8@Paper-4;
图13为将miR-221溶液滴加到ZIF-8@Paper-4(37)、ZIF-8@Paper-4(25)和ZIF-8@Paper-4的相对标准偏差曲线;
图14为ZIF-8@Paper-4(37)、ZIF-8@Paper-4(25)和ZIF-8@Paper-4的SEM图,其中a、b表示ZIF-8@Paper-4(37)、c、d表示ZIF-8@Paper-4(25),e、f表示ZIF-8@Paper-4;
图15为Paper-2.0、ZIF-90@Paper、ZIF-92@Paper和ZIF-8@Paper-4中L0/Lt值比较图;
图16为miR-221溶液的标准曲线;
图17为miR-222溶液的标准曲线;
图18为与miR-221、miR-221相关或相近的miRNA的检测结果;
图19为PMHS@Paper和AKD@Paper的检测结果,其中a表示PMHS@Paper,b表示AKD@Paper;
图20为溶液在PMHS@Paper和AKD@Paper中的接触角示意图,其中a表示PMHS@Paper,b表示AKD@Paper。
具体实施方式
本发明通过采用惰性的、不与待测物反应的水溶性染料作为显色试剂使得检测过程中水溶性染料不发生消耗,在检测区流动形成的色带颜色均匀;并通过在纸芯片上原位生长具有良好疏水性能的MOF材料使得纸芯片具有均匀的疏水性能,使得色带末端平整,提高检测准确度。
本发明提供的一种基于距离量测的非消耗型纸芯片(以下简称纸芯片)的基体为纸张,例如选用普通的实验用滤纸、书写纸张等,纸芯片的两端分别设置有加样区和检测区,在加样区与检测区之间设置有显色区,所述显色区用于填充水溶性染料,所用水溶性染料一般具有颜色,具有亲水性,自身惰性,不与其他物质(如待测物)发生反应,例如可选用红墨水、蓝墨水等水溶性染料。
优选地,所述纸芯片中原位生长有MOF材料。
上述原位生长有MOF材料地基于距离量测的非消耗型纸芯片的制备方法包括以下步骤:
1)将纸张浸泡在合成MOF材料的前驱体溶液中,前驱体发生反应使得纸张上原位生长上MOF材料;
2)将纸张取出并洗涤干燥,切割成所需形状,在纸张两端分别设置加样区和检测区,在加样区与检测区之间设置有显色区,在显色区填充水溶性染料。
上述纸芯片可用于检测miRNA。以下结合具体实施例来详细说明本发明的技术方案。
实施例1
参照图1,本实施例1的基于距离量测的非消耗型纸芯片两端分别设置有加样区11和检测区13,在加样区11与检测区13之间设置有显色区12;所述加样区11远离显色区12的一端设计成圆形,靠近显色区12并与显色区12连接的部分设计为条形;所述显色区12设计成圆形,并填充有红墨水;所述检测区13设计为长条形,其宽度为1.5~3.5mm。
上述纸芯片的制备方法为,将普通滤纸洗涤干燥后用激光雕刻机切割出所设计的形状,并在显色区滴加1.0μL红墨水,在30℃下干燥10min即可得到纸芯片。通过将检测区的宽度设计为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mm,得到一系列纸芯片,依次标记为Paper-1.5、Paper-2.0、Paper-2.5、Paper-3.0、Paper-3.5。
实施例2
参照图2,本实施例2的纸芯片两端分别设置有加样区21和检测区23,在加样区21与检测区23之间设置有显色区22;所述加样区21远离显色区22的一端设计成圆形,靠近显色区22并与显色区22连接的部分设计为条形;所述显色区22设计成圆形,并填充有红墨水;所述检测区23设计为长条形,其宽度为1.5~3.5mm,优选地,此处宽度选为2.0mm。整个纸芯片上都修饰有MOF材料,具体为ZIF-8、ZIF-90或ZIF-92纳米粒子,依次标记为ZIF-8@Paper、ZIF-90@Paper和ZIF-92@Paper。
其中ZIF-8@Paper的制备方法包括以下步骤:
1)将纸张浸泡在合成MOF材料的前驱体溶液中,前驱体发生反应使得纸张上原位生长上MOF材料。
具体地,将普通滤纸浸泡在乙酸锌甲醇溶液和2-甲基咪唑甲醇溶液组成的ZIF-8前驱体溶液中,并在一定温度下反应60min,使得滤纸上原位生长上ZIF-8纳米粒子。其中乙酸锌甲醇溶液和2-甲基咪唑甲醇溶液的浓度以及反应温度如表1和表2所示。
2)将纸张取出并洗涤干燥,切割成所需形状,在纸张两端分别设置加样区和检测区,在加样区与检测区之间设置有显色区,在显色区滴加水溶性染料。
具体地,将滤纸从反应混合物中取出,洗涤干燥后于激光雕刻机切割出所设计的形状,即,纸张两端分别设置加样区和检测区,在加样区与检测区之间设置有圆形显色区,并于显色区滴加1.0μL普通红墨水,置于30℃下干燥10min后密封保存备用。
表1:乙酸锌甲醇溶液和2-甲基咪唑甲醇溶液浓度(反应温度为4℃)
表2:反应温度(乙酸锌甲醇溶液浓度为5mM,2-甲基咪唑甲醇溶液浓度为100mM)
标号 | ZIF-8@Paper-4(37) | ZIF-8@Paper-4(25) | ZIF-8@Paper-4 |
反应温度/℃ | 37 | 25 | 4 |
另外,ZIF-90@Paper和ZIF-92@Paper的制备方法与ZIF-8@Paper的制备方法类似。
具体地,将实验用滤纸浸泡于由10mM硝酸锌甲醇溶液和40mM醛基咪唑甲醇溶液组成的ZIF-90前驱体溶液中室温反应24h,即可得到生长上ZIF-90的纸张。将生长上ZIF-90后的纸张浸泡于10%的乙醇胺甲醇溶液中,80℃下反应24h,即可得到生长ZIF-92的纸张。反应完后取出滤纸,洗涤干燥后于激光雕刻机切割出所设计的纸芯片,并于芯片的圆形显色区滴加1.0μL普通红墨水,置于30℃下干燥10min即可得到相应的ZIF-90@Paper和ZIF-92@Paper。
参照图3,该图为ZIF-8@Paper-4、ZIF-90@Paper和ZIF-92@Paper以及没有修饰任何MOF材料的纸芯片的XRD图谱。图3的XRD图谱显示,与标准峰对照,未生长MOF材料的纸芯片上未出现MOF特征峰,仅有纸的背景峰,生长纳米材料后的纸上,出现了ZIF-8、ZIF-90和ZIF-92的特征峰,表明成功生长所需的MOF纳米粒子。
实施例3
本实施例3的纸芯片两端分别设置有加样区和检测区,在加样区与检测区之间设置有显色区;所述加样区远离显色区的一端设置成圆形,靠近显色区并与显色区连接的部分为条形;所述显色区设置成圆形,并填充有红墨水;所述检测区为长条形,其宽度为2.0mm。整个纸芯片上都修饰有聚甲基氢硅氧烷(PMHS)或烷基烯酮二聚体(AKD蜡粉),分别标记为PMHS@Paper和AKD@Paper。
其中PMHS@Paper的制备方法为:采用无水乙醇将PMHS稀释至浓度为0.1%,将实验用滤纸浸泡于PMHS乙醇溶液中润湿1min,再于65℃下加热反应3h使PMHS附着在滤纸上,乙醇洗涤干燥后切割出所设计的形状,并于芯片的圆形显色区滴加1.0μL普通红墨水,即为PMHS@Paper。
AKD@Paper的制备方法为:称取0.1000g AKD蜡粉溶于100mL正庚烷溶液中,配成浓度为0.1%的AKD正庚烷溶液,将实验用滤纸浸泡于该溶液中润湿1min,再于100℃下加热反应1h使AKD附着在滤纸上,洗涤干燥后切割出所设计的形状,并于芯片的圆形显色区滴加1.0μL普通红墨水,即为AKD@Paper。
实施例4
本实施例4利用实施例1~3中的各种纸芯片对miRNA进行检测,其中的检测原理图如图4所示:将不含miRNA的空白对照溶液滴到纸芯片的加样区,记录红墨水在检测区的流动距离(即形成的印迹长度)L0,再将miRNA溶液(可通过滚环扩增来得到较高粘度的溶液)滴到纸芯片的加样区,记录红墨水在检测区的流动距离Lt,根据不同miRNA溶液浓度下的L0/Lt值得到标准曲线,利用标准曲线即可对miRNA进行检测。具体检测方法如下:
(1)待测样品处理
①设计扩增模板:
以miRNA作为模型分析物,此处具体选择miR-221和miR-222,其中miR-221序列为5’-AGC UAC AUU GUC UGC UGG GUU UC-3’(SEQ ID NO:1),miR-222序列:5’-AGC UAC AUCUGG CUA CUG GGU-3’(SEQ ID NO:2)。
根据miR-221和miR-222序列设计环形哑铃型扩增模板,模板的5’端修饰一磷酸基团,利用T4 DNA连接酶连接3’和5’端,再利用核酸外切酶I和核酸外切酶III水解未反应的线型扩增模板,获得环状哑铃形扩增模板。具体地,所设计的miR-221环状哑铃型扩增模板序列为5’-GTA GCT TCT AAA TCA CTA TGG TCG CGC TAG GTA TAT TGA GCT ACA TTG TCTGCC AAC GGC GAA ACC CAG CAG ACA AT-3’(SEQ ID NO:3),所设计的miR-222环状哑铃型扩增模板序列为5’-GTA GCT TCT AAA TCA CTA TGG TCG CGC TAG GTA TAT TGA GCT ACATCT GGC TAA CGA CCC AGT AGC CAG AT-3’(SEQ ID NO:4)。配制15%的非变性凝胶电泳,在150V电压下对上述两种环状哑铃型扩增模板进行电泳测试,电泳结果如图5所示,图中第3个条带中只有1个明显的条带,且电泳速度快于第一个条带,证明成功合成了环状哑铃形扩增模板。
②滚环扩增(RCA):
向PCR管中分别加入4μL一系列不同浓度的miR-221溶液或miR-222溶液,依次加入1μL相应的环状哑铃扩增模板,0.5μL10 mM的BSA,2μL10 mM的dNTP,2μL聚合酶缓冲液,0.5μL聚合酶和10μL DEPC处理水,混匀后于37℃下孵育2h进行滚环扩增,80℃加热20min失活酶,得到一系列相应的滚环扩增产物溶液。其中不同浓度miRNA扩增曲线图如图6所示。根据图6可知,miRNA浓度越高,扩增效率越高。配制15%的非变性凝胶电泳,在150V电压下对miR-221溶液或miR-222溶液进行电泳,电泳图如图7所示。图7反映,发生滚环扩增反应后,得到长链的DNA产物,堆积于电泳胶的顶部,而无待测miRNA存在下的体系,仅有模板链的荧光条带。
(2)纸芯片检测
移取10μL上述步骤②经滚环扩增后的miR-221溶液或miR-222溶液,滴加到纸芯片的圆形加样区(直径5mm),溶液在毛细作用力驱动下向前流动,并流经显色区推动红墨水前进到达长方形检测区,在检测区形成显色均匀的印迹(即色带)。待溶液在长方形检测区中停止流动时,读出检测区域红色印迹长度Lt,由于不同浓度的miR-221溶液或miR-222溶液在纸芯片上的流动距离不同,将会形成不同的印迹长度Lt。并以仅包括相应环状哑铃扩增模板、phi29聚合酶缓冲液、phi29聚合酶、BSA、dNTP和DEPC水的无待测miRNA的体系为空白对照溶液的印迹长度为L0,记录L0/Lt,作出L0/Lt与浓度之间的关系曲线即得标准曲线。若需要检测一未知的待测miR-221或miR-222溶液浓度,则可将该待测miR-221或miR-222溶液滴加到非消耗型纸芯片的加样区,记录检测区中印迹长度,根据该印迹长度和标准曲线即可得待测miR-221或miR-222溶液的浓度。
利用实施例1~3各种纸芯片进行检测的结果如下,需要说明的是,下文所称miR-221或miR-222溶液均指经过滚环扩增后的溶液,其浓度表示滚环扩增前的miR-221或miR-222浓度:
请参看图8,该图为将5pM的miR-221溶液滴加到实施例1中的Paper-1.5、Paper-2.0、Paper-2.5、Paper-3.0、Paper-3.5的加样区中的检测结果。图8反映,将纸芯片的检测区宽度设计在1.5~3.5mm范围内都能进行有效的检测,并且当检测区宽度为2.0mm时,L0/Lt值最大,将具有最高的检测灵敏度。
其中将5pM的miR-221溶液滴加到Paper-2.0的加样区后,溶液沿着纸芯片通道推动红墨水流动,所形成的色带以及溶液与纸芯片的接触角如图9a、9c所示。从图9a、9c可以看出,检测区中的色带颜色均匀,色带末端不平,呈尖型,且溶液与纸芯片的接触角为30.2°。
出现上述现象主要是由于将miR-221溶液滴加到纸芯片的加样区后,溶液沿着纸芯片通道向显色区流动,miR-221溶液到达显色区后溶解红墨水,于红墨水一起沿着纸芯片通道向检测区移动,而溶液不与红墨水发生反应从而不会发生颜色改变,因此在检测区留下流动印迹,形成颜色均匀的色带。不过由于纸芯片外壁具有疏水性,而纸芯片内部通道中的纤维具有亲水性,如此会使溶液和红墨水在纸芯片外壁流动速度慢,在内部通道的流动速度快,最终造成色带末端呈现尖型。
在Paper-2.0加样区中滴加不同体积的5pM的miR-221溶液,记录检测区产生的有色长度,考察L0/Lt,结果如图10所示。该图反映,当加样体积小于8μL示时,结果误差较大。加样体积大于8μL时,随着加样体积的增加,L0/Lt值逐渐增大,加样体积为10μL时比值较大且误差较小,为最优加样体积。
将浓度为5pM的miR-221溶液滴加到实施例2中在不同前驱体溶液浓度、不同温度下制得的ZIF-8@Paper的加样区中,各检测区形成的色带以及各色带长度情况如下:
请参看图11,该图为将miR-221溶液滴加到使用不同浓度的前驱体溶液制成的ZIF-8@Paper-1、ZIF-8@Paper-2、ZIF-8@Paper-3和ZIF-8@Paper-4中的结果。图11反映,前驱体溶液浓度越高,疏水性越强。浓度大于25mM时,miR-221溶液和红墨水难以在通道中流动,浓度为10mM时,miR-221溶液流动均匀性差。当浓度为5mM时,溶液在通道中流动均匀。结合图12所示相应SEM表征图可知,随着前驱体溶液浓度越高,纸芯片的纤维上ZIF-8粒子生长量越多,颗粒越大,呈现堆叠状,例如图12b中ZIF-8@Paper-1中ZIF-8粒子堆积程度较高,其电镜图呈现较模糊状态,已难以将每颗粒子区分清楚,给纸芯片的纤维通道造成一定的堵塞,因此在前驱体溶液浓度高时miR-221溶液和红墨水难以在通道中流动。当生长浓度为乙酸锌5mM、2-甲基咪唑100mM情况下,ZIF-8纳米粒子生长数量适中,颗粒分布均匀,粒径大小于50~250nm,纸芯片的纤维可清晰显露出来,没有被堵塞,miR-221溶液和红墨水得以在通道中顺利流动。
请参看图13,该图为将miR-221溶液滴加到ZIF-8@Paper-4(37)、ZIF-8@Paper-4(25)和ZIF-8@Paper-4的加样区中,红墨水在检测区中流动长度(即色带长度)的相对标准偏差。图12反映,前驱体溶液反应的温度越高,色带长度误差值越大,当生长温度为4℃时,可得到可接受的结果误差。结合图14所示的前驱体溶液在不同温度生长的ZIF-8的SEM表征图可知,生长温度越高,纸芯片中的纤维上ZIF-8颗粒生长数量越多,堆叠越明显,均匀性越差,从而导致miR-221溶液和红墨水难以在通道中均匀流动。当生长温度为4℃时,ZIF-8纳米粒子生长大小适中,颗粒分布均匀,尺寸为50~250nm范围,则miR-221溶液和红墨水能够在通道中均匀流动。
将miR-221溶液滴加到使用乙酸锌甲醇溶液浓度为5mM、2-甲基咪唑甲醇溶液浓度为100mM组成的前驱体溶液在4℃下反应制成的纸芯片,即ZIF-8@Paper-4中的加样区后,miR-221溶液沿着纸芯片通道推动红墨水流动,所形成的色带以及溶液与纸芯片的接触角如图9b、9d所示。从图9b、9d可以看出,检测区中的色带颜色均匀;相比未生长ZIF-8的纸芯片(即Paper-2.0)的结果(图9a、9c),在纸芯片上原位生长ZIF-8后检测区的色带末端变得平整,且溶液与纸芯片的接触角由30.2°增加到57.2°,说明在纸芯片上原位生在ZIF-8后纸芯片疏水性明显增强,且纸芯片外壁和内部通道疏水性相近,溶液与纸芯片外壁和内部通道的表面张力相近,溶液和红墨水在纸芯片外壁和内部通道的流动速率相近,从而可使距离量测结果更加准确。
请参看图15,该图为没有修饰任何MOF材料的Paper-2.0、ZIF-90@Paper、ZIF-92@Paper和ZIF-8@Paper-4四种不同纸芯片中L0/Lt值。图15反映,与没有修饰任何MOF材料的Paper-2.0和修饰了ZIF-92、ZIF-90的ZIF-90@Paper、ZIF-92@Paper相比,修饰了ZIF-8的ZIF-8@Paper-4检测时的L0/Lt值明显更大。虽然ZIF-92、ZIF-90与ZIF-8同属于沸石型咪唑框架材料,但是由于ZIF-92、ZIF-90表面具有醛基或羟基等亲水基团,而ZIF-8表面具有疏水的甲基,疏水性更强。
参看图16和17,其分别为将不同浓度的miR-221溶液或miR-221溶液滴加到ZIF-8@Paper-4中得到的标准曲线。图16显示,miR-221溶液0~20pM范围内线性良好,线性回归方程为:y=0.0769+1.06(R2=0.970),利用该曲线方程可对miR-221溶液进行定量检测。图17显示,miR-222在0.5~20pM范围内线性良好,线性回归方程为:y=0.0826+0.978(R2=0.978),利用该曲线方程可对miR-222溶液进行定量检测。
用ZIF-8@Paper-4对与miR-221、miR-221相关或相近的浓度为5pM的miRNA进行检测,结果如图18所示。图18反映,ZIF-8@Paper-4对miR-221、miR-221的检测最好,对与之相关或相近的miRNA的检测性能一般,具有一定特异性。
将miR-221溶液滴加到实施例3的PMHS@Paper、AKD@Paper的加样区中,结果如图19和20所示。图19反映,当采用AKD蜡粉和PMHS修饰纸芯片时,通道疏水性过强,溶液的流动均匀性差,流动误差大。结合图20所示的溶液与分别经AKD蜡粉和PMHS修饰后的纸基芯片的接触角测量结果可知,经AKD蜡粉和PMHS修饰后溶液与纸芯片通道的接触角分别为109.6°和70.0°,均远大于溶液与ZIF-8修饰的纸芯片通道的接触角57.2°(图9d)。上述现象说明由于AKD蜡粉和PMHS的疏水性过强,并不适合用于检测miRNA。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种基于距离量测的非消耗型纸芯片及其制备方法和应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
agcuacauug ucugcugggu uuc 23
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 2
agcuacaucu ggcuacuggg u 21
<210> 3
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gtagcttcta aatcactatg gtcgcgctag gtatattgag ctacattgtc tgccaacggc 60
gaaacccagc agacaat 77
<210> 4
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtagcttcta aatcactatg gtcgcgctag gtatattgag ctacatctgg ctaacgaccc 60
agtagccaga t 71
Claims (4)
1.一种基于距离量测的非消耗型纸芯片,所述纸芯片两端分别设置有加样区和检测区,其特征在于:在加样区与检测区之间设置有显色区,所述显色区用于填充水溶性染料;所述纸芯片中原位生长有ZIF-8,所述ZIF-8由乙酸锌和2-甲基咪唑组成的前驱体溶液反应得到,所述乙酸锌和2-甲基咪唑的浓度分别为5mM和100mM,所述反应温度为4℃。
2.一种基于距离量测的非消耗型纸芯片的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
将纸张浸泡在合成ZIF-8的前驱体溶液中,前驱体溶液发生反应使得纸张上原位生长上ZIF-8;
将纸张切割成所需形状,在纸张两端分别设置加样区和检测区,在加样区与检测区之间设置有显色区,并在显色区填充水溶性染料;
所述前驱体溶液含有乙酸锌和2-甲基咪唑,所述乙酸锌和2-甲基咪唑的浓度分别为5mM和100mM,所述反应温度为4℃。
3.一种检测miRNA的方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)将不含待测miRNA的空白对照溶液和系列不同浓度的经滚环扩增的含待测miRNA的标准溶液分别滴加到权利要求1所述基于距离量测的非消耗型纸芯片的加样区,分别记录检测区中水溶性染料的流动长度L0和Lt,以L0/Lt值与标准溶液浓度之间的关系做出标准曲线;
2)将经滚环扩增的待测miRNA溶液滴加到权利要求1任一项所述基于距离量测的非消耗型纸芯片的加样区,记录检测区中水溶性染料的流动长度,根据该流动长度和标准曲线即可得待测miRNA溶液的浓度。
4.根据权利要求3所述检测miRNA的方法,其特征在于:所述miRNA为miR-221或miR-222。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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