CN113174359B - 一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用，该外泌体捕获纸芯片的纸纤维表面附着有正电荷纳米粒子，正电荷纳米粒子上固定有外泌体特异性标记物的抗体，其中，正电荷纳米粒子为ZIF‑90纳米颗粒，外泌体特异性标记物的抗体为CD63抗体。本发明中的外泌体捕获纸芯片相较于常规分离方法外泌体分离效率更高，操作更简单，无需大型仪器，耗时短，捕获的外泌体的纯度相较于常规方法更高。

Description

一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生化分析与生物传感领域，具体涉及一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用。

背景技术

细胞外囊泡(EVs)是由细胞释放到细胞外空间的膜结构，并携带有核酸和蛋白质等物质。EVs有多种类型，如微囊泡、凋亡小体、外泌体等。外泌体是小的EVs，直径在30～150nm左右，是大多数真核细胞分泌的具有膜结构的内源性纳米小泡(30-150nm)。外泌体在介导细胞间通讯和调节多种生物过程中能发挥重要作用，而且，由于外泌体具有良好的生物相容性，跨膜性能以及可以作为潜在的生物标志物，从而可被广泛应用于药物载体，疾病的早期诊断和靶向治疗等众多领域。

外泌体的研究基础是建立高效的外泌体分离方法。然而，由于外泌体在样本中通常与尺寸和密度接近的微囊泡、凋亡小体、脂蛋白等复杂样本共存，对其有效分离存在巨大挑战。在相关技术中，存在部分可以用于外泌体分离富集的方法，如超高速离心法、密度梯度离心法、尺寸排阻法、聚合物沉淀法以及微流控法等，但各有弊端。超高速离心法需要大型且价格昂贵的超高速离心机，操作繁琐耗时(～8h)，而且容易产生机械力损伤，产率低。尺寸排阻法和聚合物沉降法虽然产率高、价格低、操作简单，但其选择性差，获得的外泌体纯度低。基于微流控的方法也被广泛应用于外泌体的分离和检测，但其需要复杂的微流控芯片，微流控芯片价格昂贵，制作工艺复杂且分离产率低，样本处理量极小，不适用于大规模生产。

因此，开发一种简便、高效的外泌体捕获方法，以获得高纯度的外泌体，将对促进外泌体的研究具有重大意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用，本发明利用纸芯片原位生长ZIF-90纳米粒子共价交联CD-63，提高抗体有序性和负载率原理，结合多孔滤膜，能够高效、快速和高纯度捕获和无损释放各类样品中的外泌体，解决了现有外泌体提取方法中存在的问题。

本发明的第一个方面，提供一种外泌体捕获纸芯片，该外泌体捕获纸芯片的纸纤维表面附着有正电荷纳米粒子；该正电荷纳米粒子上固定有外泌体特异性标记物的抗体。

纸芯片(Microfluidic paper-based devices，μPAD)又叫纸上实验室(Lab on apaper)，其成本低廉、制备简单、使用方便、生物相容性好，可被应用于食品安全分析、环境监测以及生物医药分析等多个行业。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述正电荷纳米粒子具有-CHO基团。

正电荷纳米粒子表面的-CHO基团可以与抗体所带-NH₂基团发生反应，使两者结合在一起，从而得到固定有抗体的外泌体捕获纸芯片。

在本发明的一些优选实施方式中，正电荷纳米粒子包括ZIF-90纳米颗粒。

在本发明的一些更优选实施方式中，正电荷纳米粒子为ZIF-90纳米颗粒。

由于纸纤维表面带大量负电荷，ZIF-90纳米颗粒中带正电荷的Zn²⁺容易和纸纤维发生较强的静电结合，而且由于采用了咪唑-2-甲醛(HICA)作为反应液，HICA与纸纤维表面的Zn²⁺发生配位反应，使反应液中游离的Zn²⁺能继续作为ZIF-90的Zn源实现ZIF-90在纸芯片上的原位生长。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述外泌体特异性标记物的抗体包括外泌体蛋白抗体和外泌体核酸抗体。

在本发明的一些优选实施方式中，所述外泌体特异性标记物的抗体为外泌体蛋白抗体。

在本发明的一些优选实施方式中，所述外泌体蛋白包括CD63、CD81和CD69。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述外泌体蛋白为CD63。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述外泌体捕获纸芯片的制备方法，包括如下步骤：

(1)将纸浸入Zn(NO₃)₂·6H₂O甲醇溶液浸泡30～35min，然后在Zn(NO₃)₂·6H₂O、咪唑-2-甲醛和甲醇的混合液中浸泡8～8.5h，甲醇洗涤，干燥；

(2)向干燥后的纸上滴加外泌体蛋白抗体，反应6～6.5h，磷酸盐吐温缓冲液洗涤，即得。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述外泌体蛋白抗体包括CD63抗体。

在本发明的一些优选实施方式中，所述外泌体蛋白抗体为CD63抗体。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中纸在Zn(NO₃)₂·6H₂O甲醇溶液以及在Zn(NO₃)₂·6H₂O、咪唑-2-甲醛和甲醇混合液中的浸泡温度均为85～95℃。

在本发明的一些优选实施方式中，纸在Zn(NO₃)₂·6H₂O甲醇溶液以及在Zn(NO₃)₂·6H₂O、咪唑-2-甲醛和甲醇混合液中的浸泡温度均为90℃。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述Zn(NO₃)₂·6H₂O甲醇溶液中Zn(NO₃)₂·6H₂O的摩尔浓度为8～12mmol/L。

在本发明的一些优选实施方式中，Zn(NO₃)₂·6H₂O甲醇溶液中Zn(NO₃)₂·6H₂O的摩尔浓度为10mmol/L。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述Zn(NO₃)₂·6H₂O、咪唑-2-甲醛和甲醇混合液中Zn(NO₃)₂·6H₂O和咪唑-2-甲醛的摩尔浓度比为1：(3～5)。在本发明的一些优选实施方式中，Zn(NO₃)₂·6H₂O、咪唑-2-甲醛和甲醇混合液中Zn(NO₃)₂·6H₂O和咪唑-2-甲醛的摩尔浓度比为1:4，Zn(NO₃)₂·6H₂O的摩尔浓度为5mmol/L，咪唑-2-甲醛的摩尔浓度为20mmol/L。

本发明的第三个方面，提供一种外泌体捕获检测系统，该外泌体捕获检测系统包括驱动装置、储存装置、大孔径分离膜、本发明第一个方面所述的外泌体捕获纸芯片或本发明的第二个方面制备方法制备得到的外泌体捕获纸芯片。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述大孔径分离膜的孔径小于等于200nm。

在本发明的一些优选实施方式中，所述大孔径分离膜包括聚碳酸酯膜(PC)。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述大孔径分离膜为聚碳酸酯膜。

采用200nm孔径的聚碳酸酯膜主要用于初步筛除样本中粒径大于200nm的微囊泡等大颗粒，使外泌体捕获纸芯片能更高效的捕获外泌体。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述驱动装置为蠕动泵。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述储存装置为带有流动控制阀的储液装置，以用于储存样品溶液，洗脱液和洗涤液。

本发明中的外泌体捕获检测系统，在蠕动泵的驱动下，样品中的大于200nm的大囊泡颗粒被PC膜截留，小于200nm的颗粒经过μPAD层时，由于μPAD表面原位修饰结构规则且表面富含醛基的ZIF-90纳米材料能够有序共价修饰外泌体特异性抗体CD-63，提高了抗体的结合效率，使外泌体被μPAD上高密度的CD63抗体特异性捕获。捕获完成后，可以利用谷胱甘肽(GSH)水解ZIF-90纳米材料(MOF)，将外泌体由μPAD上无损释放。

本发明的第四个方面，提供一种外泌体检测试剂盒，该检测试剂盒中包括本发明第一个方面所述的外泌体捕获纸芯片或本发明的第二个方面制备方法制备得到的外泌体捕获纸芯片。

本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述的外泌体捕获纸芯片、本发明的第二个方面制备方法制备得到的外泌体捕获纸芯片以及本发明第三个方面所述的外泌体捕获检测系统在外泌体分离中的应用。

本发明的第六个方面，提供本发明第一个方面所述的外泌体捕获纸芯片、本发明的第二个方面制备方法制备得到的外泌体捕获纸芯片以及本发明第四个方面所述的外泌体检测试剂盒在外泌体检测中的应用。

本发明的有益效果是：

1.本发明中的外泌体捕获纸芯片相较于常规分离方法外泌体分离效率更高，操作更简单，无需大型的仪器和离心设备、复杂的微流控芯片制备。

2.本发明中的外泌体捕获纸芯片采用了规则的ZIF-90纳米粒子固定抗体，使抗体更整齐有序，活性更高。

3.本发明中基于外泌体捕获纸芯片的外泌体捕获检测系统对于外泌体的捕获或检测耗时更短，平均耗时为30min。

4.本发明中基于外泌体捕获纸芯片的外泌体捕获检测系统捕获的外泌体的纯度相对常规方法获得的外泌体纯度更高，ZIF-90修饰的μPAD极大地降低μPAD的非特异性吸附。

附图说明

图1为本发明实施例中的生长ZIF-90前后的μPAD的SEM结果图，A和B为生长ZIF-90前的μPAD，C和D为ZIF-90@μPAD；

图2为本发明实施例中的ZIF-90、未生长ZIF-90的μPAD(纸)和生长ZIF-90的μPAD的PXRD结果谱图；

图3为本发明实施例中的μPAD、ZIF-90@μPAD和固定CD63抗体后的ZIF-90@μPAD的红外表征结果谱图；

图4为本发明实施例中的CD63蛋白表征以及ZIF-90抗蛋白吸附结果图，A为CD63@ZIF-90@μPAD，B为未加CD63的ZIF-90@μPAD，C为固定了CD63的氧等离子体处理μPAD；

图5为本发明实施例中的修饰ZIF-90前后的μPAD分别吸附FITC-BSA前后的荧光倒置显微镜结果图，A为吸附FITC-BSA前的μPAD，B为吸附FITC-BSA后的μPAD，C为吸附FITC-BSA前的ZIF-90@μPAD，D为吸附FITC-BSA后的ZIF-90@μPAD；

图6为本发明实施例中的基于ZIF-90@μPAD的外泌体捕获系统的装置图；

图7为本发明实施例中的超速离心法所得外泌体的表征结果，A为SEM结果图，B为TEM结果图，C为western Blot成像结果图，D为NTA粒径分析结果图；

图8为本发明实施例中的超速离心法制备得到的不同浓度的外泌体的比色法检测结果，A为无外泌体(PBS)，B为外泌体浓度3.0×10⁴个/μL，C为外泌体浓度3.0×10⁵个/μL，D为外泌体浓度3.0×10⁶个/μL；

图9为本发明实施例中的不同稀释浓度的CCM中的外泌体的比色法检测结果，A为无外泌体(PBS)，B为100倍稀释的CCM，C为10倍稀释的CCM，D为未稀释的CCM；

图10为本发明实施例中的外泌体捕获方法捕获的外泌体的表征图，A为CCM过滤前PC膜的SEM结果图，B为CCM过滤后PC膜的SEM结果图，C为捕获外泌体后μPAD的SEM结果图，D为外泌体释放后μPAD的SEM结果图；

图11为本发明实施例中的NTA检测结果，A为CCM中总颗粒数的粒径和浓度，B超速离心法所分离外泌体的粒径和和浓度，C为μPAD捕获的外泌体的粒径和浓度，D为不同处理后的样品颗粒浓度对比，E为μPAD捕获与超速离心法所分离的外泌体的得率对比；

图12为本发明实施例中的μPAD上释放的外泌体的TEM(A)和SEM(B)结果图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

外泌体捕获纸芯片的制备

为降低纸纤维对蛋白的非特异性吸附和对抗体的有序固定，在实验用WhatmanNO.4滤纸上原位生长表面富含醛基的ZIF-90纳米材料，具体步骤为：

将Whatman NO.4滤纸浸入至10mM的Zn(NO₃)₂·6H₂O甲醇溶液，于90℃下反应30min。由于纸纤维表面带大量负电荷，Zn(NO₃)₂·6H₂O甲醇溶液中的锌离子(带正电荷的Zn²⁺)会与纸纤维表面的负电荷发生较强的静电结合。然后将滤纸浸入2.5mM的Zn(NO₃)₂·6H₂O与10mM咪唑-2-甲醛(HICA)的混合溶液(以甲醇为溶剂)中90℃反应8h，反应过程中，HICA会与纸纤维表面的Zn²⁺发生配位反应生成ZIF-90纳米材料(也称纳米金属有机骨架，MOFs)，而混合液中的Zn²⁺也会继续为ZIF-90纳米材料的生长提供Zn源，从而实现ZIF-90在滤纸表面的原位生长，得到纸芯片(μPAD)。将μPAD取出，用甲醇充分洗涤3次，37℃下干燥30min，利用CO₂激光切割机制备直径为13mm的圆形μPAD备用。

纸芯片(μPAD)效果检测

(1)纸芯片表面结构特征检测：

采用扫描电子显微镜(SEM)分别表征生长ZIF-90前后的纸芯片，观测ZIF-90在纸纤维表面的生长情况。

结果如图1所示。

从图1中可以看出，在纸纤维表面原位生长ZIF-90纳米粒子前，μPAD具有良好的孔隙结构，且纤维表面光滑(图1A)。在生长ZIF-90纳米粒子后，纳米颗粒均匀包覆了纸纤维。由于ZIF-90纳米颗粒尺寸小，包覆纸纤维的ZIF-90纳米颗粒并不会堵塞μPAD原有的孔隙，进而保证μPAD对液体的芯吸作用不会受到影响。图1C和1D显示出ZIF-90已成功原位生长在μPAD的纸纤维表面上。

(2)纸芯片表面单位检测：

为进一步验证μPAD的纸纤维表面上所生长的纳米颗粒为ZIF-90，使用多晶粉末X射线衍射仪(PXRD)对μPAD进行表征。

结果如图2所示。

分别对ZIF-90、未生长ZIF-90的μPAD(即Whatman NO.4滤纸)和生长ZIF-90的μPAD进行检测，发现在原位生长ZIF-90后的μPAD上出现了ZIF-90纳米粒子的特征峰，而未经修饰的的μPAD上则仅有纸纤维的峰，从而可以说明μPAD的纸纤维表面上所生长的纳米颗粒为ZIF-90。

(3)纸芯片固定外泌体的可行性测试：

由于外泌体膜表面存在特异性膜蛋白CD63，如果本发明实施例中的μPAD能够将CD63抗体固定，既能够有效实现固定外泌体的目的，因此，在本实施例中，发明人将通过检测本发明实施例中的μPAD与CD63抗体(鼠抗兔CD63)的可结合性来验证μPAD固定外泌体的可行性。

①CD63抗体的固定：

具体试验步骤如下。

将20μL的10μg/mL CD63抗体(溶剂为PBS)滴加至生长有ZIF-90的μPAD表面(ZIF-90@μPAD)，于室温条件下反应6h。用磷酸盐吐温缓冲液(PBST，pH＝7.4)充分洗涤3次，除去多余未反应的抗体，在37℃下干燥30min。

由于ZIF-90表面富含-CHO基团，因此，可以与CD63抗体所带-NH₂基团发生反应，结合在一起。

②红外表征ZIF-90@μPAD上固定的CD63抗体：

为了验证ZIF-90@μPAD上CD63抗体的固定情况，对μPAD、ZIF-90@μPAD和固定CD63抗体后的ZIF-90@μPAD(CD63@ZIF-90@μPAD)进行红外表征。

结果如图3所示。

ZIF-90@μPAD在1669cm^-1和791cm^-1处出现强吸收峰，别为-CHO基团的-C＝O吸收和-CH弯曲振动，说明ZIF-90@μPAD上的ZIF-90纳米颗粒富含-CHO基团(μPAD并未产生对应的特征峰)。而在结合CD63抗体后，CD63@ZIF-90@μPAD并未显示出-CHO吸收峰，表明抗体通过-NH₂与-CHO发生偶联。

③比色法表征ZIF-90@μPAD上固定的CD63抗体：

为进一步验证CD63抗体在μPAD表面的固定情况，采用比色法检测ZIF-90@μPAD上的CD63抗体。

具体步骤如下：将辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗CD63二抗分别滴加到ZIF-90@μPAD和CD63@ZIF-90@μPAD上，37℃孵育30min，PBST洗涤三次，干燥后滴加10μL3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和H₂O₂溶液，室温反应2min。拍照记录ZIF-90@μPAD和CD63@ZIF-90@μPAD颜色变化。同时，以常规的氧等离子体处理后的纸芯片(固定CD63抗体)最为对照。

结果如图4所示。

固定有CD63抗体的纸芯片(CD63@ZIF-90@μPAD和氧等离子体处理后的纸芯片)均变为蓝色，但通过对比可以发现，CD63@ZIF-90@μPAD所呈现的蓝色(图4A)比经氧表面等离子体处理后固定CD63的μPAD(图4C)所显示出的蓝色更深，说明通过原位生长ZIF-90后，CD63@ZIF-90@μPAD固定CD63抗体的能力以及负载量均要显著优于通过传统的氧等离子体处理来固定抗体的方法。未固定CD63抗体的μPAD(ZIF-90@μPAD)未发生颜色变化。

④ZIF-90@μPAD的抗蛋白吸收性测试：

将20μL的1mg/mL异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白(BSA，或采用)分别与μPAD和ZIF-90@μPAD室温孵育30min，用PBST充分洗涤三次，于荧光倒置显微镜下观察。

结果如图5所示。

在波长为488nm的激发光照射下，未修饰ZIF-90的μPAD为黑色，无发光现象(图5A)，而吸附BSA后，μPAD会发出强烈的荧光(图5B)。而ZIF-90@μPAD在488nm的激发光照射下呈淡黄色，这可能是ZIF-90纳米颗粒在该光波下的散射光(图5C)，而吸附FITC-BSA后的ZIF-90@μPAD的荧光强度显著弱于μPAD(图5D)，说明原位生长ZIF-90后，μPAD对蛋白的非特异性吸附被极大的削弱了，从而具有了较强的抗蛋白吸附性能。

构建基于ZIF-90@μPAD的外泌体捕获系统

基于ZIF-90@μPAD的外泌体捕获系统主要由：带有阀门的样品池、蠕动泵、聚碳酸酯膜(PC)和ZIF-90@μPAD组成，当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求合理增减设备，但该系统的核心为固定CD63抗体(当然，也可以选择其他标记物，本实施例中以CD63作为示例)后的ZIF-90@μPAD(CD63@ZIF-90@μPAD)(原理及装置图如图6所示)。

基于ZIF-90@μPAD的外泌体捕获系统的使用

1.实验材料：

(1)实验用外泌体的制备：

本实施例中采用超速离心法制备下述实施例中所用的外泌体，当然，本领域技术人员也可以通过其他本领域常规手段制备得到外泌体或购买市售外泌体。

具体步骤为：

①细胞培养：

将HEPG-2细胞在DMEM完全培养基下培养24h，待细胞生长至约60％后，弃去培养基，并用PBS(pH＝7.4)洗涤三次。加入新的无血清培养基饥饿培养24h，去除培养液上清，加入0.5％去外泌体血清的DMEM完全培养基继续培养48h，收集细胞上清。

②收集外泌体：

去步骤①所得的细胞上清液100mL，300g离心10min，收集上清，以去除培养液中的死细胞。3000g离心15min，收集上清，以去除细胞碎片。10000g离心30min，收集上清，以去除培养液中的大型囊泡，重复两次。然后110000g离心90min沉降外泌体。弃上清，加入PBS重悬，110000g离心90min，收集沉淀，以去除杂蛋白，即得外泌体(沉淀物)。将所得外泌体重悬于100μL PBS中，并分装好后，储存于-80℃下备用。

(2)超速离心法制备得到的外泌体鉴定：

按照超速离心法的常规操作分离外泌体，将超速离心法制备得到的的外泌体进行表征鉴定。

使用SEM、透射电子显微镜(TEM)、纳米粒度分析仪(NTA)和Western Blot分别对超速离心法制备得到的外泌体进行表征，确定超速离心法制备得到的外泌体的形貌，粒径和纯度。

结果如图7所示。

在SEM(图7A)和TEM(图7B)下，观察到超速离心法制备得到的外泌体粒径为30-150nm的茶托状膜结构囊泡。NTA结果显示，外泌体的平均粒径为141.9nm(图7D)。通过Western Blot(图7C)检测到外泌体和细胞裂解液中的CD63和PADH蛋白，外泌体样品(Exo)中观察到明显的CD63条带，且无PADH蛋白条带。细胞裂解液样品(CL)中未检测到外泌体特异性，但有GAPDH蛋白条带显现，说明超速离心法制备得到的为粒径为30～150nm的外泌体。

(3)基于ZIF-90@μPAD的外泌体捕获系统的使用方法：

如图6所示，基于ZIF-90@μPAD的外泌体捕获系统由家用微型蠕动泵，3D打印的带有流动控制阀的储液装置(可储存样品溶液，洗脱液，洗涤液)，PC分离膜和CD63@ZIF-90@μPAD组成。

使用时，向样品池中加入外泌体样品，在蠕动泵的驱动下，外泌体样品透过PC膜向下渗透。通过PC膜的外泌体会在经过CD63@ZIF-90@μPAD时，被CD63抗体特异性捕获，而其余颗粒以及蛋白等杂质则会通过μPAD的孔隙排出。用PBS洗涤CD63@ZIF-90@μPAD三次，即可得到结合有外泌体的CD63@ZIF-90@μPAD。然后用2.5mM的谷胱甘肽(GSH)水解CD63@ZIF-90@μPAD上原位生长的ZIF-90纳米颗粒，释放被捕获的外泌体。

(4)捕获效果检测：

①对超速离心法所得外泌体溶液中的外泌体捕获效果：

采用超速离心法制备不同浓度的外泌体溶液(PBS(0个/μL)、3.0×10⁴个/μL、3.0×10⁵个/μL和3.0×10⁶个/μL)。采用上述步骤(3)中的外泌体捕获系统的使用方法捕获外泌体溶液中的外泌体，分别向捕获有外泌体的μPAD上加入10μL的0.02mg/mL外泌体特异性抗体CD9，在37℃下孵育30min，PBST洗去多余的CD9抗体，用0.1％的BSA封闭30min后洗涤三次，再加入HRP修饰的二抗孵育30min，PBST洗涤三次，加入TMB和过氧化氢显色2min，拍照记录颜色变化。

结果如图8所示，可以发现，样品中外泌体浓度越高，蓝色越深。当样品中无外泌体时，μPAD未发生颜色变化，说明本发明中的捕获方法(或系统)可特异性捕获或检测外泌体，测范围在10⁴～10⁶个/μL，可满足不同样品中外泌体的捕获和检测。

②对细胞培养液(CCM，Cell Culture Media)中的外泌体捕获效果：

采用上述实施例中的细胞培养方法制备不同浓度的HEPG-2细胞培养液(PBS(无外泌体)、100倍稀释的CCM、10倍稀释的CCM和未稀释的CCM)。采用上述步骤(3)中的外泌体捕获系统的使用方法捕获CCM中的外泌体，分别向捕获有外泌体的μPAD上加入10μL的0.02mg/mL外泌体特异性抗体CD9，在37℃下孵育30min，PBST洗去多余的CD9抗体，用0.1％的BSA封闭30min后洗涤三次，再加入HRP修饰的二抗孵育30min，PBST洗涤三次，加入TMB和过氧化氢显色2min，拍照记录颜色变化。

结果如图9所示，随着细胞液中外泌体浓度的降低，μPAD蓝色越浅，当样品为PBS(不含外泌体)的空白样品时，μPAD为无色。结果表明，该方法可特异性可视化检测经100倍稀释的CCM中的外泌体。该方法高灵敏度原因是大量外泌体倍数浓缩于小面积的纸芯片上，显著提高了外泌体局部浓度，进而提高检测灵敏度。

③捕获的外泌体SEM表征：

使用SEM对截留在PC膜上的样品进行观测。在SEM下观察，用于分离大颗粒的PC膜的孔隙为均匀的200nm(图10A)，当细胞培养液经过PC膜时，较大的颗粒被PC膜截留(图10B)。而在μPAD上，可观察到小于200nm且呈球状的外泌体(图10C)，在加入GSH后，由于GSH具有羧基、巯基等具有强配位的能力的官能团，能与ZIF-90纳米框架的Zn²⁺结合，从而将ZIF-90纳米颗粒水解，将外泌体从纸芯片上释放，因此，μPAD上无ZIF-90纳米颗粒和外泌体(图10D)。结果表明，该方法可用于外泌体的特异性捕获和完全释放。

④捕获的外泌体浓度和粒径检测：

采用NS300纳米粒度分析仪(NTA)测定细胞培养液在捕获前的颗粒数量和粒径分布，结果如图11所示，经过3000g离心15min后的CCM中，颗粒浓度约为3.4×10⁹个粒子/mL，平均粒径约为233.4nm，其粒径远大于外泌体的粒径，表明CCM中有大量尺寸较大的颗粒。而通过上述实施例中的外泌体捕获系统捕获后的溶液中，平均粒径为146.3nm，与超速离心法得到的外泌体粒径相近。当μPAD上未修饰CD63抗体或捕获不含外泌体的PBS样品时，均几乎没有检测到外泌体颗粒(图11D)。在处理CCM上清样品时，可从含有大量囊泡等杂质的复杂样品中特异性分离外泌体，其得率高于超高速离心法1.8倍(图11E)。结果表明，本方法可高效地特异性地捕获和释放外泌体。

⑤TEM和SEM表征μPAD释放的外泌体：

取5μL通过基于ZIF-90@μPAD的外泌体捕获系统中的μPAD上释放出的外泌体样品，滴加到铜网上，吸附5min后，用滤纸从铜网边缘吸干水分，室温晾干3h，于120KV电压下观察外泌体形貌。

结果如图12A所示，基于ZIF-90@μPAD的外泌体捕获系统中的μPAD上释放出的外泌体具有明显的茶托状膜结构，且粒径小于200nm。

将吸附于铜网上的外泌体样品进一步进行SEM表征，结果如图12B所示，基于ZIF-90@μPAD的外泌体捕获系统中的μPAD上释放出的外泌体粒径分布约为40～150nm，且有明显的茶托状结构。TEM和SEM结果表明，基于ZIF-90@μPAD的外泌体捕获系统中的μPAD上释放出的外泌体符合外泌体的尺寸大小和形貌结构。

综上所述，本发明实施例中的基于ZIF-90@μPAD的外泌体捕获系统能够自动捕获和无损释放外泌体，具有捕获效率高，速度快，产率高的优点，同时该方法可实现对外泌体的可视化高灵敏检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种外泌体捕获纸芯片，其特征在于，所述外泌体捕获纸芯片的纸纤维表面附着有正电荷纳米粒子；

其中，所述正电荷纳米粒子上固定有外泌体特异性标记物的抗体；

所述外泌体特异性标记物的抗体为外泌体蛋白抗体；

所述外泌体蛋白为CD63；

所述正电荷纳米粒子具有-CHO基团，所述正电荷纳米粒子为ZIF-90纳米颗粒。

2.权利要求1所述的外泌体捕获纸芯片的制备方法，包括如下步骤：

(1)将纸浸入Zn(NO₃)₂·6H₂O甲醇溶液浸泡30～35min，然后在Zn(NO₃)₂·6H₂O、咪唑-2-甲醛和甲醇的混合液中浸泡8～8.5h，甲醇洗涤，干燥；

(2)向干燥后的纸上滴加外泌体蛋白抗体，反应6～6.5h，磷酸盐吐温缓冲液洗涤，即得；

其中，所述外泌体蛋白抗体为CD63抗体。

3.根据权利要求2所述的外泌体捕获纸芯片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中纸在Zn(NO₃)₂·6H₂O甲醇溶液以及在Zn(NO₃)₂·6H₂O、咪唑-2-甲醛和甲醇混合液中的浸泡温度均为85～95℃。

4.根据权利要求2所述的外泌体捕获纸芯片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述Zn(NO₃)₂·6H₂O甲醇溶液中Zn(NO₃)₂·6H₂O的摩尔浓度为8～12mmol/L；所述Zn(NO₃)₂·6H₂O、咪唑-2-甲醛和甲醇混合液中Zn(NO₃)₂·6H₂O和咪唑-2-甲醛的摩尔浓度比为1:

(3～5)。

5.一种外泌体捕获检测系统，其特征在于，所述外泌体捕获检测系统包括驱动装置、储存装置、大孔径分离膜、权利要求1所述的外泌体捕获纸芯片；

其中，所述大孔径分离膜的孔径小于等于200nm；

所述大孔径分离膜包括聚碳酸酯膜。

6.一种外泌体检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括权利要求1所述的外泌体捕获纸芯片。

7.权利要求1所述的外泌体捕获纸芯片以及权利要求5所述的外泌体捕获检测系统在外泌体分离中的应用。

8.权利要求1所述的外泌体捕获纸芯片以及权利要求6所述的外泌体检测试剂盒在制备外泌体检测产品中的应用。