CN107254430B - 一种基于正电荷吸附分离外泌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于正电荷吸附分离外泌体的方法。其首先利用3‑氨基丙基三乙氧基硅烷APTES和玻璃器皿表面发生硅烷化反应，对玻璃器皿表面进行正电荷修饰；然后向修饰有正电荷的玻璃器皿中加入带有外泌体的样品，实现对外泌体的抓取；最后利用缓冲液PBS对玻璃器皿表面进行冲洗，得到吸附于玻璃器皿表面的纯外泌体，实现外泌体分离的目的。本发明可以在数分钟内完成对外泌体的抓取分离，分离效率较高，而且该方法允许各种后续分子分析，包括Elisa，western blot，基因组的提取，鉴定，扩增和测序。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体的说，涉及一种基于正电荷吸附分离外泌体的方法。
背景技术
外泌体属于细胞外囊泡的一种，尺寸约为30-150nm，在多种生物状态与疾病中发挥着重要的生理病理学功能。外泌体结构与细胞膜结构相似，由磷脂双分子层构成，厚度约为5nm，成分主要包含神经酰胺、胆固醇、鞘脂以及含有长饱和脂肪链的甘油磷脂。外泌体表面及内部富含各种蛋白质，并且含有多重核酸等重要的生物大分子物质，这些生物大分子物质可以被用来检测反映包括肿瘤在内等疾病的状态。近些年研究表明外泌体可以作为分泌母细胞生物信息指纹，激起了研究人员的极大兴趣。虽然人们还没有完全理解外泌体的生物学功能，但是越来越多的实验数据表明，外泌体在细胞间通讯、抗原呈递以及蛋白质核酸物质交换等起到重要的作用。特别是外泌体参与的细胞通讯方面尤为重要，外泌体通过参与细胞间免疫信号、血管生成、增值和分化等功能，直接影响了诸如癌症、神经退行性疾病等的发生。越来越多的证据表明，外泌体直接参与了肿瘤的发生，包括血管生成，免疫抑制，转移等。因此可以通过对外泌体内容物的检测，实现微创或者无创的疾病生物靶标信号的早期诊断及预后评估等。综上，怎样能够分离定量得到外泌体成为对其研究和临床应用的首要面临问题。
目前的外泌体分离主要有超速离心、过滤、免疫亲和抓取以及PEG沉淀等五种方法。这些分离技术主要根据外泌体自身所具有的物理和生物学特点发展而来。虽然这些分离方法为研究外泌体提供了极大的方便，但是也都存在较为明显的缺点。超速离心法是目前分离外泌体最常用的方法，可以简单方便的根据样品的尺寸大小对样品进行分离。超速离心法的缺点是，超速离心机和耗材价格昂贵，不适合大范围应用推广，并且得到的外泌体中含有大量的蛋白质污染，另外由于离心过程中离心力的作用，也会造成外泌体的破裂。过滤法通常分为两种，一种是滤膜过滤，一种是体积排阻法。滤膜过滤法虽然已经有产品推出，但分离的时候会产生蛋白质堵塞膜孔，外泌体破裂等一系列问题。体积排阻法则需要专门的仪器，并且极其耗时。免疫亲和抓取的方法虽然可以获得较高纯度的外泌体，但是所用抗体价格较贵，抓取效率不高，也不适合大量的应用。PEG沉淀法是目前成本最低，步骤最简单的分离外泌体的方法，但是问题也较多，例如沉淀时间较长，往往需要过夜，沉淀中杂质较多，沉淀后如果需要进一步得到较为纯净的外泌体，仍然需要其他实验方法的配合，例如采用超速离心法进一步的纯化等。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于正电荷吸附外泌体的方法。
本发明利用硅烷化试剂(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)，通过硅烷化反应，对玻璃器皿进行正电荷修饰。当加入带有外泌体的样品时，带有负电菏的外泌体会通过静电力相互作用与修饰有正电荷的玻璃皿结合，从而实现对外泌体的抓取。抓取后利用缓冲液PBS进行冲洗，可以去除其他杂质。
本发明的技术方案具体介绍如下。
一种基于正电荷吸附分离外泌体的方法，其首先利用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷APTES和玻璃器皿表面发生硅烷化反应，对玻璃器皿表面进行正电荷修饰；然后向修饰有正电荷的玻璃器皿中加入带有外泌体的样品，实现对外泌体的抓取；最后利用缓冲液PBS对玻璃器皿表面进行冲洗，得到吸附于玻璃器皿表面的纯外泌体，实现外泌体分离的目的。
本发明中，玻璃器皿是玻璃瓶或玻璃皿。
本发明中，带有外泌体的样品为血液、唾液或尿液。
本发明中，基于正电荷吸附分离外泌体的方法，具体包括以下步骤：
(1)将(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷APTES溶解到无水乙醇中配成体积百分比为4～20％的表面修饰液；
(2)将上述表面修饰液加入到清洁后的玻璃器皿中，避光，室温孵育5～10分钟；去除表面修饰液，用大量纯水冲洗，去除没有结合的APTES；清洗后晾干备用；
(3)在步骤(2)的晾干后玻璃器皿中加入带有外泌体的样品，在37℃的温度下摇床孵育5～10分钟，孵育结束后，PBS冲洗，得到吸附于玻璃器皿表面的纯外泌体，实现外泌体分离的目的。
本发明中，步骤(2)中，玻璃器皿是玻璃瓶时，表面修饰液的加入量是玻璃瓶体积的2/3以上；玻璃器皿是玻璃皿时，表面修饰液的加入量至少覆盖玻璃皿的底部。
和现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明方法可以在数分钟内完成对外泌体的抓取分离，所用试剂APTES价格便宜，分离效率较高；
本发明方法允许各种后续分子分析，包括Elisa，western blot，基因组的提取，鉴定，扩增和测序。
附图说明
图1是本发明用APTES进行外泌体分离的原理示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。
图1是本发明用APTES进行外泌体分离的原理示意图。
实施例1
1、2ml玻璃瓶等离子清洗机清洗2分钟，清洁表面。
2、APTES溶解到无水乙醇溶液中(需要现用现配)配成表面修饰液，浓度为4％(V/V)。加入到清洁后的者玻璃瓶中。玻璃瓶加入三分之二以上。
3、避光，室温孵育5分钟。去除表面修饰液，用大量纯水冲洗，去除没有结合的APTES。清洗后晾干备用。
4、取1.5ml全血，4℃下2500g离心2分钟，取出上层血浆备用。
5、取800μl血浆，加入到玻璃瓶中，37℃摇床孵育10分钟。
6、去除血浆，PBS冲洗三遍。外泌体吸附于正电修饰的表面。
7、将0.1％SDS溶液加入到玻璃瓶中裂解外泌体，提取裂解后溶液中核酸，利用arms PCR法检测核酸的量，结果显示在20个循环后，荧光曲线进入对数期，表明这种分离外泌体的方法可以得到充足的外泌体核酸物质，并可以用于后续的其他实验分析。
实施例2
1、35mm玻璃皿等离子清洗机清洗2分钟，清洁表面。
2、APTES溶解到无水乙醇溶液中(需要现用现配)配成表面修饰液，浓度为20％(V/V)。加入到清洁后玻璃皿中。玻璃皿加入三分之二以上。
3、避光，室温孵育10分钟。去除表面修饰液，用大量纯水冲洗，去除没有结合的APTES。清洗后晾干备用。
4、取1.5ml唾液，4℃下2500g离心2分钟，取出上层液体备用。
5、取800μl上层液体，加入玻璃皿中，37℃摇床孵育5分钟。
6、去除液体，PBS冲洗三遍。外泌体吸附于正电修饰的表面。
7、用10％DPH无水乙醇磷脂膜荧光探针分子对外泌体进行染色，虽然外泌体尺寸过小，无法观察到单个外泌体，但是可以明显的发现玻璃皿上的荧光强度比没有吸附外泌体的荧光强度大大增强。说明这种方法得到的外泌体可以进行ELISA实验。
实施例3
1、35mm玻璃皿等离子清洗机清洗2分钟，清洁表面。
2、APTES溶解到无水乙醇溶液中(需要现用现配)配成表面修饰液，浓度为10％(V/V)。加入到清洁后玻璃皿中。玻璃皿加入三分之二以上。
3、避光，室温孵育7分钟。去除表面修饰液，用大量纯水冲洗，去除没有结合的APTES。清洗后晾干备用。
4、取1.5ml尿液，4℃下2500g离心2分钟，取出上层液体备用。
5、取800μl上层液体，加入玻璃皿中，37℃摇床孵育8分钟。
6、去除液体，PBS冲洗三遍。外泌体吸附于正电修饰的表面。
7、利用0.1％SDS溶液对外泌体裂解后，提取蛋白质。利用考马斯亮蓝法定性对蛋白质进行分析，结果显示有蛋白质的存在。说明此种方法获得的外泌体，可用于蛋白质分析检测等实验。
Claims (5)
1.一种基于正电荷吸附分离外泌体的方法，其特征在于，其首先利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和玻璃器皿表面发生硅烷化反应，对玻璃器皿表面进行正电荷修饰；然后向修饰有正电荷的玻璃器皿中加入带有外泌体的样品，实现对外泌体的抓取；最后利用缓冲液PBS对玻璃器皿表面进行冲洗，得到吸附于玻璃器皿表面的纯外泌体，实现外泌体分离的目的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，玻璃器皿是玻璃瓶或玻璃皿。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，带有外泌体的样品为血液、唾液或尿液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解到无水乙醇中配成体积百分比为4～20％的表面修饰液；
(2)将上述表面修饰液加入到清洁后的玻璃器皿中，避光，室温孵育5～10分钟；去除表面修饰液，用大量纯水冲洗，去除没有结合的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)；清洗后晾干备用；
(3)在步骤(2)的晾干后玻璃器皿中加入带有外泌体的样品，在37℃的温度下进行摇床孵育5～10分钟，孵育结束后，PBS冲洗，得到吸附于玻璃器皿表面的纯外泌体，实现外泌体分离的目的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，玻璃器皿是玻璃瓶时，表面修饰液的加入量是玻璃瓶体积的2/3以上；玻璃器皿是玻璃皿时，表面修饰液的加入量至少覆盖玻璃皿的底部。
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