CN108124454A - 借助粗糙表面快速分离核酸的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种自含核酸的水性样品中分离核酸的方法，该水性样品含有游离核酸或裂解释放核酸。在降低水性溶液的极性之前或之后，使该样品接触具有粗糙表面或结构化表面的固相，其中，该核酸沉淀在固相上且随后随固相自水性溶液被除去。粗糙表面或结构化表面最好是非光滑的金属表面、塑料表面或橡胶表面。本发明的主题还是一种试剂盒和一种用于核酸分离的相应仪器。

Description

借助粗糙表面快速分离核酸的方法和试剂盒

技术领域

发明主题是一种全新通用的、明显简化的以及极其快速的、从含核酸的截然不同的原始材料中分离核酸的方法，该方法不仅保证了待分离核酸的很高质量，也允许分离出极高的核酸产量。该方法不仅可以在实验室或现场条件下人工进行，也可以完全自动进行。它基于核酸结合至非光滑表面。

背景技术

在典型条件下如下所述地从细胞和组织中分离DNA：含核酸的原始材料在强烈变性及还原条件下、有时也在采用蛋白分解酶情况下被分解，出现的核酸片段通过苯酚/氯仿提取步骤被纯化且核酸借助透析或乙醇沉淀从水相中获得(Sambrook,J.、Fritsch,E.F.和Maniatis,T.，1989，CSH，“分子克隆”)。

从细胞且尤其组织中分离核酸的此种“经典方法”是很费时间的(有时超过48小时)，需要显著的设备成本，此外也无法在现场条件实现。另外，这样的方法因为所用化学物质如苯酚和氯仿的量不少而对健康有害。

下一代核酸分离法依据由福格施坦恩和吉尔斯皮(Proc.Natl.Acad.Sei.美国,1979,76,615-619)研发并首次描述的，从琼脂糖凝胶中准备并分解纯化DNA片段的方法。该方法将“包含待分离DNA带的琼脂糖溶解在离液序列高的盐(NaJ)的饱和溶液中”与“将DNA结合至玻璃珠”进行了结合。固着至玻璃珠的DNA随后用洗涤液(20mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris HCl)[pH7.2]；200mM的氯化钠；2mM的EDTA；50％v/v乙醇)被洗涤，随后脱离载体颗粒。该方法迄今经历一系列改变且当前被用于自不同来源提取纯化核酸的不同方法，最后成为几乎所有商业可用的人工和自动核酸分离用试剂盒的基础。此外存在涉及核酸分离基本原理的许多专利和公开文献，所述基本原理由福格施坦恩和吉尔斯皮初次公开且或许还拥有其它的优点。这些变型不仅涉及使用不同的矿物载体材料，也涉及核酸结合用缓冲液的类型。例子尤其是在有不同的离液序列高的盐的溶液情况下将核酸结合至矿物载体，此时作为载体材料采用细磨玻璃粉(BIO 101,La Jolla,CA)、硅藻土(Sigma公司)或者硅胶或硅酸盐悬浮体或者玻璃纤维过滤器或矿土(DE 41 39 664A1、US 5,234,809、WO-A 95/34569、DE4321904、DE 20207793)。所有这些文献基于在有离液序列高的盐溶液情况下将核酸结合至基于玻璃或硅的矿物载体材料。在新近的专利文献中公开了，为了将核酸吸附至技术人员已知且采用的矿物材料，也可以很高效且成功地采用所谓的反离液盐作为裂解/结合缓冲液体系的组成(EP 1135479)。

概括而言，人们于是可以如下所述地描述现有技术，在有含有离液序列高的盐或反离液盐的缓冲液情况下，或者在含有离液序列高的盐和反离液盐的混合物的缓冲液情况下，使核酸结合至矿物材料，然后在此过程中也能分离核酸。此时也出现以下优选变型，在此采用附加的脂肪族醇来促成结合。技术人员也知道了所有常见的用于核酸分离纯化的商业产品都基于此。所用矿物载体在此以松散料形式、滤膜形式或悬浮体形式存在。为了执行自动提取过程，通常采用顺磁珠或磁珠。在此，它例如是硅酸盐物质，其具备磁芯或顺磁芯，或者是氧化铁颗粒，其表面被改性以拥有核酸结合所需的功能性。核酸分离用提取过程在此也以原理相同的模式为基础：

原始样品裂解以释放核酸，核酸结合至相应的矿物载体材料，洗涤所结合的核酸，干燥载体材料，最后自载体材料上洗脱结合核酸。即使该方法已经得到验证，也还是有一系列缺点。例如，所用材料的结合能力是有限的，尤其当采用自旋过滤膜时。当原始样品包含过多核酸时，膜也经常堵塞。在采用磁珠情况下的自动化处理过程相对复杂且根据应用不同而也需要相当长的用时。未得到在现场条件下的核酸分离的简单执行。

发明内容

因此，本发明基于以下任务，消除现有技术所述的技术方案的缺点。

任务的完成

该任务根据权利要求书的特征来完成。根据权利要求1，描述一种从含核酸的水性样品中分离核酸的方法，其中，使含有游离核酸或裂解释放核酸的水性溶液在水性溶液极性降低之前或之后接触到具有粗糙表面或结构化表面的固相，其中，核酸沉淀于该固相，进而结合至该固相，随后借助于该固相从水性溶液被除去。用语“在水性溶液的极性降低之前或之后”表述以下可能：不仅可以先使水性溶液接触到固相且随后降低水的极性，也可以先降低水的极性且随后进行与固相的接触。在前述情况下，核酸沉淀至固相只在水的极性被降低时进行，一般通过添加乙醇。在另一变型中，核酸随着接触，立即沉淀至固相。如果采用不溶于水的有机溶剂，则必须使混合物运动，以便其到达固相以便核酸沉淀。这最好通过在混合物内使固相运动来进行。

权利要求2至13示出所要求保护的发明的优选实施方式。本发明的主题也是一种用于执行方法的试剂盒及其仪器。

根据本发明，提供一种核酸分离方法，其执行起来比已知方法简单了许多，它允许也能在现场条件下(且由非专家)进行核酸分离，其执行起来极其快速(尤其是与自动化提取相关)，并且它允许高质量地分离出极其多的核酸。

本发明基于以下观察。当人们用商业可用的试剂盒(例如innuPREP血液DNA Kit/IPC16，Analytik Jena AG；DNeasy Blood&Tissue Kit；Qiagen公司)的提取试剂处理含核酸样品且人们代替矿物载体材料地采用带有粗糙表面的任何塑料材料(例如打毛的聚丙烯)且使之接触处于处理中的样品时，核酸结合至塑料材料。

术语“粗糙表面”是指可通过表面触摸或表面外观来鉴别该表面并不光滑。但它在此也可以是下述表面，其具有结构(如沟)。通过所述结构消除了表面的光滑性，即便该结构即沟本身可能是光滑的。根据本发明，这样的表面被称为“结构化表面”。如果通过表面的外观或触摸无法鉴别表面是否光滑或粗糙，则可以执行测试，在此使激光束对准该表面。在光滑表面的情况下，激光只在主方向上在表面被反射。在粗糙表面的情况下进行在所有空间方向的散射。这样的测试在基尔大学的下述网页的第7页中有所描述(http://www.tf.uni-kiel.de/matwis/amat/semitech_en/kap_3/illustr/oberflaechenstrukt ure.pdf)。

随后的洗涤步骤可以利用已知的含乙醇的洗涤缓冲液或只用乙醇来进行，也可以采用已知用于洗脱的低盐缓冲液或水。唯一的区别是，代替矿物载体材料而采用粗糙的塑料材料。根据初次实验，事实已经表明，为此所有的加工处理步骤可以简单快速许多地被实现。事实也表明，在利用所有所用的粗糙塑料材料情况下能观察到该效果。但是，所有完成的实验的特点首先在于在三维打印机上制作所用的粗糙塑料材料。由此一来，该表面并不光滑，而是滚花的即粗糙的，因为在三维打印中形成的是具有层状结构的物体。此时在采用自动提取仪(Thermo Electron)即所谓的磁珠处理仪KingFisher ml的情况下执行初次实验。它在此是用于借助磁珠提取核酸的仪器。在此，该仪器利用塑料梳，磁杆移入该塑料梳，该磁杆随后在walk-away过程中使磁珠移动且进入标准提取所需要的缓冲液中。该塑料梳被转用应用于本发明方法。为此，借助三维打印机由各种材料打印出套，其随后被套装到塑料梳上。作为样品，分别采用约1x10⁶的NIH 3T3细胞。核酸分离所用的试剂在此部分自例如商业可用的提取试剂盒(innuPREP血液DNA Mini Kit/IPC 16；Analytik Jena AG)获得。提取过程跟随下一个工作流。在采用裂解缓冲液(裂解液CBV)及蛋白酶K的情况下，细胞在60℃被裂解15分钟。在裂解过程中，KingFisher ml的反应塑料被预填充如下溶液：

腔1：400微升的异丙醇

腔2：800微升的洗涤液LS(来自提取试剂盒)

腔3：800微升的80％乙醇

腔4：800微升的80％乙醇

腔5：200微升的洗脱缓冲液(来自提取试剂盒)

在成功裂解后，裂解产物(400微升)被加入腔1中的在那里已有的异丙醇并启动提取过程。在该过程中，塑料梳连续从腔1移动到腔5。此时，在每个腔中，塑料梳在当前存在的缓冲液中执行竖向运动。在此，提取过程基于在采用磁珠情况下分离核酸的经典原理。但并未采用颗粒。在腔1内，使核酸结合至套装有套的塑料梳。使所结合的核酸相继移动经过腔2～4。在此进行多个洗涤步骤。接着是用于除去乙醇的短暂干燥步骤。最后，使核酸在腔5中脱离带套的塑料梳。在此，该过程被明显简化，因为没有处理磁珠。所需的磁珠收集步骤省掉了，因为没有为了提取而采用珠粒。由此，该方法在约15分钟内结束。如已经所述地，事实表明，利用所有采用的塑料材料且在使用商业可用的提取化学品和标准提取方案的情况下可以通过结合至所用的塑料材料来分离核酸。所述观察研究是出乎意料的。虽然知道了生物分子非特定地吸附至塑料材料，但生物分子来自其所在的水性溶液且也只是极少量。也有以下说明，将塑料材料用于核酸分离。但这是按照以下方式，人们将塑料材料的表面化学改性，使得它们携带与硅酸盐材料一样的官能团(OH基)或者其它官能团被合成到塑料表面(COOH基)。这例如在专利文献EP1135479有描述。但技术人员也知道这样的核酸分离手段并未在实践中得以证明，因为尤其是结合能力太低。根据这些初次实验，借此可以表明可以用打印的塑料套分离核酸。但是并不清楚为何能这样做。出乎意料地，可以用相当简单的实验来说明。又使用KingFisher ml。但在此次尝试中没有使用打印的塑料套。磁珠处理所用的标准塑料梳被投入使用。在此使用如所展示的几个塑料梳，其它的梳借助雕刻机被表面打毛。如上所述地利用相同的所述试剂和相同过程执行自细胞的提取。具体结果在实施例1中有所描述。

实验印象深刻地表明，核酸未结合在未经处理的梳上。相反，核酸高效结合到打毛的梳上。由此可以提供证明，只需打毛塑料材料的表面以便在使用标准提取试剂情况下高效分离核酸。但依据实验的观察研究也还指出其它让人感兴趣的事实。在初次尝试中，如上所述地，来自商用试剂盒的试剂被用于核酸分离。代替核酸结合至矿物固相(例如离心过滤膜或磁珠)，核酸分离借助所用的根据本发明的粗糙表面进行。所用试剂在此总是与结合缓冲液(曾为乙醇)相结合的裂解缓冲液。已知的是，裂解缓冲液是由盐、润湿和分散剂、络合物成分和其它成分组成的组合物。结合有乙醇的缓冲液组成促成已知的核酸结合至矿物材料。也早就已知的是，高浓度的离液序列高的盐促成核酸结合至矿物材料。但事实表明，在有高浓度离液序列高的盐的水性溶液情况下，核酸结合至矿物材料而没有结合至打毛的塑料表面。这一观察研究造成以下怀疑：借助粗糙表面的核酸分离机理必然是不同于迄今已知的或猜测的核酸结合至矿物材料的机理。

如从已经描述的现有技术中知道地，如此在典型条件下从细胞和组织中分离DNA，即，含核酸的原始材料在强烈变性和还原的条件下、有时也在采用蛋白分解酶的情况下被分解，所出现的核酸片段通过苯酚/氯仿提取步骤被纯化，且核酸借助裂解或乙醇沉淀从水相中被获得。与此相关地技术人员知道了，在高分子DNA浓度很高的情况下，所述DNA在乙醇沉淀之后像“丝”那样析出并可借助玻璃杆从试剂容器中被卷绕出。但这只在高浓度DNA且以下前提条件下起效，即，DNA也是高分子量分子。因此，乙醇沉淀大多基于以下情况，人们在添加乙醇之后将样品离心分离并且DNA以球团状沉淀。如果DNA浓度低，则必须还要在-20℃将样品培养几个小时，然后才能离心分离样品以使核酸沉淀。于是，离心分离时间在此情况下必须也被延长许多，并且可能要耗用几个小时。为此，将高浓度高分子DNA“卷绕”到玻璃杆上是一种特例。这虽然在几十年前就是已知的，但无法被自动化。

而核酸离心沉淀费时且也难以自动化。因此缘故，现有技术确实也印象深刻地书面记录下了从经典方法到将核酸结合至矿物载体材料的核酸分离纯化技术的发展。以如下形式实现这些技术：人们借助离心或真空将含核酸样品结合至过滤材料或借助磁性分离将核酸结合至磁珠或顺磁珠。关于根据本发明借助“结合”至粗糙表面来分离核酸，这看起来依据的是样品所含的核酸在使样品接触到粗糙表面之后沉淀在粗糙表面上。此时这是如此进行的，通过加入例如乙醇而使环境极性减小，由此降低核酸的可溶性。出乎意料地，核酸“沉淀”至粗糙表面是高效的，因此也允许简单快速地、自动地分离含低浓度核酸的样品。在此不需要离心分离步骤。

因此，本发明的核心在于，游离核酸或裂解释放核酸位于水性环境中，水性环境的极性借助有机物质被调节，使得核酸可溶性降低，接着使该水性环境接触到粗糙表面，从而核酸随后沉淀在粗糙表面上，随后又使沉淀的DNA脱离该粗糙表面且可供使用。可选地，沉淀在粗糙表面上的核酸也可以被洗涤且在洗涤步骤之后被脱离。

这样，本发明最理想地允许实现已说明的设定目的。为了提取，人们只需要表面被打毛的材料和水性环境，待分离的核酸位于该水性环境中且该水性环境的条件借助有机物质被调节，使得核酸可溶性被降低，从而核酸沉淀在该粗糙表面上。沉淀在粗糙表面上通过使粗糙表面接触样品或通过使样品接触粗糙表面实现。作为提取试剂，例如可以使用经典的不同类型的试剂盒试剂(例如裂解缓冲液)。核酸沉淀至粗糙表面所需要的条件通过添加有机物质来创立。提取方案也按照裂解、结合、洗涤、洗脱的已知模式操作。作为其替代，也可以省掉洗涤步骤。但该方法现在执行起来非常简单快速。可以按以下步骤执行：

1.含核酸样品(或提供含核酸液态样品)的裂解。为了样品裂解，在样品中加入经典的裂解缓冲液或人们迄今从核酸分离法中了解到的缓冲液。缓冲液可含有离液序列高的盐或非离液序列高的盐或这两个组的混合物。此外，缓冲液也可以含有其它成分例如螯合剂、Tris缓冲液、润湿剂及分散剂等。但该方法也可以利用如下缓冲液，其不含盐并且例如只由去污剂、三羟甲基氨基甲烷和EDTA组成。也还可以采用蛋白分解酶。

2.添加结合缓冲液，其包含乙醇成分和其它添加物，或者只加入乙醇或者也加入丙酮或汽油。

3.使该混合物接触表面并不光滑的材料。该表面可能是粗糙的或具有结构。

4.从混合物中除去具有结构的或粗糙的材料连同所结合的核酸，或者从材料除去该混合物。

5.或许洗涤该材料。

6.或许干燥该材料。

7.用洗脱缓冲液(低盐缓冲液或水)使核酸脱离该材料。

该方法是可通用的且不仅可以自动化进行，也可以人工进行。为此，它也能最理想地被用于在现场条件下使用核酸提取，因为可以简单执行所需步骤。待采用的本发明材料也不是限制性的。

也可以采用所谓的复合材料，其是由聚合物和例如有机成分或矿物成分构成的混合物。重要的只是提供糙化表面或具有结构的表面。根据本发明的材料的结构也不是限制性的。使用粗糙的磁性材料也是有利的。这样的材料作为按商标名的颗粒是已知的。例如也可以根据本发明将标准吸移管尖端的内表面打毛并且将该吸移管尖端人工或自动用于核酸提取。为此，根据所述的提取工作流，借助多个吸移步骤来依次完成提取方案。技术人员为此清楚知道现在可以借助本发明如何简单地执行核酸提取。本发明显示出进一步的巨大优势。如果生物样品含有大量核酸，则可以借助本发明的方法和本发明的塑料提取非常多的核酸。产量此时超过在采用矿物载体材料情况下可用已知提取方法获得的产量许多倍。为此，该方法也理想地适用于处理大量样品。事实也表明，染色体组DNA、RNA还有质体DNA都可以被分离。本发明的方法可以作为自动提取过程非常快速地处理许多样品。例如可以借助本发明方法在转用采用KingFisher ml的情况下在15分钟内同时处理15份样品。加工过程也可以在没有待分离核酸的数量和质量损失情况下被进一步缩短。于是，它也可以被套用到其它的自动工站。例如，提取也可以在具有利用所有常见自动吸移仪在打毛的吸移管尖端中实现。为此，利用本发明，提供一种全新的平台技术用于核酸的分离纯化，其相比于已知的提取方法显示出许多显著优点。本发明的主题因此也是一种核酸分离仪器，其包括打毛的吸移管尖端。

以下，结合实施例来详述本发明。这些实施例在此不是限制本发明。

具体实施方式

实施例1：证明在利用商业可用的提取化学品情况下的核酸结合至粗糙表面

核酸结合于粗糙表面且可被分离的证明如下进行。提取此时自动化实现。采用磁珠处理仪(KingFisher ml；Thermo Electron)。该仪器采用塑料梳，将磁杆(其在walk-away过程中使核酸分离所用的磁珠移动)移入该塑料梳中。塑料梳被转用应用于本发明的方法且应该用于核酸的结合和随后提取。塑料材料是聚丙烯。根据本发明，塑料梳借助磨削装置被打毛。也采用未经处理的塑料梳。作为样品，分别采用约1x10⁶的NIH 3T3细胞。核酸分离所用的提取化学品在此部分来自商用提取试剂盒innuPREP血液DNA Kit/IPC16X(AnalytikJena AG)。借助裂解缓冲液(裂解液CBV)以及蛋白酶K，细胞在60℃被裂解15分钟。在裂解过程中，KingFisher ml的反应塑料被填充如下的溶液：

腔1：400微升异丙醇

腔2：800微升洗涤液LS(来自提取试剂盒)

腔3：800微升80％乙醇

腔4：800微升80％乙醇

腔5：200微升洗脱缓冲液(来自提取试剂盒)

在成功裂解之后，裂解产物(400微升)被加入腔1中的在那里已有的异丙醇，且提取过程被启动。在此过程中，塑料梳相继地从腔1移动至腔5。在此，在每个腔中塑料梳在各自存在的缓冲液中进行竖向运动。提取过程此时基于在采用磁珠情况下的经典核酸分离原理。但没有采用颗粒。在腔1中进行核酸结合至塑料梳。使所结合的核酸相继地移动经过腔2～4。在此进行多个洗涤步骤。随后是用于去除乙醇的短暂干燥步骤。最后，使核酸在腔5中脱离塑料梳。如已经描述地，在此采用表面被打毛的塑料梳以及最初未经处理的塑料梳。分离核酸的证明是借助分光光度测量以及在琼脂糖凝胶上进行的。除了产量之外，也确定分离核酸的纯度。

分光光度测量结果：

图1示出在琼脂糖凝胶上的DNA检测。对于每个泳道，采用来自200微升总洗脱产物的4微升核酸。泳道表示：

1.DNA梯状条带(1b梯状条带)

2.未经处理的塑料梳

3.未经处理的塑料梳

4.打毛的塑料梳1

5.打毛的塑料梳2

6.打毛的塑料梳3

如结果印象深刻地表明，核酸(DNA还有RNA)并未结合至未经处理的梳。但核酸高效结合至打毛的梳，随后可以用经典的洗涤缓冲液被洗涤且最后又脱离所述梳。这样，该过程完全对应于借助磁珠或借助本领域技术人员所知的矿物载体材料分离核酸的经典过程。但该过程执行起来快速简单许多。借此利用该例子表明，可以只通过打毛塑料表面而在采用已知提取试剂情况下将该材料用于核酸提取。

实施例2：在使用商业可用的提取化学品情况下，为提取核酸而测试带有粗糙表面 的不同塑料材料

核酸能结合至不同塑料材料的粗糙表面且被分离的证明如下进行。在此，自动实现提取。又可以采用KingFisher ml的磁珠处理仪。塑料梳又被转用应用于本发明方法。如实施例1中那样，打毛的塑料梳用作核酸结合用材料。作为对照物，采用未经处理的梳。为了实验其它的材料，借助3维打印机由不同材料制造塑料环，其又被套装在KingFisher ml仪器的梳上。该环又用磨削装置被打毛。不同材料是KingFisher ml的打毛的塑料梳(聚丙烯)，此外是Biofila衬材料(TwoBEars公司)、由木质素和由芳香族乙醇构成的络合聚合物构成的复合材料、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物材料(ABS)、由聚乳酸构成的材料(PLA)、聚碳酸酯材料(PC)以及聚苯乙烯材料(PS)。KingFisher ml的梳在此以不同程度被粗糙化(A型：梳的约3厘米，B型：梳的约1厘米，C型：仅梳尖)。作为样品，分别采用约1x10⁶的NIH 3T3细胞。核酸分离所用的提取化学品又部分来自商用提取试剂盒innuPREP血液DANN Kit/IPC16(Analytik Jena AG)。在使用裂解缓冲液(裂解液CBV)以及蛋白酶K的情况下，细胞在60℃被裂解15分钟。在裂解过程中，KingFisher ml的反应塑料被填充如下的溶液：

腔1：400微升异丙醇

腔2：800微升洗涤液LS(来自提取试剂盒)

腔3：800微升80％乙醇

腔4：800微升80％乙醇

腔5：200微升洗脱缓冲液(来自提取试剂盒)

在成功裂解之后，裂解产物(400微升)被加入腔1中的在那里已有的异丙醇且开始提取过程。提取过程就像在实施例1中描述的那样进行。塑料梳(未经处理或打毛)及具有套装塑料环的塑料梳又被相继移动经过带有预装缓冲液的若干腔。最后，使核酸在腔5中脱离塑料梳。分离核酸的证明借助分光光度测量及在琼脂糖凝胶上进行。除了浓度以及产量外，也确定分离核酸的纯度。

分光光度测量结果：

图2示出在琼脂糖凝胶上的DNA检测。对于每个泳道，采用来自200微升总洗脱产物的4微升核酸。泳道表示：

1.DNA梯状条带(1b梯状条带)

2.未经处理的塑料梳

3.打毛的塑料梳，A型

4.打毛的塑料梳，B型

5.打毛的塑料梳，C型

6.具有由BioFila构成的糙面环的塑料梳

7.具有由ABS构成的糙面环的塑料梳

8.具有由PLA构成的糙面环的塑料梳

9.具有由PC构成的糙面环的塑料梳

10.具有由PS构成的糙面环的塑料梳

如结果表明，核酸未结合到未经处理的梳。但核酸高效结合至打毛的梳和糙面环。借此表明所述结合与材料类型无关。所有打毛材料高效结合核酸。事实也表明，糙化表面(在梳的情况下)甚至只需很小以结合核酸。但事实也表明，较大面积也结合更多的核酸(在采用环的情况下的面积大于梳的糙化表面)。核酸质量出色。

实施例3：经典的核酸分离用试剂盒与本发明方法的对比

利用该实施例，应进行经典的核酸分离用试剂盒与本发明方法的对比。作为对比试剂盒，采用Qiagen公司的试剂盒DNeasy Blood&Tissue Kit。它基于细胞裂解、核酸结合至带有硅酸盐膜的自旋过滤柱的表面、随后洗涤所结合的核酸和自硅酸盐膜最终洗脱核酸。该试剂盒是核酸提取用标准试剂盒且在世界范围内被用于核酸提取。它按照当前手册来操作。

对于本发明的方法，又采用KingFisher ml。作为粗糙表面，采用打毛的梳以及套装在梳上的由打毛的PLA构成的环。借助本发明方法的提取过程就像在两个实施例1和2中描述的那样进行。

作为样品，分别采用约1x10⁶的NIH 3T3细胞或者2x10⁶的NIH 3T3细胞。

分离核酸的证明借助分光光度测量以及在琼脂糖凝胶上进行。除了浓度以及产量外，也确定分离核酸的纯度。

分光光度测量结果：

图3示出在琼脂糖凝胶上的DNA的检测。对于每个泳道，采用来自200微升总洗脱产物的2微升核酸。泳道表式：

1.DNA梯状条带(1b梯状条带)

2.Qiagen试剂盒(约1x10⁶的细胞)

3.Qiagen试剂盒(约2x10⁶的细胞)

4.本发明方法；打毛的塑料梳(约1x10⁶的细胞)

5.本发明方法；打毛的塑料梳(约2x10⁶的细胞)

6.本发明方法；具有由PLA构成的糙面环的塑料梳(约1x10⁶的细胞)

7.本发明方法；具有由PLA构成的糙面环的塑料梳(约2x10⁶的细胞)

如结果表明，可以利用本发明方法结合并分离比经典试剂盒多了很多的核酸。这样，结合能力明显高于商业可用的硅酸盐膜方法的结合能力。这突显本发明方法的巨大优势。

实施例4：自血液中提取核酸

利用该实施例表明，借助本发明方法也能自血液样品中分离DNA，同时产量极高。采用3毫升全血样品。在红细胞裂解后，含核细胞被吸移且又在添加来自商业可用的试剂盒innuPREP血液DNA Kit/IPC16(Analytik Jena AG)的裂解缓冲液(裂解缓冲液CBV)后以及在添加蛋白酶K情况下在60℃被裂解30分钟。在300微升洗脱缓冲液中被洗脱。

对于本发明的方法，又采用KingFisher ml。作为粗糙表面，采用套装在梳上的由打毛材料BioFila以及PLA构成的环。借助本发明方法的提取过程就像在实施例1-3中描述的那样进行。

分离核酸的证明借助分光光度测量实现。

分光光度测量结果：

如结果表明，用本发明方法可以实现从全血样品分离核酸，在此，可获得的产量极高。

实施例5：借助本发明方法并采用经改性的吸移管尖端从NIH 3T3细胞以及全血样 品中提取核酸

用该实施例表明，借助本发明方法可以极其简单快速地用改进的吸移管尖端分离核酸。

作为吸移管尖端，采用Sarstedt公司的1毫升吸移管尖端。该吸移管尖端被缩短约5毫米。于是，根据本发明方法，吸移管尖端的内表面借助磨削装置被粗糙化。

采用1x10⁶的NIH3T3细胞以及2毫升全血(红细胞被裂解且含核细胞被吸移，细胞随后被投入使用)。细胞和吸送的含核血液细胞就像在之前的实施例那样被处理且用裂解缓冲液CBV被裂解。裂解产物被转移入一个2毫升反应容器中并被加入400微升异丙醇。以下，采用打毛的吸移管尖端并且借助移管吸排配料20次。接着，另外三个2毫升反应容器被填充已知的乙醇洗涤缓冲液(LS，80％的乙醇，80％的乙醇)。接着，吸移管尖端被相继插入各洗涤缓冲液中且分别吸排5次。在最后洗涤步骤之后，尖端被干燥，进而残余乙醇被去除。结合核酸的洗脱利用200微升洗脱缓冲液针对NIH 3T3细胞以及利用400微升洗脱缓冲液针对全血样品进行。它又被加入一个2毫升反应容器中。它被吸排20次。在移除吸移管尖端之后，分离核酸存在于反应容器中。该方法极其简单快速。

分离核酸的证明借助分光光度测量进行。

分光光度测量结果：

如结果表明，用本发明方法可以实现在仅采用其内表面根据本发明被打毛的吸移管尖端情况下结合并分离核酸。在此事实也表明产量极高。无法借助未经处理的吸移管尖端分离核酸。

实施例6：不同的裂解缓冲液与不同的乙醇溶液或非乙醇溶液相结合以借助本发 明方法提取核酸的实验

又采用KingFisher ml的磁珠处理器。用磨削装置打毛的且由BioFila材料构成的环用作核酸结合材料，该环被套装在KingFisher ml的塑料梳上。作为样品，分别采用约1x10⁶NIH 3T3细胞。细胞裂解用三种不同的缓冲液进行：

1.缓冲液A，含有离液序列高的盐：尿素，SDS，Tris HCl，EDTA

2.缓冲液B，不含盐：SDS；Tris HCl；EDTA

3.缓冲液C，含有非离液序列高的盐：氯化钠，CTAB；Tris HCl，EDTA

细胞在200微升水中被打散且被加入200微升各裂解缓冲液以及20微升裂解缓冲液，并且在60℃被裂解15分钟。在裂解过程中，KingFisher ml的反应塑料被填充以下溶液：

腔1：400微升异丙醇或无水乙醇或丙酮

腔2：800微升洗涤液LS(来自innuPREP血液DNA Kit/IPC16的提取试剂盒)

腔3：800微升80％乙醇

腔4：800微升80％乙醇

腔5：200微升洗脱缓冲液(来自innuPREP血液DNA Kit/IPC16的提取试剂盒)

在成功裂解之后，裂解产物(400微升)被加入腔1中的在那里已有的各种不同溶液(异丙醇；无水乙醇或丙酮)，并且开始提取过程。提取过程像在实施例1中描述的那样进行。分离核酸的证明借助分光光度测量以及在琼脂糖凝胶上进行。除了浓度和产量外，也确定分离核酸的纯度。

分光光度测量结果：

图4示出在琼脂糖凝胶上的DNA的检测。对每个泳道采用来自200微升总洗脱产物的4微升核酸。泳道表明示：

1.DNA梯状条带(1b梯状条带)

2.裂解缓冲液A+异丙醇

3.裂解缓冲液A+无水乙醇

4.裂解缓冲液A+丙酮

5.裂解缓冲液B+异丙醇

6.裂解缓冲液B+无水乙醇

7.裂解缓冲液B+丙酮

8.裂解缓冲液C+异丙醇

9.裂解缓冲液C+无水乙醇

10.裂解缓冲液C+丙酮

如结果表明，对于本发明的方法可以采用不同组成的裂解缓冲液以及裂解缓冲液与乙醇或与非乙醇的组合。在此，在该裂解缓冲液中可以含有离液序列高的盐、不含盐或非离液序列高的盐。

实施例7：从水性溶液获得染色体组DNA的证明

制作水性溶液，其包含从血液中分离出的染色体组DNA。300微升的DNA溶液中被加入30微升的3摩尔醋酸钠溶液以及300微升异丙醇。

已分离的核酸结合在粗糙表面且分离的证明如下进行。在此自动实现提取。对于本发明方法，又采用KingFisher ml。作为粗糙表面，采用由Biofila材料构成的套装在梳上的环。该环借助三维打印技术来制造且在表面上包含沟结构。

KingFisher ml的反应塑料被填充如下的溶液：

腔1：DNA溶液/醋酸钠/异丙醇

腔2：800微升80％乙醇

腔3：空

腔4：空

腔5：150微升水

提取过程就像在实施例1中描述的那样进行，在此，这一次只进行一个洗涤步骤。分离核酸的证明在琼脂糖凝胶上进行。

图5示出在琼脂糖凝胶上的DNA的检测。对于每一泳道采用来自150微升总洗脱产物的10微升核酸。泳道表示：

1.DNA梯状条带(1b梯状条带)

2.空

3.未经处理的塑料梳

4.未经处理的塑料梳

5.具有由Biofila构成的套装环和沟结构的塑料梳

6.具有由Biofila构成的套装环和沟结构的塑料梳

如结果印象深刻地表明，核酸未结合至未经处理的梳上。但它接合至具有沟结构的环。为此已证明人们也能从水性溶液中回收已有的DNA。通过添加异丙醇和醋酸钠，DNA的可溶性被降低，结果，DNA能结合至塑料材料的表面。

Claims (15)

1.一种从含核酸的水性样品中分离核酸的方法，其特征在于，使含有游离核酸或裂解释放核酸的水性溶液在所述水性溶液的极性降低之前或之后接触具有粗糙表面或结构化表面的固相，其中，所述核酸沉淀在所述固相上且随后随着所述固相从水性溶液中被去除。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸是短链核酸和长链核酸，它们同时结合至所述固相。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，为了降低所述水性溶液的极性，加入有机溶剂，所述有机溶剂优选乙醇。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以5体积％到90体积％，优选30体积％到75体积％的浓度加入所述有机溶剂。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述水性溶液还含有

a)盐和/或

b)至少一种去污剂和/或

c)氨基醇或用于调节pH值的物质，如TRIS。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，

a)所述盐以1mM至5M，优选5mM至2M的浓度存在，

b)所述去污剂以0.1体积％至30体积％，优选1％至10％的浓度存在，

c)TRIS以1mM至2M，优选10mM至1M的浓度存在。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，包括进一步的添加物，所述进一步的添加物优选是蛋白酶。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述粗糙面或结构化表面是非光滑的金属表面、塑料表面或橡胶表面或者磁珠。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述非光滑的塑料表面通过3维打印或通过塑料打毛来产生。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，采用粗糙的复合材料作为固相。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，采用打毛的吸移管尖端作为固相。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，采用螺钉的螺纹、金属海绵或颗粒、扭曲材料或二维或三维的网状结构作为带有结构化表面的固相。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述固相在所述水性溶液内是活动的。

14.一种从含核酸的水性样品中分离核酸的试剂盒，包括：至少一种用于降低所述水性溶液的极性的物质，至少一种用于使所述核酸与粗糙表面或结构化表面结合的固相以及洗脱缓冲液。

15.将带有粗糙表面或结构化表面的材料用于从含核酸样品中分离核酸的用途。