CN108076644B - 自动核酸提取的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

自动核酸提取的装置和方法，包括能部分或完全浸入反应腔中的主体，其特征在于，至少进入该反应腔中的部分具有非光滑表面。在裂解后，生物样本被添加有机物质且优选是乙醇或酮。现在使该配料与以非光滑表面为特点的材料接触。在此前提条件下，核酸吸附至所用材料的表面。接着，可选地进行利用已知的乙醇清洗液的清洗步骤。在干燥之后，吸附核酸通过添加水或低盐缓冲液而脱离所述材料并且能被用于下游应用。

Description

自动核酸提取的装置和方法
技术领域
本发明的主题是能借此快速高效地以及大量自动地隔离并洗出核酸的装置和方法。
背景技术
在典型条件下如下所述地从细胞和组织中分离DNA：含核酸的原始材料在强烈变性及还原条件下、有时也在采用蛋白分解酶情况下被分解，出现的核酸片段通过苯酚/氯仿提取步骤被纯化且核酸借助透析或乙醇沉淀从水相中获得(Sambrook,J.、Fritsch,E.F.和Maniatis,T.，1989，CSH，“分子克隆”)。用于从细胞且尤其组织中分离核酸的此种“经典方法”是很费时间的(有时超过48小时)，需要显著的设备成本，此外也无法在现场条件实现。另外，这样的方法因为所用化学物质如苯酚和氯仿的量不少而对健康有害。
下一代核酸分离法依据由福格施坦恩和吉尔斯皮(Proc.Natl.Acad.Sci.美国,1979,76,615-619)研发并首次描述的、从琼脂糖凝胶中准备并分解纯化DNA片段的方法。该方法将“包含待分离DNA带的琼脂糖溶解在离液序列高的盐(NaJ)的饱和溶液中”与“将DNA结合至玻璃珠”进行了结合。固着至玻璃珠的DNA随后用洗涤液(20mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)[pH7.2]；200mM的氯化钠；2mM的EDTA；50％v/v乙醇)被洗涤，随后脱离载体颗粒。该方法迄今经历一系列改变且当前被用于自不同来源提取纯化核酸的不同方法，最后成为几乎所有商业可用的人工和自动核酸分离用试剂盒的基础。此外存在涉及核酸分离基本原理的许多专利和公开文献，所述基本原理由福格施坦恩和吉尔斯皮初次公开且或许还拥有其它的优点。这些变型不仅涉及使用不同的矿物载体材料，也涉及核酸结合用缓冲液的类型。例子尤其是在有不同的离液序列高的盐的溶液情况下将核酸结合至矿物载体，此时作为载体材料采用细磨玻璃粉(BIO 101,La Jolla,CA)、硅藻土(Sigma公司)或者硅胶或硅酸盐悬浮体或者玻璃纤维过滤器或矿土(DE 41 39 664 A1、US 5,234,809、WO-A 95/34569、DE 4321904、DE 20207793)。所有这些专利基于在有离液序列高的盐溶液情况下将核酸结合至基于玻璃或硅的矿物载体材料。在新近的专利文献中公开了，为了将核酸吸附至技术人员所已知且采用的矿物材料，也可以很高效且成功地采用所谓的反离液盐作为裂解/结合缓冲液体系的组成(EP1135479)。概括而言，人们于是可以如下所述地描述现有技术，在有含有离液序列高的盐或反离液盐的缓冲液情况下，或者在含有离液序列高的盐和反离液盐的混合物的缓冲液情况下，将核酸结合至矿物材料，然后在此过程中也能分离核酸。此时也出现以下优选变型，在此采用附加的脂肪族醇来促成结合。技术人员也知道了所有常见的用于核酸分离纯化的商业产品都基于此。所用矿物载体在此以松散料形式、滤膜形式或悬浮体形式存在。为了执行自动提取过程，通常采用顺磁珠或磁珠。在此，它例如是硅酸盐物质，其具备磁芯或顺磁芯，或者是氧化铁颗粒，其表面被改进以拥有核酸结合所需的功能性。为了尤其能简单执行自动提取，采用经改进的吸移管尖端。它的特点是其已包含核酸结合所需的载体材料(多孔矿物载体材料或多孔阴离子交换剂等)。例如，专利文献DE3717211描述一种带有核酸分离用多孔层析材料的吸移管尖端。专利文献EP1951904公开一种吸移管尖端，其由上部和下部组成，两者之间也有多孔层析载体材料，且它们应被用于自动核酸分离。经改进的核酸提取用吸移管尖端也在专利文献US2013/0078619中被公开。在吸移管尖端内也有多孔矿物载体材料(多孔玻璃)用于直接结合核酸。所有这些经改进的吸移管尖端的共同点是，它是多孔层析材料(松散料或多孔固体)。该载体材料总是水平位于吸移管尖端内。待处理液体流过所用的多孔材料。提取过程所依据的是，在样品裂解且调节出用于将核酸吸附至载体材料所需要的相应结合条件后，配料借助吸移过程被吸引经过多孔载体材料。核酸结合至载体材料。接着，洗涤缓冲液被吸移穿过载体材料。接着进行干燥步骤(频繁吸排或施加真空)。最后，洗脱剂被吸移经过载体材料。在此使结合的核酸脱离载体材料。含载体材料的吸移管尖端的使用应显著简化核酸(尤其)自动提取过程。虽然该设想已经有一些年头了(1987年5月22日的专利文献DE3717211)，但这种方法并未得以实现。在这里，原因在于以下的几个根本问题：
1)含核酸的高黏度裂解产物的吸移只能有限起效或者导致层析材料完全堵塞。因此无法实现提取。
2)裂解产物吸移经过多孔材料导致了泡沫形成。这随着越来越多的吸移步骤而强，可能也使得提取过程无法实现。
3)从多孔材料中除去乙醇成分是困难的且通常不能令人满意地解决。
发明内容
因此，本发明基于以下任务，解决已知的问题，进而能相比于目前情况简单快速许多地执行自动核酸提取。本发明的另一个目的在于允许将现有的液体操作仪器平台用于自动核酸提取。这应该可利用简单手段普遍实现。
该任务根据权利要求的特征来完成。根据权利要求1，描述一种自动核酸提取装置，包括主体，其可以部分或完全浸入反应腔中，在此，至少浸入反应腔中的所述部分具有粗糙表面或结构化表面。采用相应的吸移管尖端，其或是被打毛，或者外套有粗糙物体或结构化物体。当溶液极性被降低时，在该物体上发生核酸沉淀。这或是最好通过添加有机溶剂(乙醇)来进行，或是通过现有技术中已知的结合缓冲液来进行。事实证明，当该物体具有光滑表面时并未发生核酸结合至该物体。权利要求2-6是本发明的优选实施方式。
本发明的主题还是一种具有根据本发明装置的根据walk-away原理的仪器，例如自动吸移仪或自动提取仪。
本发明的基础是以下观点，核酸吸附至结构化材料或粗糙材料的表面(如聚合物材料)。为此只需要裂解含有核酸的生物样品以释放核酸。这可以利用技术人员已知的缓冲液进行。在裂解之后，样品中被加入降低水溶液极性的物质且优选有机溶剂如乙醇或酮。现在使配料接触以非光滑表面为特点的材料。在这些前提下，核酸吸附至所用材料的表面。接着，或许进行利用已知的乙醇洗涤液的洗涤步骤。在干燥之后，所吸附的核酸通过添加水或低盐缓冲液(如10mM的Tris HCl)而脱离该材料并且可被用于下游的应用。本发明的装置和本发明的方法将所述可能方案用于可自动化的简单提取作业。该装置在此由一主体构成，其可部分浸入反应腔中，在这里，浸入反应腔中的所述部分具有非光滑表面。最好采用空心体，其可容纳和输出液体。尤其最好采用吸移管尖端。吸移管尖端如此构造，即在其外表面的后下三分之一中有结构化材料或粗糙材料。这例如可以通过插套上匹配的环来实现(例如这样的环可被插套在常见的吸移管尖端上，这强调了通用性)。但空心体本身也可以具备这种结构特点(粗糙度)，因而由一个部分构成且在注塑工具中制造。在图1中示意性示出了例如用于经改进的吸移管尖端的本发明装置。
属于本发明的还有自动核酸提取方法，其特点是有以下步骤：
a)裂解的生物样品被加入一反应腔中并被加入至少一种降低水溶液极性的物质或者用于将核酸结合至固相的物质，
b)将根据权利要求1至5之一的装置浸入所述腔中，其中，该核酸结合至该装置的粗糙部分或结构化部分，
c)或许将该装置转移入用于洗涤所结合的核酸的至少另一个腔，
d)或许干燥所结合的核酸，
e)将干燥后的结合的核酸转移入用于核酸洗脱的另一个腔。
术语“粗糙表面”是指可通过表面触摸或表面外观来鉴别该表面并不光滑。但它在此也可以是下述表面，其具有结构(如沟)。通过所述结构消除了表面的光滑性，即便该结构即沟本身可能是光滑的。根据本发明，这样的表面被称为“结构化表面”。如果通过表面的外观或触摸无法鉴别表面是否光滑或粗糙，则可以执行测试，在此使激光对准该表面。在光滑表面的情况下，激光只在主方向上在表面被反射。在粗糙表面的情况下进行在所有空间方向的散射。这样的测试在基尔大学的网页上有所描述(http://www.tf.uni-kiel.de/matwis/amat/semitech_en/kap_3/illustr/oberflaechenstrukture.pdf)。
本发明的装置如下所述地被用于根据本发明的自动核酸提取方法：人们最好采用经典的walk-away原理，即，拿来提取所需的溶液并相继地加入提取作业中。根据本发明的设定目的，当其具备所需要的技术前提条件时，甚至可以将商业可用的自动提取仪或自动吸移仪用于自动提取过程。样品被加入一反应腔中并被加入裂解缓冲液和或许蛋白分解酶。接着进行样品裂解。在用裂解缓冲液裂解样品之后，在裂解产物中添加有机成分。本发明装置浸入该溶液中并在该溶液中被竖向来回运动多次。现在，核酸位于该装置上。接着使该装置离开该溶液并运动至一个新的反应腔中。在该新的反应腔中有乙醇洗涤缓冲液(在此也可采用已知的洗涤缓冲液)或者只有乙醇。本发明装置浸入该溶液中且在该溶液中被竖向来回运动多次。洗涤步骤可以重复多次。在最后的洗涤步骤之后，使该装置离开溶液并在腔外被短暂干燥，以除去残余乙醇。在最后步骤中，本发明装置被插入另一腔中，在该另一腔中有水或其它的低盐缓冲液。本发明的装置也浸入该腔中且在该溶液中被多次竖向来回运动。这导致结合核酸的脱离。从普通的实验计划中知道所述自动提取现在是如何简单。不必再像在借助磁珠进行自动提取时所要做的那样完成磁珠分离。该方法不需要就像在使用过滤板时所需要的真空过滤步骤。它只需要本发明的装置以及吸移管平台。在此，本发明装置的通用性和简单性当然是有利的，因为人们可以接受商业可用的标准吸移管尖端。该吸移管尖端通过插套上的例如具有核酸分离专门所需要的表面性能的环被改进，从而它们可以被用于本发明的装置，进而可被用在任何的核酸分离用吸移管平台上。
此外，提取所需的试剂已经可以在相应的反应腔中呈送，因而提取过程可以按照walk-away原理进行。如此公开了另一个突出优点，本发明的装置不仅允许核酸结合，也还能使液体以单独形式运动。在该组合功能中，提取过程还可以被进一步优化。因此，样品裂解已经能在自动机器上进行。裂解时所需要的样品连续运动通过本发明装置的吸送管功能获得。此外，可以在最终的洗脱步骤后也借助吸送管功能从洗脱腔中除去洗出物并且转送入存放容器中。通过本发明装置的可简单实现的双重功能，为此可以灵活提高自动化程度。
以下应结合实施例来详述本发明。该实施例在此不是限制本发明。
具体实施方式
借助本发明方法且在采用经改进的吸移管尖端以及采用商业可用的自动提取仪 的情况下自NIH 3T3细胞自动提取核酸。
变型A：半自动提取过程(样品裂解单独进行)
作为标准自动提取仪的例子，采用InnuPure C16(Analytik Jena AG)。该系统是磁珠提取系统，其被转用于执行本发明方法。在针对InnuPure C16自动仪器所用的吸移管尖端的下端上从外侧如此套装上一个环，即，吸移管功能未受到影响。外套的环在此由聚合物构成且具有结构化表面。由空心体和安装在其上的环构成的组合体形成用于执行本发明方法的装置。
为了核酸提取，采用不同量的NIH 3T3细胞。核酸隔离所用的提取化学品此时部分来自商业提取试剂盒innuPREP血液DNA Kit/IPC16X(Analytik Jena AG)。借助裂解缓冲液(裂解液CBV)以及蛋白酶K，细胞在60℃在2.0毫升反应容器中被裂解15分钟。裂解此时不在自动提取仪中进行。接着采用Innupure C16的自动方法用于核酸纯化。提取所需的溶液在预填充的深孔板中呈现。上述裂解产物被加入填充有400微升异丙醇的腔中。带有所述环的吸移管尖端(本发明的装置)完成80次的竖向浸入所述腔的运动，在这里，在腔底端分别等待2秒的培养。接着，用所述环改进的吸移管尖端被分别相继10次浸入其它腔中，所述其它腔包含乙醇洗涤缓冲液(洗涤液LS，80％的乙醇，80％的乙醇)。
在最后的洗涤步骤之后，所述空心体上的环在所述腔外被干燥10分钟之久，因而残余乙醇被除去。核酸的洗脱通过在200微升洗脱缓冲液中重复30次浸入和提出运动来进行，该洗脱缓冲液通过仪器已被事先加热到50℃。随后是在同一腔中在40℃借助80次100微升吸移的混合步骤。为此采用本发明装置的根据本发明的双重功能。
所述方法极其简单易行且由此很快速。相比于利用InnuPure C16以及采用磁珠来结合核酸的核酸提取标准方法，时间节约超过50％。
分离核酸的证明借助在琼脂糖凝胶中的分光光度测量和电泳显示进行。
分光光度测量结果：
Figure BDA0001518026160000071
如结果所示，利用本发明的装置可以在只采用标准提取化学和可商业获得的提取平台情况下结合并分离核酸。事实表明，收得量极高且与所用细胞量相关地也会看到收得量的分级。
图2示出了分离核酸的电泳分离。示出了在0.8％琼脂糖凝胶中电泳分离开的核酸，它们借助本发明方法已被分离出。从左向右以样品1开始施加样品。所施加的体积为5微升。
变型B：全自动提取过程(样品裂解在仪器中进行)
在另一个实施方式中，样品裂解也自动进行。因此，只由使用者加入样品和蛋白酶K，其它准备完全用InnuPure C16技术设备自动进行。为了样品裂解，样品被Innupure C16加热到50℃并通过250次吸排来加强裂解。接着通过空心体的吸移管功能进行将400微升异丙醇从预填充的腔中加入带有裂解产物的腔中。所有的其它步骤如上所述地进行。
Figure BDA0001518026160000081
图3示出了分离核酸的凝胶电泳分离。示出了在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳分离开的核酸，其借助本发明方法并内部裂解。样品从左向右以样品1开始被施加。所施加的体积为5微升。
图1是示出了套装在空心体上的环的示例性实施方式。该图被显著放大。
示出了可以根据本发明方法被用于核酸提取的环的示例性实施方式。具有非光滑表面的该异型件可以被套装在任何商业可用的吸移管尖端上，从而它随即处于该尖端的后下三分之一中。

Claims (13)

1.一种自动核酸提取装置，包括至少一个能部分或完全浸入反应腔中的主体，其特征在于，至少浸入反应腔中的所述部分具有粗糙表面或结构化表面，其中，所述装置是粗糙的或结构化的物体外装在其上的光滑的空心体，并且待装的所述物体是带有粗糙表面或结构化表面的环或套管。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述光滑的空心体是吸移管尖端。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，待装的物体是粗糙的或结构化的聚合物材料、带有粗糙表面或结构化表面的复合材料或者借助3D打印所形成的材料。
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述空心体能够接纳处于反应容器中的液体。
5.一种按照walk-away原理的自动核酸提取用仪器，包括至少一个根据权利要求1至4中任一项所述的装置。
6.根据权利要求5的仪器，其特征在于，所述仪器是自动吸移仪或自动提取仪。
7.一种自动核酸提取的方法，其特征在于以下步骤：
a)裂解的生物样本被加入反应腔中并加入至少一种降低水溶液极性的物质或者用于将核酸结合至固相的物质，
b)将根据权利要求1至3中任一项所述的装置浸入该腔中，其中，该核酸结合至所述装置的粗糙部分或结构化部分，
c)将所述装置转移入用于清洗所结合的核酸的至少另一个腔，
d)干燥所结合的核酸，
e)将经过干燥的结合的核酸转移入用于洗脱核酸的另一个腔。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用有机溶剂作为用于降低水溶液的极性的物质。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂是醇类。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，借助根据权利要求4所述的装置，步骤e)中的所述腔的液体被转送至所述腔。
11.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，使用根据权利要求1至3中任一项的装置，并且其中，在洗脱腔内洗脱核酸之后，洗出液借助所述空心体从反应腔被转移入存放容器。
12.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，使用根据权利要求1至3中任一项的装置，并且裂解的生物样本借助所述空心体被加入所述反应腔中。
13.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述方法是借助自动吸移仪或自动提取仪的自动方法。
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