DE102021104319A1 - Verfahren zur simultanen Isolierung von Nukleinsäuren aus sedimentierbaren und nicht sedimentierbaren Biomolekülen in Wasserproben - Google Patents

Verfahren zur simultanen Isolierung von Nukleinsäuren aus sedimentierbaren und nicht sedimentierbaren Biomolekülen in Wasserproben Download PDF

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein einfaches und sehr schnelles Verfahren zur simultanen Isolierung von Nukleinsäuren aus sedimentierbaren und nicht sedimentierbaren Biomolekülen in Wasserproben. Bei den Wasserproben kann es sich u.a. um Trinkwasser, Industriewasser, Oberflächenwasser oder auch Abwasser handeln. Bei den Biomolekülen handelt es sich um Bakterien, Bakteriophagen, Protozoen, Viren und um frei zirkulierende Nukleinsäuren (z.B. Plasmid DNA), die für Antibiotikaresistenzen kodieren. Erfindungsgemäß wird der Wasserprobe ein Polysaccharid-Derivat zugegeben und so die Biomoleküle angereichert. Nach Auflösung des Pellets und Lyse der Biomoleküle werden die Nukleinsäuren in bekannter Weise an eine feste Phase gebunden, gereinigt und eluiert.

Description

  • Gegenstand der Erfindung ist ein einfaches und sehr schnelles Verfahren zur simultanen Isolierung von Nukleinsäuren aus sedimentierbaren und nicht sedimentierbaren Biomolekülen in Wasserproben. Bei den Wasserproben kann es sich u.a. um Trinkwasser, Industriewasser, Oberflächenwasser oder auch Abwasser handeln. Bei den Biomolekülen handelt es sich um Bakterien, Bakteriophagen, Protozoen, Viren und um frei zirkulierende Nukleinsäuren (z.B. Plasmid DNA), die für Antibiotikaresistenzen kodieren.
  • Stand der Technik
  • Die Untersuchung von Wasserproben jeder Art mittels molekularbiologischer Methoden gewinnt immer mehr an Bedeutung. So zeigt die SARS-CoV-2 Pandemie, dass die Untersuchung von Abwasser aus Kläranlagen in Hinblick auf eine epidemiologische Früherkennung steigender Infektionszahlen bedeutsam sein kann. Immer mehr in den Fokus rückt neben einer generellen Untersuchung von Wasser auf Mikroorganismen auch der Nachweis von Antibiotikaresistenzen. Diese Resistenzen sind oftmals nicht Bakterienassoziiert, sondern liegen als frei zirkulierende Plasmide vor. Die Isolierung von Nukleinsäuren aus Wasser-/Abwasserproben beinhaltet allerdings mehrere Probleme. Reicht bei der Untersuchung von Blutproben auf das Vorliegen einer Virusinfektion ein Volumen von 200 µl, ist das Probenvolumen bei der Untersuchung von Wasser/Abwasser deutlich größer. Probenvolumen von ca. 20 ml können aber nicht mehr direkt für eine einfache und schnelle Nukleinsäureextraktion eingesetzt werden.
  • Problematisch in diesem Zusammenhang ist aber auch, dass z.B. Abwasser oder industrielles Brauchwasser eine große Menge an Feststoffen und Matrix enthält. Auch Oberflächenwasser von Seen oder Flüssen enthält eine relativ hohe Konzentration an Feststoffen. Um diese Stoffe zu reduzieren oder aus der Probe zu entfernen, um nur die Flüssig-Phase zur Analyse heranzuziehen, können feste Stoffe durch Zentrifugation entfernt werden. Andere Möglichkeiten zur Entfernung dieser Stoffe sind Filtrationstechniken, die Nutzung geladener Filter oder auch Flockungsmethoden. Hierbei offenbart sich ein großes Problem, welches die Sensitivität der Analysemethoden stark beeinträchtigt. Es ist bekannt, dass sich Biomoleküle an im Wasser befindliche Feststoffe binden. Damit gehen diese Anteile an nachzuweisenden Biomolekülen über das Sediment verloren, wenn dieses vor der Extraktion aus der Probe entfernt wurde und wenn nur mit dem resultierenden Überstand gearbeitet wird. Andererseits wird oftmals auch nur mit dem Sediment gearbeitet und nicht mit dem Überstand. Je nachdem, welche Variante eingesetzt wird, gehen immer Biomoleküle aus der jeweiligen nicht Verwendung findenden Fraktion verloren. Ein Verfahren, welches simultan Nukleinsäuren aus beiden Fraktionen isoliert, ist nicht bekannt.
  • Es sei hier darauf verwiesen, dass es eine Reihe von Techniken gibt, Biomoleküle aus einer großvolumigen Probe aufzukonzentrieren.
  • So gibt es zum Beispiel für die Anreicherung von Viren oder subzellulären Partikeln aus einer biologischen Probe die Anwendung von Ultrazentrifugationstechniken. Weiterhin wird auch die Technik der Ultrafiltration eingesetzt. Auch diese Methode ist zeitaufwendig und sehr teuer. Alternative Verfahren bestehen in der Präzipitation von Viruspartikeln mittels Polyethylenglycol/Natriumchlorid und einer nachfolgenden Zentrifugation (Yamamoto et al., Virology 40(1970) 734; Morandi et al., J.Clin.Microbiol. 36 (1998) 1543-1538). Dabei nutzt man verschiedene Mischungen von PEG und Natriumchlorid und mischt diese Reagenzien mit der biologischen Probe. Nachfolgend wird der Ansatz bei Kälte längere Zeit inkubiert und nachfolgend werden die Virus(Protein)-NaCl/PEG- Präzipitate durch Zentrifugation gewonnen. Auch diese Verfahren sind aufwendig und benötigen viel Zeit. Problematisch ist darüber hinaus die Weiterbearbeitung der Präzipitate für die Isolierung der viralen Nukleinsäuren. Oftmals lassen sich die Präzipitate nur sehr schwer wieder in Lösung bringen. Dies beeinflusst die Effizienz und die Qualität der Nukleinsäureisolierung erheblich. Die Patentschrift DE 19856415 C2 beschreibt ein Verfahren, welches sich der bekannten NaCl/ PEG- Präzipitation bedient, wobei nachfolgend die Isolierung der Nukleinsäuren in an sich bekannter Weise über die Bindung an eine silikatische feste Phase realisiert wird. Inwieweit sich dieses Verfahren von der hinlänglich bekannten Methode der NaCl/PEG-Präzipitation mit den bekannten Problemen abhebt, wird nicht ersichtlich. Darüber hinaus bedarf auch dieses Verfahren einer Kälteinkubation und einer zwanzigminütigen Zentrifugation. Das Verfahren soll es gestatten, virale Nukleinsäuren aus einer Probe von bis zu 10 ml zu isolieren. Letztlich sind all diese Verfahren sehr zeit- und arbeitsaufwendig und benötigen auch ein spezielles und teures Equipment (z.B. Ultrazentrifuge).
  • Aufgabe der Erfindung
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, die Nachteile der bekannten technischen Lösungen zu beseitigen. Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein einfaches und schnell durchführbares Verfahren bereit zu stellen, welches es gestattet, simultan Nukleinsäuren aus unterschiedlichsten Biomolekülen, die sich in Wasserproben befinden, zu isolieren.
  • Lösung der Aufgabe
  • Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.. Die erfindungsgemäße simultane und parallel-simultane Isolierung erfolgte dabei aus einem nach Zentrifugation erhaltenen Sediment sowie aus der nach Zentrifugation entstandenen Flüssig-Phase. Die Trennung von Sediment und Flüssig-Phase erfolgt mittels einfacher Zentrifugation. Das Verfahren stellt sicher, dass durch die gleichzeitige Bearbeitung von Sediment und resultierender Flüssig-Phase es keinen Verlust an Nukleinsäuren gibt und damit die Sensitivität von molekulargenetischen Detektionsverfahren deutlich erhöht werden kann.
  • Darüber hinaus gestattet das Verfahren auch die simultan parallele Extraktion von Nukleinsäuren aus Biomolekülen, die per se nur im Sediment sind (z.B. Bakterien), von Biomolekülen, die sich mehrheitlich in der Flüssig-Phase nach einer Zentrifugation befinden (z.B. zirkulierende freie DNA, Bakteriophagen oder Viren).
  • Das Problem wird durch die vorliegende Erfindung überraschenderweise einfach gelöst. Dabei können kommerziell verfügbare Extraktionsreagenzien eingesetzt werden. Entscheidend ist die Kombination dieser, um die Lösung der Aufgabe zu ermöglichen. Die simultane Isolierung von Nukleinsäuren aus Sediment und resultierendem Überstand wird erfindungsgemäß wie folgt gelöst: 20 ml einer Wasserprobe, z.B. Abwasser aus einem Klärwerk, werden in ein 50 ml Zentrifugationsgefäß überführt. Die Probe wird bei 5.000 rpm für 20 Minuten zentrifugiert, um das Sediment vom Überstand zu trennen und eine Sedimentfreie Flüssig-Phase zu erhalten. Der Überstand wird komplett abgenommen. Davon werden 10 ml für die weitere Bearbeitung in ein neues Zentrifugationsgefäß überführt. Das Sediment wird mit 1xPBS Puffer resuspendiert und in ein neues 1.5 ml Zentrifugationsgefäß überführt. Beide Fraktionen liegen jetzt für die simultane Extraktion der Nukleinsäuren vor. Im Überstand befinden sich jetzt die Biomoleküle, die mittels einer einfachen Zentrifugation nicht sedimentierbar sind (freie Nukleinsäure, Bakteriophagen, Viren etc.). Die Bearbeitung des Überstandes (10ml) mit dem Ziel der Aufkonzentrierung der enthaltenen Biomoleküle basiert auf der Verwendung von Polysaccharid-Derivaten für eine Komplexierung der in einer Probe enthaltenen Biomoleküle. Bei den Polysaccharid-Derivaten handelt es sich um die Salze von Polyuronsäuren. Besonders geeignet sind dabei die sog. Alginate der Alginsäuren. Bei Alginaten handelt es sich um strukturgebende Elemente bei Braunalgen. Alginat ist ein Polysaccharid, welches aus 1,4 verknüpfter a-L-Guluronsäure (G) und β-D-Mannuronsäure (M) besteht. Dies ist in der Patentschrift DE 102008023297 offenbart. Die Patentschrift beschreibt die Nutzung der Fähigkeit von Alginaten, in Lösungen mit niedrigem Kalziumgehalt zu gelieren und sog. Hydrogele zu bilden. Die Ursache der Gelierung begründet sich in der Einlagerung von Kalziumionen in die Zickzackstruktur der GG-Blöcke. Auf diese Zone lagert sich dann die Zickzackstruktur eines anderen Alginatmoleküls. Es kommt hierdurch zur Ausbildung dreidimensionaler Strukturen. Die Ausbildung von Gelen erfolgt auch in Kombination mit starken Säuren. Die entstandenen Gelstrukturen können darüber hinaus auch wieder spezifisch zerstört werden.
  • Unter Ausnutzung der Ausbildung von Alginatgelen kann die Anreicherung von Biomolekülen (Viren, Bakteriophagen, freie Nukleinsäuren etc.) einfach und schnell erfolgen und nachfolgend die Isolierung von Nukleinsäuren durchgeführt werden.
  • Der Flüssig-Phase (10 ml Überstand) werden deshalb eine Alginatlösung und eine Kalziumchlorid-Lösung zugegeben. Der Ansatz wird kurz geschüttelt, inkubiert und nachfolgend für 20 Minuten bei 5.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und mit dem Pellet wird weitergearbeitet. Dieser Schritt ermöglicht es, das Volumen der Probe von 10 ml auf wenige Mikroliter aufzukonzentrieren.
  • Das nach Aufkonzentrierung erhaltene Pellet wird mit einem kommerziell verfügbaren Lysepuffer (Lysis Solution RL; Analytik Jena AG) versetzt. Mittels des Lysepuffers wird das Pellet aufgelöst. Damit liegen die Biomoleküle der Flüssig-Phase jetzt im Lysepuffer vor. Die in PBS Puffer resuspendierte Sediment-Fraktion wird wie folgt bearbeitet:
  • In Abhängigkeit, aus welchen Biomolekülen im Sediment die Extraktion der Nukleinsäuren erfolgen soll (z.B. aus Viren oder freien Nukleinsäuren, welche an Sediment-Komponenten gebunden waren oder aus Bakterien, welche auf Grund der vorangegangen Zentrifugation ebenfalls Bestandteil des Sedimentes waren), wird die Sediment-Fraktion kurz zentrifugiert und der Überstand direkt weiter verwendet oder das resuspendierte Sediment wird enzymatisch oder thermisch vorab lysiert, nachfolgend zentrifugiert und der Überstand nach dieser Lyse für die weitere Extraktion eingesetzt. Dieser wird dem Gefäß mit enthaltenem Lysepuffer aus der Flüssig-Phase zugegeben. Jetzt befinden sich alle Biomoleküle aus der Flüssigphase und der Sediment-Fraktion unter Lysepuffer in einem Reaktionsgefäß.
  • Die Extraktion der Nukleinsäuren kann jetzt mittels dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen. Dazu wird die Nukleinsäure nach einem kurzen Lyseschritt unter Zugabe eines Bindungspuffers an eine feste Phase gebunden (z.B. an einen Spin Filter mit enthaltener Glasfasermembran oder an magnetische oder paramagnetische Partikel). Danach wird gewaschen und die Nukleinsäure final von der festen Phase nach Zugabe von Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer abgelöst. Die vorliegenden Nukleinsäuren bestehen additiv aus den Biomolekülen der Sediment-Fraktion und Überstand-Fraktion, welche in den ersten Schritten aus einer 20 ml Abwasserprobe gewonnen wurden. Das gesamte Verfahren benötigt nur etwas mehr als eine Stunde. Es ist sowohl manuell als auch automatisiert durchführbar. Es benötigt keine Ultrazentrifugation oder Ultrafiltrationstechniken, wie sie üblicherweise für die Bearbeitung von Wasserproben eingesetzt werden. Das Verfahren ermöglicht die Extraktion von Nukleinsäuren aus allen in der Probe enthaltenen Biomolekülen.
  • Das Verfahren der parallelen Extraktion von Biomolekülen aus beiden Fraktionen kann auch noch vereinfacht werden. Dies kann vorteilhaft sein, wenn das Probenvolumen geringer (vorzugsweise kleiner als 15 ml) ist. Dabei trennt man die Probe erst gar nicht in eine Sediment-Fraktion und eine Flüssigkeits-Phase. Der gesamten Probe (z.B. 10 ml) wird eine Alginatlösung und eine Kalziumchlorid-Lösung zugegeben. Der Ansatz wird kurz geschüttelt, inkubiert und nachfolgend für 20 Minuten bei 5.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und mit dem Pellet wird weitergearbeitet. Im Pellet befindet sich jetzt das Sediment sowie die aufkonzentrierten Biomoleküle der Flüssigkeits-Phase. Das Pellet wird wieder mit einem kommerziell verfügbaren Lysepuffer (Lysis Solution RL; Analytik Jena AG) und Proteinase K versetzt, in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt und nachfolgend für 20 min bei 60°C inkubiert. Danach wird der Ansatz bei maximaler Geschwindigkeit für einige Minuten zentrifugiert und der Überstand in eine neues Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion der Nukleinsäuren kann jetzt wieder mittels bekannter Verfahren erfolgen. Dazu wird die Nukleinsäure nach einem kurzen Lyseschritt unter Zugabe eines Bindungspuffers an eine feste Phase gebunden (z.B. an einen Spin Filter mit enthaltener Glasfasermembran oder an magnetische oder paramagnetische Partikel). Danach wird gewaschen und die Nukleinsäure final von der festen Phase nach Zugabe von Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer abgelöst. Die vorliegenden Nukleinsäuren bestehen additiv aus den Biomolekülen der Sediment-Fraktion und Überstand-Fraktion, welche in den ersten Schritten aus einer 10 ml Abwasserprobe gewonnen wurden. Dieses Verfahren ist noch schneller durchführbar, da es keine Trennung von Sediment und Flüssigkeits-Phase benötigt.
  • Neben der simultanen Extraktion kann das Verfahren in idealer Weise auch für eine simultan parallele Isolierung von Nukleinsäuren aus Sediment und resultierendem Überstand eingesetzt werden. Hierbei wird lediglich auf die Zusammenführung der Sediment-Fraktion und der Überstand-Fraktion verzichtet. Beide Fraktionen werden als jeweils separate Proben parallel bearbeitet. Die erhaltenen Nukleinsäuren sind dann die Nukleinsäuren aus der jeweiligen Fraktion.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur simultanen oder parallel simultanen Isolierung von Nukleinsäuren aus einem Gemisch sedimentierbarer und nicht-sedimentierbarer Biomoleküle in Wasserproben ist gekennzeichnet durch folgende Schritte:
    1. a) Trennen der Probe in eine Sediment-Fraktion und eine Flüssig-Phase. Dafür wird vorzugsweise eine Zentrifuge verwendet. In der nicht-sedimentierbarer Phase (Überstand) befinden sich u.a. die freien Nukleinsäuren und Zellen, die nicht sedimentiert wurden.
    2. b) Aufgrund des großen Volumens, welches für eine Nukleinsäure-Isolierung ungeeignet ist, erfolgt eine Anreicherung der nicht-sedimentierbaren Biomoleküle der Flüssig-Phase in einem Pellet durch Zugabe eines Polysaccharid-Derivats, vorzugsweise wird ein Alginat eingesetzt. Vorzugsweise wird der Flüssig-Phase ein Kalziumsalz zugesetzt. Nun befinden sich alle Zellen und Biomoleküle der flüssigen Phase in diesem Pellet.
    3. c) Auflösen des Pellets durch Zugabe eines Lysepuffers. Dabei wird nicht nur das Pellet aufgelöst, sondern auch eventuell vorhandene Zellen lysiert.
    4. d) Lyse der Sediment-Fraktion und Überführung der lysierten Bestandteile in eine weitere flüssige Phase. Durch diese Lyse werden die Nukleinsäuren der Bestandteile der sedimentierten Phase freigesetzt.
    5. e) Entweder Zusammenführung beider flüssiger Phasen und Anbindung der Nukleinsäuren an eine feste Phase oder separate Anbindung der Nukleinsäuren der beiden flüssigen Phasen sowie deren Reinigung und Eluierung nach bekannten Methoden.
  • Eine einfache Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur simultanen Isolierung von Nukleinsäuren aus einem Gemisch sedimentierbarer und nicht-sedimentierbarer Biomoleküle in Wasserproben, ist durch folgende Schritte gekennzeichnet:
    1. a) Anreicherung der nicht-sedimentierbaren Biomoleküle der Flüssig-Phase in einem Pellet durch Zugabe eines Polysaccharid-Derivats, ohne das Sediment abzutrennen
    2. b) Auflösen des Pellets durch Zugabe eines Lysepuffers und gleichzeitige Lyse der Sediment-Fraktion und Überführung der lysierten Bestandteile in eine weitere flüssige Phase
    3. c) Anbindung der Nukleinsäuren dieser flüssigen Phase an eine feste Phase und deren Reinigung und Eluierung nach bekannten Methoden.
  • Die Trennung ist eine flüssige und Sediment-Phase entfällt. Diese Variante hat ihre Vorteile bei Volumina bis 15 ml.
  • Die Lyse, die Anbindung der durch Lyse freigesetzten Nukleinsäuren sowie die Aufarbeitung ist dem Fachmann bekannt. Eine mögliches Verfahren ist die Magnet-Separation. Aber auch die Anbindung der Nukleinsäuren an eine raue Oberfläche (gemäß WO 2016/169677 Al) wäre möglich.
  • Die erfindungsgemäße Verwendung des Verfahrens ist die Bestimmung des Gesamtgehalts an Nukleinsäuren aus einem Gemisch sedimentierbarer und nicht-sedimentierbarer Biomoleküle in Wasserproben. Diese Bestimmung entspricht einer simultanen Isolierung der Nukleinsäuren. Ebenso ist eine erfindungsgemäße Verwendung die Bestimmung des Gehalts an Nukleinsäuren der sedimentierbaren und / oder nicht-sedimentierbaren Bestandteile aus einem Gemisch sedimentierbarer und nicht-sedimentierbarer Biomoleküle in Wasserproben.
  • Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, wobei die Ausführungsbeispiele keine Limitation des erfindungsgemäßen Verfahrens bedeuten.
  • Ausführungsbeispiele
  • Beispiel 1: Simultane Extraktion und simultan parallele Extraktion von Nukleinsäuren von in einer Wasserprobe enthaltenen Bakterien sowie freier Bakteriophagen RNA
  • Als Ausgangsproben wurde Oberflächen-Flusswasser aus der Havel genommen. Die Proben wurden mit Bakterien (Salmonellen) sowie mit einer Bakteriophagen RNA (MS2-RNA) gespiked.
  • Für die Nukleinsäureextraktion wurden die Proben in eine Sediment-Fraktion und eine Flüssig-Phase getrennt. Es wurden immer 20 ml der Ausgangsprobe eingesetzt. Es ist davon auszugehen, dass sich die Bakterien im Sediment und die freie RNA als nichtsedimentierbare Biomoleküle in der Flüssig-Phase befinden, ggf. aber auch noch ein Anteil der freien Nukleinsäure sich an Schwebstoffen der Probe bindet und damit Teil des Sedimentes ist. Ziel ist es, sowohl die bakterielle Nukleinsäure als auch die freie Nukleinsäure einfach und schnell zu isolieren.
  • Mit der simultanen Extraktion der Nukleinsäuren aus beiden Fraktionen sollte die maximal mögliche Ausbeute erhalten werden. Neben der simultanen Extraktion aus beiden Fraktionen wurde auch eine simultane parallele Extraktion aus dem Sediment und der Flüssig-Phase durchgeführt, um zu zeigen, in welcher der Fraktionen sich welche Biomoleküle befanden.
  • Die Extraktion wurde gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie folgt durchgeführt. 20 ml der Probe wurden in einem 50 ml Reaktionsgefäß für 20 min bei 5.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und davon 10 ml in ein neues Gefäß überführt.
  • 1. Simultane parallele Extraktion der Nukleinsäuren aus Sediment und Flüssig-Phase 1.1. Extraktion der Nukleinsäure aus der Flüssig-Phase
  • Zu der 10 ml Flüssig-Phase wurden 100 µl Alginatlösung und 100 µl Kalziumchloridlösung gegeben. Der Ansatz wurde kurz geschüttelt, für 10 Minuten inkubiert und nachfolgend bei 5.000 rpm für 20 min zentrifugiert. Nach dieser Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und das Pellet mit 500 µl eines Lysepuffers (Lysis Solution RL;Analytik Jena) versetzt und das Pellet durch mehrmaliges Pipettieren aufgelöst, in ein neues 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 20 µl Proteinase K versetzt und bei 60°C für 15 Minuten inkubiert. Zur Probe wurden 50 µl einer Magnetpartikel-Lösung sowie 450 µl eines Bindungspuffers (Binding Solution SBS; Analytik Jena) gegeben. Der Ansatz wurde kurz gemischt und für 2 Minuten inkubiert. Nachfolgend erfolgte die Separation der Magnetpartikel mittels eines Magneten. Der Überstand wurde entfernt und die Magnetpartikel wurden mit 1 ml eines Waschpuffers (Washing Solution HS; Analytik Jena) gewaschen. Nach erneuter Separation der Magnetpartikel wurde der Überstand komplett entfernt und die Magnetpartikel weitere zwei Mal mit 80%igem Ethanol gewaschen. Nachfolgend wurde das Reaktionsgefäß mit geöffnetem Deckel in einem Thermomixer bei 50°C für 10 Minuten inkubiert. Die Elution erfolgte durch die Zugabe von 50 µl RNAse freiem Wasser und einer Inkubation bei 60°C für 5 Minuten. Nach Separation der Magnetpartikel wurde der Überstand entfernt und in ein neues Gefäß überführt. Das Gefäß enthält jetzt nur die Nukleinsäure aus der Flüssig-Phase.
  • 1.2. Extraktion der Nukleinsäure aus dem Sediment
  • Das nach Zentrifugation erhaltene Sediment-Pellet wurde in 250 µl 1 PBS Puffer resuspendiert und nach Zugabe von 10 ml Lysozym für 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Sediment-Probe für 2 Minuten bei 12.000 rpm zentrifugiert und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 300 µl eines Lysepuffers (Lysis Solution RL; Analytik Jena) sowie 20 µl Proteinase K versetzt und bei 60°C für 15 Minuten inkubiert. Zur Probe wurden 50 µl einer Magnetpartikel-Lösung und 450 µl Binding Solution SBS (Analytik Jena) gegeben. Der Ansatz wurde kurz gemischt und für 2 Minuten inkubiert. Nachfolgend erfolgte die Separation der Magnetpartikel mittels eines Magneten. Der Überstand wurde entfernt und die Magnetpartikel wurden mit 1 ml eines Waschpuffers (Washing Solution HS; Analytik Jena) gewaschen. Nach erneuter Separation der Magnetpartikel wurde der Überstand komplett entfernt und die Magnetpartikel weitere zwei Mal mit 80%igem Ethanol gewaschen. Nachfolgend wurde das Reaktionsgefäß mit geöffnetem Deckel in einem Thermomixer bei 50°C für 10 Minuten inkubiert. Die Elution erfolgte durch die Zugabe von 50 µl RNAse freiem Wasser und einer Inkubation bei 60°C für 5 Minuten. Nach Separation der Magnetpartikel wurde der Überstand entfernt und in ein neues Gefäß überführt. Das Gefäß enthält jetzt nur die Nukleinsäure aus dem Sediment.
  • 2. Simultane Extraktion der Nukleinsäuren aus Sediment und Flüssig-Phase
  • Das nach Zentrifugation erhaltene Sediment-Pellet wurde in 250 µl 1 PBS Puffer resuspensiert und nach Zugabe von 10 ml Lysozym für 30 min bei 37°C inkubiert. Während der Inkubationszeit wurde zu den 10 ml aus der Flüssig-Phase 100 µl Alginatlösung und 100 µl Kalziumchlorid gegeben. Der Ansatz wurde kurz geschüttelt, für 10 Minuten inkubiert und nachfolgend bei 5.000 rpm für 20 min zentrifugiert. Nach dieser Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und das Pellet mit 300 µl Lysis Solution RL (Analytik Jena) versetzt und das Pellet durch mehrmaliges Pipettieren aufgelöst und in ein neues 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt. Nach der Lyse der Sediment-Probe wurde diese für 2 Minuten bei 12.000 rpm zentrifugiert und der Überstand dann zur bereits unter Lysis Solution RL vorliegenden Probe aus der Flüssig-Phase zugegeben. Damit sind beide Proben für die weitere Bearbeitung zusammengeführt. Nach Zugabe von Proteinase K wurde diese Probe bei 60°C für weitere 15 Minuten inkubiert. Zur Probe wurden 50 µl einer Magnetpartikel-Lösung und 450 µl Binding Solution SBS (Analytik Jena) gegeben. Der Ansatz wurde kurz gemischt und für 2 Minuten inkubiert. Nachfolgend erfolgte die Separation der Magnetpartikel mittels eines Magneten. Der Überstand wurde entfernt und die Magnetpartikel wurden mit 1 ml eines Waschpuffers (Washing Solution HS; Analytik Jena) gewaschen. Nach erneuter Separation der Magnetpartikel wurde der Überstand komplett entfernt und die Magnetpartikel weitere zwei Mal mit 80%igem Ethanol gewaschen. Nachfolgend wurde das Reaktionsgefäß mit geöffnetem Deckel in einem Thermomixer bei 50°C für 10 Minuten inkubiert. Die Elution erfolgte durch die Zugabe von 50 µl RNAse freiem Wasser und einer Inkubation bei 60°C für 5 Minuten. Nach Separation der Magnetpartikel wurde der Überstand entfernt und in ein neues Gefäß überführt. Das Gefäß enthält jetzt sowohl Nukleinsäure aus dem Sediment als auch aus der Flüssig-Phase.
  • Um zu prüfen, in welcher der Fraktionen (Sediment und Flüssig-Phase) sich die Bakterien und die freie Bakteriophagen RNA befanden, wurden die erhaltenen Nukleinsäuren jeder durchgeführten Extraktionsvariante mittels Real Time PCR getestet. Dabei erfolgt der Nachweis der Salmonellen DNA und der Bakteriophagen RNA mit jeweils dafür spezifischen Assays. Die CT-Werte nach Real Time PCR sind nachfolgend in der Tabelle aufgeführt. Tabelle 1:
    Probe Salmonellen Bakteriophagen RNA
    Probe 1 (Sediment) 19,5 27,5
    Probe 2 (Sediment) 19,5 27,6
    Probe 1 (Flüssig-Phase) nicht nachweisbar 26,0
    Probe 2 (Flüssig-Phase) nicht nachweisbar 25,9
    Probe 3 (Sediment+Flüssig-Phase) 19,5 25,4
    Probe 4 (Sediment+Flüssig-Phase) 19,6 25,2
  • Die Daten bestätigen die vorangegangene Annahme, dass sich die Bakterien im Sediment befinden und das sich die freie Bakteriophagen-RNA vorrangig in der Flüssig-Phase, aber auch mit Anteilen im Sediment befindet (ca. 70% in der Flüssig-Phase und 30 % im Sediment).
  • Die Ergebnisse zeigen eindrucksvoll, dass mit nur einer Fraktion für die Extraktion der Nukleinsäuren aus den Bakterien bzw. der freien Bakteriophagen-RNA keine Nukleinsäure gewonnen würde bzw. die Ausbeute nicht ausreichend wäre. Das Verfahren der simultanen Isolierung erfasst alle zu isolierenden Targets einfach und schnell und erlaubt damit die Gewinnung der maximalen Ausbeute an Nukleinsäure.
  • Ausführungsbeispiel 2: Simultane Extraktion von Nukleinsäuren von in einer Wasserprobe enthaltenen Bakterien sowie freier Bakteriophagen RNA und freier Plasmid DNA
  • Als Ausgangsproben wurde stark verschmutztes Wasser aus einem Feuerlöschteich genommenen. Den Proben wurden Bakterien (Salmonellen), synthetische Plasmid DNA und Bakteriophagen RNA (MS2-RNA) zugesetzt.
  • Für die Nukleinsäureextraktion wurden die Proben in eine Sediment-Fraktion und eine Flüssig-Phase getrennt. Es wurden immer 20 ml der Ausgangsprobe eingesetzt. Es ist davon auszugehen, dass sich die Bakterien im Sediment und die freie RNA und die freie Plasmid DNA als nichtsedimentierbare Biomoleküle in der Flüssig-Phase befinden, ggf. aber auch noch ein Anteil der freien Nukleinsäure sich an Schwebstoffe der Probe bindet und damit Teil des Sedimentes ist. Ziel ist es, sowohl die bakterielle Nukleinsäure als auch die freien Nukleinsäuren einfach und schnell zu isolieren. In diesem Ausführungsbeispiel erfolgt die Bindung der Nukleinsäuren nicht an magnetische Partikel, sondern an einen Spin Filter mit einer Glasfasermembran.
  • Die Extraktion wurde gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie folgt durchgeführt. 20 ml der Probe wurden in einem 50 ml Reaktionsgefäß für 20 min bei 5.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und davon 10 ml in ein neues Gefäß überführt.
  • Das nach Zentrifugation erhaltene Sediment-Pellet wurde in 250 µl 1 PBS Puffer resuspendiert und nach Zugabe von 10 ml Lysozym für 30 min bei 37°C inkubiert. Während der Inkubationszeit wurde zu den 10 ml aus der Flüssig-Phase 100 µl Alginatlösung und 100 µl Kalziumchlorid gegeben. Der Ansatz wurde kurz geschüttelt, für 10 Minuten inkubiert und nachfolgend bei 5.000 rpm für 20 min zentrifugiert. Nach dieser Zentrifugation wurde der Überstand entfernt, das Pellet mit 300 µl Lysis Solution RL (Analytik Jena) versetzt, durch mehrmaliges Pipettieren aufgelöst und in ein neues 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt. Nach der Lyse der Sediment-Probe wurde diese für 2 Minuten bei 12.000 rpm zentrifugiert und der Überstand dann zur bereits unter Lysis Solution RL vorliegenden Probe aus der Flüssig-Phase zugegeben. Damit sind beide Proben für die weitere Bearbeitung zusammengeführt. Nach Zugabe von Proteinase K wurde diese Probe bei 60°C für weitere 15 Minuten inkubiert. Zur Probe wurden 450 µl Binding Solution SBS (Analytik Jena) gegeben. Der Ansatz wurde kurz gemischt, auf eine Spin Filter Säule gegeben und für 1 Minute bei 11.000 x g zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen. Die Spin Filter Säule wurde nachfolgend jeweils zweimal mit 600 µl eines Waschpuffers (Washing Solution HS; Analytik Jena) bzw. zweimal mit 80 %igem Ethanol gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde die Spin Filter Säule für 3 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert und nachfolgend die Spin Filter Säule in eine leeres Reaktionsgefäß gesteckt. Auf die Spin Filter Säule wurden dann 100 µl RNAse- freies Wasser gegeben und nachfolgend für eine Minute bei 11.000 x g zentrifugiert. Das Gefäß enthält jetzt sowohl Nukleinsäure aus dem Sediment als auch aus der Flüssig-Phase. Aus beiden Fraktionen konnten gemäß der Erfindung einfach und schnell die vermuteten Nukleinsäuren isoliert werden.
  • Der Nachweis der isolierten bakteriellen DNA, der Plasmid DNA und der Bakteriophagen-RNA erfolgte mittels Real Time PCR. Die CT-Werte nach Real Time PCR sind nachfolgend in der Tabelle aufgeführt. Tabelle 2:
    Probe Salmonellen Bakteriophagen RNA Plasmid-DNA
    Probe 1 (Sediment+Flüssig-Phase) 25,0 22,5 24,5
    Probe 2 (Sediment+Flüssig-Phase) 24,8 22,2 24,4
  • Ausführungsbeispiel 3: Simultane Extraktion von Nukleinsäuren von in einer Wasserprobe enthaltenen Bakterien sowie freier Bakteriophagen RNA und freier Plasmid DNA ohne vorherige Trennung von Sediment und Flüssigkeits-Phase
  • Als Ausgangsproben wurde stark verschmutztes Wasser aus einem Feuerlöschteich genommenen. Den Proben wurden Bakterien (Salmonellen), synthetische Plasmid DNA und Bakteriophagen RNA (MS2-RNA) zugesetzt.
  • Es wurden 10 ml probe eingesetzt. Die Probe wurde in ein 15ml Reaktionsgefäß überführt und mit 100 µl Alginatlösung und 100 µl Kalziumchlorid gegeben. Der Ansatz wurde kurz geschüttelt, für 10 Minuten inkubiert und nachfolgend bei 5.000 rpm für 20 min zentrifugiert. Nach dieser Zentrifugation wurde der Überstand entfernt, das Pellet mit 500 µl Lysis Solution RL (Analytik Jena) versetzt, durch mehrmaliges Pipettieren aufgelöst und in ein neues 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 20 µl einer Proteinase K-Lösung versetzt. Nach Inkubation bei 60°C für 20 Minuten wurde der Ansatz für 3 Minuten bei 14.000 rpm zentrifugiert und der Überstand in ein neues 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt. Der Probe wurde dann 200 µl eines Bindungspuffers (Binding Solution SBS; Analytik Jena) zugegeben. Der Ansatz wurde kurz gemischt, auf eine Spin Filter Säule gegeben und für 1 Minute bei 11.000 x g zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen. Die Spin Filter Säule wurde nachfolgend jeweils zweimal mit 600 µl eines Waschpuffers (Washing Solution HS; Analytik Jena) bzw. zweimal mit 80 %igem Ethanol gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde die Spin Filter Säule für 3 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert und nachfolgend die Spin Filter Säule in eine leeres Reaktionsgefäß gesteckt. Auf die Spin Filter Säule wurden dann 100 µl RNAse-freies Wasser gegeben und nachfolgend für eine Minute bei 11.000 x g zentrifugiert. Das Gefäß enthält jetzt sowohl Nukleinsäure aus dem Sediment als auch aus der Flüssig-Phase. Aus beiden Fraktionen konnten gemäß der Erfindung einfach und schnell die vermuteten Nukleinsäuren isoliert werden, ohne die beiden Fraktionen vorher getrennt zu haben.
  • Der Nachweis der isolierten bakteriellen DNA, der Plasmid DNA und der Bakteriophagen-RNA erfolgte mittels Real Time PCR. Die CT-Werte nach Real Time PCR sind nachfolgend in der Tabelle aufgeführt. Tabelle 3:
    Probe Salmonellen Bakteriophagen RNA Plasmid-DNA
    Probe 1 (Sediment+Flüssig-Phase; ohne Separierung) 23,7 25,5 26,5
    Probe 2 (Sediment+Flüssig-Phase; ohne Separierung) 23,8 26,2 27,3
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • DE 19856415 C2 [0005]
    • DE 102008023297 [0009]
    • WO 2016/169677 [0020]

Claims (7)

  1. Verfahren zur simultanen oder parallel simultanen Isolierung von Nukleinsäuren aus einem Gemisch sedimentierbarer und nicht-sedimentierbarer Biomoleküle in Wasserproben, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Trennen der Probe in eine Sediment-Fraktion und eine Flüssig-Phase b) Anreicherung der nicht-sedimentierbaren Biomoleküle der Flüssig-Phase in einem Pellet durch Zugabe eines Polysaccharid-Derivats c) Auflösen des Pellets durch Zugabe eines Lysepuffers d) Lyse der Sediment-Fraktion und Überführung der lysierten Bestandteile in eine weitere flüssige Phase e) entweder Zusammenführung beider flüssiger Phasen und Anbindung der Nukleinsäuren an eine feste Phase oder separate Anbindung der Nukleinsäuren der beiden flüssigen Phasen sowie deren Reinigung und Eluierung nach bekannten Methoden.
  2. Verfahren zur simultanen Isolierung von Nukleinsäuren aus einem Gemisch sedimentierbarer und nicht-sedimentierbarer Biomoleküle in Wasserproben, gekennzeichnet durch folgende Schritte: d) Anreicherung der nicht-sedimentierbaren Biomoleküle der Flüssig-Phase in einem Pellet durch Zugabe eines Polysaccharid-Derivats, ohne das Sediment abzutrennen e) Auflösen des Pellets durch Zugabe eines Lysepuffers und gleichzeitige Lyse der Sediment-Fraktion und Überführung der lysierten Bestandteile in eine weitere flüssige Phase f) Anbindung der Nukleinsäuren dieser flüssigen Phase an eine feste Phase und deren Reinigung und Eluierung nach bekannten Methoden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Polysaccharid-Derivat Alginate eingesetzt werden.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Wasserprobe oder der Flüssig-Phase ein Salz eines zweifach-positiv geladenen Kations, vorzugsweise ein Kalziumsalz, zugesetzt wird.
  5. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Bestimmung des Gesamtgehalts an Nukleinsäuren aus einem Gemisch sedimentierbarer und nicht-sedimentierbarer Biomoleküle in Wasserproben.
  6. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 oder 3 und 4 zur Bestimmung des Gehalts an Nukleinsäuren der sedimentierbaren Bestandteile aus einem Gemisch sedimentierbarer und nicht-sedimentierbarer Biomoleküle in Wasserproben.
  7. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 oder 3 und 4 zur Bestimmung des Gehalts an Nukleinsäuren der nicht-sedimentierbaren Bestandteile aus einem Gemisch sedimentierbarer und nicht-sedimentierbarer Biomoleküle in Wasserproben.
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