CN112569902B - 一种可富集及固定蛋白质的复合材料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可富集及固定蛋白质的复合材料及其制备方法与应用，该复合材料包括羧基化四氧化三铁磁性纳米球，所述羧基化四氧化三铁磁性纳米球修饰在具有带褶皱的片状结构的双金属磷酸水合物表面。本方明还公开了一种可富集及固定蛋白质的复合材料的制备方法，其先获得羧基化四氧化三铁磁性纳米球；后将步骤S1获得的四氧化三铁磁性纳米球与所述ZnxZr(PO4)2·yH2O混合得到所述复合材料。本发明提供的复合材料可实现多种蛋白质的高效富集和固定，且固定氧化酶蛋白后可显著提升氧化酶蛋白的反应活性，减少酶的用量。

Description

一种可富集及固定蛋白质的复合材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及纳米材料制备与应用技术领域，尤其是一种可富集及固定蛋白质的复合材料及其制备方法与应用。
背景技术
随着多种多样的生物样品研究不断深入，多种仪器发展及检测技术手段的提升已经不能满足复杂样品的处理及其中多种丰度蛋白质的选择性分离分析。因此采取有效的前处理方法并且结合恰当的样品前处理材料对蛋白质有效的预先分离富集至关重要。而目前新型纳米材料吸附剂研究是样品前处理领域研究的重中之重，纳米材料具有体积效应、表面效应、介电限域及量子尺寸效应，因此也赋予了其磁性、热敏性、化学活性、光吸收性及催化性能等多种不同特性。功能化磁性纳米材料以其具有的永久磁性、特殊的表面效应及易修饰特性，逐渐发展成为较为新型的纳米材料。
由于Fe3O4磁性纳米颗粒具有诸如超顺磁性、低毒性、高表面积、大比表面积和在外部磁场条件下容易分离的特点，可以将不同类型的生物分子，如蛋白质、多肽、酶、抗体和抗癌剂固定在这些纳米颗粒上。但是Fe3O4磁性纳米材料易被氧化、易团聚、稳定性差不宜长时间存放，与石墨烯和介孔碳材料相比，Fe3O4磁性纳米材料有效的表面积及作用位点相对较少，对有效吸附及富集蛋白质功能等起到极大的影响。
因此在实际应用中需对Fe3O4磁性纳米材料进行有效功能化修饰、复合，等以得到复合材料，以提高Fe3O4磁性纳米材料的稳定性并且减少材料的漏磁现象，同时也可增强材料的多功能性。但是现有技术中存在Fe3O4磁性纳米功能化修饰/复合材料不能对多种不同蛋白质进行富集或者富集能力差；氧化酶蛋白在催化反应中活性弱及所需酶体量大的技术问题。
发明内容
为了解决现有的Fe3O4磁性纳米功能化修饰/复合材料不能对多种不同蛋白质进行富集或者富集能力差；氧化酶蛋白在催化反应中活性弱及所需酶体量大的技术问题，本发明提供了一种可富集及固定蛋白质的复合材料，该复合材料通过将羧基化四氧化三铁磁性纳米球修饰在具有带褶皱的片状结构的双金属磷酸水合物化合物上，可达到对特定环境下多种蛋白质的高效富集和固定，且固定氧化酶蛋白后可显著提升氧化酶蛋白的反应活性，减少酶的用量。
为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：
一种可富集及固定蛋白质的复合材料，其包括羧基化四氧化三铁磁性纳米球，所述羧基化四氧化三铁磁性纳米球修饰在具有带褶皱的片状结构的双金属磷酸水合物表面。
进一步地，所述双金属磷酸水合物为ZnxZr(PO4)2·yH2O，其中，0＜x＜1，0＜y＜5，所述ZnxZr(PO4)2·yH2O由多种不同的锌锆磷酸水合物组成。
进一步地，所述羧基化四氧化三铁磁性纳米球的直径为150-200nm，其外部修饰有羧基亲水性基团。
本发明还提供了上述可富集及固定蛋白质的复合材料的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1：获得羧基化四氧化三铁磁性纳米球；
S2：将步骤S1获得的四氧化三铁磁性纳米球通过水热法与ZnxZr(PO4)2·yH2O混合得到所述复合材料。其中，羧基化四氧化三铁纳米球与ZnxZr(PO4)2·yH2O混合的重量比为：羧基化四氧化三铁纳米球∶ZnxZr(PO4)2·yH2O＝0.01-1∶0.1-2。
进一步地，所述步骤S1中，获得羧基化四氧化三铁磁性纳米球的方法包括：将金属源、还原剂、稳定剂混合均匀后，加入到第一溶剂中形成第一前驱体溶液；将所述第一前驱体溶液经加热回流后置于聚四氟乙烯反应釜中进行水热反应，反应结束后，采用乙醇水洗涤，再真空干燥，即得所述羧基化四氧化三铁磁性纳米球。
更进一步地，所述第一溶剂为乙二醇，所述金属源为六水合三氯化铁，所述稳定剂为柠檬酸三钠，所述的还原剂为醋酸铵。
进一步地，所述步骤S2包括：将硝酸锆、氯化锌加入到第二溶剂中，然后加入氨水及步骤S1中获得的羧基化Fe3O4磁性纳米球，超声处理后进行搅拌，获得第二前驱体溶液；向所述第二前驱体溶液中加入磷酸氢二铵及柠檬酸三钠，搅拌后置于聚四氟乙烯反应釜中进行水热反应，反应结束后，采用水和乙醇洗涤，再真空干燥，即得所述复合材料。
更进一步地，所述步骤S2中，所述第二溶剂为N，N-二甲基甲酰胺；或/和，所述步骤S2中，按照重量比计，羧基化Fe3O4磁性纳米球∶硝酸锆∶氯化锌＝0.01-1∶0.2-0.8∶0.1-0.5；或/和，所述步骤S2中，磷酸氢二铵和柠檬酸三钠的重量比为0.1-1.0∶0.1-0.5；或/和，所述步骤S2中，超声处理的时间为3-10min，或/和，所述步骤S2中，真空干燥的温度为50-90℃，时间为0.5-2h。
本发明还提供了上述可富集及固定蛋白质的复合材料的一种应用，用于多种不同蛋白质的富集及固定，或/和，用于固定氧化酶蛋白，提高酶催化反应中氧化酶蛋白的反应活性。具体的应用方法可以是，将所述可富集及固定蛋白质的复合材料制成分散液并进行固相萃取用于蛋白质富集及固定；在特定pH环境下，进行多种不同蛋白的吸附；固定相应的氧化酶蛋白，进行相应的四甲基联苯胺(TMB)氧化反应(可以对该反应进行速度及效率考察，从而可以根据检测到的紫外光强度得到反应增强倍数特性)。
本发明还提供了上述可富集及固定蛋白质的复合材料的又一种应用，用于制备磁性薄膜纳米材料。该薄膜具有磁性特性，可以在特定的pH环境下进行多种不同蛋白质的富集，并且在进行氧化酶蛋白的固定后会极大的提升氧化酶蛋白的反应活性及反应效率。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明提供的复合材料通过将羧基化四氧化三铁磁性纳米球修饰在具有带褶皱的片状结构的双金属磷酸水合物上，有效的提升了材料的有效吸附面积、稳定性及可应用范围，并且结合ZnxZr(PO4)2·yH2O的多离子特性及离子交换特性，进一步提高了材料的离子特性，实现多种不同蛋白质的特定富集特性及对于氧化酶反应的快速增强特性，最终可达到对特定环境下多种蛋白质的高效富集以及固定，且固定氧化酶蛋白后可显著提升氧化酶蛋白的反应活性，减少酶的用量，缩短反应时间；
2、本发明通过将羧基化四氧化三铁磁性纳米球和ZnxZr(PO4)2·yH2O混合制得所述复合材料，方法简单，易操作，利于商业推广，复合材料可重复回收利用，经济适用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。
图1：本发明一个实施例提供的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料的褶皱状结构的透射电镜图
图2：本发明一个实施例提供的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料的扫描电镜图；
图3：本发明一个实施例提供的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料的原子力显微镜电镜图；
图4：本发明一个实施例提供的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料的薄层厚度表征图；
图5：本发明一个实施例提供的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料的XRD表征图；
图6：本发明一个实施例提供的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料的蛋白质吸附效率情况图；
图7：本发明一个实施例提供的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料的蛋白质吸附容量情况图；
图8：本发明一个实施例提供的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料的反应催化效果情况示意图。
具体实施方式
现有技术中存在Fe3O4磁性纳米功能化修饰/复合材料不能对多种不同蛋白质进行富集或者富集能力差；氧化酶蛋白在催化反应中活性弱及所需酶体量大的技术问题。所以本发明提出新的方案，为更加清楚的表示，下面结合具体实施例和附图对本发明做详细的说明。需要说明的是，如无特别指出，本发明中采用的术语具有本领域所公知的定义和含义。
本发明提供的可富集及固定蛋白质的复合材料，包括羧基化四氧化三铁磁性纳米球，所述羧基化四氧化三铁磁性纳米球修饰在具有带褶皱的片状结构的双金属磷酸水合物表面。
其中，所述双金属磷酸水合物优选为ZnxZr(PO4)2·yH2O，其中，0＜x＜1，0＜y＜5，所述ZnxZr(PO4)2·yH2O为带褶皱的片状结构并且由多种不同的锌锆磷酸水合物组成。所述复合材料也即Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料，其中，羧基化四氧化三铁纳米球与ZnxZr(PO4)2·yH2O的重量比为：羧基化四氧化三铁纳米球∶ZnxZr(PO4)2·yH2O＝0.01-1∶0.1-2。
所述羧基化四氧化三铁磁性纳米球可以自制，也可以采用商品化产品。所述羧基化四氧化三铁磁性纳米球直径为150-200nm，优选为150-180nm。所述羧基化四氧化三铁磁性纳米球的制备方法优选为：将金属源、还原剂及稳定剂，加入第一溶剂，超声搅拌得到第一前驱液(第一前驱液呈乳液形式)；将所述第一前驱液置于一定温度的油浴中反应一定时间后置于聚四氟乙烯反应釜中，进行水热反应后，采用乙醇水洗涤，再真空干燥，获得羧基化的四氧化三铁磁性纳米球(即四氧化三铁磁性纳米球外部/表面修饰有羧基亲水性基团)。优选地，所述第一溶剂为乙二醇，所述金属源为六水合三氯化铁(FeCl3·6H2O)，所述稳定剂为柠檬酸三钠(NaCit3)，所述还原剂为醋酸铵(NH4Ac)。优选地，各物质的加量比例(按重量份计)为：六水合三氯化铁∶柠檬酸三钠∶醋酸铵＝0.5-2∶0.1-0.5∶1.0-5.0，当三氯化铁、柠檬酸三钠、醋酸铵的用量分别为0.5-2g，0.1-0.5g，和1.0-5.0g时，乙二醇的加入量为10-100mL。进一步优选为，六水合三氯化铁∶乙二醇∶柠檬酸三钠∶醋酸铵的用量＝0.6-1.5g∶20-90mL∶0.15-0.4g∶1.5-4.0g，更进一步优选为六水合三氯化铁∶乙二醇∶柠檬酸三钠∶醋酸铵的用量＝0.8-1.4g∶30-80mL∶0.2-0.3g∶2.0-4.0g。可选地，上述羧基化四氧化三铁磁性纳米球的制备过程中，超声处理的时间为3-10min，真空干燥的温度为50-90℃，时间为0.5-2h。
将所述羧基化四氧化三铁磁性纳米球与ZnxZr(PO4)2·yH2O混合即可得到所述Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料，具体的过程可以如下：
将硝酸锆(Zr(NO3)2)、氯化锌(ZnCl2)加入到第二溶剂中，然后加入氨水和羧基化Fe3O4磁性纳米球，超声处理后进行机械搅拌，获得第二前驱体溶液；向所述第二前驱体溶液中加入磷酸氢二铵((NH4)HPO4)及柠檬酸三钠(NaCit3)，搅拌后置于聚四氟乙烯反应釜中进行水热反应，反应结束后，采用水和乙醇洗涤，再真空干燥，即得所述复合材料。可选地，该第二溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；各物质加量比例为：羧基化Fe3O4磁性纳米球∶Zr(NO3)2∶ZnCl2∶N,N-二甲基甲酰胺∶(NH4)HPO4∶NaCit3＝(0.01-1)g∶(0.2-0.8)g∶(0.1-0.5)g∶(50-100)mL∶(0.1-1.0)g∶(0.1-0.5)g；超声处理的时间为3-10min，真空干燥的温度为50-90℃，时间为0.5-2h。优选地，各物质加量比例为：羧基化Fe3O4磁性纳米球∶Zr(NO3)2∶ZnCl2∶N,N-二甲基甲酰胺∶(NH4)HPO4∶NaCit3＝(0.02-0.3)g∶(0.3-0.75)g∶(0.15-0.45)g∶(55-95)mL∶(0.15-0.95)g∶(0.2-0.4)g。更为优选地，各物质加量比例为：羧基化Fe3O4磁性纳米球∶Zr(NO3)2∶ZnCl2∶N,N-二甲基甲酰胺∶(NH4)HPO4∶NaCit3＝(0.05-0.2)g∶(0.4-0.7)g∶(0.22-0.38)g∶(60-85)mL∶(0.36-0.90)g∶(0.22-0.35)g。
由于双金属的磷酸水合物是一种新型的片状材料，其表面具有较高程度的离子化特性且具有较多的电荷特性，因此赋予了其较强的离子交换特性以及可与多物质多作用的特性。另外结合双金属磷酸水合物自身的带褶皱片状结构使得其有效的吸附位点及吸附明显增加，同时离子交换特性强也可极大的增加材料本身的静电转移特性，为其提供催化反应性能及活性以及多吸附能力提供了极大的益处。
本发明通过将羧基化四氧化三铁磁性纳米球修饰在具有带褶皱的片状结构的ZnxZr(PO4)2·yH2O化合物上得到复合材料，有效的提升了材料的有效吸附面积、稳定性及可应用范围，并且结合ZnxZr(PO4)2·yH2O的多离子特性及离子交换特性，进一步提高了材料的离子特性，实现多种不同蛋白质的特定富集特性及对于氧化酶反应的快速增强特性，最终可达到对特定环境下多种蛋白质的高效富集；固定氧化酶蛋白后极大地提升氧化酶蛋白的反应活性，减少酶的用量等效果。
另外，由于本发明提供的复合材料包含羧基化四氧化三铁磁性纳米球，所以具有磁性特性，可以在磁铁作用下进行回收。
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。
实施例1
羧基化四氧化三铁磁性纳米球的合成：
准确称取金属源六水合三氯化铁1.350g于洁净的烧杯中而后加入溶剂乙二醇70mL后，室温下磁力搅拌(850rpm)至六水合三氯化铁全部溶解。然后加入稳定剂柠檬酸三钠0.24g及还原剂醋酸铵3.85g，盖上保鲜膜室温下继续搅拌20分钟后得到乳液。将上述乳液置于140℃的油浴中反应一定1h后，转移至聚四氟乙烯反应釜中，水热反应16h后，采用乙醇水洗涤并且真空干燥，获得羧基化四氧化三铁磁性纳米球。
实施例2
可富集及固定蛋白质的复合材料的制备：
准确称取硝酸锆0.6435g、氯化锌0.24g加入到N,N-二甲基甲酰胺中，超声搅拌溶解，并加入氨水2mL以及获得的羧基化Fe3O4磁性纳米球0.1g，超声处理后进行机械搅拌1h，获得第二前驱体溶液。而后称取磷酸氢二铵0.9g及柠檬酸三钠0.24g后加入所述第二前驱体溶液中得到反应体系，将该反应体系在室温下搅拌10min后，再将该反应体系(溶液)置于聚四氟乙烯反应釜中，水热反应180℃下24小时后，将所得材料采用磁性分离并且利用水和乙醇洗涤，后进行真空干燥60℃干燥处理2h，得到所述可富集及固定蛋白质的复合材料。
实施例3
蛋白质富集及固定方法：
称取20mg Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O于2mL水中制备形成10mg/mL的分散液，超声震荡，形成均匀分散的混合溶液，而后取100μL该混合液置于离心管中，磁分散除去其中的水溶液后，向其中分别加入多种不同蛋白质溶液(包括人体血清免疫球蛋白Ig-G、鸡卵清白蛋白Ova、转铁蛋白Trf、牛血清白蛋白BSA、血红蛋白Hb、肌红蛋白Mb、细胞色素c(cyt-c)、乳铁蛋白Lf、人白蛋白HRP、溶菌酶Lyz溶液)后，在室温下震荡10min，促进蛋白吸附在复合材料表面达到富集效果。向其中加入16μg/mL的细胞色素c(cyt-c)溶液，在室温下震荡10min促进细胞色素c固定在复合材料表面，形成可固定蛋白的溶液。
实验1：
为了观察羧基化四氧化三铁磁性纳米球及经过水热反应合成的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料的形貌结构变化情况，对Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料形貌分别进行了表征。
从图1的透射电镜表征可以看出，Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料具有明显的褶皱状结构并且为明显的片状材料，而且羧基化Fe3O4纳米球成功的镶嵌在片状材料的褶皱表面，为复合材料提供了较好的磁性特性，且复合材料的整体特性仍为带褶皱的片状结构，复合材料整体也具有较完整的片状结构特性以及较大的比表面积结构因此可用于蛋白质的富集及固定。
为了进一步对Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料的形貌进行验证，对复合材料进一步进行了相应的扫描电镜表征及原子力显微镜情况表征，如图2、图3所示，由图2中的扫描电镜表征可以发现，所合成的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料也具有褶皱状结构，并且Fe3O4纳米球也是固定在褶皱状结构表面，从而形成了类似于渔网式的结构特性。并且如图3所做的原子力显微镜情况表征也可以发现，所合成的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料为明显的片状结构，并且其中纳米球镶嵌在其中。且如图4所做的原子力显微镜厚度情况表征也可以发现，所合成的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料的片状厚度大致在0.85nm左右，且为均匀的片状结构。需要说明的是，图1、图2、图3及图4中复合材料为采用实施例1及实施例2中方法制备得到。
实验2：
为了确定经过水热反应合成的Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O复合材料的具体材料组成，因此对复合材料的晶型情况进行了XRD表征，结果如图5所示。并且根据多种不同标准卡片进行对比可以发现所合成的片状材料为具有复合晶型结构的纳米材料，并且主要是由含有锌锆双金属的磷酸水合物材料。需要说明的是，图5中复合材料为采用实施例1及实施例2中方法制备得到。
实验3：
为了考察本发明提供的复合材料的最佳吸附选择性性能及对不同种蛋白质的富集能力，对复合材料Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O的不同种蛋白质的吸附选择性情况及吸附容量情况进行了考察。
蛋白富集及固定效率情况的测定方法：称取20mg Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O于2mL水中制备形成10mg/mL分散液，超声震荡，形成均匀分散的混合溶液，而后取100μL该混合液置于离心管中，磁分散除去其中的水溶液后，向其中分别加入多种不同浓度的蛋白质溶液后，在室温下震荡10min，促进蛋白吸附在复合材料表面达到富集效果。并通过紫外可见吸收光谱考察复合材料的有效吸附容量。
实验结果如图6和图7所示，复合材料Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O在pH为6-7的吸附环境下对多种不同蛋白质的吸附效率均接近100％，并且对不同蛋白质的吸附容量可达到750mg/g-1400mg/g左右。上述的吸附情况证实了本发明提供的复合材料可实现对多种不同蛋白质的吸附及富集。需要说明的是，图6和图7中复合材料为采用实施例1及实施例2中方法制备得到。
实验4：
为了考察本发明提供的复合材料在最佳吸附性能且在固定特定蛋白条件下的有效固定化及催化反应效率问题，对复合材料Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O在固定细胞色素c及催化TMB的氧化反应进行了考察。需要说明的是，此处进行考察的复合材料是否也是通过实施例1和2结合制备出的。
具体的考察方法为：称取20mg Fe3O4@ZnxZr(PO4)2·yH2O于2mL水中制备形成10mg/mL分散液，超声震荡，形成均匀分散的混合溶液，取100μL该混合液置于离心管中，磁分散除去其中的水溶液后，向其中加入16μg/mL的细胞色素c溶液，在室温下震荡10min促进细胞色素c固定在材料表面，形成可固定蛋白的溶液。后通过负载细胞色素c的复合材料与TMB的氧化反应进行酶氧化反应效果提升测试，并调整所用复合材料与细胞色素c的比例(溶液体积比)进行相应的反应体系效率考察，根据检测到的紫外光强度可以得到反应增强倍数。
实验结果如图8所示，在不同的材料及细胞色素c比例下，体系的催化反应会有明显的提供，并且在80∶1的材料蛋白质比条件下可使催化效率得到最大提升。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种可富集及固定蛋白质的复合材料，其特征在于：包括羧基化四氧化三铁磁性纳米球，所述羧基化四氧化三铁磁性纳米球修饰在具有带褶皱的片状结构的双金属磷酸水合物表面；所述双金属磷酸水合物为ZnxZr(PO4)2·yH2O，其中，0＜x＜1，0＜y＜5，所述ZnxZr(PO4)2·yH2O由多种不同的锌锆磷酸水合物组成。
2.根据权利要求1所述的可富集及固定蛋白质的复合材料，其特征在于：所述羧基化四氧化三铁磁性纳米球的直径为150-200nm，其外部修饰有羧基亲水性基团。
3.一种如权利要求1或2所述的可富集及固定蛋白质的复合材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：获得羧基化四氧化三铁磁性纳米球；
S2：将步骤S1获得的四氧化三铁磁性纳米球与所述ZnxZr(PO4)2·yH2O混合得到所述复合材料。
4.根据权利要求3所述的可富集及固定蛋白质的复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，获得羧基化四氧化三铁磁性纳米球的方法包括：将金属源、还原剂、稳定剂混合均匀后，加入到第一溶剂中形成第一前驱体溶液；将所述第一前驱体溶液经加热回流后置于聚四氟乙烯反应釜中进行水热反应，反应结束后，采用乙醇水洗涤，再真空干燥，即得所述羧基化四氧化三铁磁性纳米球。
5.根据权利要求4所述的可富集及固定蛋白质的复合材料的制备方法，其特征在于：所述第一溶剂为乙二醇，所述金属源为六水合三氯化铁，所述稳定剂为柠檬酸三钠，所述的还原剂为醋酸铵。
6.根据权利要求3所述的可富集及固定蛋白质的复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤S2包括：将硝酸锆、氯化锌加入到第二溶剂中，然后加入氨水及步骤S1中获得的羧基化四氧化三铁磁性纳米球，超声处理后进行搅拌，获得第二前驱体溶液；向所述第二前驱体溶液中加入磷酸氢二铵及柠檬酸三钠，搅拌后置于聚四氟乙烯反应釜中进行水热反应，反应结束后，采用水和乙醇洗涤，再真空干燥，即得所述复合材料。
7.根据权利要求6所述的可富集及固定蛋白质的复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述第二溶剂为N，N-二甲基甲酰胺；或/和，所述步骤S2中，按照重量比计，羧基化四氧化三铁磁性纳米球∶硝酸锆∶氯化锌＝0.01-1∶0.2-0.8∶0.1-0.5；或/和，所述步骤S2中，磷酸氢二铵和柠檬酸三钠的重量比为0.1-1.0∶0.1-0.5；或/和，所述步骤S2中，超声处理的时间为3-10min，或/和，所述步骤S2中，真空干燥的温度为50-90℃，时间为0.5-2h。
8.根据权利要求1或2所述的可富集及固定蛋白质的复合材料的应用，其特征在于：用于多种不同蛋白质的富集及固定，或/和，用于固定氧化酶蛋白，提高酶催化反应中氧化酶蛋白的反应活性。
9.根据权利要求1或2所述的可富集及固定蛋白质的复合材料的应用，其特征在于：用于制备磁性薄膜纳米材料。
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