CN109652401A - 一种磁性脂肪酶纳米花催化材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种磁性脂肪酶纳米花催化材料及其制备方法和应用，属于酶固定化领域。一种磁性脂肪酶纳米花催化材料的制备方法，其特征在于：该方法是将硅基磁性Fe3O4纳米粒子分散到脂肪酶溶液中，再向其内滴加金属阳离子无机盐溶液，得到磁性脂肪酶纳米花，所述硅基磁性Fe3O4纳米粒子为经硅烷偶联剂处理的Fe3O4纳米粒子。本发明所得催化材料将脂肪酶‑无机杂化纳米花和磁性纳米颗粒二者优异的性能充分的结合在一起，从而在生物催化、生物医药、食品工业等各个领域都将有广泛的应用价值。

Description

一种磁性脂肪酶纳米花催化材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种磁性脂肪酶纳米花催化材料及其制备方法和应用，属于酶固定化领域。
背景技术
脂肪酶是一类可以在水相或有机相体系中催化甘油酯水解反应、酯化反应、转酯化反应的酶类。由于其无毒无害，绿色天然，且具有较好的水溶性、反应专一性、催 化环境温和的优势，使得其在能源、食品、洗涤、制药、纺织及造纸等行业中有着广 泛的应用，因此得到国内外学者密切关注和研究。然而，脂肪酶作为工业催化剂在实 际应用过程中仍存在很多缺陷，在较为严苛的环境下容易出现稳定性降低、酶活力损 失甚至失活的现象，且游离脂肪酶难以实现重复利用，从而极大的限制了其进一步的 工业化应用。为了解决这一难题，酶固定化技术得以提出并发展。
近几年研究显示，国内外部分学者利用自组装的方法在合成具有三维花形结构的有机-无机杂化纳米花上取得了突破性的进展。这种方法把酶作为有机组分，金属离子 作为无机组分，在实现了酶固定化的同时，还很大程度上提高了酶的活性及稳定性， 从而扩大了其在生物催化、生物传感、能源储存、医药食品、蛋白质组学分析等领域 的应用潜力。然而，这种纳米花型催化材料的粒径通常在纳米至微米级别，由于其疏 松多孔的特殊结构机械，强度较低，容易受到外界外力因素的破坏从而导致稳定性降 低，且需要高速离心才能将纳米花进行分离，进一步增加了纳米花的破损，同时提高 生产成本，因此限制了纳米花在工业生产的应用。
近些年来，国内外某些学者通过合成纳米级磁性载体，实现酶的固定化。然而此法虽实现了固定化酶的快速分离，但易于聚集而影响分散性，酶活性损失较为严重。 因此，找寻一种既能提高酶活力，又能实现固定化酶快速分离的方法是极为必要的。 目前脂肪酶作为工业催化剂在实际应用过程中仍存在很多缺陷，且在纳米花固定化后 酶活力虽有提高，但易受外界环境影响出现稳定性降低的现象，且存在难分离的问题， 从而极大地限制了其进一步的工业化应用。
发明内容
因此为了解决上述技术难题，本发明提供了一种复合固定化方法，将脂肪酶-无机杂化纳米花和磁性硅基纳米颗粒二者优异的性能充分的结合在一起，从而得到具有较 高催化活性及具有磁性的磁性纳米花复合型酶催化材料。
本发明的技术方案如下：
一种磁性脂肪酶纳米花催化材料的制备方法，该方法是将硅基磁性Fe3O4纳米粒子分散到脂肪酶溶液中，再向其内滴加金属阳离子无机盐溶液，得到磁性脂肪酶纳米 花，
所述硅基磁性Fe3O4纳米粒子为经硅烷偶联剂处理的Fe3O4纳米粒子。
上述技术方案中，所述金属阳离子选自铜离子，锌离子，钙离子，优选为铜离子；所述无机盐为硝酸盐、氯化盐、硫酸盐。
进一步地，所述金属阳离子无机盐为氯化铜、硝酸铜、硫酸铜中的一种或多种。
进一步地，所述金属阳离子无机盐浓度为120～140mM，最优选为120mM；所述 硅基磁性Fe3O4纳米粒子与金属阳离子无机盐溶液的比例为5mg:150～600μL，优选为 5mg:200～500μL。
进一步的硅基磁性Fe3O4纳米粒子与脂肪酶溶液之间的比例为10mg:30～60mL.
进一步地，所述脂肪酶浓度为0.1～0.5mg/mL，优选为0.25mg/mL。
上述技术方案中，优选所述硅基磁性Fe3O4纳米粒子按下述方法制得：将磁性Fe3O4纳米粒子按1g:60～100mL的比例加入至1～4M的NaOH溶液中，连续搅拌2h， 收集沉淀物并洗涤后干燥；将沉淀物按1g：100mL的比例分散至甲苯中，得分散液； 200r/min搅拌下按0.5～0.9g:100mL的比例向分散液中滴加硅烷偶联剂，升温至100℃ 回流8～12h，收集沉淀物，洗涤干燥，得到磁性硅基纳米颗粒。
进一步地，在上述的技术方案中，可采用至少一种硅烷偶联剂进行硅烷化修饰。所述硅烷偶联剂选自3-氨丙基三甲氧基硅烷(APMS)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES) 和N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅(AEAPS)。优选的，至少一种硅烷偶联剂选 自3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)。
上述技术方案中，优选所述磁性Fe3O4纳米粒子按下述方法制得：将2.2～3.0gFeCl3·6H2O和1.2g柠檬酸三钠溶于80mL乙二醇中，在充分搅拌条件下加入3.12g 乙酸钠，继续搅拌30分钟，倒入反应釜中，200℃下保温12～24小时，收集黑色沉淀 物，用去离子水和乙醇充分洗涤后干燥，得磁性Fe3O4纳米粒子。
进一步地，优选将2.6g FeCl3·6H2O和1.2g柠檬酸三钠溶于80mL乙二醇中。 本发明所述FeCl3·6H2O用于提供铁离子，加入量的多少直接影响产物粒径的大小， 加入量过多粒径增大，容易沉降，加入量过少，粒径减小，磁性减弱。
进一步地，所述保温时间优选为20小时。
上述技术方案中，所述柠檬酸三钠作为表面活性剂，可使反应原料均匀分散，得到的磁性纳米颗粒粒径均一，同时保持完整光滑的球形。所述乙二醇作为反应体系的 溶剂，又是强的还原剂。所述乙酸钠提供碱性环境，用于静电稳定，防止颗粒聚集， 还能协同乙二醇介导还原。
本发明所述磁性脂肪酶纳米花催化材料的制备方法一个优选的技术方案为：所述方法包括如下步骤：
(1)将2.2～3.0g FeCl3·6H2O和1.2g柠檬酸三钠溶于80mL乙二醇中，在充分 搅拌条件下加入3.12g乙酸钠，继续搅拌30分钟，倒入反应釜中，200℃下保温12～24 小时，收集黑色沉淀物，用去离子水和乙醇充分洗涤后干燥，得Fe3O4纳米颗粒；
(2)称取1g步骤(1)中所得的Fe3O4纳米颗粒，加入至80mL 1～4M的NaOH溶 液中，连续搅拌2h，收集沉淀并洗涤后干燥；
(3)取步骤(2)所得沉淀分散至100ml甲苯中，200r/min搅拌下滴加硅烷偶 联剂，升温至100℃回流10h，收集沉淀物，洗涤干燥保存，得到磁性硅基纳米颗粒；
(4)将5～15mg步骤(3)所得磁性硅基纳米颗粒超声分散后加入至用缓冲溶液 配制得到浓度为0.1～0.5mg/mL的脂肪酶溶液45mL中，震荡120min，然后滴加金属 阳离子无机盐溶液；
(5)将(4)所述混合溶液在室温下静置72h，经过外加磁场收集沉淀，洗涤， 再分离，冷冻干燥得到磁性脂肪酶纳米花催化材料。
上述技术方案中，所述步骤(2)中，可以采用至少一种金属离子。所述金属离子 选自铜离子，锌离子，钙离子，优选为铜离子。所述铜离子与溶液中磷酸盐结合形成 的磷酸铜沉淀经过自组装生成规则，均一的花状结构，此结构形态稳定，比表面积大， 酶活力高。所述的无机金属离子溶液中无机金属离子的浓度为100～140mM，优选为 120mM。
上述技术方案中，所述步骤(3)中，将脂肪酶溶液与磁性硅基纳米颗粒振荡2h， 是为了使酶与硅基磁性纳米颗粒充分结合，脂肪酶作为磁性硅基纳米粒子和无机金属 离子的粘合剂，保证了磁性纳米粒子与无机金属离子的有效结合。若先将磁性硅基纳 米颗粒和无机金属离子溶液混合搅拌，无法达到两者结合的效果。
上述技术方案中，所述步骤(3)中，所述的磁性硅基纳米颗粒加入量为5～15mg。加入质量的多少直接影响纳米花的磁性强弱与酶活力。加入量过低，磁性纳米花的磁 性较弱，难以实现快速分离；加入量过高易造成磁性纳米花催化材料的团聚，从而影 响酶与底物的充分接触，进而影响酶催化材料的活性。
上述技术方案中，所述步骤(4)中，所述缓冲溶液为PBS、柠檬酸缓冲溶液、或 硼酸缓冲溶液，所述缓冲溶液pH在5～9之间。
本发明的另一目的是提供上述方法制得的磁性脂肪酶纳米花催化材料。
本发明所述磁性脂肪酶纳米花催化材料由多层片状花瓣结构的三水合磷酸铜作为 骨架，磁性硅基纳米颗粒均匀分散在花瓣表面及花瓣内部。
所述材料由多层片状花瓣结构的三水合磷酸铜作为骨架，硅基磁性纳米颗粒及脂肪酶负载其中，花型结构完整，花瓣间孔径均一，花型表面呈现褶皱状，因此具有较 大的表面积。磁性硅基纳米颗粒均匀分散在花瓣表面及花瓣内部中，既有利于维持花 瓣的完整，又赋予纳米花磁性属性。
本发明的另一目的是提供上述磁性脂肪酶纳米花催化材料在催化生物柴油中油脂转化反应中的应用。
本发明利用磁性硅基纳米颗粒与脂肪酶-无机杂化纳米花共沉淀技术合成复合磁性纳米花催化材料，该材料具有纳米材料比表面积较大的性质，避免了酶分子间的聚 合，从而使固定化后的脂肪酶较游离酶的酶活有一定提高。同时本发明将磁性硅基纳 米颗粒负载到纳米花表面，从而实现外加磁场条件下快速分离固定化酶的技术，并将 其应用于油脂转化的催化反应中。
本发明的有益效果：本发明提供通过共沉淀方法所合成的新型磁性脂肪酶纳米花催化材料。与游离脂肪酶相比，脂肪酶纳米花因其较大的比表面积使酶的催化活性得 以提高，其中负载了磁性硅基纳米颗粒使磁性脂肪酶纳米花能在外加磁场作用下快速 分离，从而使酶的重复利用性更加快捷方便。该材料将脂肪酶-无机杂化纳米花和磁性 纳米颗粒二者优异的性能充分的结合在一起，从而在生物催化、生物医药、食品工业 等各个领域都将有广泛的应用价值。与传统的固定化方法相比，该催化材料能在外加 磁场作用下实现产物与酶的快速分离，省去了高速离心步骤。
附图说明
图1为脂肪酶、四氧化三铁纳米颗粒、三水合磷酸铜、实施例5所得磁性纳米花 的红外光谱图。
图2为脂肪酶、四氧化三铁纳米颗粒、三水合磷酸铜、实施例5所得磁性纳米花 的X射线衍射图。
图3为(a)为实施例5所得四氧化三铁纳米颗粒扫描电镜图(b)为实施例5所 得磁性硅基纳米颗粒扫描电镜图(c)为实施例5所得磁性纳米花扫描电镜图。
图4为实施例5所得磁性纳米花在外加磁场下快速分离示意图；(a)分离前(b) 分离后。
图5为实施例5所得不同金属离子合成的磁性纳米花相对酶活。
图6为实施例5所得磁性纳米花循环利用性图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料， 如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例采用的材料以及脂肪酶酶活测定方法：
1、材料
脂肪酶：洋葱假单胞菌脂肪酶，购自深圳绿维康公司；
FeCl3:购自国药集团化学试剂有限公司。
NaOH：购自天津科密欧试剂公司
甲苯：购自北京试剂厂
硅烷偶联剂：3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，购自阿拉丁试剂公司；
磷酸盐缓冲液(PBS)：0.01M，pH 7.4，按照常规方法制备得到。
2、脂肪酶酶活测定方法：采用比色法，以棕榈酸对硝基苯酯(p-NPP)为底物， 在脂肪酶的水解作用下生成对硝基苯酚(p-NP)，其中p-NP在碱性条件下显出明亮 的黄色，在402nm的波长下有最大吸光值。在一定浓度范围内，体系的吸光度值与 p-NP的浓度呈线性关系。具体操作步骤如下：
(1)对硝基苯酚标准曲线的绘制：利用PBS将p-NP(2mM)分别稀释成0、0.02、 0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2μmol/mL，依次加入4mL底物乳 化液以及5mL反应终止液(Na2CO3水溶液)，以p-NP的浓度为横坐标，OD402nm值 为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)酶活力的测定：分别取四支试管，一支作为空白对照，另外三支作为样品(三个平行试验)，首先，将含固定化酶的PBS溶液、底物溶液、终止液分开预热5-10min (37℃)，然后向1mL含有固定化酶的PBS溶液中加入4mL的底物溶液，持续振 荡反应5min，最后向反应体系中加入终止液Na2CO3持续振荡5min，而后将固定化 脂肪酶与反应体系用磁铁分离，在402nm波长下测OD值。空白对照以1mL PBS溶 液作为对照。
脂肪酶活力单位(U)定义为：在上述实验条件下，1min内催化底物释放出1μmol 的对硝基苯酚所需要的酶量定义为一个酶活单位。
实施例1
(1)称取2.6g FeCl3，1.2g柠檬酸三钠，超声分散在80mL乙二醇中。在搅拌 条件下加入3.12g乙酸钠，混合物200r/min搅拌30min后倒入反应釜中，200℃保 温20h。在外加磁场条件下分离洗涤得到Fe3O4纳米颗粒。
(2)称取1g Fe3O4纳米颗粒倒入80mL 2M NaOH水溶液中，持续搅拌2h，收 集并洗涤沉淀。将收集到的沉淀分散在200mL甲苯中，搅拌条件下滴加0.702g 3-氨 丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加热至100℃后用分水器回流10h，经过硅烷化修饰得 到磁性硅基纳米颗粒；
(3)用缓冲溶液配制得到45mL浓度为0.1mg/mL的脂肪酶溶液，加入磁性硅基 纳米颗粒5mg震荡120min，然后加入浓度为120mM的氯化铜溶液300μL，在25℃ 下静置72h，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到磁性脂肪酶纳米催化材料；
上述制备得到的磁性纳米花催化材料的性能检测结果：
图1为脂肪酶、三水合磷酸铜、Fe3O4纳米颗粒，磁性纳米花催化材料的红外图。 由图可知，在波数1042cm-1(非对称伸缩振动)、988cm-1(伸缩振动)、623cm-1(弯 曲振动)处的吸收峰来自于P-O键的振动，由此证明了磷酸基团的存在。图中脂肪 酶(a)中的特征峰1655cm-1、1538cm-1为游离脂肪酶中-CONH(酰胺键)的伸缩振 动，2800-3000cm-1的峰为-CH2和-CH3的伸缩振动，在3300cm-1为-OH的伸缩振动。 图中Fe3O4纳米颗粒特征吸收峰为2926cm-1来自Fe-O。从红外谱图中可以看出磁性脂 肪酶纳米花(d)同时具有脂肪酶(a)四氧化三铁(b)和三水合磷酸铜(c)的特征 吸收峰。
图2为脂肪酶、Fe3O4纳米颗粒、三水磷酸铜、磁性纳米花催化材料的X-射线衍 射图。由图可知，磁性纳米花催化材料中Cu3(PO4)2·3H2O和Fe3O4中的所有的衍射峰 都能够与单一的Cu3(PO4)2·3H2O，Fe3O4相对应，由此进一步证实磁性纳米花催化材料 是以三水合磷酸铜结晶体作为载体，Fe3O4负载于其中，并且三水合磷酸铜与游离脂肪 酶结合具有很高的结晶度，说明二者组装结构较为稳定。
图3为磁性硅基纳米颗粒和磁性纳米花催化材料的扫描电镜图，从图3a中可看出，合成的磁性硅基纳米颗粒粒径均一，分散性良好。从图3b中可看出磁性纳米花催化材 料由多层片状花瓣结构组成，花型结构完整，花瓣间孔径均一，具有良好的分散性和 较大的表面积。磁性硅基纳米颗粒均匀分散在花瓣结构中，既有利于维持花瓣的完整， 又赋予纳米花磁性属性。
图4为磁性纳米花催化材料分散在PBS溶液中后，在外加磁场条件下能快速分离并聚集。
在下述实施例1-9制备得到的磁性纳米花催化材料的磁响应性能均良好，其比饱和磁化强度为6.5-12.8emu·g-1范围内。
实施例2
(1)称取2.6g FeCl3，1.2g柠檬酸三钠，超声分散在80mL乙二醇中。在搅拌条 件下加入3.12g乙酸钠，混合物200r/min搅拌30min后倒入反应釜中，200℃保温20h。 在外加磁场条件下分离洗涤得到Fe3O4纳米颗粒。
(2)称取1g Fe3O4纳米颗粒倒入80mL 2M NaOH水溶液中，持续搅拌2h， 收集并洗涤沉淀。将收集到的沉淀分散在200mL甲苯中，搅拌条件下滴加0.702g 3- 氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加热至100℃后用分水器回流10h，经过硅烷化修 饰得到磁性硅基纳米颗粒；
(3)用缓冲溶液配制得到浓度为0.25mg/mL的脂肪酶溶液，取45mL酶溶液加 入磁性硅基纳米颗粒5mg震荡120min，然后加入浓度为120mM的氯化铜溶液 300μL，在25℃下静置72h，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到磁性脂肪酶 纳米催化材料；
实施例3
(1)称取2.6g FeCl3，1.2g柠檬酸三钠，超声分散在80mL乙二醇中。在搅拌 条件下加入3.12g乙酸钠，混合物200r/min搅拌30min后倒入反应釜中，200℃保温 20h。在外加磁场条件下分离洗涤得到Fe3O4纳米颗粒。
(2)称取1g Fe3O4纳米颗粒倒入80mL 2M NaOH水溶液中，持续搅拌2h，收 集并洗涤沉淀。将收集到的沉淀分散在200mL甲苯中，搅拌条件下滴加0.702g 3-氨丙 基三乙氧基硅烷(APTES)，加热至100℃后用分水器回流10h，经过硅烷化修饰得到 磁性硅基纳米颗粒；
(3)用缓冲溶液配制得到浓度为0.5mg/mL的脂肪酶溶液，取45mL酶溶液加入 磁性硅基纳米颗粒5mg震荡120min，然后加入浓度为120mM的氯化铜溶液300 μL，在25℃下静置72h，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到磁性脂肪酶纳米 催化材料；
实施例4
(1)称取2.6g FeCl3，1.2g柠檬酸三钠，超声分散在80mL乙二醇中。在搅拌条 件下加入3.12g乙酸钠，混合物200r/min搅拌30min后倒入反应釜中，200℃保温20h。在外加磁场条件下分离洗涤得到Fe3O4纳米颗粒。
(2)称取1g Fe3O4纳米颗粒倒入80mL 2M NaOH水溶液中，持续搅拌2h，收 集并洗涤沉淀。将收集到的沉淀分散在200mL甲苯中，搅拌条件下滴加0.702g 3-氨丙 基三乙氧基硅烷(APTES)，加热至100℃后用分水器回流10h，经过硅烷化修饰得到 磁性硅基纳米颗粒；
(3)用缓冲溶液配制得到浓度为0.1mg/mL的脂肪酶溶液，取45mL酶溶液加入 磁性硅基纳米颗粒10mg震荡120min，然后加入浓度为120mM的氯化铜溶液300 μL，在25℃下静置72h，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到磁性脂肪酶纳 米催化材料；
实施例5
(1)称取2.6g FeCl3，1.2g柠檬酸三钠，超声分散在80mL乙二醇中。在搅拌 条件下加入3.12g乙酸钠，混合物200r/min搅拌30min后倒入反应釜中，200℃保温 20h。在外加磁场条件下分离洗涤得到Fe3O4纳米颗粒。
(2)称取1g Fe3O4纳米颗粒倒入80mL 2M NaOH水溶液中，持续搅拌2h， 收集并洗涤沉淀。将收集到的沉淀分散在200mL甲苯中，搅拌条件下滴加0.702g 3- 氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加热至100℃后用分水器回流10h，经过硅烷化修 饰得到磁性硅基纳米颗粒；
(3)用缓冲溶液配制得到浓度为0.25mg/mL的脂肪酶溶液，取45mL酶溶液加 入磁性硅基纳米颗粒10mg震荡120min，然后加入浓度为120mM的氯化铜溶液300 μL，在25℃下静置72h，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到磁性脂肪酶纳米 催化材料；
实施例6
(1)称取2.6g FeCl3，1.2g柠檬酸三钠，超声分散在80mL乙二醇中。在搅拌 条件下加入3.12g乙酸钠，混合物200r/min搅拌30min后倒入反应釜中，200℃保温 20h。在外加磁场条件下分离洗涤得到Fe3O4纳米颗粒。
(2)称取1g Fe3O4纳米颗粒倒入80mL 2M NaOH水溶液中，持续搅拌2h，收 集并洗涤沉淀。将收集到的沉淀分散在200mL甲苯中，搅拌条件下滴加0.702g 3-氨 丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加热至100℃后用分水器回流10h，经过硅烷化修饰得 到磁性硅基纳米颗粒；
(3)用缓冲溶液配制得到浓度为0.25mg/mL的脂肪酶溶液，取45mL酶溶液加 入磁性硅基纳米颗粒10mg震荡120min，然后加入浓度为120mM的氯化铜溶液300 μL，在25℃下静置72h，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到磁性脂肪酶纳米 催化材料；
实施例7
(1)称取2.6g FeCl3，1.2g柠檬酸三钠，超声分散在80mL乙二醇中。在搅拌条 件下加入3.12g乙酸钠，混合物200r/min搅拌30min后倒入反应釜中，200℃保温20h。 在外加磁场条件下分离洗涤得到Fe3O4纳米颗粒。
(2)称取1g Fe3O4纳米颗粒倒入80mL 2M NaOH水溶液中，持续搅拌2h，收 集并洗涤沉淀。将收集到的沉淀分散在200mL甲苯中，搅拌条件下滴加0.702g 3-氨 丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加热至100℃后用分水器回流10h，经过硅烷化修饰得 到磁性硅基纳米颗粒；
(3)用缓冲溶液配制得到浓度为0.1mg/mL的脂肪酶溶液，取45mL酶溶液加 入磁性硅基纳米颗粒15mg震荡120min，然后加入浓度为120mM的氯化铜溶液300 μL，在25℃下静置72h，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到磁性脂肪酶纳米 催化材料；
实施例8
(1)称取2.6g FeCl3，1.2g柠檬酸三钠，超声分散在80mL乙二醇中。在搅拌 条件下加入3.12g乙酸钠，混合物200r/min搅拌30min后倒入反应釜中，200℃保温 20h。在外加磁场条件下分离洗涤得到Fe3O4纳米颗粒。
(2)称取1g Fe3O4纳米颗粒倒入80mL 2M NaOH水溶液中，持续搅拌2h，收 集并洗涤沉淀。将收集到的沉淀分散在200mL甲苯中，搅拌条件下滴加0.702g 3-氨 丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加热至100℃后用分水器回流10h，经过硅烷化修饰得 到磁性硅基纳米颗粒；
(3)用缓冲溶液配制得到浓度为0.25mg/mL的脂肪酶溶液，取45mL酶溶液加 入磁性硅基纳米颗粒15mg震荡120min，然后加入浓度为120mM的氯化铜溶液300 μL，在25℃下静置72h，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到磁性脂肪酶纳米 催化材料；
实施例9
(1)称取2.6g FeCl3，1.2g柠檬酸三钠，超声分散在80mL乙二醇中。在搅拌 条件下加入3.12g乙酸钠，混合物200r/min搅拌30min后倒入反应釜中，200℃保温 20h。在外加磁场条件下分离洗涤得到Fe3O4纳米颗粒。
(2)称取1g Fe3O4纳米颗粒倒入80mL 2M NaOH水溶液中，持续搅拌2h， 收集并洗涤沉淀。将收集到的沉淀分散在200mL甲苯中，搅拌条件下滴加0.702g 3- 氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加热至100℃后用分水器回流10h，经过硅烷化修 饰得到磁性硅基纳米颗粒；
(3)用缓冲溶液配制得到浓度为0.5mg/mL的脂肪酶溶液，取45mL酶溶液加 入磁性硅基纳米颗粒15mg震荡120min，然后加入浓度为120mM的氯化铜溶液 300μL，在25℃下静置72h，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到磁性脂肪酶 纳米催化材料；
实施例10
按照所述的酶活检测方法，检测上述实施例1-9的方法制备得到的磁性纳米催化材料的催化活性，结果如表1。由表1可知，通过改变脂肪酶初始酶浓度(0.1-0.5mg/mL) 以及磁性纳米花合成体系中磁性硅基材料所加质量(5-15mg/mL)，所制备的磁性纳米 花的酶催化活性为111.37-254.28U/g，与游离酶(97.31U/g)对比，提高了1.14-2.61 倍。
表1.磁性脂肪酶杂化纳米花的催化活性
实施例11
将实施实例5所得到的磁性纳米花催化材料放入含水的三角瓶中持续震荡24h后，在外加磁场作用下可快速回收，水中无物质残留，正如图4所呈现的一样。此外， 通过将这种固定化酶催化材料进行循环利用20次后，磁性纳米花花型基本保持完整， 磁响应较强，因此这种固定化酶的方法展现出良好的的结构稳定性。
实施例12
将实施例5所得到的磁性纳米催化材料作为酶催化剂，利用预处理的豆油和甲醇为原料生产生物柴油，具体为：将300mg固定化酶催化剂加入到9g豆油与800μL甲 醇混合液中，在60℃下对混合液处理，水浴振荡8h后，再次加入800μL甲醇继续震 荡8h，收集酶解产物，分离催化材料得产物脂肪酸甲酯。通过对酶解后得到的产物的 脂肪酸甲酯产率进行测定，从而评价其酯化的程度，脂肪酸价甲酯产率越高，反应越 完全。从酶催化产物中回收的磁性纳米颗粒，再次加入上述反应体系，在相同条件下 进行酶解，实现脂肪酶的循环利用。
豆油和甲醇预处理具体方法为：将豆油与甲醇加热至60℃，在超声条件下搅拌充分混合，降温至50℃左右，作为酶催化底物。
从酶催化产物中分离磁性纳米催化材料的具体方法为：用强力钕磁铁在酶解产物外部外加磁场，将酶解产物倒出反应容器，使酶解产物与磁性纳米催化材料分离，从 而回收催化材料以实现重复利用。
磁性纳米花催化材料经过20次循环利用，转化率仍保持一个较好的水平，为最初的80％左右，具有良好的循环利用性能。图5磁性纳米花催化材料的循环利用性图。 由图可知，磁性纳米花催化材料可以很好的合成生物柴油，且循环利用20次以后，转 化率还能保持最初的80％以上。

Claims (10)

1.一种磁性脂肪酶纳米花催化材料的制备方法，其特征在于：该方法是将硅基磁性Fe3O4纳米粒子分散到脂肪酶溶液中，再向其内滴加金属阳离子无机盐溶液，得到磁性脂肪酶纳米花，
所述硅基磁性Fe3O4纳米粒子为经硅烷偶联剂处理的Fe3O4纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述硅基磁性Fe3O4纳米粒子按下述方法制得：将磁性Fe3O4纳米粒子按1g:60～100mL的比例加入至1～4M的NaOH溶液中，连续搅拌2h，收集沉淀物并洗涤后干燥；将沉淀物按1g：200mL的比例分散至甲苯中，得分散液；200r/min搅拌下按0.5～0.9g:200mL的比例向分散液中滴加硅烷偶联剂，升温至100℃回流8～12h，收集沉淀物，洗涤干燥，得到磁性硅基纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磁性Fe3O4纳米粒子按下述方法制得：将2.2～3.0g FeCl3·6H2O和1.2g柠檬酸三钠溶于80mL乙二醇中，在充分搅拌条件下加入3.12g乙酸钠，继续搅拌30分钟，倒入反应釜中，200℃下保温12～24小时，收集黑色沉淀物，用去离子水和乙醇充分洗涤后干燥，得磁性Fe3O4纳米粒子。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磁性硅基Fe3O4纳米粒子与脂肪酶溶液比例为10mg：30～60mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述金属阳离子无机盐中，所述金属阳离子选自铜离子，锌离子，钙离子；所述无机盐形式为硝酸盐、氯化盐、硫酸盐。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述金属阳离子无机盐溶液浓度为120～140mM；所述硅基磁性Fe3O4纳米粒子与金属阳离子无机盐溶液的比例为5mg:150～600μL，优选为5mg:200～500μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脂肪酶浓度为0.1～0.5mg/mL，优选为0.25mg/mL。
8.权利要求1～7的任一项所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将2.2～3.0g FeCl3·6H2O和1.2g柠檬酸三钠溶于80mL乙二醇中，在充分搅拌条件下加入3.12g乙酸钠，继续搅拌30分钟，倒入反应釜中，200℃下保温12～24小时，收集黑色沉淀物，用去离子水和乙醇充分洗涤后干燥，得Fe3O4纳米颗粒；
(2)称取1g步骤(1)中所得的Fe3O4纳米颗粒，加入至80mL 1～4M的NaOH溶液中，连续搅拌2h，收集沉淀并洗涤后干燥；
(3)取步骤(2)所得沉淀分散至100ml甲苯中，200r/min搅拌下滴加硅烷偶联剂，升温至100℃回流10h，收集沉淀物，洗涤干燥保存，得到磁性硅基纳米颗粒；
(4)将5～15mg步骤(3)所得磁性硅基纳米颗粒超声分散后加入至用缓冲溶液配制得到浓度为0.1～0.5mg/mL的脂肪酶溶液45mL中，震荡120min，然后滴加金属阳离子无机盐溶液；
(5)将(4)所述混合溶液在室温下静置72h，经过外加磁场收集沉淀，洗涤，再分离，冷冻干燥得到磁性脂肪酶纳米花催化材料。
9.权利要求1～8任一项所述方法制得的磁性脂肪酶纳米花催化材料，其特征在于：所述材料由多层片状花瓣结构的三水合磷酸铜作为骨架，磁性硅基纳米颗粒均匀分散在花瓣表面及花瓣内部。
10.权利要求9所述磁性脂肪酶纳米花催化材料在催化生物柴油中油脂转化反应中的应用。
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